CN113774142A - Tgr5在制备治疗肠癌药物及诊断性试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

TGR5在制备治疗肠癌药物及诊断性试剂盒中的应用属于生物医药领域。根据TCGA数据库显示，TGR5基因在肠癌组织中的表达显著低于正常组织。本研究通过实时荧光定量PCR检测肠癌及癌旁正常组织中TGR5基因的表达水平，证实肠癌组织中TGR5基因的表达水平显著低于癌旁正常组织，可以将TGR5基因作为肠癌诊断试剂盒的检测靶点。本发明通过大量细胞实验证明激活TGR5能够抑制肠癌细胞的增殖和迁移。通过实时荧光定量PCR技术在mRNA水平证实，激活TGR5可显著下调癌症相关基因MMP7、MMP9、INOS、CCL2的表达。本发明公开了TGR5在制备肠癌诊断性试剂盒和肠癌靶向治疗药物中有很好的应用。

Description

TGR5在制备治疗肠癌药物及诊断性试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及TGR5在制备治疗肠癌药物及诊断性试剂盒中的应用。

背景技术

根据2020年国际癌症研究机构发布的最新的全球癌症统计报告显示，在全球范围内，癌症发病率的前五位依次是女性乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌和胃癌。癌症死亡主要原因依次是肺癌、结直肠癌、肝癌、胃癌和女性乳腺癌。结直肠癌的发病率和死亡率分别位居全球癌症发病率和死亡率的第3位和第2位。结直肠癌的发病率具有较大的地区差异性，欧洲、澳大利亚和北美的结肠癌发病率最高，非洲和中亚南部的结直肠癌发病率较低。据统计结直肠癌的危险因素包括遗传因素、高脂肪饮食、炎症性肠病、吸烟、大量饮酒、肥胖、糖尿病等。

结直肠癌是一种起源于结肠或直肠的胃肠道恶性肿瘤。结直肠癌的前兆有不明原因的贫血、直肠出血和大便口径改变等危险症状。目前结肠镜检查是结直肠癌筛查的主要手段，它可以在结肠息肉发展成癌症之前检测和切除息肉。研究发现结直肠腺瘤性息肉切除可预防结直肠癌。不幸的是，四分之一的患者是在手术选择有限的晚期诊断出来的。因此，鉴定生物标志物及其在肠癌中的分子功能对于研究肠癌特异性治疗至关重要。

1957年，Heidelberger等人首次合成5-氟尿嘧啶(5-FU)，随后研究证实5-FU对结直肠癌有效，5-FU和其它几种化疗药物联合使用，构成了第一批用于结直肠癌治疗的化疗组合。尽管在过去的几十年里，靶向治疗和免疫治疗等新疗法在治疗结直肠癌方面取得了一些进展。然而，结直肠癌的预后仍然很差，5年生存率仅为64％-67％，远处癌症患者的5年生存率降至14％-15％。肿瘤浸润、转移到其他组织和器官是结直肠癌患者死亡的主要原因。除了手术切除原发肿瘤改善患者生存率之外，治疗结直肠癌的关键在于抑制血管生成，切断转移路线，寻找新的副作用低的有效药物。

TGR5(又称GPBAR1)是一种G蛋白偶联胆汁酸膜受体，于2002年和2003年由两个小组首次独立鉴定。在此之前，FXR是已知的唯一被胆汁酸激活的受体。TGR5基因位于人类染色体2q35位置。其开放阅读框具有993个碱基对，编码330个氨基酸。TGR5在不同组织中的表达水平不同，在胆囊中表达最高，棕色脂肪组织、胎盘、脾脏和肠道中表达中等，肝脏和胰腺中表达较低。胆汁酸通过激活FXR和TGR5，调节自身新陈代谢。与FXR作用方式不同，TGR5通过第二信使cAMP来进行信号转导。TGR5信号的激活调节代谢稳态，包括葡萄糖代谢、胆汁酸和能量稳态。

目前主要有两类TGR5激动剂。第一类是以胆汁酸为基础，包括天然的TGR5激动剂，如胆酸(CA)和石胆酸(LCA)，和半合成的胆汁酸衍生物，如INT777。第二类是全合成的小分子TGR5激动剂，如吡啶衍生物。目前已经有多种可选择的特异性TGR5激动剂。

肠道固有层有多种细胞表达TGR5受体，包括L细胞(释放PYY和GLP-1)，肠嗜铬细胞和神经元(释放5-HT)，以及其他肠神经元。胆汁酸可通过回肠和结肠粘膜的基底外侧受体起作用，有研究表明胆汁酸可通过TGR5信号激活肠干细胞和上皮再生，IL6-IL6R-STAT3-SOCS3信号通路在肠上皮稳态，炎症性肠病的发病机理以及结直肠肿瘤的发生中起重要作用。TGR5激动剂可能是治疗代谢，炎症和消化系统疾病的潜在药物。

因此本发明将检测TGR5基因在肠癌组织中的表达情况，旨在为肠癌检测和风险提示提供新的诊断标志物，用于制备诊断性试剂盒。并在此基础上研究激活TGR5对肠癌细胞增殖和迁移的影响，以及激活TGR5对癌症相关基因表达的影响，旨在为肠癌的治疗提供新的药物靶向。这对于提高肠癌的诊断率，改善肠癌的生存状况提供有利的理论依据。

发明内容

发明目的：本发明的目的之一是提供一种TGR5在制备治疗肠癌药物中的应用，满足抗癌药物的使用需求。本发明的另一目的是提供一种TGR5基因在制备用于肠癌诊断性试剂盒中的应用，适用于大规模推广应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)TGR5基因(NCBI Gene ID：151306)在制备用于癌症诊断性试剂盒中的应用，所述的癌症为肠癌。通过实时荧光定量PCR检测TGR5基因在肠道肿瘤中的表达情况，肠癌组织中TGR5基因的表达水平显著低于癌旁正常组织，可将TGR5基因作为肠道肿瘤早期诊断的分子标志物。

(2)TGR5在制备治疗肠癌药物中的应用，所述药物以TGR5为靶点设计而成，属于TGR5特异性激动剂。

(3)TGR5特异性激动剂在制备治疗肠癌药物中的应用，所述药物的剂型为任意一种临床可接受的剂型，如片剂、胶囊、粉末或液体制剂等剂型。

有益效果：根据TCGA数据库显示，TGR5基因在肠癌组织中表达明显低于正常组织。本发明经过实时荧光定量PCR证实，TGR5基因在肠癌组织中表达显著低于正常组织(P<0.05)。检测TGR5基因在肠癌环境中的表达，该方法的灵敏度高，特异性强，可作为肠癌分子诊断的标志物；用TGR5特异性激动剂在肠癌细胞中激活TGR5，通过细胞增殖、迁移实验，证实激活TGR5能够对肠癌细胞的增殖和迁移起到抑制作用。通过实时荧光定量PCR技术在mRNA水平证实，激活TGR5后癌症相关基因表达显著下调。可见，TGR5在制备用于治疗肠癌药物、用于肠癌分子诊断试剂盒中具有广泛应用。

附图说明

图1是实时荧光定量P C R分析TGR5基因在肠癌组织(n＝15)及癌旁正常组织(n＝15)中的mRNA表达情况。

图2是细胞增殖实验。具体为TGR5激动剂BAR501激活TGR5对人结肠癌细胞SW480增殖的影响。

图3是实时荧光定量PCR分析激活TGR5后对SW480细胞中癌症相关基因表达的影响。具体是用TGR5激动剂BAR501激活TGR5后，细胞内MMP7、MMP9、INOS、CCL2基因mRNA水平的变化。

图4是细胞划痕实验。具体是TGR5激动剂BAR501激活TGR5对SW480细胞迁移的影响。

具体实施方式

本发明所使用的主要材料具体来源如下表所示，以下通过实施方案进一步描述本发明，但应当理解的是，这些只是示例性的，而非限制本发明。与如下细胞、试剂、仪器等性质或功能相似或相同的材料均可以用于本发明的实施。

下述示例中的方法如无特殊说明均为普通方法。

主要材料：

注：除非另有所指，本发明中用到的试剂可以是任何合适的市售试剂；细胞系均可以通过市售获得。

一、TGR5基因的组织表达分析检测

1.临床癌症样品采集

肠癌组织和癌旁正常组织均采集自河南大学附属淮河医院。整个采集及后续实验过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。组织样品经手术取出后，切成小块放入冻存管，置于液氮中长期保存备用。

2.组织RNA提取

刀片和镊子用干冰提前预冷，组织全程置于干冰上。用刀片切下约100mg组织放入含有1mL Trizol的1.5mL离心管中。用组织破碎仪充分破碎组织，破碎过程需注意温度不宜过高。破碎完成后，每个样品中加入100μL BCP，用涡旋仪涡旋至奶昔状时开始计时，涡旋15s充分混匀，静置8min。4℃离心机12000g离心15min。取部分上清液至1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后静置10min以沉淀RNA，4℃离心机12000g离心10min，弃去上清液。用500μL 75％DEPC乙醇溶液清洗RNA，4℃离心机7500g离心5min，弃上清，此过程重复操作2次。室温晾0.5-2h，根据RNA的量加入去核酸酶的水，55℃金属浴加热10min溶解RNA。用Nanodrop 2000测定RNA在230nm、260nm和280nm处的吸光值，一般认为A260/A230、A260/A280在1.8-2.1之间RNA质量较好。

3.RNA反转录为cDNA

选取promega反转录试剂盒，用Nanodrop 2000测定RNA浓度，根据RNA的浓度计算3μg RNA对应体积，20μM Oligo(dT)用量1μL，用无核酸酶水补至总体积14μL。弹匀离心后放入RCR仪中65℃反应10min。根据试剂盒说明书每个样品中加入4μL M-MLV RT 5×Buffer、0.3μL RNase Inhibitor(40U/μL)、0.7μL dNTP(25mM)和1μL M-MLV ReverseTranscriptase(200U/μL)，弹匀离心。42℃反应90min，95℃反应5min。

4.实时荧光定量PCR检测TGR5基因在mRNA水平上的表达

将反转录得到的cDNA稀释15倍，以稀释后的cDNA为模板，上样量为5μL。加入TGR5的上下游引物各0.5μL及10μL 2×SYBR Green Master Mix，用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行扩增。

扩增程序如下：

保温阶段：50℃2min；95℃10min；

循环阶段：95℃15s；60℃1min，重复40个循环

熔融曲线阶段：95℃15s；60℃1min；95℃30s；60℃15s

以18s作为内参基因对TGR5的CT值进行标准化校正。具体方法如下，ΔCT＝CT_目的基因-CT_内参基因，ΔΔCT＝ΔCT_实验组-ΔCT_对照组；2^-ΔΔCT反映实验组相对于对照组目的基因的相对表达水平。用相对定量分析2^-ΔΔCt法比较不同样本之间TGR5基因表达量的差异。TGR5正向引物如SEQ ID NO：1所述；TGR5反向引物如SEQ ID NO：2所述。内参基因18s正向引物如SEQID NO：11所述；内参基因18s反向引物如SEQ ID NO：12所述。

结果：如图1所示，与人类癌旁正常组织相比，肠癌组织中TGR5基因的mRNA表达水平显著性降低，P＜0.05。表明TGR5基因的表达水平的异常降低与肠癌密切相关。

二、激活TGR5可以抑制肠癌细胞的增殖

利用噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况。将人结肠癌细胞SW480以1.0×10⁴个/孔的密度种于96孔培养板中培养24h，之后将96孔板分为对照组和实验组。每组设置4个重复孔，并设置5个检测时间点。其中对照组用二甲基亚砜(DMSO)处理，实验组用TGR5特异性激动剂BAR501(15μM)处理，加药后即可向0h组每孔加入10μL的MTT(5mg/mL)，在培养箱中孵育4h后用DMSO萃取，用酶标仪检测450nm处的吸光值。随后分别检测加药后24h、48h、72h和96h的吸光值。根据不同时间点的OD值绘制细胞的增殖曲线。

结果：如图2所示，与对照组相比，BAR501处理72h后，SW480细胞的增殖速度明显降低，实验组与对照组细胞的生长速度有显著性差异(P<0.01)。表明激活TGR5可以有效抑制肠癌细胞的增殖。

三、激活TGR5可以下调癌症相关基因的表达

1.细胞种板与加药

将SW480细胞以2.5×10⁵个/mL的密度种于6孔板中培养24h，细胞铺板约70-80％时，用TGR5特异性激动剂BAR501(10μM)处理24h，对照组用DMSO处理。

2.细胞内癌症相关基因表达水平检测

提取细胞总RNA，反转录后利用实时荧光定量PCR检测BAR501处理后MMP7、MMP9、INOS、CCL2基因mRNA水平的变化。所用MMP7正向引物如SEQ ID NO：3所述；MMP7反向引物如SEQ ID NO：4所述；所用MMP9正向引物如SEQ ID NO：5所述；MMP9反向引物如SEQ ID NO：6所述；所用INOS正向引物如SEQ ID NO：7所述；INOS反向引物如SEQ ID NO：8所述；所用CCL2正向引物如SEQ ID NO：9所述；CCL2反向引物如SEQ ID NO：10所述；内参基因18s正向引物如SEQ ID NO：11所述；内参基因18s反向引物如SEQ ID NO：12所述。

结果：如图3所示，实时荧光定量PCR检测SW480细胞中癌症相关基因mRNA水平，与对照组相比，BAR501激活TGR5后，实验组细胞的MMP7、MMP9、INOS、CCL2的mRNA水平显著低于对照组(P＜0.01)。表明激活TGR5可以有效抑制SW480细胞的癌症相关基因的表达。由此我们可以推断，激活TGR5或可有效抑制肠癌。

四、激活TGR5可以抑制肠癌细胞的迀移能力

将人结肠癌细胞SW480以4.0×10⁵个/mL的密度种于24孔板中培养24h，待细胞铺满后用黄枪头在单层细胞上划“+”字，用PBS洗去漂浮的细胞，重复2次。用TGR5特异性激动剂BAR501(10μM)处理细胞，对照组用DMSO处理。记录0h拍照位置，在48h和96h时采集相同位置图像，用ImageJ软件分析划痕闭合情况。

结果：如图4所示，BAR501处理48h后，实验组与对照组相比，人结肠癌细胞SW480的划痕愈合率出现显著降低(P<0.05)，表明激活TGR5能够显著抑制肠癌细胞的迀移能力。

统计学分析：所有数据取三次独立重复实验的平均值，进行标准差分析和t-test检验。P<0.05认为具有统计学意义，记为*；P<0.01，记为**；P<0.001，记为***。

本发明请求保护的范围并不局限于具体实施方式的描述。

序列表

NO：1人-TGR5正向引物：GCTGCTTCTTCCTGAGCCTACT

NO：2人-TGR5反向引物：TTGGGAGCCAAGTAGACGAGGA

NO：3人-MMP7正向引物：GAGTGAGCTACAGTGGGAACA

NO：4人-MMP7反向引物：CTATGACGCGGGAGTTTAACAT

NO：5人-MMP9正向引物：AGACCTGGGCAGATTCCAAAC

NO：6人-MMP9反向引物：CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT

NO：7人-INOS正向引物：TTCAGTATCACAACCTCAGCAAG

NO：8人-INOS反向引物：TGGACCTGCAAGTTAAAATCCC

NO：9人-CCL2正向引物：TCAAACTGAAGCTCGCACTCT

NO：10人-CCL2反向引物：GGGGCATTGATTGCATCTGG

NO：11人-18s正向引物：GTGGGCCGAAGATATGCTCA

NO：12人-18s反向引物：TTCACGGAGCTTGTTGTCCA

Claims (5)

1.TGR5基因在制备用于肠癌的诊断性试剂盒中的应用，其特征在于，将TGR5基因作为肠道肿瘤早期诊断的分子标志物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR中TGR5的正向引物为：GCTGCTTCTTCCTGAGCCTACT；TGR5反向引物为：TTGGGAGCCAAGTAGACGAGGA；所用实时荧光定量PCR扩增程序为：

保温阶段：50℃2min；95℃10min；

循环阶段：95℃15s；60℃1min，重复40个循环

熔融曲线阶段：95℃15s；60℃1min；95℃30s；60℃15s。

3.TGR5在制备用于治疗肠癌的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物以胆汁酸膜受体TGR5为靶点，包括TGR5激动剂和TGR5拮抗剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述TGR5激动剂为BAR501。

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