CN113484313B - 用于免疫组化检测的dab显色试剂盒及其应用 - Google Patents

用于免疫组化检测的dab显色试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于免疫组织化学检测的DAB显色试剂盒，属于免疫组化检测技术领域。所述DAB显色试剂盒包括DAB缓冲液和DAB色原，所述DAB缓冲液包括咪唑、4‑壬基苯基‑聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA溶液和焦磷酸钠；所述DAB色原包括：1,2‑丙二醇和3,3‑二氨基联苯胺四氯盐水合物，进一步，所述试剂盒还包括DAB增强剂，所述DAB增强剂包括硫酸铜、氧化钠、氧化钾、蔗糖和苯扎氯铵。本发明进一步公开了所述DAB显色试剂盒的应用。利用本发明的DAB显色试剂盒进行免疫组化检测，能够显著提高染色强度和灵敏度，并且本发明的DAB显色试剂盒组分简单，易于配制，具有极佳的稳定性。

Description

用于免疫组化检测的DAB显色试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于免疫组化检测技术领域，具体地，涉及一种用于免疫组化检测的DAB显色试剂盒及其应用。
背景技术
免疫组织化学(简称免疫组化)是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的底物显色，来确定组织中是否有目标抗原及其表达情况的检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组化技术的不断发展，给临床病理和科研项目带来了很大帮助。
在免疫组化操作过程中，显色是一个很重要的环节。显色时选用不同的显色剂，可以使终产物形成不同的颜色。DAB染色法以其显色终产物的稳定性强，及切片可脱水、透明、长期保存等优点而被广泛应用于免疫组化。
DAB染色法也叫二氨基联苯胺法，是过氧化物酶的显色底物，适用于辣根过氧化物酶HRP标记的免疫印记或免疫组化反应，用于检测细胞中过氧化物酶的活性部位。其原理是：细胞颗粒中的过氧化物酶，能将过氧化氢中的氧释放出来，氧化二氨基联苯胺，形成棕黄色沉淀而定位于过氧化物酶活性的部位，显色充分后将标本及时脱水封固，其终产物可直接在光镜下观察。
DAB试剂盒的配制方法和浓度对免疫组织化学的检测强度及显色稳定性起关键作用。现有免疫组织化学法使用的DAB试剂盒组分多样，大多存在以下问题：(1)过氧化氢含量的多少将影响免疫组化显色的强度及稳定性。过氧化氢含量过低将导致显色过弱或显色时间延长，过氧化氢超过适宜浓度将使反应过快而背景加深。因过氧化氢在一般环境中会缓慢分解成水和氧气，而导致常规DAB底物缓冲液中过氧化氢稳定性较差、效期较短；(2)有些DAB显色试剂盒为保护过氧化氢及延缓DAB氧化作用，会添加各种保护剂或稳定剂，而使其组分成分复杂工艺繁琐；(3)常规DAB试剂盒对低丰度抗原的检测敏感度低；(4)常规DAB试剂盒中，色原与底物缓冲液混合后，需现配现用，不能长时间保存。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种新型的DAB试剂盒及其制备方法，可以提高针对低丰度抗原进行免疫组化检测的强度、灵敏度和稳定性。为此，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种用于免疫组织化学检测的DAB显色试剂盒，包括DAB缓冲液和DAB色原，所述DAB缓冲液包括咪唑、4-壬基苯基-聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA溶液和焦磷酸钠；所述DAB色原包括：1,2-丙二醇和3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物。
在本发明的一些实施方案中，在DAB缓冲液中，所述咪唑的摩尔浓度为25mM-100mM，所述4-壬基本基-聚乙二醇的体积分数为0.05％～0.2％，所述苯扎氯铵的体积分数为0.005％～0.02％，所述过氧过氢的质量分数为0.02％～0.04％，所述焦磷酸钠的质量分数为0.05％～0.2％，所述EDTA的摩尔浓度为50nM～100nM。
在本发明的一些具体实施方案中，在DAB缓冲液中，所述咪唑的摩尔浓度为50mM，所述4-壬基本基-聚乙二醇的体积分数为0.1％，所述苯扎氯铵的体积分数为0.01％，所述过氧过氢的质量分数为0.03％，所述焦磷酸钠的质量分数为0.1％，所述EDTA的摩尔浓度为100nM。
在本发明的一些实施方案中，所述DAB缓冲液的pH值为7.2～7.6。
在本发明的一些实施方案中，在20×DAB色原中，所述1,2-丙二醇的体积分数为25％～50％，所述3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物的质量分数为2％～4％。
在本发明的一些具体实施方案中，在20×DAB色原中，所述1,2-丙二醇的体积分数为50％，所述3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物的质量分数为2％～4％。
在本发明的一些优选实施方案中，所述试剂盒包括利用DAB显色缓冲液将20×色原稀释成1×的工作液。当然，本领域技术人员也可以根据实际需要，直接按照上述配方预先配制所述工作液，均不脱离本发明公开和保护的范围。该工作液可在加入待检样本前于2-8℃存放7-20天或更长时间，存放后的显色工作液仍能保证检测的灵敏度和可靠性。
在本发明的一些实施方案中，进一步地，所述试剂盒还包括DAB增强剂。
在本发明的一些优选实施方案中，所述DAB增强剂包括硫酸铜、氧化钠、氧化钾、蔗糖和苯扎氯铵。
在本发明的一些更优选实施方案中，在20×DAB增强剂中，所述硫酸铜的质量分数为10％～20％，所述氯化钠的质量分数为10％～20％，所述氯化钾的质量分数为0.4～0.6％，所述蔗糖的质量分数为28-33％，所述苯扎氯铵的体积分数为0.1％～0.3％。
在本发明的一些更优选实施方案中，在20×DAB增强剂中，所述硫酸铜的质量分数为10％～20％，所述氯化钠的质量分数为18％，所述氯化钾的质量分数为0.5％，所述蔗糖的质量分数为30％，所述苯扎氯铵的体积分数为0.2％。
在本发明的一些更优选实施方案中，在20×DAB增强剂中，所述硫酸铜的质量分数为10％，所述氯化钠的质量分数为18％，所述氯化钾的质量分数为0.5％，所述蔗糖的质量分数为30％，所述苯扎氯铵的体积分数为0.2％。
在本发明的一些实施方案中，进一步地，所述DAB显色试剂盒还包括免疫组化试剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述免疫组化试剂包括内源性过氧化物酶封闭液、二抗、阴性质控样品、阳性质控样品、苏木素染液和终止液中的一种或多种。
本发明第二方面提供本第发明第一方面任一所述的DAB试剂盒在免疫组化检测中的应用，所述应用包括：
S1，利用DAB缓冲液将DAB色原稀释成1×工作液；
S2，将步骤S1得到的工作液加入至待测样本中孵育，优选地，孵育2～5min。
S3，镜检控制染色，待染色强度符合预期要求，终止染色。
在本发明的一些实施方案中，进一步包括：
S4，将所述待测样本水洗切片，所述利用1×增强剂孵育，优选地，孵育2～5min；
S5，镜检控制染色，待染色强度符合预期要求，终止染色。
在本发明中，所述DAB显色试剂盒的应用平台没有任何限制，可以用于人工免疫组化实验，还可用于全自动免疫组化系统的自动化实验。
应当理解的是，本发明的试剂盒并不局限于免疫组化检测，还可以用于任何需要进行组织染色的检测方法中，如原位杂交、蛋白质印迹。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种新型DAB显色试剂盒，包括DAB缓冲液和DAB色原，还可以包括DAB增强剂，可以提高免疫组织化学检测的强度和灵敏度。
本发明的DAB显色试剂盒添加了表面活性剂、稳定剂、防腐剂等，可以保持试剂的活性和稳定性，减少非特异性结合，降低非特异性的背景染色，提高实验的稳定性和灵敏度。
本发明的DAB显色试剂盒使用咪唑作为敏化剂，但可能会引起DAB的凝集，导致显色工作液在存放一定时间后出现沉淀；本发明使用4-壬基苯基-聚乙二醇，作为非离子表面活性剂以降低工作液中DAB的沉积速率，延长显色工作液的保存时间；本发明使用焦磷酸钠、EDTA作为保护剂和金属离子螯合剂，保护和稳定过氧化氢，降低其分解速率；本发明使用甲基乙二醇作为稳定剂，以延缓DAB的氧化速率，增加其稳定性；本发明使用苯扎氯铵作为阳离子表面活性剂、抑菌防腐剂，增加DAB缓冲液的储存稳定性。
本发明的DAB显色试剂盒，通过将DAB缓冲液稀释DAB色原配制成显色工作液，能够在2-8℃保存下储存较长的期限，本领域技术人员可以根据具体实验情况灵活安排实验，不局限于显色液的现配现用，不仅增加了实验的自由度和灵活度，还降低了检测成本节约了检测时间。
本发明的DAB显色试剂盒可作为免疫学实验的显色试剂，由其产生的终产物颜色为棕黄色，本领域普通技术人员可根据具体实验需要，通过是否添加DAB增强剂或控制增强剂的孵育时间，来调节显色终产物的颜色深浅度，以达到最佳展示实验结果的目的，增加了实验的可控性。
本发明的DAB显色试剂盒可作为免疫学实验的显色试剂，本领域普通技术人员可根据抗原丰度情况、一抗二抗灵敏度情况等，通过是否添加DAB增强剂或控制增强剂的孵育时间，来调节染色强度，以达到最佳展示实验结果的目的，增加了实验的灵敏度和可控性。
相对于现有的DAB显色试剂盒，本发明的DAB显色试剂盒在保证染色强度的前提下，降低成本，并且显色工作液无需现配现用，可2-8℃较长时间存放且可通过增强剂把控染色强度。
附图说明
图1示出了A#2和B#17配制成的显色工作液和Advanced Biosystems对照试剂配制成的显色工作液在2-8℃分别放置第0天、3天和20天的外观性状。
图2示出了利用A#2和B#17配制成的显色工作液和Advanced Biosystems对照试剂配制成的显色工作液在2-8℃分别放置第0天、3天和20天后，利用单克隆抗体CK18，对结肠组织进行免疫组化染色的结果。
图3示出了利用A#2和B#17配制成的显色工作液和Advanced Biosystems对照试剂配制成的显色工作液显色清洗后使用C#24孵育，利用单克隆抗体CK18对结肠组织进行免疫组化染色的结果。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 DAB缓冲液A#1-A#4的配制
本实施例提供4种DAB缓冲液A#1-A#4，均包括咪唑、4-壬基苯基-聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA和焦磷酸钠，区别仅在于过氧化氢用量不同，具体组分如表1所示。
表1 DAB缓冲液A#1-A#4组分
Figure BDA0003178258570000071
制备方法如下：
准确称取或量取咪唑、4-壬基苯基-聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA和焦磷酸钠于洁净灭菌容器中，加200mL纯化水充分搅拌混匀后，用盐酸调pH至7.6，再加纯化水定容至250mL。充分混匀后用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例2 DAB缓冲液A#5-A#11的配制
本实施例提供7种DAB缓冲液A#5-A#11，均包括咪唑和4-壬基苯基-聚乙二醇，还包括苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA和/或焦磷酸钠，具体组分如表2所示。
表2 DAB缓冲液A#5-A#11组分
Figure BDA0003178258570000072
Figure BDA0003178258570000081
制备方法如下：
准确称取或量取咪唑、4-壬基苯基-聚乙二醇，以及苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA和焦磷酸钠中的一种或两种或三种于洁净灭菌容器中，加200mL纯化水充分搅拌混匀后，用盐酸调pH至7.6，再加纯化水定容至250mL。充分混匀后用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例3 DAB缓冲液A#12-A#15的配制
本实施例提供4种DAB缓冲液A#12-A#15，均包括咪唑、4-壬基苯基-聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA和焦磷酸钠，区别是pH值不同，具体组分如表3所示。
表3 DAB缓冲液A#12-A#15组分
Figure BDA0003178258570000082
制备方法如下：
准确称取或量取咪唑、4-壬基苯基-聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA和焦磷酸钠于洁净灭菌容器中，加200mL纯化水充分搅拌混匀后，用盐酸调至所需pH，再加纯化水定容至250mL。充分混匀后用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例4 DAB色原B#16-B#19的配制
本实施例提供4种DAB色原B#16-B#19，均包括甲基乙二醇和3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物，区别在于3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物用量不同，具体组分如表4所示。
表4 DAB色原B#16-B#19组分
Figure BDA0003178258570000091
制备方法如下：
准确量取1,2-丙二醇(甲基乙二醇)于洁净灭菌EP管中，加2.5mL纯化水充分搅拌混匀后，称取3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物于前述洁净灭菌EP管中，充分混匀后用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例5 DAB色原B#20-B#22的配制
本实施例提供3种DAB色原B#20-B#22，均包括甲基乙二醇和3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物，区别在于，甲基乙二醇的用量不同，具体组分如表5所示。
表5 DAB色原B#20-B#22组分
Figure BDA0003178258570000092
制备方法如下：
准确量取1,2-丙二醇(甲基乙二醇)于洁净灭菌EP管中，加适当体积纯化水充分搅拌混匀后，称取适当3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物于前述洁净灭菌EP管中，充分混匀后用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例6 DAB增强剂C#23-C#26的配制
本实施例提供4种DAB增强剂C#23-C#26，均包括五水硫酸铜、氯化钠、氯化钾、蔗糖和苯扎氯铵，具体组分如表6所示。
表6 DAB增强剂C#23-C#26组分
Figure BDA0003178258570000101
制备方法如下：
准确称取或量取五水硫酸铜、氯化钠、氯化钾、蔗糖和10％苯扎氯铵于洁净灭菌容器中，加纯化水充分搅拌混匀，充分混匀后用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例7 DAB增强剂C#27-C#33的配制
本实施例提供7种DAB增强剂C#27-C#30，均包括五水硫酸铜，以及氯化铁、氯化钠、氯化钾、蔗糖和苯扎氯铵中的一种，具体组分如表7所示。
表7 DAB增强剂C#27-C#33组分
Figure BDA0003178258570000102
Figure BDA0003178258570000111
制备方法如下：
准确称取或量取五水硫酸铜或氯化铁、氯化钠、氯化钾、蔗糖、10％苯扎氯铵于洁净灭菌容器中，加适量纯化水充分搅拌混匀，充分混匀后用0.22μm滤膜过滤后保存备用。
实施例8不同试剂组合的效果检测
(1)试剂材料
分别用上述配好的A液、B液、C液按不同组合稀释成工作液进行免疫组化检验，所用的抗体货号、克隆号、稀释度见表8。
表8抗体信息
抗体靶点 货号 克隆号 稀释度 供应商
PMS2 BX50112B BP6116 1:200 杭州百凌生物科技有限公司
CK18 BX50049 BP6054 1:200 杭州百凌生物科技有限公司
CD10 BX50054 BP6059 1:200 杭州百凌生物科技有限公司
p40 I10172E BP6033 工作液成品 图凌(杭州)生物医药有限公司
MSH6 I10102E BP6007 工作液成品 图凌(杭州)生物医药有限公司
CK-20 I10312E BP6030 工作液成品 图凌(杭州)生物医药有限公司
Vimentin I10032E BP6010 工作液成品 图凌(杭州)生物医药有限公司
CEA I10602E BP6085 工作液成品 图凌(杭州)生物医药有限公司
CD4 I10302E BP6028 工作液成品 图凌(杭州)生物医药有限公司
(2)对照品：
表9对照品信息
产品名称 规格 货号 批号 生产商
DAB substrate buffer 1000mL DAB R0929-58513 AdvancedBiosystems
DABChromogen(20×) 50mL DAB R0929-58513 AdvancedBiosystems
(3)检测步骤：
将载有组织样本的切片进行加热烤片后，再进行脱蜡水化。使用抗原修复缓冲液对切片进行加热修复，降温后清洗切片。添加3％过氧化氢溶液，淬灭内源性过氧化物酶的活性。使用上述一抗孵育切片，室温孵育30分钟。添加偶联了HRP的多聚物二抗，室温孵育30分钟。添加DAB显色工作液(A液B液组合)，室温孵育2分钟后水洗终止。可根据显色强度和抗原丰度，在显色终止后，选择性添加DAB增强剂，室温孵育(孵育时间可通过预检或镜检摸索控制)后水洗终止。最后进行苏木素复染、脱水透明。切片取出吹干后，中性树胶封片。
(4)检测结果：
分别利用实施例配制的DAB缓冲液A液#1-A#15，将DAB色原B液#17稀释成1×显色工作液，使用前述单克隆抗体，进行组织染色，以AdvancedBiosystems的DAB显色剂作对照。染色结果如表10、表11所示。
表10单克隆抗体名称和对应的组织染色情况
Figure BDA0003178258570000121
其中，“+”之前的数字表示染色强度，数字越大，染色越强。(-)表示预期定位无染色，(1+)表示预期定位染色弱，阳性染色为浅黄；(2+)表示染色清楚可见，阳性染色为黄色；(3+)表示染色清晰明显，阳性染色为棕黄色；(4+)表示染色很深很明显，阳性染色为深棕色；(2.5+)表示介于(2+)和(3+)之间，(3.5+)表示介于(3+)和(4+)之间。待检试剂的染色强度与对照试剂强度相同，并且阳性细胞百分比满足检测要求认为染色符合要求；待检试剂的染色强度强于对照试剂，且无背景染色，可认为待测试剂的染色优于对照试剂。
由表10可知，A#1与B#17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有5个抗体染色弱或偏弱，4个抗体染色符合要求；A#2、A#3、A#13和A#14与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，9个抗体染色均符合要求；A#4与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有3个抗体染色出现弱背景，6个抗体染色符合要求；A#12与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有2个抗体染色弱或偏弱，7个抗体染色符合要求；A#15与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化显色，有2个抗体染色出现弱背景，7个抗体染色符合要求。由此说明，DAB缓冲液(A液)中过氧化氢的最适质量分数为0.02％～0.04％，其最适pH范围为7.4～7.6。
表11单克隆抗体名称和对应的组织染色情况
抗体靶点 组织 A5B17 A6B17 A7B17 A8B17 A9B17 A10B17 A11B17 A2B17 对照
PMS2 结肠 1+ 1+ 1.5+ 1.5+ 1+ 1+ 1+ 2+ 2+
CK18 结肠 2+ 2+ 2.5+ 2.5+ 2+ 2+ 2+ 2.5+ 2.5+
CD10 肾透明细胞癌 2+ 2.5+ 2.5+ 2.5+ 2.5+ 2+ 2+ 2.5+ 2.5+
p40 肺鳞癌 2+ 2.5+ 2.5+ 2.5+ 2.5+ 2.5+ 2.5+ 2.5+ 2.5+
MSH6 结肠癌 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+
CK-20 结肠癌 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+
Vimentin 结肠 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+
CEA 结肠癌 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+
CD4 扁桃体 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+ 3.5+
由表11可知，A#5与B#17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有4个抗体染色偏弱，5个抗体染色符合要求；A#6与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有2个抗体染色偏弱，5个抗体染色符合要求；A#7与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有1个抗体染色偏弱，8个抗体染色符合要求；A#8与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有1个抗体染色偏弱，8个抗体染色符合要求；A#9与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化显色，有2个抗体染色偏弱，7个抗体染色符合要求；A#10与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化显色，有3个抗体染色偏弱，6个抗体染色符合要求；A#11与B17配制成的显色工作液，所进行的免疫组化显色，有3个抗体染色偏弱，6个抗体染色符合要求。由此说明，焦磷酸钠、EDTA和苯扎氯铵作为保护剂、金属离子螯合剂和阳离子表面活性剂，三种成分在DAB缓冲液中按适当比例添加可增加免疫组化染色效果。
利用实施例配制的DAB缓冲液A液#2，将DAB色原B液#16-#19稀释成1×显色工作液，使用前述单克隆抗体，进行组织染色，以Advanced Biosystems的DAB显色剂作对照。染色结果如表12所示。
表12单克隆抗体名称和对应的组织染色情况
Figure BDA0003178258570000141
由表12可知，A#2与B#16配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有4个抗体染色弱或偏弱，5个抗体染色符合要求；A#2与B17或B18配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，9个抗体染色均符合要求；A#2与B19配制成的显色工作液，所进行的免疫组化检测，有2个抗体染色出现少量色块沉积现象，7个抗体染色符合要求。由此说明，DAB色原(B液)中3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物的最适质量分数为2％～4％。
分别利用上述配制的DAB缓冲液A#2或A#3，将DAB色原B#20-B#22或B17-B18配制成1×显色工作液，配制后的显色工作液置于2-8℃冰箱，分别在保存第0天、3天、7天、13天、20天、27天后，取出进行外观性状的观察和进行免疫组化检测，以Advanced Biosystems的DAB显色剂作对照。观察和染色结果如表13所示。
表13单克隆抗体名称和对应的组织染色情况
Figure BDA0003178258570000142
Figure BDA0003178258570000151
Figure BDA0003178258570000161
由表13可知，A#2或A#3与B#17配制成的显色工作液，在2-8℃保存0-20天后，均无沉淀析出，取出进行免疫组化检测，3个抗体染色符合要求；A#2或A#3与B18配制成的显色工作液，在2-8℃保存0-20天后，均无沉淀析出，取出进行免疫组化检测，3个抗体染色均符合要求。而对照试剂在2-8℃放置3天后，便出现沉淀，取出进行免疫组化检测，3个抗体的检测均出现少量色块沉积现象。由此说明，表中A#2或A#3与B#17或B18组合配制的显色工作液可以在2-8℃保存20天或更长时间，用户可根据实验情况灵活安排实验，增加了实验的自由度和灵活度。A#2与B#20配制成的显色工作液，在2-8℃保存3天后，便出现沉淀，取出进行免疫组化检测，3个抗体的检测均出现少量色块沉积现象；A2与B21配制成的显色工作液，在2-8℃保存0-20天后，均无沉淀析出，取出进行免疫组化检测，3个抗体染色符合要求；A2与B21配制成的显色工作液，不溶物较多，过滤后进行免疫组化检测，3个抗体的染色均比对照弱。由此说明，合适比例的甲基乙二醇可作为稳定剂，延缓DAB的氧化速率，增加了DAB色原的稳定性。
分别利用实施例配制的DAB增强剂C液#23-C#33(事先用纯化水将其稀释成1×工作液)，进行免疫组化检测(DAB显色工作液为A2B17组合)，以未孵育DAB增强剂的染色作对照。染色结果如表14所示。
表14单克隆抗体名称和对应的组织染色情况
Figure BDA0003178258570000162
Figure BDA0003178258570000171
由表14可知，A#2与B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#23孵育，3个抗体染色均无明显增强；A#2与B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#24或C#25孵育，3个抗体染色均有所增强，符合预期要求；A#2与B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#26孵育，2个抗体染色出现色块或背景。由此说明，DAB增强剂(C液)中五水硫酸铜的最适质量分数为10％～20％。A#2与B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#27孵育，染色效果有所增强，但短时间内增强不明显；A#2与B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#28或C#29或C#30或C#31孵育，染色效果与使用C#27效果相近，短时间内染色增强不明显；A#2与B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#32或C#33孵育，增强效果相对优于使用C#27的增强效果，但相对劣于使用C24或C25的增强效果。由此说明，合适的增强剂溶剂组分对染色增强有辅助增益效果。
实施例9 A#2和B#17配制成的显色工作液的染色效果和稳定性测试
发明人利用A#2和B#17配制成的显色工作液，在2-8℃分别放置第0天、3天和20天的外观性状观察如图1上面3幅图所示。利用Advanced Biosystems对照试剂配制成的显色工作液，在2-8℃分别放置第0天、3天和20天的外观性状观察如图1下面3幅图所示。
发明人进利用A#2和B#17配制成的显色工作液，在2-8℃分别放置第0天、3天和20天后，进一步利用单克隆抗体CK18，对结肠组织进行免疫组化染色的结果如图2上面3幅图所示。发明人利用Advanced Biosystems对照试剂配制成的显色工作液，在2-8℃分别放置第0天、3天和20天后，利用单克隆抗体CK18，对结肠组织进行免疫组化染色的结果如图2下面3幅图所示。
由图1-2可知，利用A#2和B#17配制成的显色工作液，及对照试剂配制成的显色工作液，染色效果均比较理想。但A#2和B#17配制成的显色工作液在2-8℃保存20天后再进行染色，仍有非常好的染色效果和外观性状；但利用对照试剂配制成的显色工作液在2-8℃保存3天即出现沉淀，且免疫组化染色出现色块沉积现象。
实施例10 A#2和B#17配制成的显色工作液及增强剂C#24增强剂的检测效果
发明人利用A#2和B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#24孵育，利用单克隆抗体CK18对结肠组织进行免疫组化染色的结果如图3左边图所示。
发明人利用A#2和B#17配制成的显色工作液，利用单克隆抗体CK18对结肠组织进行免疫组化染色的结果如图3右边图所示。
由图3可知，A#2与B#17配制成的显色工作液，显色清洗后使用C#24孵育，利用单克隆抗体CK18对结肠组织进行免疫组化染色，染色强度比未使用增强剂孵育的切片明显增强。
综上，本发明所提供的DAB显色试剂盒可以提高免疫组织化学检测的强度、灵敏度和稳定性。本发明提供的DAB显色试剂盒可用于手工和仪器两种平台，由其配制的DAB显色工作液在2-8℃保存下具有较长的储存期限。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种用于免疫组织化学检测的DAB显色试剂盒，包括DAB缓冲液和DAB色原，其特征在于，所述DAB缓冲液包括咪唑、4-壬基苯基-聚乙二醇、苯扎氯铵、过氧化氢、EDTA和焦磷酸钠，其中，所述咪唑的摩尔浓度为25mM-100mM，所述4-壬基苯基-聚乙二醇的体积分数为0.05%~0.2%，所述苯扎氯铵的体积分数为0.005%~0.02%，所述过氧化氢的质量分数为0.02%~0.04%，所述焦磷酸钠的质量分数为0.05%~0.2%，所述EDTA的摩尔浓度为50nM~100nM，所述DAB缓冲液的pH值为7.4~7.6；所述DAB色原为1,2-丙二醇和3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物的水溶液，其中，在20×DAB色原中，所述3,3-二氨基联苯胺四氯盐水合物的质量分数为2%~4%，所述1,2-丙二醇的体积分数为25%~50%。
2.根据权利要求1所述的DAB显色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DAB增强剂。
3.根据权利要求2所述的DAB显色试剂盒，其特征在于，所述DAB增强剂包括硫酸铜、氯化钠、氯化钾、蔗糖和苯扎氯铵。
4.根据权利要求3所述的DAB显色试剂盒，其特征在于，在20×DAB增强剂中，所述硫酸铜的质量分数为10%~20%，所述氯化钠的质量分数为10%~20%，所述氯化钾的质量分数为0.4~0.6%，所述蔗糖的质量分数为28-33%，所述苯扎氯铵的体积分数为0.1%~0.3%。
5.根据权利要求4所述的DAB显色试剂盒，其特征在于，所述DAB显色试剂盒还包括免疫组化试剂。
6.权利要求5所述的DAB显色试剂盒在免疫组化检测中的应用，其特征在于，所述应用包括：
S1，利用DAB缓冲液将DAB色原稀释成1×工作液；
S2，将步骤S1得到的工作液加入至待测样本中孵育；
S3，镜检控制染色，待染色强度符合预期要求，终止染色。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，进一步包括：
S4，将步骤S3终止染色后的待测样本水洗切片，利用1×增强剂孵育；
S5，镜检控制染色，待染色强度符合预期要求，终止染色。
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