SE536352C2 - Markörgener för klassificiering av prostatacancer - Google Patents

Abstract

Föreliggande uppfinning hänför sig till ett förfarande för klassificering avprostatacancer hos en patient, varvid förfarandet innefattar stegen att a)bestämma en genuttrycksnivå eller ett genuttrycksmönster för generna F3 ochIGFBP3 i ett prov från patienten och b) klassificera tumören genom att jämföragenuttrycksnivån bestämd i a) med ett referensgenuttryck för samma gener hosreferenspatienter kända att ha en högrisk- respektive en lågrisktumör.Dessutom hänför sig uppfinningen till ett förfarande för att bestämma prognosför en patient diagnostiserad med prostatacancer, ett förfarande för att fattabehandlingsbeslut för en patient diagnostiserad med prostatacancer och en fastbärare eller ett kit för klassificering av en tumör hos en patient diagnostiserad med prostatacancer.

Description

535 352 metoder som kan prediktera vilken typ av patienter som skulle ha nytta av kastrationsbehandling.

En majoritet av prostatacancer framskrider så långsamt att de aldrig kan nå ett livshotande tillstànd, huvudsakligen på grund av hög ålder och andra konkurerande sjukdomar. En liten andel av prostatacancer framskrider dock mycket fort och kan döda patienter på mindre än fem år. Vid diagnos, med konventionella parametrar inkluderande ålder, tumörgrad, Gleason-poäng, klinisk grad och komorbiditet kan prediktionen av cancerspecifik och allmän överlevnad nå en exakthet på upp till 60-70 %. Även patienter med samma kliniska prognostiska parametrar kan uppvisa stora skillnader i överlevnad så väl som i svar på behandling. Följaktligen är prostatacancer en patologisk (morfologisk) diagnos som kan inkludera flera olika biologiska undergrupper eller subtyper.

Det finns ett behov av en metod som kan särskilja dessa biologiska undergrupper eller subtyper av prostatacancerpatienter. Det finns också ett behov av en metod som kan klassificera dessa subtyper i aggressiva eller högrisktumörer och mindre aggressiva eller lågrisktumörer, liksom en metod som kan prediktera överlevnad för patienter med respektive tumörsubtyp.

Vidare, finns det ett behov av en metod som kan användas för att fatta beslut beträffande behandling för patienter som har en tumör av respektive subtyp, eventuellt även med hänsyn till kliniska parametrar.

Känd teknik Patentdokument WO2008/013492 A1 beskriver ett tillvägagångssätt för identifiering av gener relaterade till embryonala stamceller, benämnda ES- tumörprediktorgener (ESTP-gener), som kan vara viktiga för funktionen hos cancerstamceller. 641 ESTP-gener identifierades och fanns användbara för klassificering av prostatacancertumörer.

Patentdokument WO09021338 A1 beskriver en metod för prognos av en cancersjukdom, t.ex. prostatacancer, hos en patient genom detektion av en 10 15 20 25 30 535 352 signatur av splicinghändelser. F3 omnämns som en av många gener som kan användas.

Patentdokument WO0171355 beskriver simultan analys av PSA, IGF-I och lGFBP-3 i blodplasma för att prediktera risken för en man att få prostatacancer.

US2003054419 A1 beskriver en metod för att bestämma risken för framskridning hos en prostatacancerpatient efter terapi, varvid nivåerna av TGF-ß1, |GFBP-2 eller IGFBP-3 i plasma mäts.

Patentdokument WO10006048 A och US2009298082 A beskriver respektive metoder för prediktion av överlevnad av en patient med diagnosen prostatacancer och huruvida en patient med PSA återfall senare kommer att utveckla systemiskt sjukdomstillstånd. I båda dokumenten nämns IGFBP-3 som en av många gener som, tillsammans med andra molekylära markörer, kan användas.

Dokument WO09105154 och WO06028867A beskriver en metod för att bestämma en prognos för en individ som har cancer och en metod för diagnos av multipelt myelom. c-MAF omnämns som en av många gener som kan användas.

WO1010188A beskriver en metod för att störa aktiviteten hos CTGF, varvid aktiviteten hos CTGT är förknippad med metastaser av prostatacancer.

Sfle med uppfinningen Det är ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla molekylära markörer som är användbara för klassificering, för prediktion av prognos och för att vägleda beslut beträffande behandling av prostatacancer hos en patient.

Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla nya metoder för klassificering av prostatacancer hos en patient, liksom för att använda 10 15 20 25 30 536 352 klassificeringen för prognosprediktion hos patienten och för att ta beslut beträffande behandling av patienten.

Ett ytterligare syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla en metod för behandling av en patient som har prostatacancer, vilken metod är basered på patientens tumörsubtyp. Ännu ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla verktyg för klassificering av prostatacancer eller -tumörer hos en patient_._ Beskrivning av uppfinningen Identifiering av gener och gensignaturer som är signifikant korrelerade till överlevnad hos prostatacancerpatienter För att stödja konceptet beträffande biologisk subtyp, har tidigare studier som använt cDNA mikroarrays baserade på hela genom klassificerat bröstcancer såväl som prostatacancer i molekylära subtyper med skilda kliniska och patologiska särdrag. Den föreliggande beskrivningen utvidgar konceptet och betydelsen ytterligare. Istället för att endast använda statistisk analys, drevs selektionen av genmarkörskandidater i föreliggande studie av cancerstamcells- (CSC)/ embryonalstamcells- (ESC) hypotesen, med syfte att identifiera endast ett fåtal ESC-/CSC-genmarkörer av högsta betydelse. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara effektivt eftersom de mest signifikanta prediktiva genmarkörerna som identifierades iden föreliggande studien var från listan med identifierade embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGP:er).

Uppfinnarnas hypotes var att den biologiska aggressiviteten hos prostatacancer och förmåga att svara på kastrationsbehandling till största delen bestäms av huvudsakliga genuttrycksmönster hos prostatacancerstamceller (CSCs) (Visvader, Nature 2011, 4691314-22; Ratajczak et al, Differentiation 2011, 812153-161; Lang et al, J Pathol 2009, 2172299-306). Ännu en hypotes var att gener som har en viktig funktion i embryonala stamceller (ESCzer) också kan 10 15 20 25 30 35 536 352 4a Beskrivning av figurerna Figur 1A illustrerar tillvägagàngssättet för identifiering av viktiga kandidat- ESCGP:er i prostatacancer.

Figur 1B visar 19 högt rankade ESCGP:er och 5 kontrollgener som valdes ut enligt 4 kriterier beskrivna i Exempel 2A.

Figur 1C visar uttrycket av nämnda 19 högt rankade ESCGP:er och 5 kontrollgener l prostatacancercellinjer.

Figur 2 illustrerar uttrycket av 34 ESCGP:er och 5 kontrollgener (c-MAF, AZGP1, AMACR, MUC1 and EZH2) genom RT-PCR i prostatacancercellinjer såsom beskrivs i Exempel 2B.

Figur 3 illustrerar verifiering av korrektheten i 4-plex-qPCR genom jämförelse med enkel (singel) qPCR.

Figur 4A-K visar resultattabeller från multivariat analys som gjordes för att identifiera markörgener som visar korrelation med överlevnad oberoende av alla kliniska parametrar (se Exempel 3A).

Figur 5 illustrerar tumörsubtypsklassificering för ett träningsset av patienter genom ESCGP-signatur 1 (F3, lGFBP3 och VGLL3) och ESCGP-signatur 2 (F3, lGFBP3 och c-MAF-a).

Figur 6A illustrerar skillnader i överlevnad mellan tumörsubtyper eller grupper (Grupp 1, Grupp 2 och Grupp 3) klassificerade med hjälp av ESCGP-signatur 1 (F3, lGFBP3 och VGLL3).

Figur 6B visar allmän och cancerspecifik överlevnad hos de tre tumörsubtyperna eller gruppema med Kaplan-Meier-kurvor.

Figur 6C visar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patienter med PSAsäOng/ml vid diagnos.

Figur 6D visar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patienter med en ålder av S73 vid diagnos.

Figur 6E och 6F är statistiska làddiagram som visar skillnad i överlevnad mellan de tre subtyperna eller grupperna.

Figur 7 illustrerar klassificering av tumörsubtyp eller grupp (Grupp 1, Grupp 2 och Grupp 3) hos hela patientgruppen med hjälp av ESGCP-signatur 2. 10 15 20 25 30 535 352 4b Figur 8 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patientgrupper som definieras med hjälp av (A) PSA, (B) ålder, (C) kliniskt stadium och (D) tumörgrad.

Figur 9 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyper som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur 1, hos patienter inom samma grupp definierad med hjälp av följande kliniska parametrar (A) PSAs50 ng/ml, (B) PSA>50 ng/ml, (C) ålder s73 (C), (D) ålder >73, (E) begränsat stadium, (F) framskridet stadium, (G) högt eller medelhögt differentierad cancer och (H) lågt differentierad cancer.

Figur 10 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyperna som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur1 hos patienter primärt behandlade endast med kastrationsbehandling.

Figur 11 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyperna som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur 1 hos patienter som primärt endast behandlats med kastrationsterapi och inom samma grupp som definierats med hjälp av följande kliniska parametrar; (A) PSASSO ng/ml, (B) PSA>50 ng/ml, (C) ålder S73, (D) ålder>73, (E) begränsat stadium, (F) framskridet stadium, (G) högt eller medelhögt differentierad cancer och (H) lågt differentierad cancer.

Figur 12 illustrerar prediktion av överlevnadstid med hjälp av parametrisk modell med hjälp av (A) kliniska parametrar; (B) kliniska parametrar tillsammans med tumörsubtyper eller grupper klassificerade med hjälp av ESCGP-signatur 1.

Figur 12C visar uppskattad förbättring av överlevnadsprediktion genom att lägga till parametrar från klassificeringen av tumörsubtyp med hjälp av ESCGP-signatur 1.

Figure 12D visar bidrag från ESCGP-signatur 1 respektive från kliniska parametrar för prediktionen av allmän och cancerspecifik överlevnad. 10 15 20 25 30 536 352 vara av betydelse i prostata-CSC:er. Därmed skulle direkt mätning av uttrycksmönster av gener besläktade med embryonala stamcellsgener hos prostatacancerceller avspegla den biologiska aggressiviteten hos cancern och möjliggöra prediktion av effekten av kastrationsbehandling såväl som prediktion av patientöverlevnad.

Baserat på denna hypotes har uppfinnarna tidigare identifierat gener, dvs. embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGP:er) som har en konsekvent hög eller konsekvent låg uttrycksnivå i ECS-Iinjer (WO 2008/013492 A1). l korthet identifierades ESCGP:erna genom analys av tidigare publicerade dataset av microarraydata från helgenom-cDNA härlett från 5 humana ESC- linjer och 115 humana normala vävnader från olika organ med hjälp av en enkel enklass-SAM (Significance Analysis of Microarrays), varvid generna rangordnades enligt deras grad av konsekvens i uttrycksnivåer i ESC:erna.

Detta var baserat på konceptet att gener med antingen konsekvent höga eller konsekvent låga uttrycksnivåer i alla ESC:linjer kan ha betydelsefulla funktioner i att upprätthålla ESC status/tillstånd och att förändringar av deras uttryck i olika mönster kan leda till differentiering i olika riktningar. Dessa ESC-gener kan även ha funktioner i att upprätthålla olika status hos CSC:er och därmed kan olika uttrycksmönster av ESC-gener i CSC:er klassificera tumörer i olika subtyper med olika aggressivitet och känslighet för olika typer av behandling. Genom att utgå från denna lista av ESCGP:er identifierade föreliggande studie några viktiga prognostiska och prediktiva genmarkörer för prostatacancer.

Från en lista med 641 ESCGP:er identifierade i WO 2008/013492 A1 valdes i föreliggande studie en delmängd på 33 ESCGP:er ut, som kandidater som kan möjliggöra klassificering av prostatacancer med hjälp av färre markörer.

Kandidaterna valdes ut enligt tre kriterier såsom beskrivits i Exempel 2A (se även Figur 1), dvs. enligt deras rangordningsposition i ESCGP-Iistan och enligt deras rangordningspositioner i genlistor från en tidigare studie (Lapointe et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101 :81 1-816), vilken identifierade gener som 10 15 20 25 30 535 352 potentiellt kunde användas för klassificering av subtyper av prostatacancer och gener som kunde särskilja prostatacancer från normal vävnad.

Vidare valdes 5 gener som inte var från ESCGP-Iistan ut enligt ett fjärde kriterium; de var beskrivna och kända för att vara betydelsefulla i prostatacancer. Dessa beskrivna gener användes som kontroll för att utvärdera betydelsen av ESCGP-gener i förhållande till icke-ESCGP-gener vid klassificering av prostatacancer. Vidare kunde de eventuellt inkluderas i en molekylär markörsignatur för användning vid klassificering av prostatacancer.

Uttryck av de 33 utvalda ESCGP:erna och de 5 beskrivna generna undersöktes i tre olika prostatacancercellinjer med hjälp av RT-PCR (se Exempel 2B). Av dessa 33 gener identifierades 24 gener (19 ESCGP:er och 5 beskrivna gener) som hade annorlunda uttrycksmönster i den mindre aggressiva cellinjen LNCap jämfört med de aggressiva cellinjerna DU145 och PC3 (se Figur 2). Dessa 24 gener ansågs mer sannolikt vara användbara för tumörklassificering för att särskilja mindre aggressiv från mer aggressiv cancer. Därmed valdes de 24 generna (25 genmarkörerna) ut för optimering av multiplex kvantitativ PCR och utvärdering av förmåga att klassificera prostatacanceri prover fràn finnålsaspiration (FNA) från 189 patienter med prostatacancer med känt kliniskt utfall (se Exempel 3A). Gener vars uttrycksprofil korrelerade med överlevnad identifierades först med hjälp av analys av ett träningsset, dvs. en delmängd av hela gruppen på 189 patienter. De identifierade genernas förmåga att klassificera tumörer bekräftades sedan med hjälp av analys av hela patientgruppen.

Alla patienter i den föreliggande gruppen hade kliniskt signifikant prostatacancer och majoriteten (80 %) av patienterna hade inte behandlats med radikal prostatektomi eller full dos strålningsbehandling utan endast med kastrationsbehandling när sjukdomen var långt framskriden. Således påverkades inte överlevnadsdatat av de kurativa effekterna av radikala behandlingar, vilka, när de används vid ett tidigt stadium hos vissa patienter med biologiskt aggressiv cancer, kan eliminera cancern och därmed livshotet. l 10 15 20 25 30 535 352 föreliggande grupp var uppföljningstiden 7-20 är och majoriteten (94.5 %) av patientema avled vilket möjliggjorde en fullständig analys av den faktiska allmänna överlevnadstlden med minimalt censurerat data. Dessa egenskaper säkerställde upptäckten av nya biomarkörer för prediktion av överlevnad och var unika jämfört med de flesta tidigare studier, där PSA-återfall och progressionsfri överlevnad har använts som surrogat för allmän och cancerspecifik överlevnad.

I föreliggande studie har både allmän och cancerspecifik överlevnad använts för att utvärdera det kliniska värdet av prognostiska biomarkörer. Cancerspecifik överlevnad bestäms huvudsakligen av cancercellers biologiska aggressivitet.

Dock kan exaktheten och betydelsen av korrelationen mellan prognostiska såväl som prediktiva parametrar (såsom kliniska parametrar och/eller uttryck av biomarkörer) och cancerspecifik överlevnad påverkas av hur cancerspecifik överlevnad definieras och hur mycket data som censureras på grund av andra konkurrerande dödsorsaker. Å andra sidan är den allmänna överlevnaden överlevnadsdata utan någon censurering av dödsorsaker och inkluderar alla dödsorsaker.

Därför återspeglar allmän överlevnad inte bara den biologiska aggressiviteten hos cancerceller utan också många andra faktorer såsom konkurrerande sjukdomar eller komorbiditeter, komplikationer såväl som bieffekter av behandling, älder och förväntad livslängd. Den allmänna överlevnaden kan för prostatacancerpatienter ha större betydelse än cancerspecifik överlevnad eftersom de flesta patienter är diagnostiserade vid hög ålder och vanligen har andra konkurrerande sjukdomar såsom kardiovaskulära sjukdomar, diabetes mellitus eller andra elakartade sjukdomar (Daskivich et al, Cancer 2011, Apr 8. doi: 10.1002/cncr.26104. [Epub före publikationj).

Tio molekylära markörgener visade signifikant korrelation med allmän och/eller cancerspecifik överlevnad vid envariatanalys (se Tabell 1), och kan användas för klassificering av prostatatumörer, för prognosprediktion och även för att fatta beslut beträffande behandling för patienter, beroende på klassificeringen av 10 15 20 25 30 535 352 patientens tumör. Dessa markörer var F3 (koaguleringsfaktor lll; coagulation factor lll), WNT5B (wingless-typ MMTV integrationsplats familj, medlem 5B; winglesstype MMTV integration site family, member 5B), VGLL3 (rudimentärlik 3 (Drosophila); vestigial like 3 (Drosophila)), CTGF (bindvävnadstillväxtfaktor; connective tissue growth factor), lGFBP3 (insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 3; insulin-like growth factor binding protein 3), c-MAF-a (läng form av v- maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); long form of v- maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), c-MAF-b (kort form av v-maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); short form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), AMACR (alfa-metylacyl-CoA racemas; alpha-methylacyl-CoA racemase), MUC1 (cellytesassocierad mucin 1; mucin 1,ce|| surface associated) och EZH2 (förstärkare av zestehomolog 2 (Drosophila); enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila)). Fem av dessa tio gener (F3, WNT5B, CTGF, VGLL3 och IFGBP3) var ESCGP:er som identifierats från listan av gener med konsekvent hög eller läg uttrycksnivà i embryonala stamceller. Två av dessa gener (c-MAF-a och c-MAF-b) var tidigare beskrivna gener som var kända för att ha viktiga funktioner i myelom.

Tre av de slgnifikanta generna (EZH2, AMACR och MUC1) är gener som tidigare beskrivits i samband med prostatacancer. Flera tidigare studier har identifierat biomarkörer som AMACR, EXH2, MUC1 samt AZGP1 och en stamcellsaktig signatur som är korrelerade med àterfallsfri överlevnad efter radikal prostatektomi (Varambally et al, Nature 2002, 419:624-9; Rubin et al, JAMA 2002, 287:1662-70; Oon et al, Nat Rev Urol 2011, 8:131-8; Lapointe et al, Cancer Res 2007, 67:8504-10; Rubin et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005, 1411424-32; Strawbridge et al, Biomark Insights 2008, 31303-15; Glinsky et al, J Clin Oncol 2008, 2846-53; Glinsky et al, J Clin Invest 2005, 11521503-21). Föreliggande resultat visar att uttrycksnivän av MUC1, AMACR och EXH2 i FNA-prover från prostatacancer faktiskt korrelerar med antingen cancerspecifik eller allmän överlevnad. Emellertid, av de tidigare beskrivna genmarkörerna, var endast korrelationen med c-MAF-a lika stark som 536 352 Tabell 1. Envariat proportionell riskanalys enligt Cox av 25 EïCGPær och kliniska parametrar.

Variabel PSA>50 vs. PSASSO (ng/ml) WHO Tumörgrad Lågt vs. Medelhögt I Högt Kliniskt stadium 1' Framskriden vs. Begränsad Ålder 2 PSA § F3 ll WNT5B || VGLL3 || c-MAF-a || cTGF || IGFBPB || c-MAF-b || EZH2 || AMACR || Muc1 || WNT11 || BAsP1 || AZGP1 || COL12A1 || EGR1 || LRRN1 || ERBBS || CYR61 || FBP1 || PTN || LRP4 || THBS1 || GREM1 || METTL7A || CDH1 || Provnummer' 181 175 185 161 92 89 152 174 100 169 69 144 148 143 177 177 148 176 175 182 89 79 79 27 27 27 35 35 35 Å||män överlevnad Riskkvot 195% c|) 2341165331) 1591116-213) 1.701123-2.35) 1041102-106) 1001100-100) 1.11 11.04-1.17) 1141104-125) 1031103-113) 10911.03-117) 1131103-123) 1041093-110) 11310.96-1.33) 0941034-1.os) 1.0311.02-1.16) 1071100-113) 1021097-103) 1.99 1093-106) 0.99 10.94-1 _05) 1021093107) 1.0310.95-1.11) 1021093-107) 1.0410.93-1.10) 1121099-127) 1.11 1100-123) 0991079-124) 1.06 10.90-1.24) 1.0310.91-1.17) 1.041094-116) 1.0310.91-1.23) 1.1210.96-130) P-värde <0.001 0.004 0.001 <0.001 0.005 0.001 0.004 0.002 0.007 0.008 0.16 0.13 0.26 0.01 0.04 0.38 0.87 0.81 0.34 0.47 0.26 0.23 0.07 0.06 0.93 0.47 0.66 0.40 0.37 0.14 Cancer överlevnad Riskkvot 195% c|) 2.61 (1 .68-4.05) 1.94 (1.28-2.94) 2201144333) 1.0311.00-1.05) 1001100-100) 1141106-122) 1261111-142) 1.0711.01-1.14) 1091101-119) 1.1511.02-1.29) 1.09 1101-117) 1231104-157) 0.35 1074-093) 103 11.00-1.17) 1.0610.93-114) 1.0210.96-1.09) 0.97 1039-105) 1.0210.96-1.03) 0.97 1091-1 _03) 1.0710.97-1.13) 1031093-1.09) 1041096113) 1031091-123) 1.031093-125) 1.02 1073-142) 1.11 1033-139) 1.02 1033-125) 1.1210.95-1.33) 0.95 1072-125) 0.94 (0.72-1.24) P-värde <0.001 0.002 <0.001 0.04 0.004 <0.001 <0.001 0.02 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.06 0.13 0.55 0.45 0.55 0.36 0.17 0.29 0.29 0.36 0.32 0.91 0.37 0.88 0.17 0.69 0.67 10 15 20 25 536 352 10 * Varje ESCGP har ett eget provantal eftersom inte alla ESCGP:er har profilerats över alla prover. f Grupper av kliniska stadier klassificerades med hjälp av Tumör-Nod-Metastas-systemet (TNM) och PSA-värde.

Framskridet kliniskt stadium definierades som vilket som helst TNM-stadium där T23, N1, M1 eller PSA > 100.0 ng/ml.

Begränsat kliniskt stadium definierades som T1-2NOM0 och PSAS100.0 ng/ml. 1: Ålder modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvolen anges för varje 1.0-års ökning i ålder.

§ PSA-värdet modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvoten anges för varje ökning av 1.0 ng/ml PSA i SBFUITI.

|| Genens centrerade delta-Ct-värde modellerades som en kontinuerlig variabel. Det svarar omvänt mot genuttrycksnivá. Riskkvoten anges för varje ökning av 1.0 enhet av genens centrerade delta-Ct-värde. korrelationen med ESCGP:erna F3, IGFBP3 och VGLL3, identifierade i den föreliggande studien.

Uttrycksnivàerna (omvänt korrelerade med det centrerade delta-Ct-värdet) av alla dessa signifikanta gener utom EZH2 visade en positiv korrelation med överlevnadstid (Tabell 1, Riskkvot > 1). Endast uttrycksnivàn av EZH2 i FNA- proven var omvänt korrelerad med patientöverlevnad. Denna negativa korrelation av EZH2 överensstämde med dess dokumenterade roll som en onkogen. De föreliggande resultaten för EZH2, AMACR, lGFBP3 och c-MAF-a generna är i linje med relevanta resultat från tidigare studier (Varambally et al, Nature 2002, 419:624-9; Rubin et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005, 1411424-32; Mehta et al, Cancer Res 2011, 71:5154-63; Li et al, Genes Chromosomes Cancer 1999, 24:175-82). lGFBP3 har en väl bevisad funktion i att undertrycka metastasprocessen hos prostatacancer (Mehta et al, Cancer Res 2011, 7125154-63).

Den positiva korrelationen mellan MUC1 och F3 och överlevnad var oväntad.

F3 och MUC1 har dokumenterade funktioner i att främja utvecklingen av cancer (Strawbridge et al, Biomark lnsights 2008, 3:303-15; Kasthuri et al, J Clin Oncol 2009, 27:4834-8). Den positiva korrelationen med överlevnad kan tyda på att prostatacancerceller med hög uttrycksnivà av F3 och MUC1 är starkt androgenberoende och känsliga för kastrationsbehandling (Strawbridge et al, Biomark lnsights 2008, 31303-1 5; Kasthuri et al, J Clin Oncol 2009, 27:4834-8; Mitchell et al, Neoplasia 2002, 4:9-18; Brodin et al, Semin Thromb Hemost 2001, 37:87-94). Det finns nägra prognostiska och prediktiva markörer med liknande tvàfaldiga aspekter i andra cancertyper, såsom HER-2/neu/ERBB2- amplifiering i bröstcancer, där bröstcancer med amplifiering av HER- 10 15 20 25 30 35 536 352 11 2lneu/ERBB2 har aggressiva biologiska såväl som kliniska drag men som svarar på Tratsuzumab(Herceptin)-behandling med åtföljande förlängd överlevnad.

Funktionen av VGLL3 med avseende på prostatacancer är fortfarande okänd.

Vidare genomfördes multivariat analys för att identifiera gener som, oberoende av all kliniska parametrar, visar korrelation med överlevnad (se Exempel 3A).

Fyra gener (F3, lGFBP3, CTGF och AMACR) visade korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad oberoende av alla kliniska parametrar (Figur 4A-K). Alla de fyra generna utom AlVlACR kom från listan med ESCGP:er. Två gener (WNT5B och EZH2) uppvisade, oberoende av kliniska parametrar, korrelation med cancerspecifik överlevnad och en gen (VGLL3) uppvisade, oberoende av kliniska parametrar, korrelation med allmän överlevnad.

För att studera eventuella additiva eller synergistiska effekter av flerfaldiga gener med avseende på prediktion av överlevnad, testades olika kombinationer av de tio signifikanta generna i en serie av oövervakade hierarkiska klusteranalyser (se Exempel 3B och Figur 6-7). Av vikt är att två signaturer identifierades som på ett likartat sätt kunde klassificera tumörer in i tre undergrupper eller subtyper med signifikant skillnad i allmän och cancerspecifik överlevnad. Den första ESCGP-signaturen (Signatur 1) inkluderar generna VGLL3, lGFBP3 och F3. Den andra ESCGP-signaturen (Signatur 2) inkluderar generna c-MAF-a, IGFBP3 och F3. Klassificeringen hade en stark korrelation med och kan användas för prediktionen av en patients allmänna och cancerspecifika överlevnad (se Figur 6-7 och Tabell 2-3). Denna prognostiska och prediktiva uttryckssignatur var oberoende av ålder, PSA-nivå, tumörgrad och kliniskt stadium.

De viktigaste markörgenerna som hittades i denna studie visade korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad. Detta var delvis på grund av möjligheten att prostatacancer eller bieffekter av behandlingama även bidrog till dödsfall som direkt orsakades av andra sjukdomar. Detta kan också delvis bero på det faktum att ESCGP-signaturen kan delas av både cancerstamceller och vissa typer av normala stamceller i kroppen. Därför kan ESCFP-signaturen vara av betydelse för utvecklingen av både cancer och andra sjukdomar. Till 536 352 12 Taßotf 2. Drcprmlonett riskanalys enligt Lïru: ev ESCGP-slgrinttx l och lrflrrtska pamzneuaø' (Envaitat och ñlulttvzrier analys) variabel Alumn överlevnad Canremverlevnm Envarw. analys lbtutnvatrtet Analys Envarlorannlys Muktvafint Analys -\t.\'a: ara-hv' Rëfilwol P vtinte Emmie' P vis-KS:- Frisåkvß* P váttlo Frrc-kitvnl F' vàßx 4352! .L- lêšäb CJ) (9630 Cl? 495% 'Th f; .F-Mgrzaur '- f 558156 1 vi. Gert» 'i 8:' 4 77 1127- 1:! ÜIE f-flßtït 4? :E61 *(1004 :"_\'ï:_{C.2 vs Emse? S7 ESt-jïi S0* 'SLEvtEEI-äñrl) 'JBGZ Éfxïfl il-ïšï- 003 lrfí-T-'E-ü V5. PcZQ-l-:šå t-'riïtY-*ii 'di Idé) -IÉJU-lkšlf» llííl 3.53 itfàflirl-Vï) ' 1 16 f!! I í-»ä CIS.- 0.18 WRC Yurtlâ-'glrsxí .ägt (s. NSeiEGf-N! i lr-'šgt S7 l åSt' .OLLE-åt 0.3! 2.1? rGJJÉ-Z 00.* (LEK) 1 23 (iÛ-t-SÃT; 6.54 6.61? ršllmsw Stam-har: 3 :Ian-shli-íê-t va. Bege' E-ï 2 13 f' 32-3. 45f- 0032 1.551 (054 3 Dä 5.10 3.57 iIE-'flï 73) få' 1351 3 v32 (l 55-3 45- Qšßæ Åkte: § 97 41.391 1.0” 3.95 tsâš 12.024. til) (I C63 'l 03 :092-1 35: 0.11 ' Antalet prover för klusteranalysen var 95. 87 provar hade all klinisk information inklusive ålder vid diagnos, PSA-värde. tumörgrad enligt WHO och kliniskt stadium. Envariat och muttivariat analys genomfördes på dessa 87 prover. 1 ESCGP-signatur 1 inkluderade uttryckssignatur för VGLLS, |GFBP3 och FS. Den klassificerade proven i tre subtyper av tumörer: Grupp 1, Grupp 2 och Grupp 3 genom klusteranelys (Figur 6, panel A). 1 Gmpper av kliniska stadier klassificerades med hjälp av Tumör-Nod-Metastas-sysi .net (TNM) och PSA-värde. Framskridet kliniskt stadium definierades som vilket som helst TNM-stadium där T23, N1, M1 eller PSA > 100.0 nglml. Begränsat kliniskt stadium definierades som T1-2NOM0 och PSAS100.0 nglml § Ålder modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvoten anges för varje 1.0-àrs ökning i ålder.

Tabell 3. Prouomenoël riskanalys anala! Cox av ESCGP normer 2 var kliniska parametrar tíiwonat :nu MuIm-sriar mami. variabel Ahmed överlevnad V Cmomåtrerlemoo Envarlnt m-.ityn Mxltivmiot Analys Envuriot analys Miittivoiiat hirælys Ntlexrs-:w-x' Riatkeu: = 'iaf-Sa Ftmssww-t P i-faxk Ratt-fx P vzfdc Referat F' vård-_* 96% C11 GF* Cl; ÉÉS-lh fr: EEGPfsi-grntm 2 f Simil- 4. “it C-lttpi- 3 êï 3 '-51 'tIi-Exëf, <ü.00'l 2 46 :iZi-lim i C97 4.11 ltê-l-š-.ÉSÉ 011)? C 854 Gm!!! 2 'JS Lärum- 'S 5:? 2111 11.99-21.73) l 32 -í-'SI-Zßš) D28 2.19 i* 27 3.29 .filnåf- n Pï-*x- '<7 i '1Y.{'.Tt\'4íf,fi} wftfltlt låšåt Svt-Lill så Kil tïl rß 79-?- 71; ítšlš VvHU IUPNBJQG vs Medältírgt 'H å? l 55 f'- '13-2 653, *Û GÅ l 'Iä-'Cl 833231 Gil l 934045157) '-53 ÉÛ 74-3 73:' 0-25 Ilmar: *Staden 2 Framskwen vs Beurer-sad sl 3-3 05; 0.082 l 7E411-'2-3.1r.'t üfl-l 3.87 ltåd-ITC! <0' G31 lïQC-l ÅMKQ å? t 0-31312-34 09", *ii 001 10151 31-1 :til Ö 02 1% tt iii-l tå) 0 D03 103 20 'Ylblßß 0 0-2- ' Antalet prover för klusteranalysen var 95. 87 prover hade all klinisk information inklusive ålder vid diagnos. PSA-värde, tumörgrad enligt WHO och kliniskt stadium. Envariat och multivariat analys genomfördes på dessa 87 prover. fESCGP-signatur 2 inkluderade uttryckssignatur för c-MAF-a, IGFBPS and F3. Den klassificerade proven i tre subtyper av tumörer: Grupp 1. Grupp 2 och Grupp 3 genom klusteranalys (Figur 7). t Grupper av kliniska stadier klassificerades med hjälp av Tumör-Nod-Melastas-systemel (TNM) och PSA-värde. Framskridet kliniskt stadium definierades som vilket som helst TNM-stadium där T23, N1. M1 eller PSA > 100.0 nglml. Begränsat kliniskt stadium definierades som T1-2NOM0 och PSAS100.0 nglml § Ålder modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvoten anges för varje 1,0-àrs ökning i ålder. 10 15 20 25 30 35 536 352 13 exempel har |GFBP3 identifierats att ha viktiga suppressiva funktioner i både cancer och diabetes (Yeap et al, Eur J Endocrinol 2011, 164715-23; Mehta et al, Cancer Res 2011, 71 :5451-63).

Utföringsformer av föreliggande uppfinning Enligt en första aspekt tillhandahåller föreliggande uppfinning ett förfarande för klassificering av prostatacancer hos en patient, innefattande att a) bestämma en genuttrycksnivå för generna F3 och |GFBP3 i ett prov från patienten, med andra ord bestämma genuttrycksmönstret för nämnda genen b) klassificera tumören genom att jämföra genuttrycksnivån, dvs. genuttrycksmönstret, som bestämdes i a) med ett referensgenuttryck för samma gener hos referenspatienter som är kända att ha en högrisk- respektive lågrisktumör; och c) dra slutsatsen att om den/det i a) bestämda genuttrycksnlvån/ genuttrycksmönstret matchar referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en högrisktumör, är tumören hos patienten en högrisktumör, och om den i a) bestämda genuttrycksnivån överensstämmer med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en làgrisktumör, är tumören hos patienten en lågrisktumör.

I en föredragen utföringsform bestäms uttrycksnivån för generna F3 och |GFBP3 och någon av VGLL3 och c-MAF i a), och används därmed för klassificering av tumören. Företrädesvis bestäms uttrycksnivån av F3, |GFBP3 och VGLL3.

Dessa gensignaturer har visats särskilt användbara för klassificering av prostatacancertumörer (Figur 6-7) och den resulterande klassificeringen har visats vara signifikant korrelerad med överlevnad hos prostatacancerpatienter (Figur 6 och 9-12, Tabell 2 och 3).

Enligt en utföringsform innefattar således steg a) vidare att bestämma en genuttrycksnivå för en eller flera av generna VGLL3 och c-MAF, företrädesvis VGLL3.

Enligt en ytterligare utföringsform innefattar steg a) också att bestämma en genuttrycksnivå för en eller flera av generna WNT5B och CTGF, EZH2, AMACR och MUC1. 10 15 20 25 30 35 535 352 14 Enligt en andra aspekt tillhandahåller den föreliggande uppfinningen ett förfarande för klassificering av prostatacancer hos en patient, innefattande stegen av att: a) bestämma en genuttrycksnivå, för minst en av gen vald från F3, lGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och/eller CTGF i ett prov fràn patienten; b) klassificera tumören genom att jämföra den i a) bestämda genuttrycksnivàn med ett referensgenuttryck för samma gen(er) hos referenspatienter som är kända att ha en högrisk- respektive en lågrisktumör; och c) dra slutsatsen att om den i a) bestämda genuttrycksnivån matchar referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en högrisktumör, är tumören hos patienten en högrisktumör, och om den i a) bestämda genuttrycksnivån stämmer överens med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en lågrisktumör, är tumören hos patienten en lågrisktumör.

Den andra aspekten av den föreliggande uppfinningen är baserad på det häri insedda faktum att uttrycket av någon av F3, IGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF in prover från patienter som har prostatacancer kan tjäna som indikator på sjukdomstillstånd hos nämnda patient. Uppfinnarna har funnit att det finns en positiv korrelation mellan genuttrycksnivåerna av någon av nämnda gener och överlevnad. Mer specifikt har uppfinnarna av föreliggande uppfinning funnit en korrelation mellan en hög uttrycksnivå av någon av F3, IGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF och längre överlevnad, således lågrisktumörer. Å andra sidan är en låg uttrycksnivå av någon av nämnda gener korrelerad med kortare överlevnad och således högrisktumörer.

Enligt en utföringsform av denna andra aspekt bestäms uttrycksnivån för minst två, såsom två, tre eller fyra av generna F3, IGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF i steg a) av förfarandet enligt föreliggande uppfinning och används därmed för klassificering av tumören.

Enligt en ytterligare utföringsform bestäms uttrycksnivån för samtliga gener F3, IGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF i steg a) av förfarandet enligt föreliggande uppfinning och används därmed för klassificering av tumören. 10 15 20 25 30 35 535 352 15 Enligt ännu en utföringsform bestäms uttrycksnivän även, dvs. utöver vilken som helst av kombinationema ovan, för minst en av genema EZH2, AMACR och MUC1 och används därmed för klassificeringen.

Huruvida uttrycksnivän för en av nämnda gener hos en patient med prostatacancer är hög eller låg kan bestämmas genom att jämföra genuttrycksnivån i ett prov från patienten med ett gentuttrycksreferensvärde för samma gen(er) hos en referenspatient, eller grupp av referenspatienter, kända för att ha en högrisk- respektive lågrisktumör. Om uttrycksnivän för den valda genen/generna i patientprovet är lika hög eller högre än uttrycksnivån för samma gen hos en referenspatient känd för att ha en lågrisktumör kan tumören hos patienten klassificeras som låg risk. Om uttrycksnivän för den valda genen/generna i patientprovet är lika låg eller lägre än uttrycksnivän av samma gen hos en referenspatient känd för att ha en högrisktumör kan tumören hos patienten klassificeras som hög risk. När en grupp av referenspatienter används förjämförelse, kan den valda genens/genernas medel- eller medianuttrycksnivå i gruppen användas som genuttrycksreferensvärde.

Med att matcha genuttrycksnivàn för den valda genen med referensgenuttrycket hos en referenspatient menas, när genuttrycksnivån bestäms för en gen, att när uttrycksnivän för den valda genen är lika hög eller högre än referensgenuttrycket hos en referenspatient som är känd för att ha en lägrisktumör matchar genuttrycksnivån med det referensgenuttrycket. Pä samma sätt, när uttrycksnivän för den valda genen är lika låg eller lägre än referensgenuttrycket hos en referenspatient som är känd för att ha en högrisktumör matchar genuttrycksnivån med det referensgenuttrycket.

Med att matcha genuttrycksnivån för den valda genen med referensuttrycket hos en referenspatient menas, när genuttrycksnivån bestäms för två eller fler gener, att det övergripande genuttrycksmönstret för de två eller fler valda generna mäste matcha det övergripande referensgenuttrycksmönstret för de två eller fler valda generna hos en referenspatient. Således behöver inte uttrycket för båda eller samtliga valda gener, såsom det utvärderats var och en för sig, helt matcha referensgenuttrycket för de valda generna var och en för sig.

Snarare kan en väldigt hög genuttrycksnivå för en av genema kompensera för en lägre genuttrycksnivå för den/de andra genen/generna, och uttrycksmönstret 10 15 20 25 30 35 535 352 16 skulle fortfarande anses matcha. Med genuttrycksmönster menas genuttrycksnivån för generna i en selektion av två eller fler gener.

Matchning av genuttrycksprofiler erhållna från patienten respektive referenspatienten kan till exempel göras med hjälp av hierarkisk klustring av genuttrycksdatat fràn både patient- och referensproverna medelst metoder som är kända inom teknikområdet (set.ex. Eisen et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95:14863-8). Klustringsmetoder är lämpliga för att utvärdera trender i stora datamängder. Oövervakad klusteranalys såsom hierarkisk klusteranalys används med fördel för att detektera grupper eller klasser i datamängder som inte lätt skulle kännas igen genom att bara titta igenom datat. Om patienten, vars tumör ska klassificeras, klustras eller grupperas tillsammans med referenspatienter som är kända för att ha en lågrisktumör, klassificeras tumören hos patienten också som en lågrisktumör. Om patienten, vars tumör ska klassificeras, klustras eller grupperas tillsammans med referenspatienter som är kända för att ha en högrisktumör, klassificeras tumören hos patienten också som en högrisktumör.

Med en högrisktumör menas att tumörsubtypen, såsom den bestämts genom användning av en grupp av patienter med känd tumörsubtyp och känd överlevnad, är förknippad med kortare allmän och/eller cancerspecifik överlevnadstid än en lågrisktumör. Subtypen kan exempelvis definieras som en tumörsubtyp med vissa kliniska parametrar eller med visst uttryck av vissa gener. När man bestämmer om det finns en signifikant skillnad avseende överlevnadstid mellan patienter med kända subtyper och kända överlevnadstider kan man använda beräkning av riskkvot (Hazard ratio), vilket är välkänt inom teknikområdet (Cox DR, J Royal Statist Soc B 1972, 34:187- 220). En risk i en grupp är takten med vilken händelser, såsom dödsfall, inträffar. Risken i en grupp antas vara en konstant andel av risken i den andra gruppen. Denna andel är riskkvoten. Således, om riskkvoten är, med signifikans, högre eller lägre än ett föreligger det en högre risk hos en grupp jämfört med den andra.

Klassificeringen av tumören kan också inkludera fler klasser än högrisk och lågrisk, såsom en eller flera intermediära riskgrupp(er). 10 15 20 25 30 35 536 352 17 Provet från patienten kan vara ett tumörprov, såsom ett tumörprov som erhållits med finnålsaspiration (FNA), nålbiopsi eller genom kirurgi. Alternativt kan provet vara ett blodprov, plasma-, serum-, ryggmärgsvätske-, urin-, sädesvätske-, exsudat- eller ett avföringsprov erhållet från patienten. I synnerhet, kan genuttrycksnivån för lGFBP3 och F3 med fördel bestämmas genom analys av ett blodprov.

Enligt en utföringsform bestäms genuttrycksnivàn för de utvalda generna medelst kvantifiering av mängden RNA eller mRNA som uttrycks från generna.

Mängden RNA eller mRNA kan exempelvis bestämmas genom användning av ett förfarande valt från mlkroarrayteknologi, Northern-blotting och kvantitativ PCR (qPCR), såsom kvantitativ realtids-PCR (qrt-PCR), valbart multiplex PCR, eller någon annan inom teknikområdet känd metod för mätning av genuttryck.

Uppfinnarna har i föreliggande studie exempelvis utvecklat ett enkelt multiplext kvantitativt PCR(q PCR)-förfarande för att mäta uttrycksnivån för ett flertal valda markörgener i finnålsaspirationsprover (FNA-prover) frän prostata. Det utvecklade förfarandet kan även användas för att mäta uttrycksnivåer i vilket tumör- eller blodprov som helst taget från patienten.

En viktig teknisk fördel med detta tillvägagångssätt är att, trots att markörgenerna enligt den föreliggande uppfinningen är identifierade med hjälp av ett stamcellstillvägagångssätt och tros vara viktiga för en cancerstamcellsfunktion, så behöver man inte direkt isolera CSC:erna från tumörproverna. Den enkla och robusta multiplex-qPCR-metoden som etablerats iden föreliggande studien kan appliceras direkt på färska prover från rutinmässiga nålbiopsier eller aspirationscytologi för prediktion av överlevnad och effekt av kastrationsbehandling vid tidpunkten för diagnos. Alla analyserade prover i den föreliggande studien var färskfrusna cytologiska cellutstryk som skulle säkerställa isolering av rena cancercell-RNA-molekyler av hög kvalitet för qPCR-analys. l några fall lyckades dock inte isoleringen av RNA på grund av att för få celler fanns på glasskivorna med FNA-cytologiutstryk. Vid framtida kliniska tillämpningar kan detta problem lätt lösas genom att omedelbart använda färska cellsuspensioner från FNA eller mikrodissekerade tumörprover från nålbiopsier för isolering av RNA. 10 15 20 536 352 18 Eftersom markörgenerna enligt föreliggande uppfinning (F3, lGFBP3, VGLLS, c- MAF, WNT5B och CTGF) kodar för proteiner är det också möjligt att använda immunohistokemi och andra proteinanalytiska metoder för att mäta deras uttryck av protein som en uppskattning eller en funktion av deras genuttryck.

Således kan, enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning, genuttrycksnivån indirekt bestämmas genom mätning av mängden protein som kodas för av nämnda gener. Mängden protein kan exempelvis bestämmas genom användning av metoder såsom ELISA, RlA och masspektrometri, liksom andra inom teknikomràdet kända metoder för proteindetektion.

Fackmannen inser att användbarheten hos den föreliggande uppfinningen inte är begränsad till kvantifieringen av genuttryck av någon särskild variant av markörgenerna enligt den föreliggande uppfinningen. Som icke-begränsande exempel, kan markörgenerna ha kodande sekvenser och aminosyrasekvenser såsom specificeras i Tabell 4.

Ta bell 4 Gen/kodande Protein sekvens sekvens Gen Fullständigt namn SEKV ID NR: SEKV ID NR: lGFBP3 insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 3; 1 11 insulin-like growth factor binding protein 3 F3 koagulationsfaktor lll; coagulation factor lll 2 12 VGLL3 Rudimentärlik 3 (Drosophila); vestigial like 3 3 13 (Drosophila) c-MAF-a lång form av v-maf muskuloaponeurotisk 4 14 fibrosarkom onkogen homolog (aviär); long form of v-maf musculoaponeurotic flbrosarcoma oncogene homolog (avlan) c-MAF-b kort form av v-maf muskuloaponeurotisk 5 15 fibrosarkom onkogen homolog (aviär); short form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avlan) WNT5B wlngless-typ MMTV integrationsplats familj, 6 16 medlem 5B; wingless-type MMTV integration site family, member 5B CTGF bindvävstillväxtfaktor; oonnective tissue growth 7 17 factor EZH2 förstärkare av zestehomolog 2 (Drosophila): 8 18 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) AMACR alfa-metylacyl-CoA-racem as; alpha-methylacyl- 9 19 CoA racemase MUC1 cellyteassocierad mucin 1; mucin 1, cell surface 10 20 associated Enligt några utföringsformer har de cDNA-sekvenser eller aminosyrasekvenser som är minst 85% identiska med eller liknande de listade sekvenserna, såsom 10 15 20 25 30 35 536 352 19 minst 90%. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller åtminstone 99% identiska med eller liknande de sekvenser som är listade i Tabell 4.

Begreppet “Vo-identitet", såsom det används i denna beskrivning, är beräknat enligt följande. Söksekvensen inpassas (alignas) med målsekvensen medelst CLUSTAL W algoritmen (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680 (1994)). En jämförelse görs över ett fönster som motsvarar den kortaste av de inpassade sekvenserna. Den kortaste av de inpassade sekvenserna kan i vissa fall vara mälsekvensen. I andra fall kan söksekvensen utgöra den kortaste av de inpassade sekvenserna.

Aminosyraresterna jämförs i varje positionoch den procentuella andelen av positionerna i söksekvensen som har identiska motsvarigheter i mälsekvensen anges som %-identitet.

Begreppet “°/>-likhet" såsom det används i denna beskrivning, är beräknat pà det följande sätt. lnpassning av sekvenserna och sekvensjämförelsen utförs i grunden pä samma sätt som beskrivet för beräkningen av %-identitet. ”Likhet” bör dock tolkas enligt följande. Två aminosyrarester anses vara liknande om de tillhör samma grupp av aminosyrarester. Icke-begränsande exempel pä grupper av aminosyrarester är den hydrofoba gruppen innefattande aminosyraresterna Ala, Val, Phe, Pro, Leu, Ile, Trp, Met och Cys; den basiska gruppen innefattande aminosyraresterna Lys, Arg och His; den sura gruppen innefattande aminosyraresterna Glu och Asp; den hydrofila gruppen innefattande de oladdade aminosyrorna Gln, Asn, Ser, Thr och Tyr; och den neutrala gruppen innefattande aminosyraresten Gly. Således jämförs aminosyrarester i varje position och procentandelen av positionerna i söksekvensen som har liknande motsvarigheter i mälsekvensen anges som %- likhet.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning för klassificering av en tumör hos en patient som har prostatacancer kan ha rnänga fördelar. Till exempel kan den, enligt en utföringsform av uppfinningen, användas för att prediktera nämnda patients överlevnad. För en patient med en tumör som är klassificerad som en làgrisktumör indikeras det att patienten har en god prognos, medan för en patient som har en tumör som är klassificerad som en högrisktumör indikeras det att patienten har en dàlig prognos. 10 15 20 25 30 35 536 352 20 En dålig prognos för en patient kan betyda att patienten har en minskad sannolikhet för överlevnad eller förkortad överlevnadstid jämfört med en patient som har predikterats att ha en god prognos. En dålig prognos kan även betyda att patienten har en ökad risk för återfall eller metastasering jämfört med en patient med en god prognos. Till exempel kan sannolikheten för femårsöverlevnad hos en patient med en lågrisktumör vara 90% eller lägre, såsom 85%, 80%, 75%, 70%, 60% eller lägre medan sannolikheten för femårsöverlevnad hos en patient med en högrisktumör kan vara 50% eller lägre, såsom 45%, 40%, 30%, 20%, 10% eller lägre. Medianlängden för överlevnad hos patienter med làgrisktumörer kan likaledes vara 6 år eller längre, såsom 7 år, 8 år, 9 år, 10 år eller längre, medan medlanlängden för överlevnad hos patienter med högrisktumörer kan vara 5 år eller kortare, såsom 4 år, 3 år, 2 år, 1 år eller kortare.

Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning kan klassificeringen av en tumör användas för att förbättra prediktion av överlevnad med användning av kliniska parametrar. Uppfinnarna har till exempel visat (Exempel 3C) att när subtypklassificering genom användning av Signatur 1 (VGLL3, |GFBP3 och F3) adderas till konventionella prediktionsmodeller vilka endast nyttjar kliniska parametrar förbättras noggrannheten hos prediktionen signifikant.

Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahålls ett förfarande för att fatta beslut beträffande framtida behandling av patienten, varvid beslutet är beroende på klassificeringen enligt föreliggande uppfinning. Patienter som har en tumör som har blivit klassificerad att vara en högrisktumör behöver mer radikala eller kurativa behandlingar än patienter med lågrisktumörer, och därtill på ett tidigare stadium. Radikal eller kurativ behandling omfattar behandlingskurer valda från prostatektomi, strålning, kemoterapi, kastrering eller en kombination därav. Patienter med tumörer som har klassificerats som lågrisktumörer behöver mindre eller ingen radikal eller kurativ behandling alls, utan kan föreskrivas uppmärksam väntan/“vänta-och se" eller aktiv övervakning.

Enligt vissa utföringsformer av föreliggande uppfinning behöver patienter med begränsad cancer av tumörsubtyp med hög eller intermediär risk, radikala eller kurativa behandlingar utan dröjsmål, medan patienter med begränsad cancer av lågrisktumörsubtyp tryggt kan bli tilldelade uppmärksam väntan med minimal oro eftersom kastrationsbehandling fortfarande kan vara en garanti för långtidsöverlevnad i fall att sjukdomen framskrider. För patienter med cancer 10 15 20 25 30 35 535 352 21 som är framskriden vid diagnos, kan de med lägrisksubtyp ha största möjliga nytta av kastrationsbehandling eller anti-androgenterapi, medan patienter med högrisksubtyp eller intermediärrisksubtyp kan behöva bli behandlade tidigt med kemoterapi eller andra nya terapier.

Enligt en aspekt tillhandahåller uppflnningen vidare ett förefarande för behandling av patienten som har blivit diagnostiserad med prostatacancer, och vars tumör har klassificerats enligt uppfinningen, i enlighet med behandlingsbeslutet som tagits enligt ovan.

Enligt en aspekt tillhandahåller uppfinningen användning av någon av generna lGFBP3, F3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och/eller CTGF eller av proteinerna som kodas därav som prognostisk(a) markör(er) för prostatacancer. Enligt olika utföringsformer av denna aspekt tillhandahåller uppfinningen användning av en kombination av två, tre eller flera av generna IGFBP3, F3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och/eller CTGF eller proteinerna som kodas därav som prognostiska markörer för prostatacancer. En särskilt användbar utföringsform tillhandahåller användning av en kombination av generna IGRBP3 och F3 och, valbart, någon av VGLL3 och c-MAF, eller proteinerna som kodas därav som prognostiska markörer för prostatacancer.

Enligt en aspekt tillhandahåller uppfinningen en fast bärare eller ett kit för klassificering av en tumör hos en patient diagnostiserad med prostatacancer, innefattande nukleinsyrasonder (prober) eller antikroppar som är användbara för bestämning av genuttryck och är specifika för en kombination av minst två av generna lGFBP3, F3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF. Enligt en utföringsform därav, innefattar nämnda fasta bärare eller kit nukleinsyrasonder eller antikroppar som är specifika för IGFBP3 och F3. Enligt en annan utföringsform innefattar den fasta bäraren eller kitet nukleinsyrasonder eller antikroppar som är specifika för lGFBP3 och F3 och endera eller båda av VGLL3 och c-MAF. Enligt ytterligare en utföringsform innefattar den fasta bäraren eller kitet vidare nukleinsyrasonder eller antikroppar som är specifika för EXH2, AMACR och MUC1.

Den fasta bäraren kan vara en array, såsom en cDNA-mikroarray, en polynukleotidarray eller en proteinarray. 535 352 22 Nukleinsyrasonderna för vilken som helst av kit-utföringsformerna kan exempelvis bara valda från sekvenserna som beskrivs i Tabell 6. Sådant kit är särskilt användbart för bestämning av genuttrycksnivåer genom användning av multiplex-PCR, t.ex. multiplex-kvantitativ-PCR. 5 Kitet ka n även in nefatta ytterl iga re reagenser som ä r nödvä nd ig a för mätning en av genuttrycksnivå, som sekundära inmärkta sonder eller affinitetsligander för detektering och/eller kvantifiering av bundna eller ampllfierade nukleinsyror eller antikroppar, beroende på valt förfarande. Sådana märkningar kan också vara 10 direkt bundna med eller kopplade till nukleinsyrasonder eller antikroppar.

Kitet kan vidare innefatta olika hjälpsubstanser för att möjliggöra att kitet kan användas enkelt och effektivt, till exempel lösningsmedel, tvättbuffertar o.s.v.

Vidare ka n kitet företrädesvis äve n inn efatta referen sprover ell er information om 15 referensg en uttrycksn ivåer erhållna frå n patienter med kä nda hög risk- och lågriskstumörer genom användning av samma metod.

Ta bell 6 SEKV SEKV SEKV Gen- Probsekvens ID ID ID symbol (5'-3') NR: Sensprimersekvens (5'-3') NR: Antisensprimersekvens(5'-3') NR: AMACR Cl' GCI GGAG CCCITCCGCCGC 21 CTGTGCAAGCGGTCGGATG 2 2 CACT CAGCCI' GG CATAAATAAGC 23 Cl' GF TGTGTGACGAGCCCAAGGACCAAACC 24 GGAAATG Cl' GCGAGGAGTGG 25 CGTGTCFFCCAGTCGGTAAGC 26 EZH2 ACACGCFFCCGCCAAUAACTGGTCC 27 GCGGGACGAAGAATAATCATGG 28 TGTCl' CAGTCGGATGTACT Cl' G 29 P3 ACAACAG ACACAGAG TGTGACCFCACCGA 30 AGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATG 3 1 CCGTGCCAAGTACGTCT GC 32 lGFBP3 ACCCAGAACI' TCT CCT CCGAGTCCAAGC 33 GACTACGAGTCFCAGAGCACAG 34 Cl' CTACGGCAGGGACCATATTC 35 IG FBP3 ACAG ATACCCAGAACFT CT CCT CCGAGTCCA 36 TACAAAGTTGAGACGAGTCFCAGAG 37 AGTGTGTCTT CCATITCI' Cl' ACGG 38 c-MAF TTITCATAACFGAGCCCACTCGCAAGWGG 39 AGCGACAACCCGTCCT CT C 40 GGCGTATCCCACTGATGGC 41 c»MAF CAATCCATGAGCCAGACACCOXTTCCCT 42 TCGAGWTGTGGTGGTGGTG 43 CFAGCAAGTTATGGAGAAHTCAGATTG 44 c-MAF 'ITTTCATAACTGAGCCCACFCGCAAGTFGG 45 AGCGACAACCCGTCCI CT C 46 GGCGTATCCCACFGATGGC 47 c-MAF TTTTCATAACTGAGCCCACFCGCAAGTTGG 48 AGCGACAACCCGTCCT CTC 49 GGCGTATCCCACTGATGGC 50 M UCI CCCCTCCCCACCCAWTCACUCCA S 1 CGCCTGCCTGAATCTGTTCTG 52 Cl' GTAAGCACT GTGAGGAGCAG 53 VG LL3 AGACAGCTCAGCYCTCTCAAGCCAGC 54 AAAGCAAGATGGGGCTAACCC S5 TCCAAAAGGAAGTTGGGAAACTATTC 56 VG LL3 TGCTGTAGACCTGTATCGAATCCCACGC 57 TGGAGCITTTCATGGAACAGTAG 58 TACCACGGTGATTCCFI' ACT CTT G 59 VG LL3 CT GAATACCGCI' AACTT CTT CT GCI' GGCC 60 CCCCACAGCCTACFATCAGC 61 GACFTCCAGAGAGTCCTGCATC 62 VG LL3 AGACAGCFCAGCI' CT Cl' CAAGCCAGC 63 AAAGCAAGATG GGGCFAACCC 64 GGTCCAAAAGGAAGTTGGGAAAC 65 WNTSB AGCCCTGCGACCGGCCTCGT 66 GGTGCTCATGAACUGCAAAAC S7 AGGCTACGTGGCCATCFTATAC 68 Detal ierad beskrivning av fig urern a Figur 1 illustrerar tillvägagångssättet för identifiering av viktiga kandidat- 20 ESCG P :er i prostataca ncer. A. Stegvis id entifieri n g av ka nd idat-ESCG P : er för prediktering av prostatacancerprognos. B. 19 högt rankade ESCGP:er och 5 10 15 20 25 30 35 536 352 23 kontrollgener valdes ut enligt 4 kriterier såsom beskrivet i Exempel 2A. C.

Uttrycket av dessa 24 gener i prostatacancercellinjer verifierades genom qPCR.

Genuttycksmönstret visualiserades med hjälp av användning av Treeviewmjukvara med gen-mediancentrerade delta-Ct-värden. Nivån av genuttryck ökade frän ljusgrå till svart medan delta-Ct-värdena minskade fràn ljusgrå till svar. Vitt representerar data som saknas.

Figur 2 illustrerar uttrycket av ESCGP:er genom RT-PCR i prostatacancercellinjer såsom beskrivs i Exempel 2B. Uttrycksmönstret för 34 ESCGP:er och 5 kontrollgener (c-MAF, AZGPl, AMACR, MUC1 and EZH2) verifierades med RT-PCR i de tre prostatacancerlinjerna (LNCaP, DU145 och PC3) med 50ng cDNA som mallmolekyl för varje reaktion. G|yceraldehyd-3- fosfatdehydrogenas (GAPDH) användes som intern laddningskontrollgen.

Figur 3 illustrerar verifiering av korrektheten i 4-plex-qPCR genom jämförelse med enkel (singel) qPCR. I en serie av cDNA-spädningsanalyser (cDNA- standardkurvmetoden) jämfördes resultaten av enkel qPCR och 4-plex-qPCR.

De optimerade förhållandena för 4-plex-qPCR definierades som de som gav det resultat som var mest likt resultatet av enkel qPCR.

Figur 4A-k visar resultattabeller från multlvariat analys som gjordes för att identifiera markörgener som visar korrelation med överlevnad oberoende av alla kliniska parametrar (se Exempel 3A).

Figur 5 illustrerar tumörsubtypsklassificering för ett träningsset av patienter genom ESCGP-signatur 1 och ESCGP-signatur 2. I träningssetet hade 28 av 36 FNA-prover uttrycksdata för de fyra signifikanta generna (F3, IGFBP3, VGLL3 och c-MAF-a). En serie av klusteranalyser av olika genkombinationer visade att tvä genkombinationer eller signaturer på ett likartat sätt kunde klassificera prover i tre subtyper med hög korrelation med överlevnad. Den första (ESCGP- signatur 1) inkluderade F3, IGFBP3 och VGLL3 och den andra (ESCGP- signatur 2) inkluderade F3, IGFBP3 och c-MAF-a. Genuttrycksnivån ökar med minskande ACt-värde.

Figur 6 illustrerar skillnader i överlevnad mellan tumörsubtyper klassificerade med hjälp av ESCGP-signatur 1 (F3, IGFBP3 och VGLL3). A. FNA-prover från 95 patienter klassificerades in i tre tumörsubtyper eller grupper (Grupp 1, Grupp 10 15 20 25 30 35 535 352 24 2 och Grupp 3) med hjälp av ESCGP-signaturl (F3, lGFBP3 och VGLL3) såsom beskrivs i Exempel 3B. Varje patients kliniska parametrar är representerade såsom visas av olika rutor. Tomma rutor representerar längre överlevnad, lägre PSA-nivå, begränsat kliniskt stadium respektive högt/medelhögt differentierad tumörgrad. Rutor med olika ifyllnad representerar kortare överlevnad, högre PSA-nivå, framskridet kliniskt stadium, lågt differentierad tumörgrad. Nivån av genuttryck ökar med minskande ACt-värde.

B. Analys av allmän och cancerspecifik överlevnad hos tre undergrupper visas med Kaplan-Meier-kurvor. C. Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patienter med PSAS50ng/ml vid diagnos. D. Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patienter med en ålder av 573 vid diagnos. E och F är statistiska låddiagram som visar skillnad i överlevnad mellan de tre subtyperna eller grupperna. Ändarna hos lådorna är 25:e och 75:e kvartiler och linjen genom mitten av lådan visar medianvärdet med 95% konfidensintervall (Kl). P-värdena beräknades med hjälp av t-test och de p-värden som är markerade med en stjärna var av statistisk signifikans.

Figur 7 illustrerar klassificering av tumörsubtyp hos hela patientgruppen med hjälp av ESGCPsignatur 2. Samma 95 FNA-prover klassificerades i tre huvudtumörsubtyper eller grupper (Grupp 1, Grupp 2 och Grupp 3) med hjälp av signatur 2 (F3, IGFBP 3 och c-MAF-a). Genuttrycksnivån ökar med minskande ACt-värde.

Figur 8 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patientgrupper som definieras med hjälp av PSA, ålder, kliniskt stadium och tumörgrad. A. 87 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data avseende PSA i serum vid diagnos samt överlevnad. Patienterna delades in i två grupper, den ena med PSA>50ng/m| och den andra med PSAs50ng/ml. B. 92 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data avseende ålder vid diagnos samt överlevnad. Patienterna delades in i två grupper, den ena med ålder s 73 år och den andra med ålder > 73 år. C. 89 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data beträffande kliniskt stadium och överlevnad. Patienterna delades in i två grupper baserat på kliniskt stadium, den ena med begränsat stadium (TsT2 och NO och M0 och PSAs100ng/ml) och den andra med framskridet stadium (T>T2 eller N1 eller M1 eller PSA>100 ng/ml). D. 92 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data beträffande tumörgrad och överlevnad. Patienterna delades in i två grupper, en med lågt differentierad 10 15 20 25 30 535 352 25 cancer och den andra med högt eller medelhögt differentierad cancer information. Alla p-värden beräknades med Log-rang testmetoden.

Figur 9 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyper som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur 1, hos patienter inom samma grupp definierad med hjälp av kliniska parametrar. Av de 95 patienterna i Figur 6, uppvisade 48 av de 95 patienterna PSAs50 ng/ml, 39 uppvisade PSA>50 ng/ml (B), 40 var av en ålder s73 (C), 52 var av en ålder >73 (D), 38 uppvisade begränsat stadium (E), 51 uppvisade framskridet stadium (F), 39 hade högt eller medelhögt differentierad cancer (G) och 53 hade lågt differentierad cancer (H). Patienter inom gruppen med samma kliniska parametrar kunde alltjämt klassificeras med ESCGP-signatur 1 (F3, IGFBP3 and VGLL3) i högrisksubtyp (Grupp 1), intermediärriskgrupp (Grupp 2) och lågrisksubtyp (Grupp 3) med tydligt skild överlevnad. Övre och nedre del av varje panel visar allmän respektive cancerspecifik överlevnad. Log-rangtestet användes för att beräkna signifikans eller p-värde för skillnaden i överlevnad mellan subtyperna eller grupperna.

Figur 10 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyperna som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur 1 hos patienter primärt behandlade endast med kastrationsbehandling. Av de 95 patienterna i Figur 6 erhöll 65 kastrationsbehandling som den primära behandlingen. En tydlig skillnad iöverlevnad mellan de tre tumörsubtyperna klassificerade enligt ESCGP-signatur 1 kunde observeras.

Figur 11 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyperna som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur1 hos patienter som primärt endast behandlats med kastrationsterapi och inom samma grupp som definierats med hjälp av kliniska parametrar. Av de 95 patienterna i Figur 6 erhöll 65 kastrationsterapi som den primära behandlingen. Av dessa 65 patienter, uppvisade 29 PSAS5O ng/ml (A), 37 uppvisade PSA>50 ng/ml (B), 24 var av en ålder S73 (C), 41 var av en ålder >73 (D), 22 uppvisade begränsat stadium (E), 44 uppvisade framskridet stadium (F), 26 uppvisade högt eller medelhögt differentierad cancer (G) och 39 uppvisade lågt differentierad cancer (H). Tydlig skillnad i överlevnad kunde alltjämt observeras mellan högrisk- 10 15 20 25 30 535 352 26 (Grupp 1) och lägrisksubtyp (Grupp 3) hos patienter inom samma grupp av kliniska parametrar.

Figur 12 illustrerar prediktion av överlevnadstid med hjälp av parametrisk modell. Prediktion av överlevnadstid modellerades genom användning av den parametriska modellen med antagandet om Weibulls fördelning. A. Allmän (vänster del) och cancerspecifik (höger del) överlevnad predikterades med hjälp av kliniska parametrar inklusive PSA (>50 ng/ml vs. 550 ng/ml), kliniskt stadium (framskridet vs. begränsat), tumörgrad (lägt vs. högt + medelhögt differentierad) och älder vid diagnos. B. Allmän (vänster del) och cancerspecifik (höger del) överlevnad predikterades med hjälp av kliniska parametrar tillsammans med tumörsubtyper eller grupper klassificerade med hjälp av ESCGP-signatur 1. Y- axeln representerar den faktiska överlevnadstiden medan X-axeln representerar den predikterade överlevnadstiden. Överlevnad i 5 är och 8 är är markerade l respektive grafer för förenklad tolkning. C. Tabellen presenterar uppskattad förbättring av överlevnadsprediktion genom att lägga till parametrar frän klassificeringen av tumörsubtyp med hjälp av ESCGP-signatur 1. D. Tabellen representerar bidrag frän ESCGP-signatur 1 respektive frän kliniska parametrar för prediktionen av allmän och cancerspecifik överlevnad.

Exempel Allmänna metoder Bioinformatikanalys Bioinformatikanalys för identifiering av embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGP:er) har beskrivits tidigare (WO 2008/013492 A1). Kortfattat hämtades genuttrycksdataset frän tidigare publicerad cDNA-mikroarray frän Stanford Microarray Databasen (SMD, http://smd.stanford.edu/). Kriterierna som användes för att hämta in data var som följer: Gen-/punkt(spot)selektion: alla gener eller kloner pä arrayer selekterades, kontrollpunkter och tomma punkter inkluderades inte.

Datakollaps and inhämtning: raddata inhämtades och medelvärdesberäknades med SUlD; UlD-kolumnen innehåller NAMN. 10 15 20 25 30 536 352 27 lnhämtat data: Log(bas2) av R/G Normaliserad Kvot (Medelvärde).

Valda datafilter: Punkt är inte flaggad av experimentatorn.

Datafilter för GENEPIX resultatset: Kanal 1 Medelintensitet I Median Bakgrundsintesitet > 1.5 OCH normaliserad Kanal 2 (Medelintensitet / Median Bakgrundsintensitet) > 1.5.

För att genomföra oövervakad hierarkisk klusteranalys av medelkoppling användes programmet Cluster (version 3.0) och programmet TreeView användes för att visualisera klusterresultatet (Eisen et al, Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95:14863-8). SAM (signifikant analys av mikroarrays) utfördes såsom tidigare beskrivet (Tusher et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 9815116-21).

Datacentrering av lnhämtat cDNA-Mikroarray Dataset: cDNA-mikroarraydatat från 5 humana ESC-linjer (Sperger et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100113350-5) och 115 humana normala vävnader från olika organ (Shyamsundar et al, Genome Biol 2005, 6:R22) inhämtades fràn SMD enligt ovan beskrivna parametrar. Datamängden delades in i undergrupper enligt olika arrayomgàngar. Generna centrerades inom varje arrayomgäng genom användning av gencentreringsfunktionen hos programmet Cluster.

Undergrupperna kombinerades äter och arrayer centrerades genom användning av arraycentreringsfunktionen hos programmet Cluster. Efter centreringen sparades datamängden och konverterades till Excel-format.

Prostatacancercellinjer Tre prostatacancercellinjer LNCaP, DU145 och PC3 köptes in från the American Type Culture Collection (ATCC). Cellodling genomfördes med medium och metoder enligt instruktion från ATCC. LNCaP, DU145 och PC3 celler upprätthålls med lscove's Modified Du|becco's Medium (lMDM, Kat Nr. 21980-032, lnvitrogen) kompletterat med 10% Fetalt Kalvserum (Kat Nr. 10082- 147, lnvitrogen) och 50 enheter/ml och and 50 ug/ml Penicillin/Streptomycin (Kat Nr.15140-163, lnvitrogen). 10 15 20 25 30 535 352 28 FNA -prover FNA-prover (finnålsaspiration) från prostata togs enligt rutinmässigt tillvägagångssätt för cytologidiagnos vid Institutionen för Klinisk Cytologi och Patologi, Karolinska Sjukhuset, Stockholm, Sverige. FNA-prover erhölls från 241 patienter vid tidpunkten för diagnos före någon behandling. Minst ett färsk cytologiutstryk fràn varje patient Giemsa-infärgades för klinisk cytologidiagnos.

Kvarvarande dubbletter av färska utstryk överfördes till frys och hölls färskfrysta vid -80°C tills isoleringen av RNA-prover. De flesta FNA-cytologiutstryken med prostatacancerdiagnos uppskattades att innehålla mer än 80% tumörceller på grund av den välkända selekteringseffekten att aspirationsprovtagningsförfarandet kan anrika cancerceller på grund av deras minskade cellvidhäftning. Av de 241 patienterna, var isoleringen av RNA av god kvalitet från 193 patienter lyckad. Av dessa diagnostiserades 189 med prostatacancer medan 4 hade inte prostatacancer.

Kliniska särdrag hos gruppen Totalt analyserades färskfrysta FNA-prover från 189 prostatacancerpatienter i föreliggande studie. Dessa 189 patienter diagnostiserades mellan åren 1986- 2001. Alla de 189 patienterna hade kliniska symptom som ledde fram diagnosen prostatacancer. Under övervakning av en onkolog, samlade en praktikantläkare in relevant kliniskt data såsom ålder vid diagnos, diagnosdatum, cytologi- och biopsidiagnos, PSA i serum vid diagnos, kliniskt stadium, primär behandling osv. Tabell 5 visar detaljer beträffande kliniska särdrag hos dessa 189 patienter.

Data avseende diagnosdatum, dödsdatum och dödsorsak för alla patienterna erhölls först från regionala och nationella register och verifierades sedan med hjälp av tillgängliga läkarjournaler i original. Datumet för censurering av data var 31 december 2008. Vid denna tidpunkt var 22 av de 189 patientema fortfarande vid liv, 163 hade avlidit och 4 saknade data i registren. Prostatacancerspecifik död definierades som att den primära eller sekundära dödsorsaken var prostatacancer eller metastaser. Dödsfall av andra orsaker definierades som att de primära och sekundära dödsorsakerna inte var prostatacancer eller 536 352 29 TABELL 5 Tamil 5. Kllnlslta sdrdrag hos patienterna.

Kliniskt Siad:urr-_ Antal (är) X Fram salvia! 'i Iš -14-'1 ti) Esegransaz 19-139 4) Saknas 4 WHO Tumcrgracl; Antal -1 MQ Låg! (4 (35 ti) lï-*iadeêltögt f Högt Saknas O Behandlir-g Antal fií-ç H Rudlkztå prosšnleklcnxi 'l 3 j Strålning 5 :16 t j Harman .' Ar-tetšo testis 'ifs (C11 J; Ašdng nshan-:llad f: :'19 4) Saknas f ss :nn 7; 31 (393) 4 (43) *li 113137 62 176.52 4 44.9) 7 särdrag Träningssot Validoréngssot 1 Vallderíngsset 2 Komplett sot F anmäl sn=|ui:'at|nns1_'F HA i-rrrover Genprefilerad FNA Anšaš Ne) 33- (#5 88 '189 firterliai) överlevt-rad (EVIin-PJEax; år -jü 07-17 80) 4 00 (i) ill-l S- 67) 4 '32 (Oil 55,08) 4 3? (ü (1117 SU) Prostataspeciíië: dtid, Arial íäâl 13 (343. áü (61 -15 (5131) 961518) Atinan G66. Antal (Wei '59 11522) .'11 :'32 3) fäâflj G5 íßšfitj Levande, Arltvl fika) 3 (3,3) 3:11 'lb 518,2) 22%: 1 .Ej fisaknas. Alvar (si) = :z a.) -r gifn 12.3; 4 (2 i, Ålder är ^ h-ïedelàhzler, tär 70.427 t* 71* 'li-S 7 7: 81-8 ü 71' 6:8 7 Saknas 1 'I '2 4 PSA-nivå irlgfltzli, Anten äts) t *Säll '50 (2357) 23 (434) 35 (4333) 88 142.3) ífvüí) 'i 13-3 3,! 30 (56 E) 45 155.3) 83 (E15) Sæzknav; 9- 'l 2 8 2?- rus :så ts;- 79 í-iöflijl 99 ifvlf-.Si 21812465; 81A 7) 'IB 110.5) :fil-t 177.9) 129m metastaser. Dessa fall inkluderade även patienter som avled av sjukdomar eller tillstànd som kunde förvärras på grund av prostatacancer eller vara relaterade till bieffekter och komplikationer av behandlingar.

Samtliga 189 patienter uppvisade kliniska symptom som ledde till digital undersökning av rektum, PSA-tester och påföljande FNA av prostata. Vid framskriden sjukdom var kastrationsbehandling den enda primära behandlingen för de flesta patienter (77,9%). 10 15 20 536 352 30 Isolering av RNA AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Kat Nr.80204, QIAGEN) användes för isolering av total-RNA fràn prostatacancercellinjer. RNAqueous®-Micro Kit (Kat Nr.1931, Ambion) för isolering av total-RNA mindre än 100 ng användes för att isolera total-RNA från färskfrysta FNA-prover från prostatacancerpatienter. Kvantitet och kvalitet av RNA kontrollerades genom användning av Agilent RNA 6000 Nano Kit (Kat Nr.5067-1511, Agilent) på en 2100 RNA Bioanalyzer (Agilent).

RNA-prover med ett RNA-integritetsnummer (RIN) större än 7 ansågs vara kvalificerade. I föreliggande studie isolerades kvalificerat total-RNA från 193 av de 241 FNA-proverna för vidare syntes av cDNA och kvantivativ-PCR-försök (qPCR).

RT-PCR För reaktioner med omvänd transkription (RT), utfördes syntes av cDNA för PCR (polymeraskedjereaktion) med hjälp av Cloned AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit (Kat Nr. 12328-032, lnvitrogen) enligt tillverkarens anvisningar.

För omvänd transkription (RT) användes maximalt 2 pg total-RNA i en reaktionsvolym av 20 ul. Uttrycksmönstret för 33 ESCGP:er och 5 kontrollgener validerades med hjälp av RT-PCR i prostatacancercellinjer med genspecifika primerpar (Figur 2). 50 ng cDNA användes till varje reaktion och försöket upprepades tre gånger. Konventionella metoder användes för design av primrar och förhållanden för PCR-cykling. 4-plex kvantitativ realtids-PCR Syntes av första strängen av cDNA för kvantitativ PCR (qPCR) kördes med ett QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Kat Nr. 205311, QIAGEN). För varje qPCR användes upp till 1 ug total-RNA i en 20 ul reaktionsvolym. Reaktionen kördes på en ABl 7500 real time cycler som i realtid simultant kunde följa densiteten för fyra olika fluorescerande färgämnen (4-plex). Ingen passiv referens valdes vid denna kombination av fyra färgämnen. Förhållandena för 4- plex-qPCR var 1 cykel vid 50°C i 2 minuter; 1 cykel vid 94°C i 10 minuter; 40 cyklar vid 94°C i 1 minut och 1 cykel vid 60°Ci 1.5 minut. Fast baslinjestartvärde 10 15 535 352 31 och slutvärde valdes för analys av Ct-värden (Schmittgen and Livak, Nat Protoc 2008, 3:1101-8; Wittwer et al, Methods 2001, 25:430-42).

Optimering av 4-plex kvantitativ realtids-PCR En 4-plex-qPCR innehåller fyra par av genspecifika primers och fyra genspecifika Taqman-sonder varav varje dubbelinmärkts med en flourofor vid 5'-änden och en släckare (quencher) vid 3'-änden. I vår studie användes Cy5, FAM, Texas Red och VIC för inmärkning av 5'-änden medan BHQ-3, BHQ-1, BHQ-2 och TAMRA användes som 3'-släckare. De fyra olika kombinationerna av fluorofor-släckar-par möjliggjorde specifik detektion av PCR-produkter från de 4 olika generna. Totalt designades 45 predikterade 4-plex-sonder och 24 primerpar med Beacon Designer 7.0 mjukvara (Primer Biosoft) för de 19 ESCGP:erna och 5 kontrollgenerna. Sekvensinformation avseende sonder och primers för generna enligt föreliggande uppfinnings visas i Tabell 6.

För att validera huruvida 4-plex-qPCR har samma specificitet och effektivitet som singel-sonds-qPCR, användes cDNA-standardkurvmetoden. cDNA från totalt RNA som renats från LNCap-, DU145- och PC3-celler späddes till en koncentrationsserie på 10 pg, 100 pg, 1000 pg, 10000 pg, 100 000 pg och användes som mall för både singel-sonds-qPCR och 4-plex-qPCR.

Standardkurvor görs baserat på Ct-värdet för varje sond och mängden cDNA.

Lutnings- och r-värdena för cDNA-standardkurvorna härledda från singel-sonds- qPCR och 4-plex qPCR för samma gen jämfördes. Optimering av koncentrationer av sonder och primerpar utfördes tills det inte fanns någon signifikant skillnad i dessa värden mellan singel-sonds- och 4-plex-qPCR.

Dessa resultat visar att 0,2 uM sonder och 0,2 uM primerpar var de bästa koncentrationerna för 4-plex-qPCR. Validering av resultaten för 4-plex-qPCR presenteras i Figur 3.

Normalisering och centrering av Ct-värde från resultat av qPCR Ct (cykeltröskel) är ett mätt på antalet PCR-cykler (i realtids-PCR) som krävs för att erhålla en fluorescerande signal eller tillräckligt med PCR-produkt. l föreliggande studie genererades Ct-värdet för en gen i ett prov efter realtids- 10 15 20 25 30 535 352 32 PCR genom användning av 7500 mjukvara (version 2.0.5, ABI). För att normalisera Ct-värdena för varje gen, beräknades delta-Ct-värdet enligt en ekvation ACt=Ctgenx-CtGAr>oH där Ctgenx var Ct-värdet för genen som analyseras och CtGApDH var Ct-värdet för basgenen GAPDH (glyceraldehyd-3- fosfatdehydrogenas) (Schmittgen and Livak, Nat Protoc 2008, 311101 -8; Wittwer et al, Methods 2001, 252430-42). Därmed normaliserades uttrycksnivän för varje gen i provet med uttrycksnivän av GAPDH. ACt-värdet var omvänt korrelerad med genuttrycksnivän. Varje panel av 4-plex-qPCT innehåller en specifik GAPDH sond respektive. Prover med svaga signaler uteslöts frän analys (Ct-värde hos GAPDH >28). Ct-värdet sattes till 40 (sattes som det maximala Ct-värdet) för prover med svaga signaler för gener som ska analyseras. Delta-Ct-värdet för gener i alla prov centrerades genom användning av genmediancentreringsfunktionen hos ett Clusterprogram (version 3.0) (Eisen et al, Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95:14863-8). Det centrerade delta-Ct- värdet användes för statistiska analyser.

Statistisk analys av överlevnadskorrelation Allmän överlevnad och prostatacancerspecifik överlevnad användes som respektive slutpunkter i överlevnadsanalys för korrelationen med molekylära och kliniska parametrar. Överlevnadstid definierades som tiden frän datumet för diagnos till dödsdatumet och användes som en kontinuerlig variabel. För förenklad tolkning definierades läng, intermediär och kort Överlevnadstid som >8, 5-8 respektive <5 är. För patienter som primärt behandlats endast med kastrationsbehandling definierades ledtiden före behandling som tiden frän datumet för diagnos till det datum kastrationsbehandlingen påbörjades och användes som en kontinuerlig variabel. Det centrerade delta-Ct-värdet för varje gen, älder vid diagnos och serumnivä av PSA vid diagnos användes som kontinuerliga variabler. Med oövervakad hierarkisk klusteranalys klassificerades prov i tre grupper eller subtyper och grupperingen användes som en ickekontinuerlig variabel. Även PSA analyserades som en icke-kontinuerlig variabel med tvä kategorier s50 ng/ml eller >50 ng/ml. WHOs tumörgrad integrerades in i tvä kategorier: högt-medelhögt differentierad eller lägt differentierad. Det kliniska stadiet integrerades in i tvä kategorier: framskriden 10 15 20 25 535 352 33 (vilken som helst av TzT3 eller N1 eller M1 eller PSAzi 00 ng/ml) eller begränsad (T multivariat analys av proportionell riskkvot enligt Cox och Cox-regression ufördes med Stata statistikmjukvara (Version 10.1, StataCorp LP). Kaplan- Meyer-analys så väl som statistiska blockdiagram utfördes med JMP® statistikmjukvara (version 8.0.1, SAS Institute lnc.).

Utformning av studie Studien utfördes i tre steg: 1) identifiering av en embryonal stamcellsgenprediktorsignatur (ESCGP- signatur) med 641 gener. 2) selektion av en delmängd av viktiga kandidatgener från ESCGP-signaturen för klassificering av prostatacancersubtyper och optimering av multiplex- qPCR i prostatacancercellinjer. 3) verifiering av den kliniska betydelsen genom mätning av uttrycksnivåer för dessa selekterade gener i F NA-prover från prostatacancerpatienter med 7- 20 års överlevnadsdata.

Detta resulterade i identifikationen av en delmängd av genmarkörer som visar en signifikant korrelation med antingen allmän eller cancerspecifik överlevnad.

Exempel 1. Identifiering av en ESCGP-signatur En ESCGP-signatur för klassificering av olika typer av cancer identifierades såsom beskrivs i patentdokumentet WO 2008/013492 A1. ln korthet inhämtades tidigare publicerade dataset av microarraydata för helgenom-cDNA, härlett från 5 humana ESC-linjer och 115 humana normala vävnader från olika organ, från Stanford Microarray Database (SMD) enligt ovanbeskrivna parametrar. Datacentrering av de inhämtade dataseten genomfördes också som beskrivs ovan. Dataset från normal vävnad användes för att underlätta centrering av data. Efter centrering isolerades subdatasetet för ESC-linjer från 10 15 20 25 30 535 352 34 hela datasetet. En enklass-SAM utfördes med enbart detta ESC-liniedataset, genom vilken alla gener rangordnades enligt hur konsekvent deras uttrycksnivåer var över de 5 ESC-linjerna. Genom att använda ett q-värde 50.05 som gränsvärdeidentifierade analysen 328 gener med konsekvent höga och 313 med konsekvent låga uttrycksnivåer i ESC:erna. De 641 generna benämndes embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGP:er.) Exempel 2A: Selektion av viktiga ESCGP-kandidater i prostatacancer.

Från listan av 614 ESCGP:er valdes en delmängd på 33 ESCGP:er liksom 5 kontrollgener ut som kandidater som kan möjliggöra klassificering av prostatacancer med användning av färre ESCGP:er. Kandidaterna valdes enligt fyra kriterier (se figur 1B); i) position i rangordning i genlistan på 641 ESCGP (benämnd "ESCGP-listan" i figur S1 B); ii) position i rangordningen i genlistan som identifierats av Lapointe et al (Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 1011811- 816) innefattande signifikanta gener för klassificering av subtyper av prostatacancer (betecknade "PCa vs. PCa" i figur 1B); iii) position i rangordningen i genlistan som identifierats av Lapointe et al (Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101:811-816) innefattande signifikanta gener som särskiljer mellan prostatacancer och normal vävnad (betecknade "Normal vs. PCa" ifigur 1B); och iv) gener från tidigare viktiga publikationer (Lapointe et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101:811-816; Varambally et al, Nature 2002, 419:624-629; Rubin et al, JAMA 2002, 287:1662-70). I figur 1B markerades generna med "1" om närvarande och "O" om inte närvarande i de respektive genlistorna. Således uppfyllde vissa gener alla fyra kriterier, medan andra generna uppfyllde 1-3 av de fyra kriterierna. AZGP1, c-MAF, AMACR, MUC1 och EZH identifierades inte i listan av ESCGP:er men inkluderades som viktiga kontrollgener eftersom de befunnits ha betydelse i prostatacancer vid tidigare studier. Ett fåtal gener som c-MAF har olika RNA-transkript ((http:llvwuw.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4094).

Primers och sonder designades att målinriktas mot dessa respektive olika RNA- transkript. 10 15 20 25 30 535 352 35 Exempel 2B: verifiering av uttryck av de selekterade genema i prostatacancercellinjer.

Uttryck av de 33 selekterade ESCGP:erna och 5 kontrollgenerna i tre olika prostatacancercellinjer validerades med RT-PCR som använde genspecifika primerpar (se Figur 2). Cellinjerna som användes för analys var LNCap, viken är härledd från en mindre aggressiv cancer, samt DU145 och PC3, båda härledda från aggressiva cancerformer. Av de 38 analyserade genema hade 14 likartat uttryck i alla tre cellinjer och ansågs mindre sannolikt vara värdefulla för tumörklassificering. De återstående 24 generna hade olika uttrycksmönster i den mindre aggressiva cellinjen LNCap och de aggressiva cellinjerna DU145 och PC3, och ansågs således mer sannolika att vara användbara för tumörklassificering för att skilja mellan mindre aggressiva och mer aggressiva cancerformer. Således valdes totalt 24 gener (25 genmarkörer) ut för optimering av muItipIex-qPCR och utvärdering av förmåga att klassificera prostatacancer.

Exempel 3A: Fokuserad genuttrycksprofilering av FNA-prover från prostatacancer och identifiering av signifikanta ESCGP:er som korrelerar med överlevnad.

Uttryck av de 24 generna (25 genmarkörerna) analyserades i finnålsaspirationsprover (FNA-prover) från 189 prostatacancerpatienter med hjälp av multiplex-qPCR och analyserades sedan för korrelation med överlevnadsdata. Kliniska särdrag hos patientgruppen så väl som den statistiska analysen beskrivs ovan.

Alla kandidatgener kunde inte analyseras i varje FNA-prov på grund av för liten mängd av total-RNA i de flesta FNA-prover. För att kompromissa för denna begränsning delades gruppen på 189 patienter in i tre delar enligt tidsordningen av experimentet. De tre delarna innehöll prover från 36, 65 respektive 88 patienter (Tabell 5). Enbart gener som uppvisade signifikant korrelation med överlevnad i den första delmängden inkluderades, tillsammans med nya kandidatgener, i efterföljande delmängder. Överlevnadsanalys utfördes i var 10 15 20 25 30 535 352 36 och en av de tre delmängderna liksom i den slutliga kompletta gruppen (Tabell 1, Figur 5-7). Denna kompromissade screeningprocess säkerställde upptäckten av de mest signifikanta genmarkörerna men kan missa ett fåtal genmarkörer med mer blygsam signifikans.

Analys av korrelation med överlevnad utfördes både för kända kliniska parametrar hos patienterna och för genuttryck av de selekterade kandidatgenerna. Vid envariat analys visade alla kliniska parametrar signifikant korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad (Tabell 1). Tio av de 25 genmarkörerna, F3 (koaguleringsfaktor lll; coagulation factor lll), WNT5B (wingless-typ MMTV integrationsplats familj, medlem 5B; wlnglesstype MMTV integration site family, member 5B), VGLL3 (rudimentärfik 3 (Drosophila); vestigial like 3 (Drosophila)), CTGF (bindvävnadstillväxtfaktor; connective tissue growth factor), IGFBP3 (insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 3; insulin- like growth factor binding protein 3), c-MAF-a (lång form av v-maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); long form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), c-MAF-b (kort form av v-maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); short form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), AMACR (alfa-metylacyl-CoA racemas; alpha-methylacyl-CoA racemase), MUC1 (cellytesassocierad mucin 1 ; mucin 1, cell surface associated) och EZH2 (förstärkare av zestehomolog 2 (Drosophila); enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila)) uppvisade signifikant korrelation med antingen allmän och/eller cancerspecifik överlevnad (Tabell 1). Ett p-värde < 0,05 anses signifikant genomgående genom studien. Uttrycksnivåerna (omvänt korrelerade till delta- Ct-värdet) för alla signifikanta gener utom EZH2 visade positiv korrelation med överlevnadstid (värde <1 i Tabell 1).

Var och en av de 10 genmarkörerna med signifikant korrelation med överlevnad enligt envariat analys analyserades tillsammans med kliniska parametrar som inkluderar älder vid diagnos, två-kategori PSA, tumörgrad samt kliniskt stadium med multivariat analys (Figur 4A-K). Multivariat analys indikerar hur mycket signifikansen av genvariabeln påverkas av kliniska parametrar. Antalet patienter som inkluderades iden multivariata analysen var mindre än det i den envariata 10 15 20 25 30 536 352 37 analysen på grund av att data för olika parametrar saknades.

Sammanfattningsvis uppvisade 4 gener (F3, IGFBP3, CTGF och AMACR) korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad oberoende av alla kliniska parametrar. Alla fyra generna utom AMACR var från listan med ESCGP:er. Två gener (WNT5B och EZH2) uppvisade oberoende korrelation med cancerspecifik överlevnad och en gen (VGLL3) uppvisade oberoende korrelation med allmän överlevnad.

Exempel 3B: ldentifiering av signifikanta ESCGP-signaturer som korrelerar med överlevnad.

För att studera möjliga additiva effekter eller synergieffekter av flera gener i prediktionen av överlevnad, provade uppfinnarna olika kombinationer av de tio signifikanta generna i en serie av oövervakade hierarkiska klusteranalyser, med användning av data från patienter i det första setet (träningssetet). Två signaturer kunde på ett likartat sätt klassificera tumörer i tre undergrupper eller subtyper med signifikant skillnad i allmän och cancerspecifik överlevnad (Figur 5). Den första ESCGP-signaturen (Signatur 1) inkluderar markörgenerna VGLL3, IGFBP3 och F3. Den andra ESCGP-signaturen (Signatur 2) inkluderar markörgenerna c-MAF-a, IGFBP3 och F3. Klassificeringen av tumörsubtyp med hjälp av respektive signatur bekräftades genom användning av data från patienter i hela gruppen (Figur 6 och 7).

ESCGP-Signatur 1 (VGLL3, IGFBP3 och F3) uppvisade bättre resultat än ESCGP-Signatur 2 (c-MAF-a, IGFBP3 och F3) (Tabell 2 och 3). Av de 189 patienterna hade 87 data för både alla kliniska parametrar och för subtypsklassificering enligt Signatur 1. Multivariat analys för allmän och cancerspecifik överlevnad visade att subtypsklassificiering med Signatur 1 var den mest signifikanta parametern och oberoende av ålder, PSA-nivå, tumörgrad och kliniskt stadium (Tabell 2).

Medianen för allmän överlevnad var 2,60 år för högrisksubtypen, 3,85 år för den intermediära risksubtypen och 7,98 år för lågrisksubtypen (Figur 6E), motsvarande en riskkvot på 5,86 (95% Kl 2,91-11,78, P<0,001)för högrisk- och 10 15 20 25 30 535 352 38 3.45 (95% Kl 1,79-6,66, P<0,001) för den intermediära subtypen över lågrlsksubtypen (Tabell 3). Skillnaden i allmän överlevnad tillskrevs både cancerspecifik och icke-cancerspecifik överlevnad (Figur 6E).

Intressant nog var medianöverlevnadstiden för ospecifika dödsfall 3,54 år för högrisk-, 3,70 årför intermediära risk- och 7,98 år i lågrlsksubtypen. inom fem år efter diagnos var andelen dödsfall som inte var direkt orsakade av prostatacancer endast 4/31 (12,9 %) i lågrlsksubtypen jämfört med 9/31 (29%) i högrisksubtypen respektive 9/32 (28%) i den intermediära risksubtypen. Av de tre fallen med kortast överlevnadstid i lågrlsksubtypen (symboliserade punkter), behandlades PC39 och PC140 aldrig efter prostatacancerdiagnos och dog av andra sjukdomar, och PC234 diagnostiserades vid 81 års ålder, behandlades bara med kastrationsbehandling och dog av prostatacancer.

Vidare visade Kaplan-Meier kurvor tydlig överlevnadsskillnad mellan de tre subtyperna klassificerade med tumör-ESCGP-Signaturen 1. Allmän överlevnad hos högrisksubtyp (Grupp 1), intermediär risksubtyp (Grupp 2) och lågrisksubtyp (Grupp 3) var 20 %, 40 % respektive 80 % vid 5 år och 10,3 %, 25,0 % respektive 64,4 % vid 8 år. Överlevnadsskillnaden mellan högrisk- och lågrisksubtypema var mycket mer imponerande än resultaten med vilka som helst kliniska parametrar och observerades inom varje patientgrupp eller blev ännu mer tydlig inom samma patientgrupp definierad med PSA, kliniskt stadium, tumörgrad eller ålder (Figur 6C-D).

Till exempel hade 48 av 92 patienter serumnivåer av PSA s 50 ng/ml vid diagnos. Av dessa 48 patienter var allmänna överlevnaden vid 8 år 21 ,4% för högrisksubtypen, 47,1 % för den intermediära risksubtypen respektive 76,5 % för lågrlsksubtypen. Mest imponerande var 40 av 92 patienter vid en ålder av 573. Av dessa 40 unga patienter var allmänna överlevnaden vid 8 år 7,1 % för högrisksubtypen, 44,4 % för den intermediära risksubtypen respektive 88,2 % för lågrlsksubtypen. Dessutom sågs även skillnaden i överlevnad mellan de klassificerade grupperna hos patientgrupper som endast behandlats med kastrationsbehandling (Figurer 6-11). 10 15 536 352 39 Exempel 3C: Förbättrad prediktion av överlevnad genom att lägga till ESCGP- Signaturen till kliniska parametrar.

Parametrisk modell användes för överlevnadsprediktion för att uppskatta hur mycket subtypsklassificering med signaturen med VGLL3, |GFBP3 och F3 (Signatur 1) kunde förbättra predlktion med användning av samtliga kliniska parametrar (Figur 12). Jämfört med prediktionsmodellen som bara använde kliniska parametrar, förbättrar tillägget av subtypsklassificering med Signatur 1 exaktheten hos prediktionen av allmän överlevnad från 70,1 % upp till 78,2 % och för cancerspecifik överlevnad från 65,5 % till 71,3 % vid 5 är (Figur 12C).

Baserat pä Cox-regressionsanalys visade nästlat likelihood-kvottest att subtypsklassificieringen med Signatur 1 signifikant bidrar till förbättringen av regressionsgraden i en multivariat modell tillsammans med kliniska parametrar (Figur 12D).

Claims (25)

1. 0 15 20 25 30 535 352 40 Patentkrav .

2. Förfarande för klassificering av prostatacancer hos en patient, innefattande att: a) bestämma en genuttrycksnivä för generna F3 och |GFBP3 och för en eller flera av generna VGLL3 och c-MAF-a i ett prov fràn patienten; b) klassificera tumören genom att jämföra genuttrycksnlvän bestämd i a) med ett referensgentuttryck för samma gener hos referenspatienter som är kända att ha en högrisk- respektive en Iàgrisktumör; och c) dra slutsatsen att om genuttrycksnivàn bestämd i a) matchar med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en högrisktumör, är tumören hos patienten en högrisktumör, och om genuttrycksnivän bestämd i a) matchar med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en lägrisktumör, är tumören hos patienten en lägrisktumör. .

3. Förfarande enligt krav 1, varvid a) vidare innefattar att bestämma en genuttrycksnivä för en eller flera av generna WNT5B och CTGF, EZH2, AMACR och MUC1. .

4. Förfarande enligt nägot av kraven 1-2, varvid genuttrycksnivàn bestäms genom kvantifiering av mängden av RNA eller mRNA som uttrycks från nämnda gener. .

5. Förfarande enligt krav 3, varvid nämnda mängd av RNA eller mRNA bestäms genom användning av ett förfarande valt från mikroarrayteknologi, Northern-blotting och kvantitativ PCR (qPCR), såsom kvantitativ realtids-PCR (qrt-PCR), valbart multiplex-PCR. _ Förfarande enligt något av kraven 1-2, varvid genuttrycksnivàn bestäms genom kvantifiering av mängden av protein som kodas för av nämnda genen 10 15 20 25 30 35 535 352 41

6. Förfarande enligt krav 5, varvid nämnda mängd protein bestäms genom användning av ett förfarande valt från immunohistokemi, Western- blotting, ELISA, RIA och masspektrometri.

7. Förfarande enligt något av kraven 1-6, varvid provet är ett tumörprov erhållet från patienten.

8. Förfarande enligt något av kraven 1-6, varvid provet är ett blodprov erhållet från patienten.

9. Förfarande för att bestämma prognos för en patient diagnostiserad med prostatacancer och som har en tumör, varvid nämnda förfarande innefattar att a) klassificera tumören med förfarandet enligt något av kraven 1-8; och b) dra slutsatsen att en lågrisktumör indikerar att patienten har en god prognos och en högrisktumör indikerar att patienten har en dålig prognos.

10.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen är en minskning i sannolikheten för överlevnad jämfört med den goda prognosen.

11.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen är en minskning av allmän överlevnadstid jämfört med den goda prognosen.

12.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen implicerar en minskning av cancerspecifik överlevnadstid jämfört med den goda prognosen.

13.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen implicerar en ökad mortalitetsrisk jämfört med den goda prognosen.

14.Förfarande för att fatta ett behandlingsbeslut för en patient diagnostiserad med prostatacancer och som har en tumör, varvid nämnda förfarande innefattar att 10 15 20 25 535 352 42 a) klassificera tumören med förfarandet enligt något av kraven 1-8; och b) fatta ett behandlingsbeslut för nämnda patient beroende på klassificeringen erhällen i a).

15. Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att ge radikal eller kurativ behandling till en patient med begränsad cancer och en högrisktumör.

16.Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att awakta med behandling eller att ge hormonterapi, såsom kastrationsbehandling eller anti-androgenbehandling, till en patient med begränsad cancer och en làgrisktumör.

17. Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att ge kemoterapi till en patient med framskriden cancer och en högrisktumör.

18.Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att ge kastrationsbehandling till en patient med framskriden cancer och en lågrisktumör.

19.Användning av generna F3 och lGFBP3 och någon av VGLL3 och c- MAF-a, eller proteinerna som kodas därav, som prognostiska markörer för prostatacancer.