JP3503890B2 - 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬 - Google Patents

改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬

Info

Publication number
JP3503890B2
JP3503890B2 JP2001008926A JP2001008926A JP3503890B2 JP 3503890 B2 JP3503890 B2 JP 3503890B2 JP 2001008926 A JP2001008926 A JP 2001008926A JP 2001008926 A JP2001008926 A JP 2001008926A JP 3503890 B2 JP3503890 B2 JP 3503890B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
solution
antibody
peroxidase
slide
chromophore
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2001008926A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2001231552A (ja
Inventor
フイリツプ・シー・ミラー
マイケル・ジエイ・デグロフ
マイケル・ジエイ・ギジンスキ
ジエイムズ・エイ・リブスキ
パメラ・エス・バンデイボート
アンソニイ・エル・ハートマン
Original Assignee
ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド filed Critical ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド
Publication of JP2001231552A publication Critical patent/JP2001231552A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3503890B2 publication Critical patent/JP3503890B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • C12Q2326/10—Benzidines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00079—Evaporation covers for slides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00277—Special precautions to avoid contamination (e.g. enclosures, glove- boxes, sealed sample carriers, disposal of contaminated material)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/961—Chemistry: molecular biology and microbiology including a step of forming, releasing, or exposing the antigen or forming the hapten-immunogenic carrier complex or the antigen per se
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/112499—Automated chemical analysis with sample on test slide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はスライドの免疫組織
化学的に染色する改良された方法、とくに自動化された
方法、およびそのための試薬に関する。
【０００２】
【発明の背景】現在、免疫染色のために、一般にペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰＯ）を使用する４つの主な方法が認
識されている。これらの方法は試料の中の検出すべき抗
原に対して特異的な抗体と複合化する、その抗原の免疫
反応に基づく。これらの方法は、主として、抗原−抗体
の複合体を検出する方法において異なる。これらの方法
は直接的方法、間接的方法一次または第１抗体の種に対
して特異的な酵素接合二次抗体を使用する間接的方法、
ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）、お
よびビオチン接合二次抗体およびビオチン接合ペルオキ
シダーゼおよびアビジンまたはストレプトアビジンの複
合体を使用する、間接的ビオチン−アビジン法である。
【０００３】免疫組織化学的方法のすべて、ならびに他
の免疫化学的方法は、試薬の添加、インキュベーション
および洗浄のシーケンスから成る、多工程の手順であ
る。これらの手順の大部分は高度に訓練した人員を必要
とし、そして結果は実験室の間で有意に変化することが
ある。自動化されたシステムはコストの節約、スライド
の調製の均一性、および手順のヒトの誤差の減少を探索
してきている。
【０００４】自動化された方法およびマニュアルの方法
の両者について、ある数の考慮すべき重要な点が存在す
る。スライドから試料の損失を回避するために注意しな
くてはならない。試薬の適用の間に試料をよく洗浄する
ことは、残留物が増幅されるので、とくに、結合しない
抗体を除去することは必須である。過剰の液体を除去し
て望ましくない抗体の希釈を回避し、なお試料は決して
乾燥させないようになくてはならない。十分な抗体な試
薬を適用して、試料が存在しうるスライドの区域を完全
にカバーしなくてはならないが、不用なものは絶対最小
値に保持しなくてはならない。
【０００５】さらに、免疫組織化学的方法ならびに免疫
化学的方法において使用される試薬の多数、例えば、酵
素溶液およびペルオキシダーゼの発色試薬は、使用温度
においておよび室温においてさえ制限された安定性を有
する。これは試薬の頻繁な調製を必要とする。さらに、
非特異的抗体の結合は誤まった結果に導き、問題を残
す。
【０００６】結果を改良し、そして試薬の調製を最小と
する方法および試薬は、マニュアルおよび自動化の両者
の免疫組織化学的方法を促進するであろう。改良の多く
は、関係する免疫化学的、例えば、酵素結合免疫収着ア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイおよび正常部
位ハイブリダイゼーションに容易に適用することができ
る。
【０００７】
【先行技術の説明】コスグロウブ（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ）
ら、ＡＣＬ ｐｐ２３−２７（１９８９年１２月）は、
免疫染色法、とくにペルオキシダーゼ染色法、および自
動化染色装置を記載している。ブリガチ（Ｂｒｉｇａｔ
ｉ）および同僚達［ブリガチ（Ｂｒｉｇａｔｉ）ら、ジ
ャーナル・オブ・ヒストテクノロジー（Ｊ．Ｈｉｓｔｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１１：１６５−１８３（１９８
８）；ウンガー（Ｕｎｇｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・
ヒストテクノロジー（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ）１１：２５３−２５８（１９８８）］は、フィッ
シャー（Ｆｉｓｈｅｒ）の自動化ワークステーション
（これは免疫組織化学的染色法および正常部位ハイブリ
ダイゼーション法）および自動化法において使用する試
薬を記載している。さらに、このシステムおよび試薬は
米国特許第４,７７７,０２０号、米国特許第４,７９８,
７０６号および米国特許第４,８０１,４３１号に記載さ
れている。それらの装置の各々は、高価な（抗体含有）
試薬を保存する異なる方法を使用する。
【０００８】ストロス（Ｓｔｒｏｓｓ）ら、ジャーナル
・オブ・クリニカル・パソロジー（Ｊ．Ｃｌｉ．Ｐａｔ
ｈｏｌ．）４２：１０６−１１２（１９８９）は、抗体
含有試薬のマニュアル適用に従いスライドをプロセシン
グする、自動化された組織染色システムを記載してい
る。スターク（Ｓｔａｒｋ）ら、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ）１０７：８９−９２（１９８８）は、マイク
ロプロセッサー制御の自動化染色システムを記載してい
る。
【０００９】前述の参考文献の各々の全体はここに引用
によって加える。
【００１０】
【発明の要約】本発明は、免疫化学的試薬を使用してス
ライドを染色する改良された方法を提供する。好ましい
実施態様において、この方法は自動化されたプロセスに
おいて使用される。この方法は次の工程からなる。スラ
イドのアッセイ領域（組織の切片を含有する領域）を水
および洗浄剤からなる改良されたリンス溶液で洗浄す
る。蒸発抑制液体をスライドに適用してアッセイ領域を
カバーする。アンマスキングを必要とする抗原につい
て、組織の切片を改良された、安定化されたタンパク質
分解酵素の溶液と組み合わせる。スライドをリンスし、
そして蒸発抑制液体をスライドに再度適用する。第２抗
体と同一の種からのグロブリンを含有する改良された希
釈剤の中の一次抗体を組織の切片と、抗体の結合を実質
的に完結するために十分な時間の間、組み合わせる。ス
ライドをリンスし、そして蒸発抑制液体を再び適用す
る。改良された希釈剤の中の標識した第２抗体を組織の
切片と、抗体の結合を実質的に完結するために十分な時
間の間、組み合わせる。スライドをリンスし、そして蒸
発抑制液体を再び適用する。好ましい実施態様におい
て、安定化されたジアミノベンジン（ＤＡＢ）溶液を包
含する、発色試薬を組織の切片と、発色のために十分な
時間の間、組み合わせる。リンス、および、必要に応じ
て、ＤＡＢ色増強および／または反対染色後、組織の切
片は分析に準備された状態にある。
【００１１】この方法において使用した改良された試薬
を、また、記載する。
【００１２】
【発明の詳細な記述】本発明は、一般に免疫組織化学的
（ＩＨＣ）染色手順に、および、とくに、ペルオキシダ
ーゼの標識つけ試薬を使用するＩＨＣ法において有用で
ある、改良された組成物およびアッセイ法の工程を提供
する。しかしながら、組成物および方法の工程の多く
は、当業者に明瞭であるように、より一般の応用可能性
を有する。
【００１３】現在、４つの主な方法が免疫染色に一般に
使用されている。これらの方法は、抗原に対して特異的
な抗体と複合化する試料の中の抗原の免疫反応に基づ
く。これらの方法は抗原−抗体の複合体を検出する方法
が異なる。これらの方法の各々は標識された抗体を使用
する。
【００１４】ＩＨＣ技術を包含する、イムノアッセイ技
術に適当な標識はよく知られている。それらの標識は、
次のものを包含する：直接観察または測定することがで
きる標識、例えば、放射能カウンティング装置で測定す
ることができる放射線標識；分光光度測定で視的に観察
または測定することができる顔料、色素または他の色素
源；スピン標識分析器で測定できるスピン標識；および
紫外線下で可視化または、例えば、標準のフルオロメー
ターで測定することができる蛍光部分。標識はルミネセ
ンス物質、例えば、リンまたはフルオロゲン、バイオル
ミネセンス物質、化学ルミネセンス物質または金属含有
金属であることができる。
【００１５】バックグラウンドからの増幅およびより大
きい分布は、酵素の標識または酵素の標識つけ系の使用
により達成することができる。酵素は基質を破壊して色
素源を生成し、スライド上の抗原／抗体複合体の部位を
可視化する。基質は好ましくは測定可能な生成物を生成
するよに選択する。発色性および蛍光発生性の酵素は好
ましい。これらは、それぞれ、色素源および蛍光源を生
成する基質が既知である酵素である。
【００１６】好ましい色素源の基質および酵素の組み合
わせは、オキシドリダクターゼ、例えば、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼおよび区別する色（それぞれ、褐色
および赤色）を生ずる基質、例えば、ジアミノベンジジ
ン（ＤＡＢ）およびアミノ−エチルカルバゾール（ＡＥ
Ｃ）を使用する。任意の他の酵素／色素源生成基質の組
み合わせは、それが区別する着色を提供する場合、使用
することができる。
【００１７】使用することができる蛍光源の基質との酵
素の組み合わせは、例えば、米国特許第４,１９０,４９
６号、その開示をここに引用によって加える、に記載さ
れている。好ましい蛍光源の基質およびそれに対応する
適当な酵素は、次のものを包含する：適当な基質がホモ
バニル酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニ
ル酢酸であるセイヨウワサビペルオキシダーゼ、適当な
基質が４−メチルウベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシ
ドであるベータ−ガラクトシダーゼ、適当な基質が４−
メチルウベリフェリルホスフェート、他のウベリフェリ
ルホスフェート、例えば、４−カルボキシウベリフェリ
ルホスフェート、およびウベリフェリルホスフェート４
−カルボキシアルキルエステルなどであるアルカリ性プ
ロテアーゼ。
【００１８】直接法において、抗体は標識、好ましくは
酵素、例えば、ペルオキシダーゼまたは蛍光団に化学的
に結合する。標識した抗体試薬を添加したとき、抗体は
抗原に結合して抗原−抗体／標識接合体の複合体を形成
する。蛍光団を直接可視化することができる。標識が酵
素であるとき、酵素の基質を適用し、そして着色した沈
澱物は抗原−抗体／酵素接合体の複合体の位置に生成す
る。
【００１９】検出すべき各抗原に対して特異的な標識し
た抗体を必要とする場合、直接法の適用は制限される。
このような試薬は一般に商業的に入手可能ではない。し
かしながら、試薬は入手可能でありかつ感度が十分であ
るとき、直接法は抗原の検出に好ましい方法である。
【００２０】第２の方法は、問題の抗原に対して特異的
な第１または一次抗体を使用して、初期の抗原−抗体複
合体を形成する。標識した抗体、好ましくは酵素接合抗
体は、第２または二次抗体と呼び、一次抗体の種に対し
て特異的であり、次いで、これを使用して一次抗体を検
出する。標識が酵素であるとき、基質を添加して複合体
を検出する。このようにして、同一の動物種において生
成した種々の一次抗体を、可視化のために、単一の標識
した第２抗体とともに使用することができる。さらに、
増強された感度は第２抗体の使用により達成される。
【００２１】第３の方法は、ペルオキシダーゼ−抗ペル
オキシダーゼまたはＰＡＰ法と呼び、広く使用されてい
る。ＰＡＰ法は３つの主な試薬を有する。一次および第
２抗体に加えて、ペルオキシダーゼをペルオキシダーゼ
に対する抗体と複合化する。第２または連鎖抗体は一次
抗体および抗ペルオキシダーゼ抗体の両者に対して特異
的である。この複合体は基質−色素源反応を使用して可
視化する。
【００２２】第４法、間接的ビオチン−アビジン法、に
おいて、第２抗体をビタミンのビオチンに接合する。第
３試薬は方法に依存して変化する。ＡＢＣ法において、
アビジンまたはストレプトアビジンをビオチン接合ペル
オキシダーゼの前にまたはそれと同時に添加する。ＬＡ
Ｂ法において、第３試薬はペルオキシダーゼ標識アビジ
ンまたはストレプトアビジンである。アビジン分子の遊
離部位は第２抗体上のビオチンに結合する。複合体を適
当な発色団で可視化する。ビオチンについてのアビジン
の強い親和性は、この方法に、他の接合抗体の技術より
大きい感度を与える。
【００２３】明瞭のためにかつ非限定的に、本発明は間
接的ビオチン−アビジンペルオキシダーゼ法により例示
される免疫組織化学的方法により記載する。当業者に明
らかなように、この方法の改良された工程は他の免疫組
織化学的方法において使用することができる。事実、改
良された工程の多数は免疫化学的方法に一般に使用する
ことができる。試薬および工程のあるものは、スライド
について実施される臨界的試薬濃度範囲を包含する、任
意の小さい体積のアッセイにアルカリ性プロテアーゼす
ることができる。当業者は認識するように、改良された
試薬は任意のＨＲＰＯ染色法において使用することがで
きる。さらに、試薬の多くは他の、ペルオキシダーゼ以
下意の免疫組織化学的染色法ならびに他の免疫化学的技
術において使用することができる。例示的方法において
使用する試薬の各々は、この方法において使用する順序
で、以下に記載する。
【００２４】ここで使用するとき、用語「アッセイ領
域」は、任意の１または２以上の試薬または試料、例え
ば、抗体または組織の切片を結合するスライドの区域を
意味する。用語「組織の切片」を使用して組織の切片
（ホルマリン固定、パラフィンに埋め込んだ切片および
凍結した切片の両者）、スミア、骨髄吸引液、サイトス
ピン、および評価、とくに組織学的評価のためにスライ
ドに添付した他の試料物質を呼ぶために使用する。
【００２５】試薬 改良された免疫化学的リンス溶液 試料またはアッセイ試薬をスライドに添付する先行技術
のアッセイ法、例えば、免疫化学的法（イムノアッセイ
および免疫組織化学的染色法）および正常部位ハイブリ
ダイゼーション（ＩＳＨ）法は、塩添加した緩衝液を使
用して、染色または他の抗体、酵素または核酸を含有す
る試薬の添加の間にスライドのアッセイ領域をリンスす
る。ここで使用するとき、用語「塩」は、溶液中でイオ
ンに解離する物質を意味し、そして中性塩、例えば、Ｎ
ａＣｌならびに緩衝液、とくに生物学的アッセイの手順
において使用される緩衝液の中に見いだされる酸性、ア
ルカリ性および両性の塩を包含する。
【００２６】塩添加した緩衝液の使用は、非特異的抗体
の結合を減少し、これによりバックグラウンドを減少す
る。塩の存在は、また、特異的抗原−抗体の相互作用、
酵素活性および試薬の核酸の反応が起こるために必要で
ある。
【００２７】スライドについて実施するアッセイのため
に、リンス溶液はスライドから完全に排除されず、そし
て残留してアッセイ試薬を希釈する。さらに、大過剰の
リンス溶液を使用して有効な希釈を保証して、スライド
のアッセイ領域における結合しない試薬を除去してバッ
クグラウンドのシグナルを減少する。したがって、免疫
組織化学的方法を包含する、スライド上で実施するほと
んどの方法は、次の反応を実施すべき緩衝液、通常リン
酸塩緩衝化生理的塩類溶液（ＰＢＳ）、リン酸塩緩衝液
（ＰＢ）または同様な生理学的緩衝液で洗浄する。
【００２８】洗浄液適用ステーション塩添加した緩衝液
の使用は、一般に、欠点を有し、自動化されたシステ
ム、とくに自動化された免疫組織化学的システムにおい
て、いくつかの問題を発生した。ＰＢＳの調製は、マニ
ュアルまたは自動化された方法のいずれにおいても使用
しても、時間を消費しかつ経費がかかる。さらに、ＰＢ
Ｓおよび他の生理学的緩衝液の中に含有される塩は、自
動化された染色計器に対して有害である。塩の蓄積はク
リーニングを困難とする。
【００２９】今回、洗浄剤を有する実質的に塩不含の水
溶液は、スライドのアッセイ領域の洗浄に有効な水性リ
ンス溶液であることが発見された。驚くべきことには、
このリンス溶液の使用免疫組織化学的調製物における染
色品質を改良する。さらに、改良されたリンス溶液の使
用は計器への有害な作用を排除する。
【００３０】今回、試薬の溶液の中に存在する塩はすぐ
れた染色に十分であること、および新規なリンス溶液は
試薬の相互作用を妨害しないことことが発見された。さ
らに、改良されたリンス溶液は調製が経費が低くかつ消
費時間が少ない。さらに、溶液のシートは均一に、より
効果的にスライドを洗浄する。これは、スライドをリン
ス溶液の浴の中に浸漬することができない自動化された
環境においてとくに重要である。
【００３１】本発明のリンス溶液は、実質的に塩不含の
水溶液および表面張力を減少して水性リンス溶液の平ら
なシートを形成するために十分な量の洗浄剤から本質的
に成る。大部分の適用のために、塩不含溶液は水であ
る。しかしながら、核の形態学の増大された保存が免疫
組織化学的応用におけるように望ましいとき、塩不含の
水溶液はトリス（Ｔｒｉｓ）である。
【００３２】塩不含の水溶液は、スライド上に残留物を
残すことがある因子を含有すべきではない。したがっ
て、水は蒸留水または、好ましくは、脱イオン水である
ことができる。水は免疫組織化学的染色の応用において
塩不含の水溶液として有用であるが、トリス（Ｔｒｉ
ｓ）溶液の使用はリンス溶液に塩を添加しないで核の形
態学を維持し、そして免疫組織化学的染色のために好ま
しい。好ましくは、トリス（Ｔｒｉｓ）の濃度は約０.
０５〜約０.５モル、より好ましくは約０.１モルであ
る。
【００３３】前述したように、洗浄剤はリンス溶液の平
らなシートを形成して、スライド区域全体を効果的にリ
ンスすることを保証する。洗浄剤は成分免疫組織化学的
染色試薬および免疫化学的試薬と相溶性であるべきであ
り、そしてタンパク質および膜の成分の可溶化のために
生化学的に使用されている非イオン性の生物学的洗浄剤
のいずれであることもできる。ポリオキシエチレンソル
ビタンおよびポリオキシエチレンエーテルは好ましい。
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［名称ツ
イーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で販売されている］およびポ
リオキシエチレン２３ラウリルエーテル［名称ブリジ
（Ｂｒｉｊ）３５で販売されている］はより好ましい。
両者の洗浄剤は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、ミゾリー州、セ
ントルイスを包含する種々の源から入手可能である。
【００３４】好ましくは、洗浄剤は約０.０１〜約５％
（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０.０５〜約１％（ｖ／
ｖ）、最も好ましくは約０.０５〜約０.５％（ｖ／ｖ）
の濃度で使用する。最も好ましい実施態様において、濃
度は０.０５％である。（ここで使用するとき、特記し
ない限り、％は１００ｍｌの合計の体積の中のグラム数
である重量％を意味する。ここに論ずる他の洗浄剤を含
有する溶液の各々について、適当な洗浄剤およびそれら
の濃度範囲はここに論ずる範囲から変化しない。
【００３５】リンス溶液は、好ましくは、保存剤、例え
ば、抗真菌剤および抗菌剤を溶液中の微生物の成長を阻
害する有効濃度で含む。免疫化学的反応を妨害しない保
存剤はよく知られている。保存剤の例は、ゲンタマイシ
ン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび、好ましく
はチメロサールである。アジ化ナトリウムはペルオキシ
ダーゼ酵素を不活性化することが知られており、そして
好ましくはＨＲＰＯＩＨＣ染色試薬とともに使用する。
保存剤は約０.００１％〜０.１％の範囲の濃度において
有効であり、そして好ましくは約０.０１〜約０.１％、
より好ましくは約０.０５％である。ここに記載する他
の保存剤を含有する溶液の各々について、適当な保存剤
およびそれらの濃度範囲はここに記載するものから変化
しない。
【００３６】好ましいリンス溶液は、脱イオン水の中の
約０.１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および約０.０
５％のチメロサールから成る。免疫組織化学的染色につ
いて、好ましいリンス溶液は脱イオン水の中の約０．１
モルのトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７.６、約０.０５％のブ
リジ（Ｂｒｉｊ）３５および約０.０５％のチメロサー
ルから成る。
【００３７】本発明のリンス溶液は、染色品質の有害と
ならないで計器への塩類の有害な作用を排除した。さら
に、リンス溶液は容易に調製され、そして先行技術の免
疫化学的洗浄溶液より安価である試薬を使用する。驚く
べきことには、このリンス溶液の使用は染色品質を実際
に改良することが発見された。研究において、また、リ
ンス溶液の中の塩の存在はすぐれた染色に十分であるこ
と、および本発明のリンス溶液の使用は試薬の相互作用
を妨害しないことを示す。とくに、リンス溶液の使用は
先行技術の緩衝化リンス溶液に比較して非特異的結合の
量を増加しない。リンス溶液を使用して任意の免疫化学
的技術においてスライドのアッセイ領域をリンスするこ
とができる。なぜなら、リンス溶液は抗体の結合または
酵素活性を妨害しないからである。
【００３８】蒸発抑制液体 免疫組織化学的または正常部位ハイブリダイゼーション
の反応において、インキュベーション期間の間のスライ
ド上の反応混合物の蒸発を防止することが重要である。
これは、反応速度のコントロールまたは増大に加熱を使
用するとき、反応混合物の体積が小さい場合、とくに重
要である。蒸発が起こる場合、試薬の濃度は変化するこ
とがあり、そして組織の切片は乾燥することがある。そ
れらの導管のいずれも誤差のある結果を引き起こすこと
がある。
【００３９】伝統的には、蒸発は加湿したチャンバーの
中にスライドを配置するか、あるいはガラスのカバース
リップをスライドの上に配置しそしてカバースリップの
側面をシールすることによってコントロールされる。こ
れらの方法の両者は時間を消費しかつ面倒である。さら
に、ガラスのカバースリップの使用は、カバースリップ
を除去するとき、組織の切片がスライドから除去される
という危険を表す。
【００４０】本発明の方法は、水性反応混合物を蒸発抑
制液体でカバーすることによって蒸発を抑制し、そして
蒸発抑制液体は水性相中で不混和性であり、そして水性
相より低い密度を有する。このようにして、蒸発抑制液
体は反応混合物の表面をカバーし、そしてカバースリッ
プまたは加湿チャンバーの使用の必要性を排除する。
【００４１】蒸発抑制液体は、小さい体積の試薬を高温
（室温以上）に維持する、スライド上で実施するアッセ
イに有用である。蒸発抑制液体は、試薬の塩化カルシウ
ムが重要である場合、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｉ
ＳＨおよびＩＨＣの応用においてとくに有用である。
【００４２】蒸発抑制液体は、次の特性を有する液体か
ら本質的に成る。液体は水性相中で起こる反応を妨害し
ない。蒸発抑制液体は反応を実施する温度より有意に高
い沸点を有する。好ましくは、蒸発抑制液体は１００℃
以上、好ましくは１５０以上の沸点を有する。好ましく
は、蒸発抑制液体は適用を容易にするために低い粘度を
有する。
【００４３】これらの基準を満足する液体は、炭化水
素、好ましくは６〜１８個の炭素を有する非芳香族の炭
化水素である。中鎖のアルカン族の油、例えば、デカン
〜ヘキサデカン（Ｃ１０〜Ｃ１６）がより好ましい。ペ
ンタデカンは最も好ましい。
【００４４】これらの油は、ＩＨＣおよびＩＳＨ反応に
おける蒸発を防止するために有用な次の性質を有する。
油類はＩＨＣおよびＩＳＨにおいて使用する水性反応混
合物中で実際に不活性であるかつ不混和性である。油類
は水の密度より有意に低い、０.７３〜０.７７の範囲の
密度を有して、水性相の上に容易に浮く。油類は免疫組
織化学的または正常部位ハイブリダイゼーションに必要
な温度の範囲よりかなり上の沸点を有し、この沸点範囲
は１７４℃〜２８０℃の範囲である。これは油類がイン
キュベーションの間に蒸発するのを防止する。
【００４５】要求される特性に加えて、これらの油類の
すべてはこのような反応における使用に望ましい追加の
性質を有する。油類は室温より低い融点を有して、それ
らのディスペンシングを容易とする。油類は、また、容
易なディスペンシングを促進しかつ油類を水性相上に浮
かす、比較的低い粘度を有する。油類は、また、安価で
あり、そして高い純度で入手可能である。
【００４６】蒸発抑制液体は、十分な量の液体をスライ
ド上に滴下してアッセイ領域をカバーすることによっ
て、使用される。約５００μｌの使用は便利である。
【００４７】蒸発抑制液体の使用は、ガラスのカバース
リップまたは加湿したチャンバーを使用する先行技術方
法より効率よくかつ便利である。蒸発抑制液体は、数滴
の液体をスライドに単に適用することによって、水性相
の上に容易に浮く。蒸発抑制液体は、また、スライドを
少量の水で洗浄することによって容易に除去される。さ
らに、蒸発抑制液体の劇的な性質のために、水性相の試
薬は、蒸発抑制液体相を通して沈むので、任意の順序で
添加することができ、先行技術の方法におけるカバース
リップの添加またはチャンバー内の配置の前に、蒸発は
起こらない。
【００４８】水性相は所定位置で蒸発抑制液体と混合す
ることができる。水性相はスライドを普通の撹拌機上に
配置することによって混合することができる。好ましい
自動化された装置は、スライド上に空気ジェットを向け
ることによって、水性相を混合する。その装置は実施例
３に記載されている。蒸発抑制液体は、水性相の試薬を
混合の間にスライド上の所定位置に効果的に保持する。
【００４９】ＩＳＨ反応のために、ＤＮＡは典型的には
約９５℃において溶融することに注意すべきである。蒸
発抑制液体は９５℃において完全に有効である。蒸発を
防止するために先行技術の反応において使用した加湿チ
ャンバーは有効ではない。なぜなら、典型的なチャンバ
ーの内側の蒸気圧は蒸発を防止するために十分に高くな
いからである。
【００５０】内因性ペルオキシダーゼ阻害溶液 ＩＨＣ染色法は、好ましくは、抗体試薬の使用前に、組
織の切片を過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の溶液とインキュベー
ションして内因性ペルオキシダーゼ活性を排除する工程
を包含する。よく知られているように、水中の３％のＨ
2Ｏ2の普通の溶液ならびに１.０％のＨ2Ｏ2、０.１のア
ジドの溶液は有効である。好ましくは、この溶液は生理
学的緩衝液、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、リン
酸塩緩衝液（ＰＢ）、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝
化生理的塩類溶液（ＰＢＳ）を包含する。最も好ましい
緩衝液は０.１モルのＰＢＳ、ｐＨ７．３、０.１％のツ
イーン（Ｔｗｅｅｎ）２０である。
【００５１】４０℃において約４０分のインキュベーシ
ョンは、通常、内因性ペルオキシダーゼ活性を排除する
ために十分である。
【００５２】安定化されたタンパク質分解酵素 プロテアーゼ溶液を、種々の抗体、例えば、抗デスミン
および抗ケラチン抗体を使用する免疫組織化学的染色に
対する予備処理として、パラフィンに埋め込んだ、ホル
マリン固定した組織の切片に適用する。抗原の認識する
ためにこのような組織の処理、抗原のアンマスキングま
たはアンマスキングと呼ぶ、を必要とする抗体は、実験
的に決定され、そして文献に報告されている。プロテア
ーゼ溶液は、抗体の適用の前にそして、好ましくは、ペ
ルオキシダーゼ処理の直後に適用する。
【００５３】プロテアーゼは、固定プロセスの間にホル
マリンによりなされた損傷から、組織を救うと言われ
る。ホルマリンの固定は組織の抗原をマスキングする架
橋結合を生じ、これにより抗原の抗体の認識を防止し、
こうして、染色が起こるのを防止する。これは誤った陰
性の読みを生ずることがあり、その結果組織の試料の誤
診に導くことがある。プロテアーゼはホルマリンの架橋
を混乱し、組織の抗原を標識する試薬に暴露する。プロ
テアーゼの表面に対する主要な欠点は、酵素が凍結して
いるときにのみ、延長した時間の間安定であるというこ
とである。室温において、酵素は使用希釈においてわず
かに１分間のみ安定であった。これは、ことに自動化さ
れた方法について、有意な欠点である。
【００５４】本発明は、タンパク質分解酵素のための安
定剤として作用する希釈剤を提供する。この希釈剤にお
いて、酵素は変化する程度の温度においてある延長した
時間の間安定である。とくに、酵素は、実施例４に詳細
に記載するように、希釈剤中で２〜８℃および室温にお
いて１０週間貯蔵後安定である（もとの酵素活性の少な
くとも９０％を保持する）ことが示された。安定化され
た酵素配合物は周囲の輸送／郵送および反復した凍結／
融解に耐えることができ、そして大きく延長した貯蔵寿
命を有する。
【００５５】安定化されたタンパク質分解酵素の配合物
は、グリコール、還元剤、カルシウムイオン、および、
必要に応じて、保存剤を含有する緩衝液中で、好ましく
は使用希釈において、有効量の酵素を包含する。本発明
の好ましい安定化されたタンパク質分解酵素の溶液は、
生理学的緩衝液；約４０〜約６０％のグリコール；有効
量の還元剤；酵素の安定性を増大するために十分な濃度
のカルシウムイオン源；および有効量のタンパク質分解
酵素からなる。
【００５６】緩衝液は生理学的緩衝液ｐＨ約７.０〜約
７.５、好ましくは７.４である。この緩衝液は有効濃度
のリン酸塩緩衝液の中のカルシウム沈澱物のようにリン
酸塩に基づかない。緩衝液は、約０.０１〜０.１モル、
好ましくは約０.０２５モルの濃度における、ＭＯＰＳ
（２−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）、ＴＥ
Ｓ（２−（−ヒドロキシ−１，１−［ビス（ヒドロキシ
メチル）エチル］アミノ）エタンスルホン酸、ヘペス
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エ
タンスルホン酸）、ＢＥＳ（２−［ビス（２−ヒドロキ
シエチル）アミノ］エタンスルホン酸）、バルビタール
緩衝液またはカコジル酸緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）マ
レエートまたは、好ましくは、トリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ
Ｃｌであることができる。
【００５７】還元剤はジチチオスオスレイトール、アス
コルビン酸または、好ましくは、メタ重亜硫酸ナトリウ
ム（ＭＢＳ）。それらの還元剤は約０.０００５〜０.０
５％の範囲の濃度において酵素を安定化するために有効
である（ＭＢＳについて、この濃度は約０.０２６〜０.
６ミリモルである）。好ましい還元剤は約０.３ミリモ
ルの濃度のＭＢＳである。
【００５８】グリコールは任意のグリコールであること
ができ、そして好ましくはプロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールまたは、より好ましくは、プロピレ
ングリコールである。グリコールは酵素を安定化するた
めに有効量で、好ましくは希釈剤の約４０〜約６０容量
％、より好ましくは約５０％（ｖ／ｖ）で存在する。
【００５９】希釈剤は、また、カルシウムイオン源、便
利には塩化カルシウムを、約１〜約１０ミリモル、好ま
しくは約５ミリモルの濃度で含む。カルシウムイオン源
は、前述のカルシウムの不溶性の問題のために、好まし
くはリン酸カルシウムではない。
【００６０】この溶液は必要に応じて保存剤を含有す
る。適当な保存剤は前述のものと異ならない。
【００６１】この酵素は少なくとも有効量で存在するタ
ンパク質分解酵素であるが、後の希釈について濃縮する
ことができる。好ましい濃度範囲は約０．１〜約１０単
位／ｍｌ、好ましくは約０.１〜約０.５単位／ｍｌであ
る。最も好ましくは約０.２５単位／ｍｌである。酵素
活性は、２８０ｎｍにおける吸収に基づいて、標準のカ
ゼインアッセイおよび合計のタンパク質を使用して測定
することができる。
【００６２】酵素はエキソペプチダーゼ（例えば、カル
ボキシ−およびアミノ−ペプチダーゼ、ジペプチダー
ゼ）または、好ましくは、エンドプチダーゼ（例えば、
ペプシン、カテプシンおよびパパイン）であることがで
きる。好ましくは、酵素はＶＩＩＩ型アルカリ性プロテ
アーゼ［シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から商業的に入手可能であ
る］である。最も好ましい配合物を下表１に示す。
【００６３】表１ 安定化されたタンパク質分解酵素の配合物 ５０％のプロピレングリコール ０.０２５モルのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.４ ０.３ミリモルのメタ重亜硫酸ナトリウム ５ミリモルの塩化カルシウム ０.０５％のチメロサール ０.０２単位／ｍｌのＶＩＩＩ型アルカリ性 プロテアーゼ 本発明の安定化された酵素配合物は成分を一緒に混合す
ることによって調製される。調製後、配合物は好ましく
は２〜８℃において貯蔵するが、−２０℃において貯蔵
すると安定である。
【００６４】バックグラウンドのシグナルの減少のため
の抗体の希釈 一次（または第１）抗体および引き続く種特異的第２抗
体を利用する組織の切片の免疫組織化学的染色は、標本
の非特異的染色に導く、非特異的抗体の結合を普通に生
ずる。非特異的染色は結果の誤解を引き起こし、これは
究極的に患者の状態の誤診に導くことがある。
【００６５】非特異的抗体の結合をブロッキングするア
プローチの大部分は、増加したタンパク質濃度、例え
ば、２〜５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と一緒に
比較的濃縮した非免疫血清希釈剤（１：５〜１：２０）
の使用に頼る。非免疫血清／ＢＳＡ溶液は別々の試薬と
してしばしば使用され、そして通常一次抗体試薬の前に
添加される。この方法は非特異的結合を減少するが、問
題を排除しない。
【００６６】今回、一次抗体の非特異的結合は非特異的
結合の主要な源でないことが発見された。一次抗体の非
特異的結合はタンパク質、例えば、ＢＳＡを溶液に添加
することによって減少することができる。しかしなが
ら、ＩＨＣにおいて観測される非特異的結合の大部分は
組織の切片に非特異的に結合する第２または架橋する抗
体のためである。
【００６７】本発明は、一次抗体または二次抗体の希釈
剤の中の第２抗体種と同一の種からの非免疫血清のグロ
ブリンの分画を含めることによって、非特異的抗体の結
合の問題を解決する。一次抗体および第２抗体の希釈剤
の中のグロブリン分画の使用は、一次抗体および第２抗
体の両者による非特異的結合を排除する。
【００６８】本発明の抗体の希釈剤は、適当な緩衝液の
中の第２抗体の規定したのグロブリン分画から本質的に
成る。マウスのモノクローナル抗体を一次抗体および引
き続いてヤギ抗マウス第２抗体として使用するとき、非
特異的結合は高い濃度のヤギグロブリンを一次抗体およ
び第２抗体の両者のための希釈剤の中に組み込むことに
よって排除する。第２抗体はウサギ抗体である場合、ウ
サギグロブリンを両者の希釈剤に添加する。
【００６９】グロブリン分画は非血清から飽和硫酸アン
モニウム（ＳＡＳ）を使用することによって調製するこ
とができる。あるいは、より精製したグロブリン分画、
例えば、ＤＥＡＥセルロース精製により調製されたもの
（コーン分画ＩＩに類似する）をまた使用することがで
きる。よく知られている方法により調製することができ
かつシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（カタログＮｏ．Ｇ５６４０）
を包含するある数の源から商業的に入手可能である。
【００７０】グロブリンは希釈剤の中に非特異的抗体の
結合を抑制するために十分な濃度で存在する。好ましく
は、濃度は約０.１〜約５％、より好ましくは約０.１〜
約０.５％、最も好ましくは約０.３％（または３ｍｇ／
ｍｌ）である。
【００７１】グロブリンに加えて、希釈剤は免疫化学的
手順に適当な生理学的緩衝液を包含する。適当な緩衝液
は前述の生理学的緩衝液およびリン酸塩緩衝液、例え
ば、リン酸塩緩衝液（ＰＢ）およびリン酸塩緩衝化生理
的塩類溶液（ＰＢＳ）を包含する。最も好ましい緩衝液
は０.１モルのＰＢＳ、ｐＨ７.３である。
【００７２】緩衝液は、また、必要に応じて洗浄剤およ
び保存剤を含む。洗浄剤は、前述したように、溶液の表
面張力を減少して、緩衝液の平らなシートを形成するた
めに十分な量で存在して、組織の切片全体を抗体溶液で
効果的にカバーすることを保証する。さらに、抗体希釈
緩衝液の中に洗浄剤を含めることは、この手順を通して
一定の洗浄剤濃度を維持する。適当な洗浄剤は前述のも
のである。
【００７３】希釈緩衝液は、また、溶液中の微生物の成
長を阻害する有効濃度で保存剤を含む。適当な保存剤お
よびそれらの濃度は前述した通りである。アジ化ナトリ
ウムは好ましくは使用しない。
【００７４】最も好ましい希釈剤は、３ｍｇ／ｍｌ
（０.３％）のグロブリン、０.１％のツイーン（Ｔｗｅ
ｅｎ）２０および０.３％のチメロサールを含有する０.
１モルのＰＢＳ、ｐＨ７.３である。本発明の抗体溶液
は、本発明の希釈剤および抗体の使用希釈の一次または
第２抗体を含む。よく知られているように、一次抗体は
問題の抗原に対して特異的である。第２抗体は一次抗体
に対して特異的であり、そして標識する。好ましい実施
態様において、一次抗体はマウスモノクローナル抗体で
あり、そして第２抗体は標識したヤギ抗マウス抗体であ
る。間接的ビオチン−アビジン法のために、第２抗体は
ビオチンで標識する。好ましい実施態様において、第２
抗体はビオチニル化ヤギ抗マウス抗体、より好ましくは
抗体のＦａｂ′２分画である。ビオチニル化第２抗体を
使用するとき、組織の切片を発色の前にＨＲＰＯ標識し
たアビジンとインキュベーションする。
【００７５】本発明の抗体溶液は、抗体を先行技術の配
合物中で希釈した場合と同一の方法で使用する。免疫化
学的手順は、後述するように、非免疫血清のブロッキン
グ工程を排除することにおいて異なる。
【００７６】高い濃度のグロブリンの使用は、非特異的
結合のブロッキングの再現能力を改良する。非免疫血清
のロット毎の変動はブロッキングの精製したタンパク質
分画の使用により排除される。第２抗体の種からのグロ
ブリンの使用は、一次抗体の非特異的結合を減少するた
めに十分なタンパク質を希釈剤の中に提供する。グロブ
リンの使用は、また、非特異的結合をブロッキングする
ために先行技術の方法において使用された濃縮した血清
希釈剤の貯蔵の間に起こる沈澱を減少する。試薬の沈澱
は、試薬の成分が貯蔵の間に変化するので、再現可能な
試験を障害する。
【００７７】第２抗体種の非免疫血清のグロブリン分画
の組み込みは、別のブロッキング剤の必要性を減少し、
染色手順における１つの工程および染色試薬のキットか
ら１つの試薬を排除する。これは組織の染色の性能を合
理化する。
【００７８】ペルオキシダーゼ標識アビジン溶液 間接的ビオチン−アビジン染色法において、組織の切片
をＨＲＰＯ標識アビジンの溶液とインキュベーションす
る。好ましいＨＲＰＯ標識アビジンは、ジャクソン・イ
ムノ・リサーチ（ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ）（ペンシルベニア州ウェストグローブ）
を包含するある数の源商業的に入手可能な、セイヨウワ
サビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンである。
ＨＲＰＯ標識アビジン溶液は普通のものであることがで
きる。普通の溶液は、生理学的緩衝液、非特異的結合を
阻害するタンパク質源および、必要に応じて、保存剤を
包含する。ＢＳＡは、そのＨＲＰＯとの相互作用のため
に、タンパク質源として好ましくは使用しない。
【００７９】好ましくは、ＨＲＰＯ標識アビジンを本発
明の抗体希釈剤中で希釈する。ウシまたは他の種のガン
マグロブリンを、必要に応じて、コストの節約のために
第２抗体種のグロブリンと置換することができる。
【００８０】安定化されたペルオキシダーゼ発色団の配
合物 ペルオキシダーゼ発色団は電子供与発色団であり、溶液
の使用希釈の範囲において、低い濃度で水溶液中の安定
性を制限した。免疫組織化学的使用のために最も普通に
使用されるペルオキシダーゼは、３,３′−ジアミノベ
ンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ、褐色の不溶
性最終生成物）および３−アミノ−９−エチルカルバゾ
ール（ＡＥＣ、赤色の不溶性最終生成物）である。酵素
イムノアッセイのために、オルト−フェニルジアミノ塩
酸塩（ＯＰＤ、オレンジ−褐色の可溶性最終生成物）
を、また、普通に使用する。他のペルオキシダーゼ発色
団は、次のものを包含する：２,２′−アジノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（Ａ
ＢＴＳ、緑色の可溶性最終生成物）；５−アミノ−サリ
チル酸（５ＡＳ、褐色の可溶性最終生成物］；４−クロ
ロ−１−ナフトール（４ＣＩＮ、青色の不溶性最終生成
物）；オルト−ジアニシジン（ＯＤ、黄色−オレンジの
可溶性最終生成物）および３,３′,５,５′−テトラメ
チル−ベジジン（ＴＭＢ、淡い青色の可溶性最終生成
物）。
【００８１】現在、ＤＡＢの安定化液体配合物はカーケ
ガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｅｒｋｅ
ｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）（ＫＰＬ）から市販されている。配合物は、高
いＤＡＢ濃度（２５ｍｇ／ｍｌ）、使用濃度のほぼ１０
倍、を含み、そして未知の型のグリコールの存在下に低
いｐＨで４℃における貯蔵を必要とする。この溶液は２
〜８℃において約３０日間安定であり、そして使用濃度
に希釈後使用できる。ＫＰＬ生成物は２ｍｇ／ｍｌの使
用濃度において４５℃において１日程度に短く安定では
ない。標準のストレス試験は、４５℃において３日後抗
原特異的免疫染色における酵素活性を必要とする。
【００８２】液体ＡＥＣ溶液は、また、入手可能である
［シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．）］。配合物は未知であるが、高い
濃度、使用濃度のほぼ２００倍のＡＥＣを含む。配合物
を希釈し、そして過酸化水素を添加して使用溶液を形成
する。いったん添加した過酸化水素で希釈すると、使用
溶液は多分数時間の間だけ安定である。
【００８３】他のＨＰＲＯ発色団について、ユーザーは
一般に発色団溶液を使用濃度で調製し、そしてこの溶液
を希過酸化水素と使用の日に新しく混合する。このよう
な発色団溶液を過酸化水素の添加の前に凍結して貯蔵す
ることができる。対照的に、本発明の発色団溶液はペル
オキシダーゼを含まず、そしてスライド上のペルオキシ
ダーゼと組み合わせる。これはペルオキシダーゼと発色
団との混合により引き起こされる酸化の加速を防止す
る。
【００８４】本発明は、発色団の使用濃度範囲におい
て、低い濃度の液体ＨＲＰＯ発色団を有する安定化され
た溶液を提供する。レドックス発色団についての一般の
範囲は約１〜２ｍｇ／ｍｌ（約１〜約１０ミリモル）で
ある。ＤＡＢについて、最も好ましい範囲は約４.６〜
９.２ミリモルである。安定化された配合物において、
発色団は、標準の３日の４５℃のストレス試験後、抗原
特異的免疫染色手順において生物学的に活性に止まる。
本発明の安定化された配合物は発色団を使用濃度で含有
するので、試薬のユーザーの希釈を必要としない。
【００８５】発色団に加えて、配合物は６.０より低い
ｐＨを維持することができる酸性緩衝液；発色団を安定
化するために有効量の還元剤；および発色団を安定化す
るために有効量のグリコールから本質的に成る。
【００８６】緩衝液は、安定化された溶液のｐＨを６.
０以下、好ましくはｐＨ５.０〜５.５に維持する酸性緩
衝液である。緩衝液は、好ましくは、発色団溶液をスラ
イド上の酵素を含有する混合物に適用するとき、酵素活
性のために有効なｐＨ（約ｐＨ６〜７）を提供する。酸
性緩衝液は、クエン酸塩リン酸塩、クエン酸塩酢酸塩、
酢酸塩、コハク酸塩、フタル酸塩、およびマレイン酸塩
の緩衝液である。緩衝液のモル濃度を調節して、有効な
酵素活性のために適当な緩衝化能力を与える。特定の発
色団のために適当な緩衝液の選択は当業者の技量の範囲
内である。
【００８７】さらに詳しくは、ＤＡＢのＩＨＣｐＨ最適
値は６.５以上であるが、ＤＡＢはｐＨ５付近で最も安
定である。これを得るために、弱いクエン酸塩−リン酸
塩緩衝液、これはＰＢＳ、ｐＨ７.３中で０.０２％の過
酸化水素およびスライド上に残留するリンス溶液（ｐＨ
７.６）と組み合わせるとき、反応混合物のｐＨは７よ
り大きい。
【００８８】対照的に、ＡＥＣの酵素ｐＨの最適値は約
５.３である。したがって、より強い酸性の緩衝液（例
えば、０.１モルの酢酸塩、ｐＨ５.３）を発色団配合物
中で使用する。好ましくは最適な活性のために低いｐＨ
を必要とする発色団について、過酸化水素溶液は、ま
た、酸性緩衝液中で調製する。スライド上に残留するリ
ンス溶液と組み合わせるとき、６より低い「スライド上
の」ｐＨが生じ、許容されうるＡＥＣの染色を与える。
【００８９】要約すると、緩衝化能力は最適な発色団に
ついてのｐＨおよび体積、緩衝化能力および個々のスラ
イド上に残留する液体のｐＨに基づいて選択する。
【００９０】同様な緩衝液の選択のプロセスは、発色団
およびスライドの染色状態の独特の要件に基づいて、他
のペルオキシダーゼについて実施する。
【００９１】ＤＡＢとともに使用する好ましい緩衝液
は、約５〜約１０ミリモル、好ましくは約７〜約８、よ
り好ましくは約７.５ミリモルの濃度の、弱い緩衝液、
好ましくはクエン酸塩−リン酸塩緩衝液である。緩衝液
は酸性のｐＨ、好ましくは約４.０〜６.０、より好まし
くは約５.５〜５.５を有する。最も好ましくはｐＨ５.
３であり、こうしてＤＡＢ配合物をスライド上のＨ2Ｏ2
と混合して発色反応を開始するとき、この混合物のｐＨ
６.５またはそれ以上であって、結果の誤った解釈に導
くことがある核周辺のＤＡＢの沈澱を回避する。
【００９２】ＡＥＣとともに使用するために好ましい緩
衝液は比較的強い酸性緩衝液、好ましくは約０.５〜約
０.０１モル、好ましくは約０.２５〜約０.０５モル、
より好ましくは約０.１モルの濃度の酢酸塩緩衝液であ
る。緩衝液は酸性のｐＨ、好ましくは約４.０〜６.０、
より好ましくは約４.５〜５.５を有する。最も好ましく
はｐＨ５.０である。
【００９３】発色団配合物は、また、グリコールおよび
小さい分子、例えば、ＤＡＢおよびＡＥＣを安定化する
ために有効な濃度の還元剤を含有する。しかしながら、
それらの濃度および発色団の濃度はバランスさせて、酵
素活性を妨害しなくてはならない。この場合において、
約１〜約１０％、好ましくは約５％の濃度のポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）は任意のＨＲＰＯとともに好ま
しいグリコールである。
【００９４】還元剤は前述のものであることができる。
濃度は選択したＨＲＰＯ発色団に依存して変化しそし
て、また、各ロットの汚染物質の差のために、所定の発
色団のロット毎に変化する。例えば、それらの還元剤は
ＤＡＢを約０.０００５〜０.０５％（ほぼ０.０２６〜
０.６ミリモル）の範囲の濃度で安定化し、そしてＡＥ
Ｃを約０.０００８〜０.００８％（ほぼ４０〜４００μ
ミリモル）の範囲の濃度で安定化するために有効であ
る。任意の発色団のための還元剤の適当な濃度は実施例
において詳細に記載する。
【００９５】ＤＡＢのために最も好ましい配合物は約５
％のポリエチレングリコールおよび約１ミリモルのメタ
重亜硫酸ナトリウム（ＭＢＳ）（ほぼ０．０２％）であ
る。ＡＥＣについて最も好ましい組み合わせは約５％の
ポリエチレングリコールおよび約２００μモルのＭＢＳ
（ほぼ０.２％）である。
【００９６】緩衝液は必要に応じて保存剤を含有する。
適当な保存剤は前述のものと異ならない。緩衝液は、必
要に応じて、また、この手順を通して一定レベルに反応
混合物中で洗浄剤濃度を維持するために、抗体希釈剤中
と同一の生物学的洗浄剤を含む。安定化されたＤＡＢ配
合物はグリコールを緩衝溶液（存在する場合、洗浄剤を
含有する）に添加することによって調製する。還元剤を
その溶液に添加し、次いでＤＡＢを添加する。ＡＥＣに
ついて、還元剤を添加し、次いでＡＥＣをグリコールを
含有する緩衝溶液に添加する。安定化したＨＲＰＯ発色
団溶液の調製は、実施例に詳細に記載する。調製後、発
色団配合物は２〜８℃において暗所で貯蔵する。
【００９７】本発明の安定化されたＨＲＰＯ発色団配合
物の使用は、過酸化水素が配合物の中に存在せずそして
スライドに直接添加する以外、先行技術の配合物の使用
と異ならない。しかしながら、配合物は使用濃度で安定
である。こうして、新しい使用溶液を各々の日に調製す
る必要性は排除された。
【００９８】下表は本発明のＤＡＢおよびＡＥＣの安定
化された配合物およびＤＡＢ［カークガード・アンド・
ペリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ａｎｄ
Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］およびＡ
ＥＣ［シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）］の性質の比較を示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】過酸化水素の発色溶液 ペルオキシダーゼ法において、発色団溶液を過酸化水素
ペルオキシダーゼ溶液と混合するとき、発色は開始す
る。Ｈ2Ｏ2溶液は普通のものであることができる。好ま
しいＨ2Ｏ2は生理学的緩衝液を包含する。適当な生理学
的緩衝液前述した通りである。０.１モルのＰＢＳ、ｐ
Ｈ７.３、は最も好ましい。この溶液は、必要に応じ
て、また、洗浄剤および保存剤、好ましくは０.１％の
ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および０.０５％のチメロ
サールを含む。
【０１０１】Ｈ2Ｏ2溶液を発色団溶液と混合し、そして
組織の切片と約４〜約５分間約４０℃においてインキュ
ベーションする。
【０１０２】ＤＡＢ色−増強溶液 ＤＡＢ色−増強溶液を、必要に応じて、カラースリッピ
ングの前に使用して、ＤＡＢの色をより顕著にする。Ｄ
ＡＢ染色は褐色である。金属イオンの溶液を使用して、
暗色化（銅）するか、あるいは染色の色を黒（ニッケ
ル）または青（コバルト）に変化させる。酢酸塩緩衝液
中の硫酸銅の溶液は好ましい。
【０１０３】反対染色 反対染色を、必要に応じて、カラースリッピングの前に
使用して、免疫組織化学的染色をより顕著にする。反対
染色は色が最初の染色と異なり、そして最初の染色のそ
れら以外の組織、細胞または細胞の部分に対する親和性
を有する。多数の反対染色はよく知られている。好まし
い反対染色はヘマトキシリンである。
【０１０４】方法 明瞭のためおよび限定せずに、この方法は発色団として
ＤＡＢを使用する間接的ビオチン−アビジンペルオキシ
ダーゼ法により例示されるように、免疫組織化学的手順
で記載する。当業者にとって明らかなように、この方法
に改良された工程を他の免疫組織化学的手順ならびに他
の免疫化学的プロセス、例えば、ＥＬＩＳＡイムノアッ
セイにおいて使用することができる。
【０１０５】組織の切片を含有するスライドを本発明の
リンス溶液で洗浄する。スライドは、それをリンス溶液
の浴の中に浸漬することによって、好ましくはこの溶液
の３つの浴の中に順次に浸漬することによって洗浄する
ことができる。あるいは、リンス溶液は、例えば、スク
イーズびんを使用することによって、スライド上に吹き
出させることができる。過剰の液体は、スライドから滴
下するか、あるいはスライドのへりを吸収性表面上で吸
い取ることによって除去する。
【０１０６】染色試薬の各々について、組織の切片は、
よく知られているように、インキュベーションの間に試
薬でカバーする。スライドを試薬の浴の中に垂直の位置
でインキュベーションする方法について、浴のレベルは
全体の組織の切片をカバーするために十分である。水平
にインキュベーションするスライドのために、約１００
〜１５０μｌの試薬は通常組織をカバーするために十分
である。２００μｌの使用は便利である。
【０１０７】インキュベーション時間は変化し、そして
インキュベーション温度に依存する。実質的に完全な抗
体の結合のためのインキュベーション、発色およびこの
方法の他の工程はよく知られている。工程の多数、例え
ば、抗原のアンマスキング、抗体の結合、および発色
は、好ましくは、少なくとも約３５℃の高温、好ましく
は約４０〜約４５℃において実施する。しかしながら、
酵素活性に依存する工程（抗原のアンマスキングおよび
発色）を除外して、インキュベーション期間を適当に増
加する場合、大部分の工程は、また、４℃程度に低い温
度で実施することができる。次の工程の各々について記
載するインキュベーション期間は、特記しない限り、４
０℃の好ましいインキュベーション温度においてであ
る。 蒸発抑制液体をスライドに適用して、この液体を
湿った組織の切片上に滴下することによって、組織の切
片をカバーする。十分な量、好ましくは約５００μｌの
液体を添加して組織の切片をカバーする。
【０１０８】過酸化水素溶液をスライドに添加して、染
色の内因性ペルオキシダーゼ誘発妨害を排除する。Ｈ2
Ｏ2溶液を組織の切片をカバーする蒸発抑制液体に添加
し、そしてＨ2Ｏ2溶液は蒸発抑制液体を通して下の組織
の切片に行く。Ｈ2Ｏ2溶液は内因性ペルオキシダーゼ活
性を排除するために十分な時間、便利には約４〜約６分
間インキュベーションする。
【０１０９】抗体染色試薬は、アンマスキングを必要と
する抗原、例えば、デスミンまたはケラチンに対して特
異的であるとき、組織の切片を、一次抗体の添加前に、
本発明の安定化されたタンパク質分解酵素溶液で処理す
る。安定化されたタンパク質分解酵素溶液を組織の切片
をカバーする蒸発抑制液体に添加し、そしてこのタンパ
ク質分解酵素溶液は蒸発抑制液体を通して沈んで下の組
織の切片に行く。抗原のアンマスキングのために十分な
インキュベーション期間後、最適には約４〜約５分後、
スライドを洗浄し、そして蒸発抑制液体を再び適用す
る。
【０１１０】抗体の適用後、好ましくはペルオキシダー
ゼ処理の直後、組織の切片をカバーするために十分な
量、便利には約２００μｌのプロテアーゼ溶液をパラフ
ィンに埋め込まれた、ホルマリン固定した組織に適用す
る。この希釈剤中で、プロテアーゼは組織の抗原に損傷
を与えないでホルマリンの架橋を崩壊させる。こうし
て、抗原は標識試薬に暴露され、より正確な結果を可能
とする。
【０１１１】インキュベーション期間は、抗原が破壊さ
れないかぎり、架橋を崩壊するために十分である。期間
は温度、酵素濃度、組織の厚さおよびホルマリンの中の
時間の長さに依存する。適当な時間は容易に決定するこ
とができる。４０℃において４〜５分のインキュベーシ
ョン、好ましくは４０℃において４分３０秒のインキュ
ベーションは本発明の好ましい方法において有効であ
る。インキュベーション後、プロテアーゼ溶液を洗浄除
去し、そして染色／標識プロセスにおける次の試薬を適
用する。これらの範囲が観測されないとき、プロテアー
ゼにより過度および／または不完全な消化は起こること
があり、これは、それぞれ、破壊された抗原／マスキン
グされた抗原を生ずることがある。インキュベーション
後、スライドをリンスする。
【０１１２】インキュベーション、洗浄および蒸発抑制
液体の再適用後、標識つけ試薬を組織の切片に添加す
る。第１に、本発明の一次酵素溶液をスライドに添加す
る。抗体溶液を、実質的に完全な抗体の結合のために十
分な時間、少なくとも５分の間、インキュベーションす
る。インキュベーション、洗浄および蒸発抑制液体の再
適用後、本発明のビオチニル化第２抗体溶液をスライド
に添加し、そして約５分間インキュベーションする。イ
ンキュベーション、洗浄および蒸発抑制液体の再適用
後、ＨＲＰＯ標識アビジン溶液を組織の切片と、実質的
に完全なビオチン−アビジン結合のために十分な時間の
間、約３７〜４０℃において約４〜約５分間インキュベ
ーションする。
【０１１３】インキュベーション、洗浄および蒸発抑制
液体の再適用後、発色試薬をスライドに添加する。発色
試薬は、本発明の安定化されたＤＡＢ溶液および過酸化
水素溶液を包含する。試薬を混合し、次いで使用の前に
約１５分以下の間添加する。好ましくは、ＤＡＢ溶液を
スライドに添加し、次いでＨ2Ｏ2溶液を添加する。溶液
を混合して発色反応を開始する。溶液はスライド上で、
スライドを撹拌機上に配置することによって、混合する
ことができる。発色のために十分な時間の間、約５分間
インキュベーションし、そして洗浄した後、免疫組織化
学的染色手順を完結する。ＤＡＢ色増強溶液、好ましく
は硫酸銅溶液および／または反対染色剤を、カバースリ
ッピングの前に、必要に応じて添加する。
【０１１４】自動化された方法について工程はマニュア
ル法と異ならない。詳しくは、試薬、試薬の添加順序お
よびインキュベーションの時間および温度は異ならな
い。試薬を組織の切片に適用しそして組織の切片とイン
キュベーションする方法、組織の切片をリンスする方法
および過剰のリンス溶液を除去する方法は、装置に依存
する。好ましい自動化された方法は実施例２に詳細に記
載する。
【０１１５】次の特定であるが非限定的である実施例に
よって、本発明をさらに説明する。特記しない限り、温
度はセ氏度および濃度は重量％で記載する。実施するた
めに構成的に簡単にした手順は現在の時制で記載し、そ
して実験室で実施した手順は過去の時制で記載する。
【０１１６】
【実施例】実施例１ 新規な染色試薬の調製 本発明の新規な試薬の各々は後述するように調製した。
【０１１７】リンス溶液 １.０ｍｌのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（Ｓｉｇｍａ
Ｐ−１３７９）および５００ｍｇのチメロサールを１
リットルの蒸留水に添加して、０.１％のツイーン（Ｔ
ｗｅｅｎ）２０および０.０５％のツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）２０を生成する。
【０１１８】安定化されたプロテアーゼ配合物 ２４.２ｇのトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）塩基を１リット
ル蒸留水に添加することによって溶液Ａ［０.２モルの
トリズマ・べース（Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ）および溶
液Ｂ（０.２モルのＨＣｌ）をつくることによって、０.
５モルのトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ、ｐＨ７.４を調
製する。５０ｍｌの溶液Ａ、４１.４ｍｌの溶液Ｂ、お
よび１０８.６ｍｌの蒸留水を添加して、０.０５モルの
トリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ、ｐＨ７.４を調製する。
【０１１９】４００ｍｌの安定化されたプロテアーゼ配
合物について、次を混合する： ２００ｍｌのトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ、ｐＨ７.
４、 ２００ｍｌのプロピレングリコール＊ ０.０２ｇのメタ重亜硫酸ナトリウム＊ ０.２９４ｇの塩化カルシウム＊ ０.２０ｇのチメロサール＊ １００単位のＶＩＩＩ型アルカリ性プロテアーゼ＊ ＊シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から購入した形態で使用する。
【０１２０】一次抗体および第２抗体のための希釈剤 希釈剤は０.１モルのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ
７.３を調製することによって調製する。次の試薬を緩
衝液に添加し、そして混合する： ３ｍｇ／ｍｌ（０.３％）のヤギグロブリン（シグマ・
ケミカル・カンパニー、カタログＮｏ．Ｇ５６４０）、 ０.１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、および ０.０５％のチメロサール。
【０１２１】安定化されたＤＡＢ配合物 １リットルの７.５ミリモルのクエン酸塩−リン酸塩緩
衝液、ｐＨ ５.３を調製するために、次の成分を次の順序で８００
ｍｌの蒸留水に添加する： １、５１０.５ｍｇのクエン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃ−７１
２９）、 ２、１.１７ｇのリン酸カリウム（Ｓｉｇｍａ Ｐ−５
５０４）、 ３、１ｍｌのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（Ｓｉｇｍａ
Ｐ−１３７９）、 ４、０.５ｇのチメロサール、 ５、蒸留水を添加して１リットルにする。
【０１２２】次に、８０ｍｌのクエン酸塩−リン酸塩緩
衝液の中に５ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を
溶解することによって、クエン酸塩−リン酸塩緩衝液の
中の５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓｉｇ
ｍａ Ｐ−５４１３）を調製する。次いで、追加の緩衝
液で１００ｍｌに希釈する。５％のＰＥＧを含有する５
ｍｌのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の中に９５.０５ｍ
ｇのメタ重亜硫酸ナトリウム（ＭＢＳ）（Ｓｉｇｍａ
Ｓ−９０００）を溶解して（１００ミリモルのＭＢ
Ｓ）、溶液Ａを調製する。５％のＰＥＧを含有する１０
ｍｌのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の中で１００μｌの
溶液Ａを希釈して（１ミリモルのＭＢＳ）、溶液Ｂを調
製する。
【０１２３】２０ｍｇのＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ Ｄ−５６
３７）を１０ｍｌの溶液Ｂの中に溶解して、２ｍｇのＤ
ＡＢ／ｍｌの１.０ミリモルのメタ重亜硫酸ナトリウム
および５％のポリエチレングリコールを含有する７.５
ミリモルのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐＨ５.３、
を生成する。調製後、使用するまで暗所で２〜８℃にお
いて貯蔵する。
【０１２４】安定化されたＡＥＣ配合物 １リットルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ５.０、を調製するた
めに、次の試薬を次の順序で８００ｍｌの蒸留水中に溶
解する： １、９．５８ｇの酢酸ナトリウム３Ｈ2Ｏ（Ｓｉｇｍａ
Ｓ−８６２５）、 ２、１．７０ｍｌの氷酢酸（Ｓｉｇｍａ Ａ６２８
３）、 ３、１．７ｍｌのＢｒｉｊ−３５（Ｓｉｇｍａ ４３０
ＡＧ−６）、 ４、蒸留水を添加して１リットルにする。
【０１２５】次に、ＰＥＧを８０ｍｌの緩衝液の中に溶
解することによって、酢酸塩緩衝液の中の５％のポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓｉｇｍａ Ｐ−５４１
３）を調製する。次いで、追加の緩衝液で１００ｍｌに
希釈する。１００ｍｇのＡＥＣ（Ｓｉｇｍａ Ａ−５７
５４）をジメチルホルムアミド（Ｂａｋｅｒ ９２２１
−０１）。１０ｍｌのＡＥＣをＰＥＧを含有する９０ｍ
ｌの酢酸塩緩衝液に添加する。この溶液を室温において
１０分間放置する。次いでこの溶液をワットマン（Ｗｈ
ａｔｏｍａｎ）＃１濾紙を通して、ほぼ１ｍｇ／ｍｌの
ＡＥＣ、０.１モルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ５.０、５％の
ポリエチレングリコールを生成してＡＥＣ溶液を調製す
る。
【０１２６】５％のＰＥＧを含有する１０ｍｌの酢酸塩
緩衝液の中に４０．９ｍｇのメタ重亜硫酸ナトリウム
（ＭＢＳ）を溶解する（２１.５ミリモルのＭＢＳ）。
ＭＢＳがＡＥＣの反応を阻害するまで、ほぼ０．２絶対
単位、ＭＢＳ溶液を滴定してＡＥＣ溶液の中に入れる。
最終のＭＢＳ濃度は、ＡＥＣのロットの精製に依存し
て、約１００から２００μモルまで変化する。調製後、
使用するまで暗所で２〜８℃において貯蔵する。滴定は
後述するように実施した。
【０１２７】発色団のアミノ−エチルカルバゾール（Ａ
ＥＣ）は、シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳＩＧＭＡ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）からのほぼ９０
％の純粋な製品として入手可能である。発色団は純粋で
はなく、そしてＡＥＣ（ジメチルホルムアミド中に溶解
した）を０.１モルの酢酸ナトリウム緩衝液に添加する
とき、発色団の沈澱は実施例１に記載する可溶化手順の
間に起こる。こうして、ＭＢＳの添加の前のＡＥＣの最
終濃度は未知である。それゆえ、使用するＭＢＳは生成
する液体ＡＥＣの各バッチについて滴定により実験的に
決定しなくてはならない。
【０１２８】ＡＥＣの酵素反応を種々の濃度のＭＢＳの
存在下に実施して、ＡＥＣ反応をほぼ０.２吸収単位阻
害するＭＢＳの濃度を決定する。これは通常１００〜２
００μモルのＭＢＳの範囲である（最終濃度）。反応成
分を以下に記載する。
【０１２９】ａ、４８３．４μｌの新鮮なＡＥＣ（実施
例１に記載するように調製した、ＭＢＳの添加の前）、 ｂ、８．４μｌの０．３ｍｇのアビジン−Ｄセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ／ｍｌの５％のポリエチレングリ
コールおよび０．０５％のＢｒｉｊ ３５洗浄剤を含有
する０．１モルの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.０、 ｃ、５％のポリエチレングリコールを含有する０．１モ
ルの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５.０、の中の８.４μ
ｌの１８０ミリモルの過酸化水素、および ｄ、５％のポリエチレングリコールおよびＢｒｉｊ ３
５洗浄剤を含有する０.１モルの酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ５.０、中の５.０μｌの種々の濃度のＭＢＳ。
【０１３０】滴定は次のようにして実施した。反応混合
物を室温において５分間インキュベーションする。イン
キュベーション後、１００μｌのＡＥＣ反応混合物を９
００μｌの脱イオン水（１：１０の希釈）に添加する。
希釈したＡＥＣの吸収をＵＶ−ＶＩＳ分光光度計で８０
０から４００ｎｍまで走査する。５％のポリエチレング
リコールを含有する０.１モルの酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ５.０を脱イオン水で１：１０に希釈した液体
で計器をブラッケットする。
【０１３１】種々の吸収曲線をプロットし、そして各Ｍ
ＢＳ濃度について４８０ｎｍにおけるピークの吸収を決
定する。これらのデータから、適当な最終ＭＢＳ濃度を
選択し、そして２１.５ミリモルの原溶液から十分なＭ
ＢＳを全体のＡＥＣ溶液に添加する。次いで、ＭＢＳを
含有する最終ＡＥＣ溶液をアッセイし、そしてＭＢＳを
含有しないＡＥＣ溶液と比較して、ＭＢＳを含有する溶
液についての吸収曲線は安定化しない配合物についての
曲線よりほぼ０.２の吸収単位だけ低いことが評価され
る。完結した試薬を使用するまで暗所に冷却して貯蔵す
る。
【０１３２】実施例２ デスミンを検出するためのマニュアルの間接的 ビオチン−アビジンの染色 脱パラフィンした組織の切片を、スクイーズびんからほ
ぼ１０ｍｌを組織の切片より上のスライド上に吹き出さ
せることによって、リンス溶液を使用してリンスした。
次いで、組織の切片を５００μｌのドデカンの添加によ
り蒸発抑制液体でカバーした。洗浄および蒸発抑制液体
の手順を、各インキュベーション期間の終わり後、この
手順の残部を通して同一方法において実施した。
【０１３３】０.１モルのリン酸塩緩衝化生理的塩類溶
液（０.１モルのリン酸塩、０.０５５モルのＮａＣ
ｌ）、ｐＨ７.３、０.１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２
０（２００μｌ）中の３％のＨ2Ｏ2の溶液を、この溶液
を蒸発抑制液体の上に滴下することによって、スライド
に添加した。Ｈ2Ｏ2溶液を４０℃において５分間インキ
ュベーションした。
【０１３４】プロテアーゼ溶液（２００μｌ）をスライ
ドに適用し、そして４０℃において５分間インキュベー
ションした。
【０１３５】デスミンについて、一次抗体試料（２００
μｌ）は、実施例１に記載する希釈剤中で１：７に希釈
したマウスのモノクローナル抗デスミン（クローンＤＥ
−Ｒ−１１；Ｄａｋｏ、カリフォルニア州カーペンタ
ー）であった。４０℃において５分間インキュベーショ
ンした後、スライドを洗浄し、そして蒸発抑制液体を適
用した。
【０１３６】希釈剤中で１：５０に希釈した、第２抗体
溶液（２００μｌ）、好ましくはビオチニル化ヤギ抗マ
ウス抗体、Ｆａｂ′２（Ｊａｃｋｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、４０℃において５分間インキュ
ベーションした。４０℃において５分間インキュベーシ
ョンした後、スライドを洗浄し、そして蒸発抑制液体を
適用した。
【０１３７】実施例１に記載するように調製した抗体希
釈剤（ウシグロブリンをヤギヤギと置換した）中で１：
１００に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビ
ジン（Ｊａｃｋｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）を、スライドに添加し、そして４０℃において５分
間インキュベーションした。スライドを洗浄し、そして
蒸発抑制液体を再適用した。
【０１３８】定化されたＤＡＢ溶液（２００μｌ）をス
ライドに添加した。０.１モルのＰＢＳ、ｐＨ７.３、
０.１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０中の０.０２％の
Ｈ2Ｏ 2の溶液を添加し、そしてＤＡＢ溶液を混合して反
応を開始した。この混合物を４０℃において５分間イン
キュベーションした。
【０１３９】スライドをリンスした。蒸発抑制液体を適
用し、次いでＤＡＢ色を硫酸銅溶液（０.１モルの酢酸
塩緩衝液、ｐＨ５.０、０.１％のツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）２０の中の０.５％のＣｕＳＯ4）でこの溶液を４０
℃において５分間インキュベーションすることによって
増強した。ＤＡＢの増強後、スライドをリンスし、ヘマ
トキシリンで反対染色し、脱水（アルコール／キシレン
を使用する）し、そしてカバースリッピングした。
【０１４０】実施例３ デスミンを検出するための自動化された、 間接的ビオチン−アビジン染色法 最も好ましい自動化された染色装置を使用して、実施例
２の手順を反復した。この装置は、本出願人に係る同時
継続出願第０７／４８８,６０１号、１９９０年２月２
日提出、発明の名称「自動化された生物学的反応装
置」、発明者コウプランド（Ｃｏｐｅｌａｎｄ）ら、に
詳細に記載されている。その出願をここに引用によって
加える。
【０１４１】脱パラフィンした組織の切片をリンスし、
計器の中に配置し、そして蒸発抑制液体でカバーする。
スライドをＤＡＢ増強後にリンスした後取り出し、そし
てこの手順の残部をマニュアルで実施した。自動化され
た工程の各々は、インキュベーション期間が４分２０秒
である以外、実施例２に記載するように計器により実施
した。
【０１４２】この手順を４分３７秒のインキュベーショ
ン期間を使用して反復した。
【０１４３】実施例４ デスミンを検出するための自動化された、 間接的ビオチン−アビジン染色法 次の例外を使用して、実施例３を反復した。実施例１に
記載するように調製した安定化されたＡＥＣ溶液を安定
化されたＤＡＢ溶液の代わりに使用し、そして過酸化水
素溶液の中の緩衝液は０.１モルの酢酸ナトリウムであ
った。発色後、スライドをリンスし、ヘモトキシリンで
反対染色し、そして水性マウント媒質でカバースリッピ
ングした。
【０１４４】実施例５ 安定化されたプロテアーゼ配合物の中の酵素活性の研究 本発明の安定化されたプロテアーゼ配合物の２つの試料
を、配合物の１つの試料がチメロサールを省略した以
外、実施例１に記載するように調製した。各溶液を３つ
のアリコートに分割し、そしてバイアルの中に入れた。
バイアルを２〜８℃、室温（ＲＴ、約２３℃）、および
４５℃の雰囲気の中に入れ、その直後に、各バッチの酵
素活性（第０日における初期活性）をカゼイン溶液のア
ッセイを使用して決定した。各温度における各バイアル
の活性を、同一カゼインアッセイを使用して、初期酵素
活性の百分率について周期的に測定した。アッセイを３
回実施し、そして平均値を取った。１００％として５.
０カゼイン単位の活性（平均の初期活性）の値を使用し
てプロットをつくった。結果を下表３に示す。チメロサ
ールを含まない酵素活性の値を１１週に決定し、そして
チメロサールを含む場合１０週に決定した。
【０１４５】
【表２】
【０１４６】この表に示すように、安定化されたプロテ
アーゼ配合物は、２〜８℃および室温において少なくと
も１０週の間、初期酵素活性の９０％より多くを保持し
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル・ジエイ・ギジンスキ アメリカ合衆国アリゾナ州85741トウー ソン・ウエストバタフライレイン3649 (72)発明者 ジエイムズ・エイ・リブスキ アメリカ合衆国アリゾナ州85718トウー ソン・アパートメント115・イーストリ バーロード855 (72)発明者 パメラ・エス・バンデイボート アメリカ合衆国アリゾナ州85718トウー ソン・アパートメント32・イーストリバ ーロード855 (72)発明者 アンソニイ・エル・ハートマン アメリカ合衆国アリゾナ州85741トウー ソン・ノーススピネルプレイス8932 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/96 G01N 33/48 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ．ペルオキシダーゼの働く範囲内の濃
    度のペルオキシダー ゼ発色団、 ｂ．６.０より低いｐＨを維持することができる酸性緩
    衝液、 ｃ．０．０００５〜０．０５％の還元剤、および ｄ．１〜１０％のグリコール、から本質的になることを
    特徴とする安定化された水性ペルオキシダーゼ発色団溶
    液。
  2. 【請求項２】 表面張力を減少させて溶液の平らなシー
    トを提供するために十分な量の洗浄剤をさらに含んでな
    る請求項１記載の安定化された水性ペルオキシダーゼ発
    色団溶液。
  3. 【請求項３】 ａ．２ｍｇ／ｍｌのＤＡＢ、 ｂ．５〜１０ｍＭのクエン酸塩−リン酸塩緩衝液、ｐＨ
    ５.０〜５.５、 ｃ．０.０００５〜０.０５％のメタ重亜硫酸ナトリウ
    ム、 ｄ．１〜１０％のポリエチレングリコール、および ｅ．必要に応じて、０.０１〜５％（ｖ／ｖ）のポリオ
    キシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンエー
    テルよりなる群から選択される非イオン性洗浄剤、を含
    んでなることを特徴とする安定化された水性３,３′−
    ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）
    溶液。
  4. 【請求項４】 ａ．１ｍｇ／ｍｌのＡＥＣ、 ｂ．０.０１〜０.５Ｍの酢酸塩緩衝液、ｐＨ４.５〜５.
    ５、 ｃ．０.０００８〜０.００８％のメタ重亜硫酸ナトリウ
    ム、 ｄ．１〜１０％のポリエチレングリコール、および ｅ．必要に応じて、０.０１〜５％（ｖ／ｖ）のポリオ
    キシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンエー
    テルよりなる群から選択される非イオン性洗浄剤、を含
    んでなることを特徴とする安定化された水性３−アミノ
    −９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）溶液。
  5. 【請求項５】 ペルオキシダーゼおよびペルオキシダー
    ゼ発色団を含む酵素系を用いて直接的または間接的に標
    識されている抗体を反応混合物に添加する免疫化学的方
    法であって、ペルオキシダーゼ発色団の働く範囲内の濃
    度の該ペルオキシダーゼ発色団、６.０より低いｐＨを
    維持することができる酸性緩衝液、０．０００５〜０．
    ０５％の還元剤、および該ペルオキシダーゼ発色団を安
    定化するために有効な濃度のグリコールから本質的にな
    る安定化された水性ペルオキシダーゼ発色団溶液を該ペ
    ルオキシダーゼと組み合わせることを特徴とする改良さ
    れた免疫化学的方法。
JP2001008926A 1990-03-02 2001-01-17 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬 Expired - Lifetime JP3503890B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US488348 1990-03-02
US07/488,348 US5225325A (en) 1990-03-02 1990-03-02 Immunohistochemical staining method and reagents therefor

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP15384799A Division JP3168195B2 (ja) 1990-03-02 1999-06-01 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2001231552A JP2001231552A (ja) 2001-08-28
JP3503890B2 true JP3503890B2 (ja) 2004-03-08

Family

ID=23939382

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3505979A Expired - Lifetime JP2966522B2 (ja) 1990-03-02 1991-02-27 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬
JP15384799A Expired - Lifetime JP3168195B2 (ja) 1990-03-02 1999-06-01 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬
JP2001008926A Expired - Lifetime JP3503890B2 (ja) 1990-03-02 2001-01-17 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3505979A Expired - Lifetime JP2966522B2 (ja) 1990-03-02 1991-02-27 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬
JP15384799A Expired - Lifetime JP3168195B2 (ja) 1990-03-02 1999-06-01 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬

Country Status (9)

Country Link
US (3) US5225325A (ja)
EP (2) EP1030178B1 (ja)
JP (3) JP2966522B2 (ja)
AT (2) ATE317978T1 (ja)
CA (1) CA2077451C (ja)
DE (2) DE69133006T2 (ja)
DK (1) DK1030178T3 (ja)
ES (2) ES2177521T3 (ja)
WO (1) WO1991013336A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014133120A1 (ja) 2013-02-28 2014-09-04 株式会社ニチレイバイオサイエンス 標識酵素を用いた染色用ｄａｂ含有基質キット

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5595707A (en) * 1990-03-02 1997-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Automated biological reaction apparatus
US6472217B1 (en) * 1990-03-02 2002-10-29 Ventana Medical Systems, Inc. Slide aqueous volume controlling apparatus
US5696887A (en) * 1991-08-05 1997-12-09 Biotek Solutions, Incorporated Automated tissue assay using standardized chemicals and packages
US6225115B1 (en) 1992-03-04 2001-05-01 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding taurine and GABA transporters and uses thereof
US5656504A (en) * 1992-10-26 1997-08-12 Pharmacia Biosensor Ab Method of preventing undesired binding in solid phase assays
US5807999A (en) * 1993-02-01 1998-09-15 Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Monoclonal antibody that distinguishes between phosphorylated and nonphosphorylated histone H1 and uses therefor
US5439649A (en) * 1993-09-29 1995-08-08 Biogenex Laboratories Automated staining apparatus
US5432056A (en) * 1993-11-15 1995-07-11 Ventana Medical Systems, Inc. Bisulfite-based tissue fixative
US5552087A (en) * 1993-11-15 1996-09-03 Ventana Medical Systems, Inc. High temperature evaporation inhibitor liquid
US5487975A (en) * 1993-11-15 1996-01-30 Ventana Medical Systems, Inc. Biotin/avidin formulation
JP2717940B2 (ja) * 1994-11-04 1998-02-25 三洋化成工業株式会社 改良された免疫分析用洗浄液
US5874315A (en) * 1996-03-05 1999-02-23 Meridian Diagnostics, Inc. Method for staining stool parasites
JP3623303B2 (ja) * 1996-03-21 2005-02-23 株式会社三菱化学ヤトロン スライドプレート洗浄液及びそれを含むキット
US5804141A (en) * 1996-10-15 1998-09-08 Chianese; David Reagent strip slide treating apparatus
SE9700207D0 (sv) * 1997-01-24 1997-01-24 Erik Litborn A method of preventing evaporation from liquid samples in small volumes
US6489171B1 (en) 1997-04-18 2002-12-03 Cell Marque Corporation Chemical dispensing system and method
US5935276A (en) * 1997-07-29 1999-08-10 Texaco Inc Method of impeding the evaporation of a solvent and compositions useful therein
JP2002517725A (ja) * 1998-06-02 2002-06-18 ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド 顕微鏡スライド上で不安定試薬を合わせることによる生物学的検体を染色する方法
US7550298B2 (en) 1998-09-03 2009-06-23 Ventana Medical Systems, Inc. Automated immunohistochemical and in situ hybridization assay formulations
US6855552B2 (en) * 1998-09-03 2005-02-15 Ventana Medical Systems Automated immunohistochemical and in situ hybridization assay formulations
CA2289174A1 (en) * 1998-11-09 2000-05-09 Andrew A. Pham Liquid barriers for assays
US8298485B2 (en) * 1999-07-08 2012-10-30 Lee H. Angros In situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method
US7951612B2 (en) * 1999-07-08 2011-05-31 Lee H. Angros In situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method
US7897106B2 (en) * 1999-07-08 2011-03-01 Lee Angros Situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method
WO2001004634A1 (en) * 1999-07-08 2001-01-18 Lee Angros Antigen recovery and/or staining apparatus and method
CA2414198A1 (en) 2000-07-06 2002-01-17 Neurogen Corporation Melanin concentrating hormone receptor ligands
US6828154B1 (en) 2000-11-03 2004-12-07 Cytologix Corporation Staining method with chromic acid precursors
JP2005530165A (ja) 2002-06-20 2005-10-06 ビジョン・バイオシステムズ・リミテッド 流体排出機構を備えた生物反応装置
AU2003901871A0 (en) * 2003-03-31 2003-05-08 Vision Biosystems Limited A method and apparatus for fluid dispensation, preparation and dilation
US7648678B2 (en) 2002-12-20 2010-01-19 Dako Denmark A/S Method and system for pretreatment of tissue slides
PL1601450T3 (pl) * 2003-03-10 2014-03-31 Expression Pathology Inc Ciekły preparat tkankowy z próbek biologicznych, tkanek i komórek poddanych obróbce histopatologicznej
US7501283B2 (en) * 2003-08-11 2009-03-10 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Fluid dispensing apparatus
US7767152B2 (en) 2003-08-11 2010-08-03 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Reagent container and slide reaction retaining tray, and method of operation
US7744817B2 (en) * 2003-08-11 2010-06-29 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Manifold assembly
US9518899B2 (en) 2003-08-11 2016-12-13 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Automated reagent dispensing system and method of operation
US20050176026A1 (en) * 2003-09-05 2005-08-11 Franck Carl P. Liquid mixing reactor for biochemical assays
EP1697719B1 (en) * 2003-12-23 2018-09-19 Ventana Medical Systems, Inc. Method and apparatus for efficient thin film fluid processing of flat surfaces
GB0501590D0 (en) * 2005-01-25 2005-03-02 Ceres Power Ltd Processing of enhanced performance LSCF fuel cell cathode microstructure and a fuel cell cathode
EP1888739B1 (en) 2005-05-24 2021-08-11 Lee H. Angros Automated apparatus and method for treating biological specimens on slides
CA2613203C (en) * 2005-06-28 2013-08-13 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Methods for growing and harvesting carbon nanotubes
JP5490414B2 (ja) * 2006-01-13 2014-05-14 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 生体サンプル処理用組成物及び方法
US8459509B2 (en) 2006-05-25 2013-06-11 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Fluid dispensing apparatus
EP3029461B1 (en) 2006-11-01 2017-12-20 Ventana Medical Systems, Inc. Haptens, hapten conjugates, compositions thereof and method for their preparation and use
AU2008262489B2 (en) 2007-05-23 2013-11-28 Ventana Medical Systems, Inc. Polymeric carriers for immunohistochemistry and in situ hybridization
JP2009121906A (ja) * 2007-11-14 2009-06-04 Japan Health Science Foundation 抗原賦活化方法
AU2009226423B2 (en) 2008-03-17 2014-11-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for detection of liver cancer cell using anti-glypican-3 antibody
CA2979353C (en) 2008-06-05 2020-06-30 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions comprising nanomaterials and method for using such compositions for histochemical processes
AU2009285551B2 (en) * 2008-08-29 2015-10-29 Lee H. Angros Multiplexed microscope slide staining apparatus
JP4638555B1 (ja) * 2010-09-08 2011-02-23 田中貴金属工業株式会社 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット
EP3088534B1 (en) * 2010-12-30 2018-08-01 Ventana Medical Systems, Inc. Enhanced deposition of chromogens utilizing pyrimidine analogs
US8752732B2 (en) 2011-02-01 2014-06-17 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Fluid dispensing system
CN103649760B (zh) 2011-06-01 2015-09-09 文塔纳医疗系统公司 具有过滤器件的分液器
US8580568B2 (en) 2011-09-21 2013-11-12 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Traceability for automated staining system
US8932543B2 (en) 2011-09-21 2015-01-13 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Automated staining system and reaction chamber
JP6017585B2 (ja) * 2012-01-23 2016-11-02 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 色素原溶液のポリマー安定化
HU230739B1 (hu) 2013-02-28 2018-01-29 3Dhistech Kft. Berendezés és eljárás tárgylemezek automatikus festésére, fedésére, digitalizálására integrált tárgylemez festő-fedő-digitalizáló automata berendezés segítségével
EP3080610A4 (en) * 2013-12-12 2018-02-28 University of Houston System Universal antigen retrieval compounds and methods of use
ES2918325T3 (es) * 2014-04-30 2022-07-15 Ventana Med Syst Inc Procedimiento de limpieza para precipitados de hemateína en aparatos de tinción automatizados
EP2985603A1 (en) * 2014-08-13 2016-02-17 Yantai AusBio Laboratories Co., Ltd. Method for carrying out a ligand binding assay and device for carrying out such a method
CA2984701C (en) * 2015-05-10 2023-09-26 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions and methods for simultaneous inactivation of alkaline phosphatase and peroxidase enzymes during automated multiplex tissue staining assays
CN106018781B (zh) * 2016-05-19 2018-11-13 四川金域医学检验中心有限公司 一种组织切片的免疫组化操作方法
US20200041489A1 (en) * 2017-04-07 2020-02-06 Michael R. Emmert-Buck High precision micropurification system and methods of use
TWI662961B (zh) * 2018-03-16 2019-06-21 共生地球生物科技有限公司 多重ｐＨ緩衝配方與胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑之緩衝組合物及其用途
US11237170B2 (en) 2018-12-04 2022-02-01 Aat Bioquest, Inc. Styryl phenols, derivatives and their use in methods of analyte detection
CN109781983A (zh) * 2019-03-14 2019-05-21 武汉原谷生物科技有限责任公司 一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法
CN110907255A (zh) * 2019-12-10 2020-03-24 武汉赛维尔生物科技有限公司 一种即用型免疫组化染色液及其制备方法和应用
CN112816685A (zh) * 2020-12-30 2021-05-18 苏州堪赛尔医学检验有限公司 免疫组化的免疫酶标方法以及用于免疫酶标方法的试剂盒
CN113484313B (zh) * 2021-07-23 2022-06-24 图凌(杭州)生物医药有限公司 用于免疫组化检测的dab显色试剂盒及其应用
CN114594245A (zh) * 2022-01-26 2022-06-07 浙江莱阅病理诊断科技有限公司 一种全自动免疫组化染色机适配的清洗缓冲液及其制备方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3050445A (en) * 1958-08-13 1962-08-21 Armour Pharma Stabilized trypsin solution
DK132327A (ja) * 1968-07-16
GB2070767B (en) * 1980-03-03 1983-07-27 Abbott Lab Stabilizing the reaction product formed in enzyme immunoassays
JPS57203017A (en) * 1981-06-09 1982-12-13 Fujirebio Inc Purifying method of immunoglobulin
US4503143A (en) * 1982-08-20 1985-03-05 Btc Diagnostics Limited Partnership Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen
US4971783A (en) * 1982-11-22 1990-11-20 The University Of Va Alumni Patents Foundation Tissue processing for immunofluorescence microscopy
US4615972A (en) * 1983-11-04 1986-10-07 Immuno Concepts, Inc. Stabilization of indicators for detecting enzyme activity
US4543333A (en) * 1984-06-05 1985-09-24 Novo Industri A/S Liquid proteinase concentrate and method for preparation
JPS61108387A (ja) * 1984-10-30 1986-05-27 Showa Denko Kk 酵素の安定化法及び安定化組成物
IL74205A (en) * 1985-01-31 1990-01-18 Savyon Diagnostics Ltd Method for carrying out enzyme assays utilizing stable chemical compositions containing hydrogen peroxide and a chromogen
US4824784A (en) * 1985-04-08 1989-04-25 Hygeia Sciences, Incorporated Chromogenic solution for immunoassay
US4731335A (en) * 1985-09-13 1988-03-15 Fisher Scientific Company Method for treating thin samples on a surface employing capillary flow
DE3541979A1 (de) * 1985-11-28 1987-06-04 Behringwerke Ag Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet mit stabilisator, verfahren zur herstellung und seine verwendung
US4965203A (en) * 1987-01-28 1990-10-23 Warner-Lambert Company Purified thrombin preparations
US4847208A (en) * 1987-07-29 1989-07-11 Bogen Steven A Apparatus for immunohistochemical staining and method of rinsing a plurality of slides
US5017471A (en) * 1988-08-26 1991-05-21 Epitope, Inc. Reagent for peroxidase detection
US5215885A (en) * 1990-10-23 1993-06-01 Beckman Instruments, Inc. Stable two-part chromogen substrate
US5206150A (en) * 1990-10-26 1993-04-27 University Of Kentucky Research Foundation Composition of, method of producing and method of using a stabilized formulation for assaying peroxidase activity
US5192657A (en) * 1990-12-18 1993-03-09 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Stabilized proteolytic solution and reagent kit

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014133120A1 (ja) 2013-02-28 2014-09-04 株式会社ニチレイバイオサイエンス 標識酵素を用いた染色用ｄａｂ含有基質キット

Also Published As

Publication number Publication date
US5225325A (en) 1993-07-06
DK1030178T3 (da) 2006-06-12
EP0517818B1 (en) 2002-05-08
CA2077451A1 (en) 1991-09-03
EP0517818A1 (en) 1992-12-16
EP1030178A1 (en) 2000-08-23
US5322771A (en) 1994-06-21
US5418138A (en) 1995-05-23
WO1991013336A1 (en) 1991-09-05
ATE217418T1 (de) 2002-05-15
DE69133006T2 (de) 2002-12-12
DE69133508D1 (de) 2006-04-20
DE69133508T2 (de) 2006-09-28
CA2077451C (en) 1996-06-18
DE69133006D1 (de) 2002-06-13
JPH05505239A (ja) 1993-08-05
JP3168195B2 (ja) 2001-05-21
EP1030178B1 (en) 2006-02-15
JP2001231552A (ja) 2001-08-28
ES2177521T3 (es) 2002-12-16
ES2258422T3 (es) 2006-09-01
EP0517818B9 (en) 2003-01-08
EP0517818A4 (en) 1995-03-22
ATE317978T1 (de) 2006-03-15
JP2000046827A (ja) 2000-02-18
JP2966522B2 (ja) 1999-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3503890B2 (ja) 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬
US4503143A (en) Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen
US7563566B2 (en) Stabilization of H2O2 under alkaline conditions for use in luminescence, fluorescence and colorimetric assays for enhanced detection of peroxidase type assays
Mepham et al. The use of proteolytic enzymes to improve immunoglobulin staining by the PAP technique
Bratthauer The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods
US4684609A (en) Method and substance for the enhanced labelling of cellular material
CA1206092A (en) Glucose oxidase immunohistochemical detection of antinuclear antibodies
JPS60184385A (ja) 安定化酵素結合体組成物
US5780239A (en) Method for the determination of cast in urine
CZ83393A3 (en) Process of treating humors when determining neopterin and means for carrying out said process
Vijayaraj Immunochemistry Analysis Using Chromogenic Substrates on Tissue Sections
CN110567785B (zh) 染色试剂盒及使用方法
Bratthauer Labeled avidin binding (LAB) method
JPH05123190A (ja) イムノブロツト分析用標識ペルオキシダーゼの検出試薬
Shi et al. Use of monoclonal antibodies in immunohistochemistry
Zarbo et al. Abc‐immunoperoxidase staining of cytologic preparations: Improvement of specificity
Kumar Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods
CN115615786A (zh) 骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用
Beesley Immunogold probes for light microscopy
Sarrazy et al. Double immunohistochemistry with horseradish peroxidase and alkaline phosphatase detection systems
Dako (Animal Research Kit), Peroxidase
Jar-Ethanol Signal Enhancer HIKARI
Manual SUPER SENSITIVE™* IHC DETECTION SYSTEMS
QUIK RABBIT RAPID STAINING KIT

Legal Events

Date Code Title Description
A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20031205

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081219

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091219

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091219

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101219

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111219

Year of fee payment: 8

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111219

Year of fee payment: 8