CN111766385A

CN111766385A - 术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒

Info

Publication number: CN111766385A
Application number: CN202010642322.1A
Authority: CN
Inventors: 杨潇燕; 牛银银; 米贯勋; 崔红米; 童大伟; 齐华; 刘文弟
Original assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Current assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2040-07-06
Also published as: CN111766385B

Abstract

本发明涉及一种术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，包含冰冻固定液、过氧化物酶封闭剂、CK广(AE1/AE3)抗体、P40抗体、TTF1抗体、VIM抗体、酶标羊抗鼠/兔多聚物、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液以及清洗缓冲液，并提供上述免疫组化检测试剂盒的使用方法。本发明提供的试剂盒，通过对术中冰冻切片的快速免疫组化染色，使用CK广、VIM、TTF1、p40检测指标辅助区分硬化性肺细胞瘤和肺癌，将术中病理判断依据从单一的形态学HE染色，增加到免疫组织化学和形态学相结合，为病理医师提供更全面可靠的诊断依据，从而提高诊断准确率，降低误诊、漏诊率。

Description

术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒。

背景技术

目前术中活检主要方法是术中冰冻切片HE染色，冰冻切片即术中快速冰冻切片，其优点是检查快速，病理工作者将手术医生术中切除的病变组织，在冰冻切片机中迅速冷冻后制成组织切片，经过快速苏木素伊红染色，由病理医生即时在显微镜下观察，短时间做出判断，整个过程一般需要在半小时内完成，而石蜡切片经过中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋一般需要2～3天才能完成。但由于HE染色判断仅依赖于形态学证据，组织在冰冻过程中不可避免地形成结晶，细胞形态表现质量较差，造成细胞变形，发生人为假象，加上冰冻切片取材有限，更增加了诊断难度，存在误诊的可能。在肺部肿物术中冰冻诊断中，硬化性肺细胞瘤组织形态多样，临床和影像学易误诊为癌，文献报道硬化性肺细胞瘤术中冰冻诊断准确率低至37.7％。

冰冻诊断正确与否与临床医生和病理医生的取材部位、组织大小及数量关系甚为重要，仅靠常规取材方法制作一张冰冻切片往往不能反映肿瘤的全貌。当多种形态混合在一起时更易与癌混淆，其术中鉴别诊断难度大，极易造成误诊、漏诊、过度诊断，对患者身心造成负担。因此提高术中冰冻诊断的准确率十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，该试剂盒能够用于肺肿物切除术中肺癌和硬化性肺细胞瘤的快速鉴别诊断，为病理医师提供更全面可靠的诊断依据，提高硬化性肺细胞瘤术中冰冻诊断准确率。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，包括冰冻固定液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液以及清洗缓冲液，其中，一抗试剂包括CK广(AE1/AE3)抗体工作液、P40抗体工作液、TTF1抗体工作液和VIM抗体工作液；二抗试剂为酶标羊抗鼠/兔多聚物。

优选的，所述清洗缓冲液为10×TBSB缓冲液，配置方法如下：48.4g tris、90g氯化钠、10g Brij-35加入800mL蒸馏水中，溶解混匀，调节PH到7.5，定容至1L。

优选的，所述冰冻固定液为丙酮，较其他固定液可更好的保存细胞上的抗原。同时以福尔马林为主要成分的固定液及其衍生固定液，如AAF液、EAF液、B-5固定液、B-5固定液等，均适用于该试剂盒。

优选的，所述过氧化物酶封闭剂为浓度为3.0％-3.5％的过氧化氢溶液。

优选的，所述一抗试剂每毫升添加0.5-1％的曲拉通100，曲拉通100购自阿拉丁。

优选的，所述一抗试剂为一抗抗体浓缩液稀释制备成的一抗工作液，所述一抗抗体浓缩液购自河南赛诺特生物技术有限公司，CK广(AE1/AE3)抗体，货号：CCM0960、P40抗体，货号：CPM0133、TTF1抗体，货号：CTM0261、VIM抗体，货号：CVM0040。

优选的，所述酶标羊抗鼠/兔多聚物购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SN109040。

优选的，所述试剂盒中一抗CK广(AE1/AE3)稀释比1：100，VIM稀释比1：80，P40稀释比1：100；TTF1稀释比：1：90；二抗浓度为36μg/mL，均高于普通免疫组化。

优选的，所述DAB显色底物主要由3,3＇-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物、Tris、EDTA组成。

优选的，所述DAB显色缓冲液主要由Tris、EDTA、过氧化氢、显色剂组成。

优选的，所述苏木素复染液购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SN640504。

本发明提供了上述免疫组化试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)将冰冻组织切片贴于载玻片上；

2)冰冻固定液固定30S-1min，蒸馏水冲洗；

3)内源性过氧化物酶封闭，每张切片滴加100微升3％～3.5％的过氧化物酶封闭剂，常温孵育30S，TBSB缓冲液冲洗5S；

4)靶标抗体的孵育(100微升/切片)，常温孵育2-4分钟，TBSB缓冲液冲洗10S；

5)酶标羊抗鼠/兔聚合物的孵育(100微升/切片)，常温孵育1-3分钟，TBSB缓冲液冲洗10S；

6)配置DAB显色液，DAB底物：缓冲液＝1:20，混合均匀，现配现用；

7)每张组织切片滴加150微升的DAB显色液，孵育1-2分钟，蒸馏水冲洗；

8)常规脱水封片。

根据上述使用方法将本发明提供的免疫组化试剂盒应用于术中冰冻切片的免疫组化染色，可以实现肺癌和硬化性肺细胞瘤的术中快速鉴别。

常见的肺癌为肺腺癌和肺鳞癌，其中肺腺癌更不易于和硬化性肺细胞瘤鉴别。TTF1和p40是区分肺腺癌和肺鳞癌的良好标志物，肺腺癌TTF1+，p40-，而肺鳞癌TTF1-，p40+。硬化性肺细胞瘤分为圆形细胞型和表面细胞型，圆形细胞型CK广-，TTF1+，VIM+；表面细胞型CK广+，TTF1+，VIM+。将本发明提供的免疫组化试剂盒用于术中肺肿物切除样本，检测样本中CK广、VIM、TTF1、p40的表达情况，能够为病理医师提供更全面可靠的诊断依据：肺腺癌一般为TTF1+，CK广+，而P40-，VIM-；肺鳞癌为p40+，CK广+，而TTF1-，VIM-；硬化性肺细胞瘤圆形细胞型CK广-，TTF1+，VIM+，而P40-；硬化性肺细胞瘤表面细胞型CK广+，TTF1+，VIM+，而P40-。(其中+代表阳性，目标细胞特定部位有棕色沉淀；-代表阴性，目标细胞特定部位无棕色沉淀。)

本发明取得的有益效果：

1)能够在术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤：硬化性肺血管瘤在形态学和影像学中易误诊为癌，本发明提供的免疫组化试剂盒，通过对术中冰冻切片的快速免疫组化染色，使用CK广、VIM、TTF1、p40检测指标辅助区分硬化性肺细胞瘤和肺癌，将术中病理判断依据从单一的形态学HE染色，增加到免疫组织化学和形态学相结合，为病理医师提供更全面可靠的诊断依据，从而提高诊断准确率，降低误诊、漏诊率。

2)操作简单用时短：本发明提供的免疫组化试剂盒，操作简单用时短，能够在10-12分钟内实现对术中肺肿物切除样本CK广、VIM、TTF1和P40的免疫组化染色。这与常规石蜡切片经过中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋过程(一般需要2～3天才能完成)后再进行免疫组化染色相比，能够快速及时的提供辅助诊断依据。

3)灵敏度高：本发明提供的试剂盒中固定液优选丙酮，较其他固定液可更好的保存细胞上的抗原；试剂盒中一抗和二抗的浓度高于普通免疫组化，且在一抗工作液中加入0.5％-1％曲拉通100，增加细胞膜的通透性，利于抗原抗体的结合；同时，由于细胞膜的通透性增加，也更加利于二抗的结合，使得试剂盒灵敏度大大提高。

4)特异性强：但也正是由于快速免疫组化灵敏度高，极易产生背景着色，从而造成假阳性的结果。同时，由于冰冻切片和石蜡包埋切片性质不同，其更易附着蛋白类物质，产生非特异性染色或假阳性。这在很大程度上局限了快速免疫组化在术中病理诊断方面的应用。针对这一问题，本发明将TBST清洗缓冲液更换为TBSB清洗缓冲液，后者添加了分散能力更强的Brij-35，可有效去除非特异性染色，降低假阳性率，从而大大提高特异性，使背景更干净，并且缩短了清洗时间，进一步压缩从样本送检到出结果所用时间。

附图说明

图1是病例A的HE染色结果图；

图2是病例A的CK广快速免疫组化染色结果图；

图3是病例A的VIM快速免疫组化染色结果图；

图4是病例A的TTF1快速免疫组化染色结果图；

图5是病例A的P40快速免疫组化染色结果图；

图6是肺部肿物的CK广快速免疫组化染色，TBST清洗结果图；

图7是肺部肿物的CK广快速免疫组化染色，TBSB清洗结果图；

图8是病例B的HE染色结果图；

图9是病例C的HE染色结果图；

图10病例C的CK广快速免疫组化染色结果图；

图11是病例C的VIM快速免疫组化染色结果图；

图12是病例C的TTF1快速免疫组化染色结果图；

图13是病例C的P40快速免疫组化染色结果图；

图14是病例D的HE染色结果图；

图15是病例D的CK广快速免疫组化染色结果图；

图16是病例D的VIM快速免疫组化染色结果图；

图17是病例D的TTF1快速免疫组化染色结果图；

图18是病例D的P40快速免疫组化染色结果图；

图19是病例E的HE染色结果图；

图20是病例E的CK广快速免疫组化染色结果图；

图21是病例E的VIM快速免疫组化染色结果图；

图22是病例E的TTF1快速免疫组化染色结果图；

图23是病例E的P40快速免疫组化染色结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

该实施例提供了一种术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，具体组成如下：

1)固定液为丙酮；

2)过氧化物酶封闭剂为浓度为3.5％的过氧化氢溶液；

3)一抗工作液的制备：所述试剂盒中一抗(CK广(AE1/AE3)抗体、P40抗体、TTF1抗体、VIM抗体)为经抗体稀释液稀释制备成的一抗工作液，每毫升工作液加入0.5-1％的曲拉通100，曲拉通100购自阿拉丁，抗体稀释液和一抗抗体浓缩液购自河南赛诺特生物技术有限公司(CK广(AE1/AE3)抗体，货号：CCM0960、P40抗体，货号：CPM0133、TTF1抗体，货号：CTM0261、VIM抗体，货号：CVM0040)；经实验确定抗体最佳稀释比，经验证本试剂盒中CK广稀释比1：100，VIM稀释比1：80，P40稀释比1：100；TTF1稀释比：1：90；稀释后按照比例，每毫升工作液加入0.5～1％的曲拉通100，其中CK广(AE1/AE3)抗体加入0.5％曲拉通100，TTF1抗体加入0.8％曲拉通100，P40抗体加入1％曲拉通100，VIM抗体抗体加入0.6％曲拉通100；

4)酶标羊抗鼠/兔聚合物工作液的制备：酶标羊抗鼠/兔多聚物购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SN109040；通过冰冻免疫组化试验，对多例肺组织进行染色，观察试验结果，确定该试剂的工作液浓度，本次试验的最佳试剂浓度为36μg/mL；取2ml浓缩液(720μg/mL)，加入40ml的二抗稀释液中，慢速混匀即可；

5)10×TBSB清洗液的配置：48.4g tris，90g氯化钠，10g Brij-35加入800mL蒸馏水中，溶解混匀，调节PH到7.5，定容至1L；

6)DAB显色底物：购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SN640503A；

7)DAB显色缓冲液：购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SN640503A；

8)苏木素复染液：购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SN0503B；

9)组装试剂盒：将以下成分组装成一整套完整的试剂盒，包括100mL固定液，1L清洗液(10X)，20mL过氧化物酶封闭剂、5mL CK广工作液、5mLVIM工作液、5mL TTF1工作液、5mLp40工作液、20mL酶标羊抗鼠/兔聚合物工作液、2mLDAB显色底物、30mL DAB显色缓冲液和20mL苏木素复染液。

实施例2

该实施例提供了将实施例1所述的免疫组化试剂盒应用于术中肺肿物切除样本，在肺肿物切除样本冰冻切片上实施免疫组化染色检测，步骤如下：

1)取病例A手术切除肺标本置于滴有少许OCT包埋剂的冻头上，冷冻至适宜硬度，备冰冻切片5张，分别标注为1号、2号、3号、4号、5号，其中1号切片进行HE染色，其余切片进行快速免疫组化染色；

2)在固定液中固定30S-1min；

3)过氧化物酶封闭：过氧化物酶封闭剂孵育，常温孵育20s，TBSB缓冲液冲洗5S；

4)抗体孵育：2号、3、号、4号、5号切片分别孵育CK广、VIM、TTF1和P40抗体，室温孵育3分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

5)酶标羊抗鼠/兔聚合物溶液孵育：孵育3分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

6)DAB显色剂显色：切片显色1-2分钟，蒸馏水冲洗5S；

7)衬染：苏木素染色液复染5-10S，蒸馏水冲洗；

8)脱水、封片，观察。

图1为HE染色结果图，图2图3图4图5分别为CK广、VIM、TTF1和P40的快速免疫组化染色结果图。由图2-5可知，CK广(+)、VIM(+)、TTF1(+)、P40(-)，快速免疫组化染色效果良好，信号清晰，易于判断。根据HE切片和免疫组化结果综合判断，该病例为表面细胞型硬化性肺细胞瘤。由此可知，本发明提供的试剂盒可以在短时间内完成冰冻手术组织的免疫组化染色试验，辅助HE进行肺部肿物硬化性血管瘤和肺癌的鉴别诊断，并对硬化性肺细胞瘤进行分类。

对比例1

该对比例对肺部肿物冰冻组织切片进行冰冻免疫组化染色，分别用TBSB和TBST清洗液清洗，其他实验条件均相同。

冰冻免疫组化步骤如下:

1)取肺部肿物组织置于滴有少许OCT包埋剂的冻头上，冷冻至适宜硬度，制备冰冻切片2张，厚度为5微米；

2)在固定液中固定30S，标为6号和7号，进行CK广免疫组化染色；

3)过氧化物酶封闭：6号切片进行过氧化物酶封闭剂孵育，常温孵育20S，TBST缓冲液冲洗5S，7号切片进行过氧化物酶封闭剂孵育，常温孵育20S，TBSB缓冲液冲洗5S；

4)抗体孵育：6号切片孵育抗体CK广，常温孵育4分钟，TBST缓冲液冲洗5S，7号切片孵育抗体CK广，常温孵育4分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

5)酶标羊抗鼠/兔聚合物溶液孵育：6号切片常温孵育2分钟，TBST缓冲液冲洗5S，7号切片常温孵育3分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

6)DAB显色剂显色：切片显色1分钟，蒸馏水冲洗5S；

7)衬染：苏木素染色液孵育5S，蒸馏水冲洗；

8)脱水、封片，观察。

图6为TBST清洗，肺部肿物CK广染色效果，图7为TBSB清洗，肺部肿物CK广染色效果。TBSB清洗背景更干净，非特异性着色减少，结果更易判别。

对比例2

对病例B肺部肿物冰冻组织切片1张进行冰冻HE染色；病人C肺部肿物冰冻组织切片5张，分别进行HE染色和CK广、VIM、TTF1和P40冰冻免疫组化项目染色。

冰冻免疫组化步骤如下:

1)取肺肿物组织置于滴有少许OCT包埋剂的冻头上，冷冻至适宜硬度，制备冰冻切片，厚度为5微米；

2)在固定液中固定30S，病例B切片标为8号进行HE染色，病例C切片标注为9号、10号、11号、12号、13号，分进行HE染色和CK广、VIM、TTF1、P40快速免疫组化染色；

3)过氧化物酶封闭：常温孵育20S，TBSB缓冲液冲洗5S；

4)抗体孵育：10号、11号、12号、13号分别孵育抗体CK广、VIM、TTF1、P40常温孵育4分钟，TBSB缓冲液冲洗10S；

5)酶标羊抗鼠/兔聚合物溶液孵育：切片常温孵育1分钟，TBSB缓冲液冲洗10S；

6)DAB显色剂显色：切片显色1.5分钟，蒸馏水冲洗5S；

7)衬染：苏木素染色液孵育10S，蒸馏水冲洗；

8)脱水、封片，观察。

图8为病例B肺部肿物术中病理检测结果图，图9是病例C的HE染色结果，图10、图11、图12、图13分别为病例C的CK广、VIM、TTF1、P40染色结果。由图9-13可知，CK广(-)、VIM(+)、TTF1(+)、P40(-)，病理医师可结合冰冻HE和冰冻免疫组化染色结果综合判断，该病例为圆形细胞型硬化性肺细胞瘤。病例C结果可参考指标较多，更易对疾病进行鉴别诊断。

试验例1

该试验例将实施例1所述的免疫组化试剂盒应用于病例D肺肿物冰冻免疫组化染色检测。

具体步骤如下：

1)取肺部肿物置于滴有少许OCT包埋剂的冻头上，冷冻至适宜硬度，制备冰冻切片5张，厚度为5微米；

2)在固定液中固定30S，切片分别标注为14号、15号、16号、17号、18号，进行HE染色和CK广、VIM、TTF1、P40快速免疫组化染色；

4)抗体孵育：14号、15号、16号、17号、18号，进行HE染色和CK广、VIM、TTF1、P40，常温孵育2分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

5)酶标羊抗鼠/兔聚合物溶液孵育：常温孵育3分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

6)DAB显色剂显色：切片显色2分钟，蒸馏水冲洗5S；

7)衬染：苏木素染色液孵育10S，蒸馏水冲洗；

8)脱水、封片，观察。

图14是HE染色结果，图15、图16、图17、图18分别CK广、VIM、TTF1、P40染色结果。由图14-18可知，CK广(+)、VIM(-)、TTF1(-)、P40(+)，病理医师可结合冰冻HE和冰冻免疫组化染色结果综合判断，该病例为肺鳞癌。

试验例2

该试验例将实施例1所述的免疫组化试剂盒应用于病例E肺肿物冰冻免疫组化染色检测。

具体步骤如下：

2)在固定液中固定30S，切片分别标注为19号、20号、21号、22号、23号，进行HE染色和CK广、VIM、TTF1、P40快速免疫组化染色；

4)抗体孵育：20号、21号、22号、23号，进行HE染色和CK广、VIM、TTF1、P40，常温孵育3分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

5)酶标羊抗鼠/兔聚合物溶液孵育：常温孵育2分钟，TBSB缓冲液冲洗5S；

6)DAB显色剂显色：切片显色1.5分钟，蒸馏水冲洗5S；

7)衬染：苏木素染色液孵育10S，蒸馏水冲洗；

8)脱水、封片，观察。

图19是HE染色结果，图20、图21、图22、图23分别CK广、VIM、TTF1、P40染色结果。由图20-23可知，CK广(+)、VIM(-)、TTF1(+)、P40(-)，病理医师可结合冰冻HE和冰冻免疫组化染色结果综合判断，该病例为肺腺癌。

最后说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制。上文中已经用具体实施方案描述了本发明的基本原理和主要特征，在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或替换，但这些修改或者替换并不使相应技术方案的本质脱离本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，其特征在于，包括冰冻固定液、过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液以及清洗缓冲液，其中，所述一抗试剂包括CK广(AE1/AE3)抗体工作液、P40抗体工作液、TTF1抗体工作液和VIM抗体工作液；所述二抗试剂为酶标羊抗鼠/兔多聚物。

2.根据权利要求1所述的术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述清洗缓冲液为TBSB缓冲液。

3.根据权利要求1所述的术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述一抗试剂每毫升添加0.5～1％的曲拉通100。

4.根据权利要求1所述的术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述冰冻固定液为丙酮或福尔马林为主要成分的固定液及其衍生固定液。

5.根据权利要求1所述的术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述过氧化物酶封闭剂的主要成分为过氧化氢，含量为3％～3.5％。

6.根据权利要求1所述的术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述DAB显色底物主要由3,3＇-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物、Tris、EDTA组成。

7.根据权利要求1所述的术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述DAB显色缓冲液主要由Tris、EDTA、过氧化氢、显色剂组成。