JP5963748B2 - 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後予測方法、キット及び使用 - Google Patents
中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後予測方法、キット及び使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2011年7月13日に出願された日本国特許出願第2011−154664号明細書、2011年12月12日に出願された日本国特許出願第2011−271087号明細書、2011年12月19日に出願された日本国特許出願第2011−277473号明細書及び2012年2月21日に出願された日本国特許出願第2012−034695号明細書(これらの開示全体が参照により本明細書中に援用される)に基づく優先権を主張する。
項1. 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測する方法であって、該患者から採取された試料において、以下の23遺伝子:
GLOD4、ZNF681、AFAP1AS、RBBP8、EPCAM、FANCA、PGAM1、ROCK1、POLR1D、SC4MOL、CCDC88A、ATAD1、PPM1E、NUBPL、BRCA1、GGH、NEXN、GAPDH、GNASAS、DNAJC12、 PPP3R1、STIL、TRMT6
の少なくとも1種の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、方法。
項2. 少なくとも以下の6遺伝子:
BRCA1、ROCK1、FANCA、ZNF681、PPP3R1、RBBP8の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項1に記載の方法。
項3. BRCA1の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項1又は2に記載の方法。
項4. RBBP8とBRCA1とPPP3R1の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項1又は2に記載の方法。
項5. さらに年齢及び一般全身状態(KPS)からなる群から選ばれる少なくとも1種を評価する工程を含むことを特徴とする項1〜4のいずれかに記載の方法。
項6. RBBP8とBRCA1とPPP3R1の発現レベルを測定する工程、年齢と一般全身状態(KPS)を評価する工程を含み、これら5つの因子に基づき中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測することを特徴とする項1〜5のいずれかに記載の方法。
項7. 前記23遺伝子全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、項1又は2に記載の方法。
項8. 前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、項1〜4、7のいずれかに記載の方法。
項9. 前記遺伝子の発現レベルと年齢及び一般全身状態(KPS)からなる群から選ばれる少なくとも1種を評価レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、項5又は6に記載の方法。
項10. 下記の予後予測式
項11. 下記の予後予測式
を用いてZ2を算出し、Z2の値に基づいて予後を予測する、項6に記載の方法。
項12. 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するためのキットであって、以下の23遺伝子:
GLOD4、ZNF681、AFAP1AS、RBBP8、EPCAM、FANCA、PGAM1、ROCK1、POLR1D、SC4MOL、CCDC88A、ATAD1、PPM1E、NUBPL、BRCA1、GGH、NEXN、GAPDH、GNASAS、DNAJC12、 PPP3R1、STIL、TRMT6
の少なくとも1種に対するプローブまたはプライマーを含むキット。
項13. 以下の23遺伝子:
GLOD4、ZNF681、AFAP1AS、RBBP8、EPCAM、FANCA、PGAM1、ROCK1、POLR1D、SC4MOL、CCDC88A、ATAD1、PPM1E、NUBPL、BRCA1、GGH、NEXN、GAPDH、GNASAS、DNAJC12、 PPP3R1、STIL、TRMT6
の少なくとも1種の中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するための使用。
項14. 予後の予測が生存期間の予測である、項13に記載の使用。
(1)BRCA1、(2)PPP3R1、(3)RBBP8、(4)GLOD4、(5)ZNF681、(6)AFAP1AS、(7)EPCAM、(8)FANCAとPGAM1、(10)ROCK1とPOLR1DとSC4MOLとCCDC88A、(14)ATAD1とPPM1EとNUBPL、(17)GGHとNEXN、(19)GAPDH、(20)GNASASとDNAJC12、(22)STIL、(23)TRMT6
となる。
Z > 1.82 ⇒ 予後不良群
Z ≦ 1.82 ⇒ 予後良好群
(1)サンプル
組織は、回収後5分以内に液体窒素中で凍結し、-80℃で保存した。サンプルは、新潟大学の有資格の病理学者により評価した。新潟大学医学部(プロトコール#70)、千葉大学医学部および山口大学医学部ヒト研究倫理委員会のガイドラインにしたがい、全ての患者からサンプルの使用についてインフォームドコンセントを得た。全生存率は、診断データから測定した。生存期間の最終日は、死亡日または追跡最終日とした。
各腫瘍からの約100mgの組織を用いて、ISOGEN(ニッポンジーン)により製造元の説明書にしたがい全RNAを抽出した。得られたRNAの質は、Bioanalyzer System (Agilent Technologies) によりRNA Pico Chipを用いて検証した。28S/18S比>0.7であってリボゾームピークの崩壊が見られないサンプルのみを本研究に使用した。RNA(1μg)をGene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 Expression array (Affymetrix, Inc.)(約47,000遺伝子を含む)でのハイブリダイゼーション用に処理した。ハイブリダイゼーション後、Fluidics Station 450、High-Resolution Microarray Scanner 3000、およびGCOS Workstation Version 1.3 (Affymetrix, Inc.)を用いてチップを処理した。
統計学的解析は全て、Rソフトウェア(R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2011 ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org)およびBioconductor(Gentleman R, Carey V, Bates D, et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol 2004, 5:R80)にて行った。
(1)患者特性
2000年〜2010年に外科的切除ないし生検術を受けた患者32人から、非処置中枢神経原発悪性リンパ腫標本を得た。患者の平均年齢は64.1歳(44-76歳)であり、男性17人、女性15人であった。手術前のKarnofsky Performance Status (KPS)は、70以上が19人、60以下が13人であった。以上をTraining setとする。さらにValidation setとして表1に示す43症例を解析した。Training setと Validation setは深部病変がValidation setに多く見られる以外、年齢、性別、KPS, 病変数、病理組織、化学療法レジメなどに有意差がなかった。
23遺伝子が予測因子として選択された。表1は、これら遺伝子および各遺伝子のVariable Importance (VI)を示す。図1は、推定集合死亡率と選択した6つの遺伝子(BRCA1、ROCK1、FANCA、ZNF681、PPP3R1、およびRBBP8)との間の関係を示す散布図である。
SAM(A)、適用した23遺伝子のセットによるRandom survival forest model(B)により分類された群について、Kaplan-Meier曲線を描いた(図2)。対応するLogrank検定のためのp値(p)は、遺伝子発現がp<0.038、および23遺伝子によるRandom Survival Forest modelがp<0.0001であった。これらの結果は、Random Survival Forest modelの方が遺伝子発現を直接用いるよりも有用であることを示す。
高用量メソトレキセートにより治療された症例(A)、高用量メソトレキセートを含む多剤併用化学療法により治療された症例(B)を適用した23遺伝子のセットによるRandom survival forest modelにより分類された群について、Kaplan-Meier曲線を描いた(図3)。対応するLogrank検定のためのp値(p)は、高用量メソトレキセート群がp=0.0001、および高用量メソトレキセートを含む多剤併用化学療法群がp<0.0001であった。これらの結果は、治療法によらず23遺伝子のセットによって予後が良く予測可能であるという事を示す。
23遺伝子予測式により分類された群の比較ついて、Kaplan-Meier曲線を描いた(図4)。対応するLogrank検定のためのp値(p)は、p<0.0001であった。この結果は、23遺伝子予測式により予後を良く予測可能であるという事を示す。
Z1 > 1.82 ⇒ 予後不良群
Z1 ≦ 1.82 ⇒ 予後良好群
表2に示す様に、Training SetとValidation Setの異なる症例群を設定した。Training Setはいままでの解析に用いた症例群で。Validation Setは新たな症例群となる。
ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本の5ミクロンの切片を用いて免疫組織化学を行った。BRCA1 (抗体希釈1:200; Abcam), FANCA (抗体希釈1:3000; Abcam), PPP3R1(抗体希釈1:100; Abcam), ROCK1 (抗体希釈1:125; SIGMA), RBBP8 (抗体希釈1:200; Abnova)、CD79a (抗体希釈1:50;DAKO)を一次抗体として用いた。染色強度は、なし、または、弱い陽性(0ポイント)、中程度の陽性(1ポイント)、または強い陽性(2ポイント)に分類した。3回の独立した測定の平均を小数点一桁まで計算した。観察者は患者番号を認識していなかった。
StepOne RealTime PCR system (Applied Biosystems) において、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) を用いて、製造元のプロトコールにしたがい定量的PCR(QPCR)を行った。TaqMan Gene Expression Assay Mixには、プライマーおよびTaqManプローブはApplied BiosystemsのATAD1(Hs00907773_g1),BRCA1(Hs01556193_m1), FANCA(Hs01116668_m1),GAPDH(Hs99999905_m1),GGH(Hs00914163_m1),GNASAS(Hs00294858_m1),PGAM1(Hs01652468_g1),PPP3R1(Hs01547793_m1),RBBP8(Hs00161222_m1),ROCK1(Hs01127699_m1),STIL(Hs00161700_m1),TRMT6(Hs00210942_m1),ZNF681(Hs01862022_s1)が含まれた。全RNA(5μg)を、SuperScript II (Invirtogen) を用いて逆転写してcDNAとした。このcDNA(1μl)をQPCRに使用した。検証は、はじめに評価した腫瘍の一部について行った。アッセイはデュプリケートで行った。QPCRの生データは、反応が対数期に到達するのに必要なサイクル数である。GAPDHの発現をQPCRデータの標準化に使用した。腫瘍群間の平均発現変化は、2-ΔΔCT法(Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 ;25:402-408)を用いて計算した。
(1)前記の12遺伝子について、QPCRによる検証ができた(データ非提示)。
(ここでAGEは年齢値、KPSとは70以上であれば1,以下なら0、PPP3R1, BRCA1, RBBP8とは免疫組織化学染色で1ポイント以上なら1,0ポイントなら0)
・ルール
Z2 > 3.48 ⇒ Poor群
Z2 ≦ 3.48 ⇒ Good群
このルールに従って生存曲線を描いたものが図5、6である。
Z2式でより簡易に予後良好群と不良群がTraining set(図5)、Validation Set(図6)
でも分けられることがわかる。
Z2式でより簡易に予後良好群と不良群が分けられることがわかる。
Claims (13)
- 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測する方法であって、
該患者から採取された試料において、遺伝子BRCA1の発現レベルを測定する工程、及びBRCA1の発現がPOSITIVEである場合に予後が不良であると予測し、BRCA1の発現がNEGATIVEである場合に予後が良好であると予測する工程を含む、方法。 - 少なくとも以下の6遺伝子:
BRCA1、ROCK1、FANCA、ZNF681、PPP3R1、RBBP8の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - RBBP8とBRCA1とPPP3R1の発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- さらに年齢及び一般全身状態(KPS)からなる群から選ばれる少なくとも1種を評価する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- RBBP8とBRCA1とPPP3R1の発現レベルを測定する工程、年齢と一般全身状態(KPS)を評価する工程を含み、これら5つの因子に基づき中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 以下の23遺伝子:
GLOD4、ZNF681、AFAP1AS、RBBP8、EPCAM、FANCA、PGAM1、ROCK1、POLR1D、SC4MOL、CCDC88A、ATAD1、PPM1E、NUBPL、BRCA1、GGH、NEXN、GAPDH、GNASAS、DNAJC12、PPP3R1、STIL、TRMT6
全ての発現レベルを測定する工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 前記遺伝子の発現レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現レベルと年齢及び一般全身状態(KPS)からなる群から選ばれる少なくとも1種を評価レベルを統計処理し、予測生存関数を算出する工程をさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するためのキットであって、遺伝子BRCA1に対するプローブまたはプライマーを含む、請求項1に記載の方法に用いるためのキット。
- 中枢神経原発悪性リンパ腫患者の予後を予測するための遺伝子BRCA1の使用であって、請求項1に記載の方法に用いるための使用。
- 予後の予測が生存期間の予測である、請求項13に記載の使用。
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