CN111323604B - 一组贲门腺癌预后预测标志物及其应用 - Google Patents

一组贲门腺癌预后预测标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及贲门腺癌预后预测技术，具体涉及一组贲门腺癌预后预测标志物及其应用。即能够特异性检测ZBED5、CUL5、AVIL和USP15或该组基因表达产物的检测试剂在贲门腺癌预后预测试剂盒中的应用，本发明试剂盒的检测对象为贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品。本发明试剂盒用于贲门腺癌的预后预测，使得贲门腺癌的预后预测更加方便易行；并且，本发明联合利用四种标志物组合对贲门腺癌患者三年生存期的预测灵敏度为89.1%，特异度为70.2%。

Description

一组贲门腺癌预后预测标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及贲门腺癌预后预测技术，具体涉及一组贲门腺癌预后预测标志物及其应用。
背景技术
贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)是我国北方最常见的上消化道恶性肿瘤之一，其发病率与病死率在我国呈逐年上升趋势，显著的地域性分布差异和明显的家族聚集现象是贲门腺癌突出的流行病学特征。贲门腺癌起病隐匿，许多患者早期阶段无明显症状，许多患者确诊时已为中晚期。目前，贲门腺癌的预后情况很差，中晚期的患者，术后5年的生存率仅20%左右，严重威胁着人民的生命健康。此外，患者普遍存在术后生存率低、耐药性高或复发转移的情况。如果能找到有效区分患者预后的分子标志物，则可以指导临床实现个体化治疗，避免过度治疗和治疗不足。人们期望探索和建立一组灵敏度高、特异度强的贲门腺癌预后预测指标，并利用这些指标作为指导治疗和判断预后的依据。目前，在临床实践中，贲门腺癌的预后分级主要是以病理分级作为最重要的预后指标，而发现的预后相关的分子标志物较少，已发现的指标均未被临床接受应用，对于贲门腺癌患者预后预测仍处于初步探索阶段。因此，准确预测贲门腺癌患者的预后对于临床进一步的治疗和随访具有重要意义。本领域亟需可用于贲门腺癌预后预测的分子标志物，此外，目前还没有一种简便有效的方法可以更加准确地预测贲门腺癌患者的预后。
发明内容
针对于现有技术存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一组贲门腺癌预后预测标志物及其应用。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一组可以有效区分贲门腺癌病人预后预测的分子标志物，所述分子标志物为ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的组合。
本发明还提供了一种上述基因蛋白的检测试剂在制备用于贲门腺癌预后预测的试剂盒中的应用。
根据上述应用，优选地，所述检测试剂为检测ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白是否表达的分子组合。
根据上述应用，优选地，检测前述基因蛋白是否表达的方法为本领域常见的蛋白定量检测方法，包括电泳法、蛋白质印迹法和免疫组织化学；更加优选地，本发明采用免疫组合化学法检测上述基因蛋白是否表达。
根据上述应用，优选地，所述分子组合由与ZBED5蛋白特异性结合的抗体（以下简称ZBED5抗体）、与CUL5蛋白特异性结合的抗体（以下简称CUL5抗体）、与AVIL蛋白特异性结合的抗体（以下简称AVIL抗体）和与USP15蛋白特异性结合的抗体（以下简称USP15抗体）组成。
根据上述应用，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
根据上述应用，优选地，所述试剂盒的检测对象为贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品。
根据上述应用，优选地，所述试剂盒采用免疫组织化学法对组织样品中的ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白进行定量检测，确定组织样品中ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的表达水平。
根据上述应用，优选地，所述试剂盒中还含有二抗、所述二抗为Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液。
本发明还提供了一种用于贲门腺癌预后预测的多指标检测试剂盒，所述试剂盒含有检测ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的特异性检测试剂。
根据上述试剂盒，优选地，所述检测试剂为检测ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白是否表达的分子组合。
根据上述试剂盒，优选地，所述分子组合由ZBED5抗体、CUL5抗体、AVIL抗体和USP15抗体组成。更加优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明试剂盒对贲门腺癌患者预后预测的数学模型为：Y＝0.372×A+0.401×B+0.572×C+0.395×D；其中Y为风险系数，A为ZBED5蛋白的表达量；B为CUL5蛋白的表达量；C为AVIL蛋白的表达量；D为USP15蛋白的表达量；当Y高于2.186时为高风险，当Y值低于2.186时为低风险。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一组可以有效预测贲门腺癌生存期的分子标志物，即ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白，并提供了一种基于本发明试剂盒检测结果对贲门腺癌患者预后预测的数学模型，通过检测组织样品中ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的表达水平，可以有效区分贲门腺癌患者的生存期长短，从而为贲门腺癌的预后预测判断提供了新途径，对于贲门腺癌病情分析提供了参考依据。
(2)本发明提供的用于贲门腺癌预后预测的试剂盒操作简单，使用方便，能够快速检测贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的表达水平，可用于贲门腺癌的预后预测，使得贲门腺癌的预后预测更加方便易行。
（3）本发明试剂盒采用四种贲门腺癌预后预测标志物组合用于对贲门腺癌进行预后预测，相对于现有单一检测标志物对贲门腺癌的预后预测，本发明试剂盒具有更好的预测效果，本发明联合利用四种标志物组合对贲门腺癌患者的预后预测的灵敏度为89.1%，特异度为70.2%。
附图说明
图1为ZBED5蛋白作为单一标志物判断术后贲门腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线
（χ2 =6.718，P=0.010）；
图2为CUL5蛋白作为单一标志物判断术后贲门腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线
（χ2=5.193，P=0.023）；
图3为AVIL蛋白作为单一标志物判断术后贲门腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线
（χ2=4.832，P=0.031）；
图4为USP15蛋白作为单一标志物判断术后贲门腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线
（χ2=7.902，P=0.0002）；
图5为四种蛋白联合后判断术后贲门腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线
（χ2=19.613，P<0.0001）；
图6为利用贲门腺癌预后预测数学模型判断术后贲门腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线；
图7为贲门腺癌预后预测数学模型对贲门腺癌患者三年生存期预测的ROC曲线。
具体实施方式
实施例1试剂盒的组成
本发明试剂盒的组成如下：
（1）一抗：ZBED5抗体、CUL5抗体、AVIL抗体、USP15抗体，购自美国BD公司；
（2）封闭液，其制备方法是：从Biosharp公司购得牛血清蛋白BSA，用pH为7.2～7.4，浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS溶液）作为溶剂配制成浓度为5％(w/v)牛血清蛋白BSA溶液；
（3）3％(v/v)H2O2工作液，其制备方法是：用PBS溶液作为稀释液将30％H2O2溶液稀释为3％(v/v)的H2O2溶液，30％H2O2购自国药集团化学试剂有限公司；
（4）抗体稀释液，由含有0.1％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)构成，其制备方法是：用PBS溶液将Tween-20稀释1000倍得到，Tween-20购自Amresco公司；
（5）Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液，购自北京索莱宝科技有限公司；
（6）SABC-POD浓缩液，购自北京索莱宝科技有限公司；
（7）20×DAB显色液A，购自北京索莱宝科技有限公司；
（8）20×DAB显色液B，购自北京索莱宝科技有限公司。
试剂盒中的ZBED5抗体、CUL5抗体、AVIL抗体、USP15抗体需4℃保存，其它试剂若长期储存需放于-20℃，短期储存可放于4℃以方便使用。
此外，除试剂盒中的试验材料之外，在实际检测过程中还需要自行制备以下试验材料：PBS溶液即pH为7.2～7.4，浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液；pH为6.0，浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液；苏木素染液；中性树脂；75％(v/v)乙醇；95％(v/v)乙醇；无水乙醇；二甲苯。
实施例2 试剂盒的使用方法
以甲醛固定石蜡包埋的组织切片为例，本发明检测试剂盒的使用方法如下：
1、组织切片的处理
（1）脱蜡至水：将组织切片依次浸没在二甲苯中5min，无水乙醇中5min，95％乙醇中5min，75％乙醇中5min，PBS溶液中5min。
（2）封闭内源性酶活：在切片上滴加3％H2O2工作液，可覆盖整张组织切片。室温放置10min以灭活内源性辣根过氧化物酶。之后将切片浸没于PBS溶液中洗3次，每次5min。
（3）抗原修复：将切片浸入0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液中，放入盛有适量蒸馏水的高压锅中，当其排气阀冒气后开始计时5～10min。冷却后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5min。
（4）封闭：在切片上滴加封闭液，可覆盖整张切片，室温放置30min。之后甩去多余液体。
（5）一抗：用抗体稀释液将ZBED5抗体、CUL5抗体、AVIL抗体、USP15抗体按1∶100-1∶500稀释（经过稀释的抗体可在4℃短期保存）后，加在切片组织上，37℃放置1个小时或在4℃下放置过夜。然后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5min。
（6）二抗：用抗体稀释液将Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液按1：100-1∶500稀释为工作液（此工作液可在4℃短期保存），加在切片组织上，37℃，30min到1个小时。然后浸没于PBS溶液中洗涤3次，每次5min。
（7）SABC-POD复合物：用抗体稀释液按1:100将SABC-POD浓缩液稀释为工作液（此工作液可在4℃短期保存），加到切片上，室温或37℃，30 min。然后浸没于PBS洗涤3次，每次5min。
2、显色及终止反应
（1）DAB显色：用PBS溶液将20×DAB-显色液A和20×DAB显色液B各稀释20倍后混合制备DAB工作液。混匀后加至切片。室温显色，镜下控制显色时间，一般5～10min。蒸馏水洗涤终止反应。
（2）苏木素复染：切片上滴加苏木素染液，静置1～2min后，用蒸馏水洗涤。
（3）脱水、透明、封片：切片分别置于75％乙醇中5min，95％乙醇中5min，无水乙醇中5min，二甲苯中5min。然后滴加中性树脂，盖玻片封片。
（4）待中性树脂凝固后，在显微镜下观察切片。
实施例3 本发明试剂盒对贲门腺癌的预后预测价值分析
（一）试验材料
我们收集了280例来自郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室贲门腺癌患者的手术标本存档蜡块。在每例存档蜡块中切取等量的五份切片，其中一份切片利用本发明试剂盒并根据实施例2中给出试剂盒的使用方法，对切片中的ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白进行联合检测；另外四份切片分别利用本发明试剂盒的使用方法对切片中的ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白进行依次单独检测，对ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白进行依次单独检测的试剂盒中一抗分别依次为ZBED5抗体、CUL5抗体、AVIL抗体和USP15抗体。即每例存档蜡块经过五种不同的试剂盒检测后得到五种不同的免疫染色切片。
（二）试验结果及分析
1、不同组合标志物蛋白的表达与术后生存时间的关系分析
所有的免疫染色切片经2位病理医师采用盲法独立评分。肿瘤细胞浆中出现棕黄色颗粒被认为是阳性信号，同时将染色强度分为4级：0级，阴性（无色）；1级，弱染色（淡黄色）；2级，中度染色（棕黄色）；3级，强染（棕褐色）。
用细胞计数板计算阳性细胞百分数，并将阳性细胞百分数分为5级：0级，0～5％；1级，6～25％；2级，26～50％；3级，51～75％；4级，≥76％。
每个免疫染色切片的总分数是由肿瘤细胞染色强度和肿瘤细胞阳性百分数两部分的乘积得出的，范围是0～12。为了方便统计，我们把所有切片分为低表达和高表达两组，1代表低表达组，2代表高表达组，其中，ZBED5蛋白检测的切片中0～7分为低表达组，8～12分为高表达组；CUL5蛋白检测的切片中0～4分为低表达组，6～12分为高表达组；AVIL蛋白检测的切片中0～1分为低表达组，2～12分为高表达组；USP15蛋白检测的切片中0～4分为低表达组，6～12分为高表达组。以郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室贲门腺癌患者临床诊疗信息大数据库为背景，依据前述280例得到的所有免疫染色切片的检测结果，计算出ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白以及四种标志物蛋白联合后的术后患者的Kaplan-Meier生存曲线，如图1～5所示。
结果分析如下：在图1～4中可以看出，随着生存月数的增加，ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白低表达组和高表达组累积生存率均逐渐降低，但高表达组降低的更明显；当四种蛋白联合检测时的生存曲线如图5所示，可以看到，在四种蛋白联合检测时低表达组和高表达组累积生存率都逐渐降低，高表达组降低的更明显；与图1～4中单个蛋白检测得到的高表达组累积生存率降低的趋势相比，四种蛋白联合检测的高表达组累积生存率降低的趋势更加明显，表明ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白四种蛋白联合比单一标志物蛋白预测贲门腺癌患者预后具有更高的价值。
2、基于前述280例手术标本存档蜡块的所有切片数据建立对贲门腺癌的预后预测数学模型
基于数学模型Y＝α×A+β×B+γ×C+δ×D，其中α、β、γ、δ为系数，A、B、C、D分别为同一病例中ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的表达量（即前述免疫切片的总分数）；利用上述280例手术标本存档蜡块所有切片中ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的表达量数据，并通过Cox回归处理得到贲门腺癌的预后预测数学模型：Y＝0.372×A+0.401×B+0.572×C+0.395×D；其中Y为风险系数，A为ZBED5蛋白的表达量；B为CUL5蛋白的表达量；C为AVIL蛋白的表达量；D为USP15蛋白的表达量。并根据280例中每例标本的Y值按照从小到大的顺序排列，其中位于中间位置的病例对应的Y值为cut-off值，即cut-off值为2.186；小于该cut-off值的病例为低危组，低危组的贲门腺癌患者术后三年生存期较高，高于该cut-off值的病例为高危组，高危组的贲门腺癌患者术后三年生存期较低，结果如图6所示。
3、贲门腺癌的预后预测数学模型对贲门腺癌预后预测的灵敏度和特异度分析
随机选取郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室中200名贲门腺癌患者作为验证组，收集每例临床活检切片中ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的表达量数据，利用贲门腺癌的预后预测数学模型对验证组中患者进行贲门腺癌预后预测，分析本发明贲门腺癌预后预测数学模型对验证组中患者三年生存期预测的灵敏度和特异度，结果如图7中ROC曲线所示，ROC曲线中AUC为0.758，当cut-off值为2.186时，本发明贲门腺癌的预后预测数学模型对贲门腺癌患者三年生存期的预测灵敏度为89.1%，特异度为70.2%。
综上所述，ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白、USP15蛋白四种标志物蛋白联合后评价贲门腺癌患者的预后具有更高的预测价值，证实了本发明试剂盒可以作为较理想的预测贲门腺癌患者的预后的方法和手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.能够特异性检测ZBED5、CUL5、AVIL和USP15的检测试剂在贲门腺癌预后预测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为检测ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白是否表达的分子组合。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分子组合由与ZBED5蛋白特异性结合的抗体、与CUL5蛋白特异性结合的抗体、与AVIL蛋白特异性结合的抗体和与USP15蛋白特异性结合的抗体组成。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
5.根据权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒利用免疫组织化学法检测样品中ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的表达水平。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还含有二抗，所述二抗为Bio-羊抗小鼠IgG浓缩液。
8.一种用于贲门腺癌预后预测的多指标检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白的特异性检测试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为检测ZBED5蛋白、CUL5蛋白、AVIL蛋白和USP15蛋白是否表达的分子组合。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒对贲门腺癌患者预后预测的数学模型为：Y＝0.372×A+0.401×B+0.572×C+0.395×D；其中Y为风险系数，A为ZBED5蛋白的表达量；B为CUL5蛋白的表达量；C为AVIL蛋白的表达量；D为USP15蛋白的表达量；当Y高于2.186时为高风险，当Y值低于2.186时为低风险。
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