ES2258422T3 - Procedimiento mejorado de coloracion inmunohistoquimica y reactivos obtenidos. - Google Patents

Procedimiento mejorado de coloracion inmunohistoquimica y reactivos obtenidos.

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ES2258422T3 ES00105355T ES00105355T ES2258422T3 ES 2258422 T3 ES2258422 T3 ES 2258422T3 ES 00105355 T ES00105355 T ES 00105355T ES 00105355 T ES00105355 T ES 00105355T ES 2258422 T3 ES2258422 T3 ES 2258422T3
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Michael J. Gizinski
James A. Rybski
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Abstract

Solución de enzima proteolítica estabilizada, que comprende: a. del 40 al 60% de un glicol; b. un tampón fisiológico; c. una cantidad efectiva de un agente reductor; d. una fuente de iones de calcio en una concentración suficiente para mejorar la estabilidad de la enzima; e. una cantidad efectiva de dicha enzima.

Description

Procedimiento mejorado de coloración inmunohistoquímica y reactivos obtenidos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a soluciones estabilizadas, por ejemplo para su uso en procedimientos de teñido biológicos.
Antecedentes de la invención
Ahora se reconocen generalmente cuatro procedimientos principales que usan peroxidasa (HRPO) para inmunoteñido. Los procedimientos están basados en la reacción inmune de un antígeno que se ha de detecta en el espécimen que forma un complejo con un anticuerpo específico para el antígeno. Los procedimientos difiere principalmente en la manera de detectar el complejo antígeno-anticuerpo. Los procedimientos son el procedimiento directo, un procedimiento indirecto usando un anticuerpo secundario conjugado con una enzima específica para las especies del primer anticuerpo o primario, el procedimiento de la peroxidasa-anti-peroxidasa (PAP), y un procedimiento indirecto biotina-avidina que usa un anticuerpo secundario conjugado con biotina y un complejo de una peroxidasa conjugada con biotina y avidina o estrepavidina.
Todos los procedimientos de inmonuhistoquímica, así como otros procedimientos inmunoquímicos, son procedimiento de múltiples etapas que consisten en una secuencia de adiciones de reactivos, incubaciones y lavados. La mayoría de estos procedimientos requieren personal muy entrenado y los resultados pueden variar significativamente entre los laboratorios. Se han explorado sistemas automatizados para introducir un ahorro de costes, una uniformidad de preparación de la lámina y una reducción de los errores humanos en el procedimiento.
En los procedimientos automatizados y manuales hay una serie de puntos críticos que se han de considerar. Se ha de tener cuidado para evitar la pérdida del espécimen de la lámina. El lavado completo del espécimen entre las aplicaciones de reactivos es esencial, particularmente se amplificaría para retirar el anticuerpo no unido como residuos. Se ha de retirar el líquido en exceso para evitar la disolución no deseada de los anticuerpos, pero los especímenes nunca se han de dejar que se sequen. Se ha de aplicar un reactivo de anticuerpo suficiente para cubrir completamente el área de la lámina donde se puede producir el espécimen, pero los residuos se han de mantener en un mínimo absoluto.
Además, muchos de los reactivos usados en los procedimientos inmunohistoquímicos, así como en los procedimientos inmunoquímicos, tales como soluciones de enzimas y reactivos de desarrollo de color de peroxidasa, tienen una estabilidad limitada a la temperatura de trabajo e incluso a temperatura ambiente. Esto necesita una preparación frecuente de los reactivos. Además, sigue siendo un problema la unión de un anticuerpo no específico, lo que provoca resultados erróneos.
Procedimientos y reactivos que mejoren los resultados y minimicen la preparación de los reactivos facilitarían los procedimientos inmunohistoquímicos manuales y automatizados. Muchas de las mejoras se podrían aplicar fácilmente a procedimientos inmunoquímicos relacionados tales como ensayos inmunoabsorbentes enlazados con enzimas (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia e hibridización in situ.
Descripción de la técnica anterior
Cosgrove et al, ACL pp 23-27 (Diciembre, 1989) describe procedimiento de inmunoteñido, particularmente procedimientos de teñido de peroxidasa, y un aparato de teñido automático. Brigati y sus colegas [Brigati et al, J. Histotechnology 11:165-183 (1988); Unger et al, J. Histotechnology 11:253-258 (1988)] describe la estación de trabajo automática Fisher (que puede realizar teñido inmunohistoquímico y procedimientos de hidrización in situ) y reactivos usados en los procedimientos automatizados. El sistema y los reactivos también se describen en las patentes US-4.777.020, 4.798.706 y 4.801.431. Cada uno de esos dispositivos usa un procedimiento diferente para conservar reactivos (que contienen anticuerpos) caros.
Stress et al, J. Clin. Pathol. 42:106-112 (1989) describe un sistema de teñido de tejido automatizado que procesa las láminas siguiendo una aplicación manual de reactivos que contienen anticuerpos. Stara et al, J. Immunol. Methods. 107:89-92 (1988) describe un sistema de teñido automatizado controlado con un microprocesador.
La patente JP 61 108387 A describe una solución para estabilizar proteasa alcali que comprende aminoácidos tales como glicina y sulfato de calcio.
La patente GB-A-2 070 767 describe soluciones de cromoforo de peroxidasa estabilizado que incluyen metabisulfatos o tiosulfatos.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona soluciones estabilizadas, por ejemplo para su uso en procedimientos para teñir láminas usando reactivos inmunoquímicos. La presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento previo de las secciones de tejido para el teñido inmunohistoquímico usando una solución de enzima proteolítica estabilizada. En una realización preferida, el procedimiento se usa en un proceso automatizado. El procedimiento puede comprender las siguientes etapas. La región de ensayo de una lámina (la región que contiene la sección del tejido) se lava con una solución de enjuague mejorada que comprende agua y detergente. Se aplica un líquido inhibidor de la evaporación a la lámina para cubrir la región del ensayo. Para los antígenos que requieren desenmascarado, la sección del tejido se combina con una solución de enzima proteolítica estabilizada mejorada. La lámina se enjuaga, y se vuelve a aplicar el líquido inhibidor de la evaporación a la lámina. Un anticuerpo primario en un diluyente mejorado que contiene globulinas de la misma especie que un segundo anticuerpo se combina con la sección de tejido durante un periodo de tiempo suficiente para completar substancialmente la unión del anticuerpo. La lámina se enjuaga, y se vuelve a aplicar el líquido inhibidor de la evaporación. Se combina un segundo anticuerpo marcado en el diluyente mejorado con la sección de tejido durante un periodo de tiempo suficiente para completar substancialmente la unión del anticuerpo. La lámina se enjuaga, y se vuelve a aplicar el líquido inhibidor de la evaporación a la lámina. Se combinan reactivos de desarrollo del color, en una realización preferida una solución de diaminobenzidina (DAB) estabilizada, con la sección de tejido durante un periodo de tiempo suficiente para el desarrollo del color. Después del enjuague, y opcionalmente, de la mejora del color con DAB y/o el contrateñido, la sección de tejido está lista para el análisis.
Se describen los reactivos mejorados usados en el procedimiento:
La presente invención proporciona composiciones mejoradas y las etapas del procedimiento de ensayo que son útiles en los procedimientos de teñido inmunohistoquímicos (IHC) en general, y en particular, en procedimientos IHC en los que se usa un reactivo de marcado de peroxidasa. Sin embargo, muchas de las composiciones y las etapas del procedimiento tienen una aplicabilidad más general, tal como quedará claro para un técnico en la materia.
Se conocen generalmente cuatro procedimientos principales para el inmunoteñido. Los procedimientos están basados en la reacción inmune de un antígeno de interés en el espécimen que forma un complejo con un anticuerpo específico para el antígeno. Los procedimientos difieren principalmente en la manera que se detecta el complejo antígeno-anticuerpo. Cada uno de los procedimientos usa un anticuerpo marcado.
Las etiquetas adecuadas para las técnicas de inmunoensayos, incluyendo las técnicas IHC, son bien conocidas. Esas etiquetadas incluyen marcas que se pueden observar o medir directamente, tales como radioetiquetas que se pueden medir con dispositivos contadores de radiación; pigmentos, tintes u otros cromógenos que se pueden observar o medir visualmente con un espectrómetro; etiquetas de espín que se pueden medir con un analizador de etiquetas de espín; y fracciones fluorescentes que se pueden visualizar bajo luz ultravioleta o se pueden medir con fluorómetros estándar, por ejemplo. La etiqueta puede ser una sustancia luminiscente tal como un fósforo o fluorógeno, una sustancia bioluminiscente, una sustancia químicoluminiscente o una sustancia que contiene metal.
La amplificación y mayores distinciones de la técnica anterior se pueden conseguir mediante el uso de etiquetas de enzima o sistemas de etiquetado de enzima. La enzima rompe un sustrato para producir un cromógeno, visualizando el sitio del complejo antígeno/anticuerpo en la lámina. El sustrato se selecciona para producir el producto preferido que se puede medir. Se prefieren enzimas cromogénicas y fluorogénicas. Estas son enzimas para las que se conocen los sustratos que producen cromógenos y fluorógenos, respectivamente.
Una combinación preferida de sustrato cromogénico y enzima usa oxidoreductasas tales como peroxidasa de rábano y un sustrato tal como diaminobenzidina (DAB) y amino-etil carbozol (AEC) que produce un color de distinción (marrón y rojo, respectivamente). Se puede usar cualquier otra combinación de enzima y sustrato que produce cromógenos si proporciona una pigmentación de distinción.
Combinaciones de enzima con sustratos fluorogénos que se pueden se describen en la patente US 4.190.496, por ejemplo. Los sustratos fluorogénicos preferidos y las enzimas adecuadas que corresponden a los mismos incluyen peroxidasa de rábano para el cual un sustrato adecuado es ácido homovanílio o ácido 4-hidroxi-3-metoxi-fenilacético, beta-galactosidasa para el cual un sustrato adecuado es 4-metilumbeliferil-\beta-D-galactosuro, fosfatasa alcalina para el cual un sustrato adecuado es fosfato de 4-metilumbeliferil, otros fosfatos de umbeliferil tales como fosfato de 4-carboxio-beliferil, y fosfato de umberliferil 4-carboxi alquilésteres, etc.
En el procedimiento directo el anticuerpo está químicamente enlazado con una etiqueta, preferiblemente una enzima tal como peroxidasa o un fluoroforo. Al añadir el reactivo de anticuerpo etiquetado, el anticuerpo se une al antígeno para formar un complejo conjugado antígeno-anticuerpo/etiqueta. Un fluoroforo se puede visualizar directamente. Cuando la etiqueta es una enzima, se aplica el sustrato de la enzima, y se produce un precipitado coloreado en la posición del complejo conjugado antígeno-anticuerpo/enzima.
La aplicación del procedimiento directo es limitada, ya que se requiere un anticuerpo etiquetado específico para cada antígeno que se ha de detectar. Estos reactivos no están generalmente disponibles comercialmente. Sin embargo, cuando los reactivos están disponibles y la sensibilidad es suficiente, el procedimiento directo es un procedimiento preferido de detención del antígeno.
El segundo procedimiento usa un primer anticuerpo o primario específico para el antígeno de interés para formar el complejo antígeno-anticuerpo inicial. A continuación se usa un anticuerpo etiquetado, preferiblemente un anticuerpo conjugado de enzima, llamado segundo anticuerpo o secundario, que es específico para la especie del anticuerpo primario, para detectar el anticuerpo primario. Cuando la etiqueta es una enzima, se añade el sustrato para detectar el complejo. De esta manera, se pueden usar una variedad de anticuerpos primarios producidos en la misma especie animal con un único anticuerpo secundario etiquetado para su visualización. Además, se consigue una sensibilidad mejorada mediante el uso del segundo anticuerpo.
El tercer procedimiento, llamado el procedimiento peroxidasa-anti-peroxidasa o PAP es muy usado. El procedimiento PAP tiene tres reactivos principales. Además de los anticuerpos primario y secundario, la peroxidasa forma un complejo con un anticuerpo contra la peroxidasa. El cuerpo de enlace o secundario es específico para las especies del anticuerpo primario y la anti-peroxidasa. El complejo se visualiza usando una reacción sustrato-cromógeno.
En el cuarto procedimiento, el procedimiento indirecto biotina-avidina, el anticuerpo secundario se conjuga con la biotina vitamina. El tercer reactivo varía dependiendo del procedimiento. En el procedimiento ABC, se añade avidita o estrepavidina antes o al mismo tiempo que una peroxidasa conjugada con biotina. En el procedimiento LAB, el tercer reactivo es avidina o estrepavidina etiquetada con peroxidasa. Los sitios libres de la molécula de avidina se unen a la biotina en el anticuerpo secundario. El complejo se visualiza con un cromógeno apropiado. La fuerte afinidad de la avidina con la biotina le da a este procedimiento una mayor sensibilidad que otras técnicas de anticuerpos conjugados.
Por motivos de claridad y no a modo de limitación, la invención se describirá en términos de un proceso inmunohistoquímico tal como se ejemplifica mediante un procedimiento de peroxidasa biotina-avidina indirecto. Quedará claro para un experto en la materia que las etapas mejoradas del procedimiento se pueden usar en otros procesos inmunohistoquímicos. De hecho, muchas de las etapas mejoradas se pueden usar generalmente en procesos inmunoquímicos. Algunos de los reactivos y las etapas son aplicables a cualquier ensayo de pequeño volumen que implique rangos de concentración de reactivos críticos que se realice en una lámina. Los expertos en la materia reconocerán también que los reactivos mejorados se pueden usar en cualquier procedimiento de teñido HRPO. Además, muchos de los reactivos se pueden usar en otros procedimientos de teñido inmunohistoquímicos no peroxidasa, así como en otras técnicas inmunoquímicas. Cada uno de los reactivos usados en el procedimiento de ejemplo se describe a continuación en el orden en el que se usan en el procedimiento.
Tal como se usa aquí, el término "región de ensayo" significa el área de una lámina a la cual se unen cualquier reactivo(s) o muestra(s) de ensayo tales como anticuerpos o secciones de tejido. El término "sección de tejido" se usa para indicar las secciones de tejido (las secciones fijadas con formalina, secciones incrustadas en parafina y las secciones heladas), frotis, aspirados de tuétano óseo, citoespines, y otros materiales de muestra fijados a una lámina para evaluación, particularmente evaluación histológica.
Reactivos
Soluciones de enjuague o tampones salados se pueden usar para enjuagar la región de ensayo de una lámina entre la adición del reactivo de teñido u otros reactivos de anticuerpo, enzima o que contienen ácido nucleico.
Una solución de enjuague puede comprender una cantidad de detergente suficiente para reducir la tensión superficial de la solución acuosa para proporcionar un laminado uniforme de la solución de enjuague.
Tal como se ha indicado previamente, el detergente proporciona un laminado uniforme de la solución de enjuague para asegurar que toda el área de la lámina se enjuaga de una manera efectiva. El detergente ha de ser compatible con los reactivos de teñido inmunohistoquímicos y los reactivos inmunoquímicos en general y puede ser cualquiera de los detergentes biológicos no iónicos usados en bioquímica para la solubilización de proteínas y componentes de la membrana. Se prefieren polioxietilenosorbitanos y éteres de polioxietileno. Más preferido es el polioxietilenosorbitano monolaurato (vendido bajo el nombre Tween 20) y polioxietileno 23 lauril éter (vendido bajo el nombre Brij 35). Ambos detergentes están disponibles por parte de una variedad de fuentes que incluyen Sigma Chemical, Co. St. Louis, MO.
Las soluciones estabilizadas de la invención incluyen preferiblemente preservativos tales como agentes antimicóticos y antimicrobiales en una concentración efectiva para impedir el crecimiento de microorganismos en la solución. Son bien conocidos los preservativos que no interfieren con las reacciones inmunoquímicas. Son agentes de ejemplo gentamicina, penicilina, estreptomicina y, preferiblemente, timerosal. El azido de sodio es conocido para inactivar la actividad de la enzima de peroxidasa y preferiblemente no se usa con reactivos de teñido HRPO IHC. Los agentes son efectivos en concentraciones en el rango de 0,001% al 0,1% aproximadamente y se usan preferiblemente entre un 0,01 y un 0,1% aproximadamente, más preferiblemente de un 0,05% aproximadamente.
Enzima Proteolítica Estabilizada
Se aplica una solución de proteasa a secciones de tejido fijadas con formalina incrustadas en parafina como tratamiento previo para el teñido inmunohistoquímico con una variedad de anticuerpos tales como la mayoría de anticuerpos anti-desmina y anti-queratina. Los anticuerpos que requieren este tratamiento del tejido para el reconocimiento de antígenos, indicados como desenmascarado de antígeno o desenmascarado, se han determinado empíricamente y son indican en la literatura. La solución de proteasa se aplica antes de la aplicación del anticuerpo y, preferiblemente, justo después del tratamiento de peroxidasa.
Se dice que la proteasa rescata el tejido de los daños realizados por la formalina durante el proceso de fijación. La fijación de formalina produce uniones de reticulación que enmascaran los antígenos del tejido, evitando así el reconocimiento del anticuerpo de los antígenos y, así, que se produzca el teñido. Esto puede provocar falsas lecturas negativas que pueden llevar a falsos diagnósticos de la muestra de tejido. La proteasa deteriora la reticulación de la formalina, exponiendo los antígenos del tejido a los reactivos de etiquetado.
Un inconveniente mayor para usar la proteasa es que la enzima era estable durante periodos de tiempo extendidos solamente cuando estaba congelada. A temperatura ambiente, la enzima era estable durante solamente minutos en la disolución de trabajo. Este es un inconveniente significativo, especialmente para los procedimientos automati-
zados.
Preferiblemente, el procedimiento incluye proporcionar un diluyente que actúa como estabilizador para una enzima proteolítica. En este diluyente, la enzima es estable durante periodos de tiempo extendidos en grados variantes de temperatura. En particular, la enzima se ha mostrado que es estable (reteniendo por lo menos un 90% de la actividad de la enzima original) en el diluyente en una concentración efectiva después de almacenamiento durante 10 semanas a 2 a 8ºC y a temperatura ambiente, tal como se describe en detalle en el Ejemplo 4. La formulación de la enzima estabilizada puede soportar un transporte/envío a temperatura ambiente y repetida congelación/descongelado y tiene una vida propia muy extendida.
La formulación de la enzima proteolítica estabilizada incluye una cantidad efectiva de la enzima, preferiblemente en la disolución de trabajo, en un tampón que contiene un glicol, un agente de reducción, una fuente de iones de calcio, y, opcionalmente, un preservativo. Una solución de enzima proteolítica estabilizada preferida comprende un tampón fisiológico; del 40 al 60% aproximadamente de un glicol; una cantidad efectiva de un agente reductor; una fuente de iones de calcio en una concentración suficiente para mejorar la estabilidad de la enzima; y una cantidad efectiva de la enzima.
El tampón es un tampón fisiológico a un pH de entre 7,0 y 7,5 aproximadamente, preferiblemente 7,4. El tampón no es un tampón basado en fosfato, ya que el calcio precipita en el tampón de fosfato en una concentración efectiva. El tampón puede ser MOPS (2-[N-morfolino] ácido propanesulfónico), TES (2-(-hidroxi-1,1-[bis(hidroximetil)-etil] amino) ácido etanesulfónico, hepes (N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanesulfónico), BES (2-[bis(2-hidroxietil)amino] ácido etanesulfónico), tampón barbital o tampón de ácido cacodílico, Tris maleato o, preferiblemente, Tris/HCl a una concentración de 0,01 a 0,1 M aproximadamente, preferiblemente de 0,025 M aproximada-
mente.
El agente reductor puede ser ditiotreitol, ácido ascórbico o, preferiblemente, metabisulfito de sodio (MBS). Esos agentes son efectivos para estabilizar las enzimas en concentraciones entre 0,0005 y 0,05% aproximadamente (Para MBS, esta concentración es aproximadamente de 0,026 a 2,6 mM). Un agente reductor preferido es MBS a una concentración de 0,3 mM aproximadamente.
El glicol puede ser cualquier glicol y es preferiblemente polipropilenglicol, polietilenglicol o, más preferiblemente, propilenglicol. El glicol está presente en una cantidad efectiva para estabilizar una enzima, preferiblemente del 40 al 60% aproximadamente del diluyente en volumen, más preferiblemente del 50% aproximadamente (v/v).
El diluyente también incluye una fuente de iones de calcio, convenientemente cloruro de calcio, con una concentración comprendida entre 1 y 10 mM aproximadamente, preferiblemente 5 mM aproximadamente. La fuente de iones de calcio es preferiblemente no fosfato de calcio debido a los problemas de insolubilidad del calcio descritos previamente.
La solución contiene opcionalmente un preservativo. Los preservativos adecuados no difieren de los descritos previamente.
La enzima es una enzima proteolítica presente en por lo menos una cantidad efectiva, pero puede estar concentrada para su disolución posterior. Un rango de concentración preferido está comprendido entre 0,1 y 10 unidades por ml aproximadamente, preferiblemente entre 0,1 y 0,5 u/ml aproximadamente. Más preferido es de 0,25 u/ml aproximadamente. La actividad de la enzima se puede medir usando un ensayo de caseína y la proteína total basada en la absorbancia a 280 nm.
La enzima puede ser una exopeptidasa (tal como carboxi- y amino-peptidasa, dipeptidasa) o, preferiblemente, una endopeptidasa (tal como pepsina, catepsina y papaína). Preferiblemente, la enzima es proteasa alcalina tipo VIII, disponible comercialmente por parte de Sigma Chemical Co. Una formulación más preferida se muestra en la Tabla 1 adjunta.
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TABLA I Formulación de Enzima Proteolítica Estabilizada 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 50% Propilenglicol\cr  0,025 M Tris/HCl, pH 7,4\cr  0,3 mM
Metabisulfito de Sodio\cr  5 mM Cloruro de Calcio\cr  0,05%
Timerosal\cr  0,025 u/ml proteasa alcalina tipo
VIII\cr}
La formulación de la enzima estabilizada se prepara mezclando los ingredientes juntos. Después de la preparación, la formulación se guarda preferiblemente a 2-8ºC, pero es estable al almacenarse a -20ºC.
Formulación de Cromoforo de Peroxidasa Estabilizada
Los cromoforos de peroxidasa son cromoforos donantes de electrones que tiene una estabilidad limitada en soluciones acuosas en bajas concentraciones, en el rango de las disoluciones de trabajo de las soluciones. Los cromoforos de peroxidasa más comúnmente usados para uso inmunohistoquímico son tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB, producto final marrón insoluble) y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, producto final rojo insoluble). Para inmunoensayos de enzima, también se usa comúnmente hidrocloruro de orto-fenildiamina (OPO, producto final naranja-marrón soluble). Otros cromoforos de peroxidasa incluyen 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS, producto final verde soluble); 5-amino-ácido salicílico (5AS, producto final marrón soluble); 4-cloro-1-naftol (4CIN, producto final azul insoluble); orto-dianisidina (0D, producto final amarillo-naranja soluble) y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB, producto final azul claro soluble).
En la actualidad, se comercializa una formulación líquida estabilizada de DAB por parte de Kirkegaard and Perry Laboratorios (KPL). La formulación incluye una alta concentración de DAB (25 mg/ml), aproximadamente diez veces la concentración de trabajo, y requiere un almacenamiento a 4ºC con un bajo pH en presencia de un glicol de tipo desconocido. La solución es estable durante unos 30 días a 2-8ºC y está lista para usarse después de su disolución en una concentración de trabajo. El producto de KPL no es estable a 2 mg/ml, la concentración de trabajo, durante tan poco como un día a 45ºC. Una prueba de tensión estándar requiere la actividad de la enzima en inmunoteñido de un antígeno específico después de tres días a 45ºC.
También está disponible una solución de AEC líquida (Sigma Chemical Company). La formulación es desconocida pero incluye una alta concentración de AEC, aproximadamente 200 veces la concentración de trabajo. La formulación se diluye y se añade peróxido de hidrógeno para formar a solución de trabajo. Una vez diluida con el peróxido de hidrógeno añadido, la solución de trabajo es probablemente solamente estable durante unas pocas horas.
Para otros cromoforos de HPRO, el usuario generalmente prepara las soluciones de cromoforos a la concentración de trabajo y mezcla la solución con peróxido de hidrógeno diluido nuevo del día de uso. Estas soluciones de cromoforo pueden almacenarse congeladas antes de la adición del peróxido de hidrógeno. En contraste, la solución de cromoforo preferida para usarse en la presente invención no incluye peróxido y está diseñada para combinarse con peróxido en la lámina. Esto evita la aceleración de la oxidación provocada por la mezcla del peróxido con el cromoforo.
Preferiblemente, se usa una solución estabilizada que tiene una baja concentración de cromoforo de HRPO líquido, en el rango de trabajo del cromoforo. El rango general para los cromoforos redox está comprendido entre 1 y 2 mg/ml (de 1 a 10 mM aproximadamente). Para DAB, el rango más preferido es entre 4,6 y 9,2 mM aproximadamente. En la formulación estabilizada, el cromoforo permanece biológicamente activo en los procedimientos de inmunoteñido de antígeno específico siguiendo una prueba de tensión estándar de tres días a 45ºC. Como las formulaciones estabilizadas preferiblemente contienen el cromoforo a una concentración de trabajo, no se requiere la disolución del reactivo por parte del usuario.
Además del cromoforo, la formulación consiste esencialmente en un tampón ácido capaz de mantener un pH menor de 6,0; una cantidad efectiva de un agente reductor para estabilizar el cromoforo; y un glicol en una cantidad efectiva para estabilizar el cromoforo.
El tampón es un tampón ácido que mantiene el pH de la solución estabilizada por debajo de un pH de 6,0, preferiblemente entre un pH de 5,0 y 5,5. El tampón preferiblemente proporciona un pH efectivo para la actividad de la enzima (pH de 6 a 7 aproximadamente) cuando la solución de cromoforo se añade a la mezcla que contiene la enzima sobre la lámina. Tampones ácidos adecuados son tampón de citrato fosfato, citrato acetato, acetato, succinato, ftalato, y maleato. La molaridad del tampón se ajusta para proporcionar una capacidad de tampón apropiada para una actividad de enzima efectiva. La selección de un tampón apropiado para un cromoforo particular está dentro del nivel del experto en la materia.
Más específicamente, el pH inmunohistoquímico del DAB óptimo es mayor de 6,5, pero el DAB es más estable con un pH alrededor de 5. Para obtener este pH se cambia un tampón de citrato-fosfato débil que, cuando se combina con un 0,02% de peróxido de hidrógeno en PBS con un pH de 7,3 y permaneciendo la solución de enjuague (con un pH de 7,6) sobre la lámina, el pH de la mezcla de reacción es mayor de 7.
En contraste, el pH enzimático del AEC óptimo es de 5,3 aproximadamente. Por lo tanto, se usa un tampón ácido más fuerte (por ejemplo, acetato 0,1 M, pH 5,3) en la formulación del cromoforo. Preferiblemente para cromoforos que requieren un bajo pH para una actividad óptima, la solución de peróxido de hidrógeno también se prepara en el tampón ácido. Cuando se combina con la solución de enjuague restante en la lámina, se produce un pH "sobre la lámina" menor de 6, proporcionando un teñido del AEC aceptable.
En resumen, la capacidad del tampón se selecciona basado en el pH óptimo para el cromoforo y el volumen, la capacidad de tampón y el pH del líquido restante sobre las láminas individuales. Se realiza un proceso de selección del tampón similar para otros cromoforos de peroxidasa basados en los requerimientos únicos del cromoforo y las condiciones de teñido de la lámina.
Un tampón preferido para usarse con DAB es un tampón débil, preferiblemente tampón de citrato-fosfato a una concentración de entre 5 y 10 mM aproximadamente, preferiblemente entre 7 y 8 mM aproximadamente, y más preferiblemente de 7,5 mM aproximadamente. El tampón tiene un pH ácido, preferiblemente entre 4,0 y 6,0, más preferiblemente entre 5,0 y 5,5 aproximadamente. Más preferido es el pH 5,3, de manera que cuando la formulación DAB se mezcla con H_{2}O_{2} en la lámina para empezar la reacción de desarrollo del color, el pH de la mezcla es de 6,5 o superior, preferible un pH de 7,0 aproximadamente, para evitar precipitación de DAB perinuclear que puede provocar una mala interpretación de los resultados.
Un tampón preferido para usarse con AEC es un tampón ácido relativamente fuerte, preferiblemente tampón de acetato con una concentración entre 0,5 y 0,01 M aproximadamente, preferiblemente entre 0,25 y 0,05 M aproximadamente, y más preferiblemente de 0,1 M aproximadamente. El tampón tiene un pH ácido, preferiblemente entre 4,0 y 6,0 aproximadamente, más preferiblemente entre 4,5 y 5,5. Más preferiblemente un pH de 5,0.
La formulación del cromoforo también contiene un glicol y un agente reductor en concentraciones efectivas para estabilizar pequeñas moléculas tales como DAB y AEC. Sin embargo, esas concentraciones y la concentración de cromoforo se han de equilibrar para evitar interferencias con la actividad enzimática. En este caso, polietilenglicol (PEG) con una concentración de 1 al 10% aproximadamente, preferiblemente del 5% aproximadamente es un glicol preferido con cualquier cromoforo HRPO.
El agente reductor puede ser los descritos previamente. La concentración varía dependiendo del cromoforo HRPO seleccionado y también varía de lote a lote de un cromoforo dado debido a las diferencias en los contaminantes de cada lote. Por ejemplo, aquellos agentes son efectivos para estabilizar AEC en concentraciones entre 0,0008 y 0,008% aproximadamente (de 40 a 400 \muM aproximadamente). Un procedimiento de volumetría de ejemplo que se puede usar para determinar la concentración adecuada de agente reductor para cualquier cromoforo se describe en detalle en los ejemplos.
Una formulación más preferida para DAB es aproximadamente un 5% de polietilenglicol y aproximadamente un 1mM de metabisulfito de sodio (MBS) (aproximadamente 0,02%). Una combinación más preferida para AEC es aproximadamente un 5% de polietilenglicol y aproximadamente 200 \muM de MBS (aproximadamente 0,2%).
El tampón contiene opcionalmente un preservativo. Los preservativos adecuados no difieren de los descritos previamente. El tampón también incluye opcionalmente el mismo detergente biológico que en el diluyente del anticuerpo para mantener la concentración de detergente en la mezcla de reacción a un nivel constante a lo largo del procedimiento. La formulación de DAB estabilizada se prepara añadiendo el glicol a la solución de tampón (conteniendo el detergente, si está presente). El agente reductor se añade a esa solución, seguido por la adición de DAB. Para el AEC, el agente reductor se añade después de la adición de AEC a la solución de tampón que contiene glicol. La preparación de las soluciones de cromoforo HRPO estabilizadas se describe en detalle en los ejemplos. Después de la preparación, la formulación de cromoforo se guarda en oscuridad a 2 a 8ºC.
El uso de una formulación de cromoforo HRPO estabilizada no difiere del uso de las formulaciones de la técnica anterior excepto que el peróxido de hidrógeno no está presente en la formulación y se añade directamente a la lámina. Sin embargo, la formulación es estable en la concentración de trabajo. Así se ha eliminado la necesidad de preparar una nueva solución de trabajo cada día.
La siguiente tabla muestra una comparación de las propiedades de las formulaciones estabilizadas de DAB y AEC preferidas para usarse en esta invención y de las preparaciones de DAB (Kirkegaard and Perry Laboratories) y AEC (Sigma Chemical Company) disponibles comercialmente.
TABLA 2 Formulaciones de Cromoforo
Factor DAB AEC DAB/AEC
KPL Sigma Estabilizado
pH ácido del tampón de stock Sí N/A^{1} Sí
Indicador stock contiene glicol N/A N/A Sí
Indicador stock contiene antioxidante N/A N/A Sí
Indicador stock requiere Sí Sí No
disolución antes de uso 1:50 1:200
Solución de trabajo estable No N/T^{2} Sí
durante prueba de tensión
^{1} N/A: No disponible por parte del fabricante.
^{2} N/T: No probado.
Solución de Desarrollo del Color de Peróxido de Hidrógeno
En los procedimientos de peroxidasa, el desarrollo del color empieza cuando la solución de cromoforo se mezcla con una solución de peróxido de hidrógeno. La solución de H_{2}O_{2} puede ser convencional. Una solución de H_{2}O_{2} preferida incluye un tampón fisiológico. Tampones fisiológicos adecuados eran tal como se han descrito previamente. El preferido es 0,1 M PBS, pH 7,3. La solución también incluye opcionalmente un detergente y un preservativo, preferiblemente 0,1% Tween 20 y 0,05% timerosal.
La solución de H_{2}O_{2} se mezcla con la solución de cromoforo y se incuba con la sección de tejido durante unos 4 a 5 minutos a unos 40ºC.
Solución de Mejora del Color del DAB
Se usa opcionalmente una solución de mejora del color del DAB antes de cubrir por deslizamiento para hacer el color del DAB más distinto. El tinte del DAB es marrón. Se pueden usar soluciones de iones de metal para oscurecer (cobre) o cambiar el color del tinte a negro (níquel) o azul (cobalto). Se prefiere una solución de sulfato de cobre en tampón de acetato.
Contratinte
Se usa opcionalmente un contratinte antes de cubrir por deslizamiento para hacer el teñido inmunohistoquímico más distinto. Los contratintes difieren en color del primer tinte y tienen afinidad por tejidos, células o partes de células diferentes de las del primer tinte. Son bien conocidos numerosos contratintes. Un contratinte preferido es hematoxilina.
Procedimiento
Un procedimiento inmunoquímico mejorado comprende las siguientes etapas. Por motivos de claridad y no a modo de limitación, el procedimiento se describirá en términos de un proceso inmunohistoquímico como ejemplo mediante un procedimiento de peroxidasa biotina-avidina indirecto usando DAB como cromoforo. Quedará claro para un experto en la materia que se puede usar una etapa mejorada del procedimiento en otros procesos inmunohistoquímicos, así como otros procesos inmunoquímicos tales como inmunoensayos ELISA.
Una lámina que contiene una sección de tejido se lava en una solución de enjuague de la presente invención. La lámina se puede lavar sumergiendo la lámina en un baño de la solución de enjuague, preferiblemente mediante inmersión secuencial en tres baños de la solución. Alternativamente, la solución de enjuague se puede rociar sobre la lámina usando una botella de plástico blando. El exceso de líquido se retira dejando que se caiga de la lámina o secando el borde de la lámina sobre una superficie absorbente.
Para cada uno de los reactivos de teñido, la sección de tejido se cubre con el reactivo durante el periodo de incubación, como es bien conocido. Para los procedimientos en los que las láminas se incuban en una posición vertical en un baño del reactivo, el nivel del baño es suficiente para cubrir toda la sección del tejido. Para láminas que se incuban horizontalmente, de 100 a 150 \mul aproximadamente de reactivo es usualmente suficiente para cubrir el tejido. Es conveniente usar 200 \mul.
Los tiempos de incubación varían y dependen de la temperatura de la incubación. Son bien conocidos periodos de incubación para completar substancialmente la unión del anticuerpo, el desarrollo del color y otras etapas del procedimiento. Muchas de las etapas, por ejemplo del desenmascarado del antígeno, la unión del anticuerpo, y el desarrollo del color, se realizan preferiblemente a temperaturas elevadas de por lo menos unos 35ºC, preferiblemente entre 40 y 45ºC aproximadamente. Sin embargo, con la excepción de las etapas que dependen de la actividad de la enzima (desenmascarado del antígeno y desarrollo del color), la mayoría de etapas se pueden realizar también a temperaturas tan bajas como 4ºC, si el periodo de incubación se aumenta apropiadamente. El periodo de incubación descrito para cada una de las siguientes etapas son a una temperatura de incubación preferida de 40ºC, a menos que se indique lo contrario.
Se aplica un líquido inhibidor de la evaporación a la lámina para cubrir la sección de tejido haciendo caer el líquido sobre la sección de tejido mojada. Se añade una cantidad suficiente de líquido para cubrir la sección de tejido, preferiblemente 500 \mul aproximadamente.
Se añade una solución de peróxido de hidrógeno a las láminas para eliminar la interferencia inducida por la peroxidasa endógena con el teñido. Se añade la solución de H_{2}O_{2} al líquido inhibidor de la evaporación que cubre la sección de tejido y transpira a través del líquido inhibidor de la evaporación a la sección de tejido de abajo. La solución de H2O2 se incuba durante un periodo de tiempo suficiente para eliminar la actividad endógena de la peroxidasa, convenientemente entre 4 y 6 minutos aproximadamente.
Cuando el reactivo de teñido del anticuerpo es específico para un antígeno que requiere el desenmascarado tal como desmina o queratina, la sección del tejido se trata con una solución de enzima proteolítica estabilizada de la presente invención antes de la adición del anticuerpo primario. La solución de enzima proteolítica estabilizada se añade líquido inhibidor de la evaporación que cubre la sección de tejido y transpira a través del líquido inhibidor de la evaporación a la sección de tejido de abajo. Después de un periodo de incubación suficiente para el desenmascarado del antígeno, óptimamente de 4 a 5 minutos aproximadamente, la lámina se lava y se vuelve a aplicar el líquido inhibidor de la evaporación.
Antes de la aplicación del anticuerpo, y preferiblemente justo después del tratamiento con el peróxido, se aplica una cantidad suficiente de la solución de proteasa para cubrir la sección de tejido, convenientemente de unos 200 \mul, al tejido fijado con formalina e incrustado en parafina. En este diluyente, la proteasa deteriora la reticulación de la formalina sin provocar daños a los antígenos del tejido. Los antígenos se exponen así a los reactivos de etiquetado, permitiendo unos resultados más precisos.
El periodo de incubación es suficiente para deteriorar la reticulación, pero no tan largo para que los antígenos se destruyan. El periodo depende de la temperatura, la concentración de enzimas, el espesor del tejido, el tipo de tejido y la cantidad de tiempo en formalina. Un tiempo apropiado se puede determinar fácilmente. Una incubación de 4 a 5 minutos a 40ºC, preferiblemente una incubación de 4 minutos y 30 segundos a 40ºC es efectiva en un procedimiento preferido de la presente invención. Después de la incubación, la solución de proteasa se lava, y se aplica el siguiente reactivo en el proceso de teñido/etiquetado. Cuando no se observan estos rangos, es probable que se produzca la sobre y/o baja digestión del tejido mediante la proteasa, lo que puede provocar antígenos destruidos o antígenos enmascarados, respectivamente. Después de la incubación, la lámina se sumerge.
Después de la incubación, el lavado y la aplicación adicional del líquido inhibidor de la evaporación, se añaden los reactivos de etiquetado a la sección de tejido. Primero, se añade una solución de enzima primaria de la presente invención a la lámina. La solución de anticuerpo se incuba durante un periodo de tiempo suficiente para completar substancialmente la unión del anticuerpo, por lo menos de unos 5 minutos. Después de la incubación, el lavado y la aplicación adicional del líquido inhibidor de la evaporación, se añade una solución de anticuerpo secundaria biotinilada de la presente invención a la lámina y se incuba durante unos 5 minutos. Después de la incubación, el lavado y la aplicación adicional del líquido inhibidor de la evaporación, se incuba la solución de avidina etiquetada con HRPO con la sección de tejido durante un periodo de tiempo suficiente para completar substancialmente la unión biotina-avidina, de 4 a 5 minutos aproximadamente a unos 37 a 40ºC.
Después de la incubación, el lavado y la aplicación adicional del líquido inhibidor de la evaporación, se añaden los reactivos de desarrollo del color a la lámina. Los reactivos de desarrollo del color incluye una solución de DAB estabilizada de la presente invención y una solución de peróxido de hidrógeno. Los reactivos se pueden mezclar y a continuación se añaden a la lámina durante no más de unos 15 minutos antes de usarse. Preferiblemente, la solución de DAB se añade a la lámina, seguida por la adición de la solución de H_{2}O_{2}. Las soluciones se mezclan para empezar la reacción del desarrollo del color. Las soluciones se pueden mezclar sobre la lámina colocando la lámina sobre un agitador. Después de la incubación durante un periodo de tiempo suficiente para el desarrollo del color, de unos 5 minutos aproximadamente, y del lavado, se completa el procedimiento de tenido inmunohistoquímico. La solución de mejora del color de DAB, preferiblemente una solución de sulfato de cobre, y/o un contratinte se añaden opcionalmente antes de la cubierta por deslizamiento.
Las etapas para un procedimiento automatizado no difieren de las de un procedimiento manual. Específicamente, los reactivos, el orden de adición de los reactivos y el tiempo de incubación y la temperatura no varían. La manera en la que los reactivos se aplican y se incuban con la sección de tejido, la manera en la que la sección de tejido se sumerge y la manera en la que se retira la solución de enjuague en exceso dependen del dispositivo. Un procedimiento automatizado preferido se describe en detalle en el Ejemplo 2.
La presente invención también se ilustra mediante los siguientes ejemplos específicos pero no limitativos. Las temperaturas se dan en grados Centígrados y las concentraciones en porcentajes en peso, a menos que se especifique lo contrario. Los procedimientos que están reducidos constructivamente en la práctica se describen en tiempo presente, y los procedimientos que se han realizado en el laboratorio se indican en tiempo pasado.
Ejemplo 1 Preparación de los Nuevos Reactivos de Teñido
Cada uno de los nuevos reactivos de la presente invención se prepararon tal como se describe a continuación.
Solución de Enjuague
Añadir 1,0 ml de Tween 20 (Sigma P-1379) y 500 mg de timerosal en un litro de agua destilada para producir 0,1% de Tween 20 y 0,05% de timerosal.
Formulación Proteasa Estabilizada
Preparar 0,5 M Tris/HCl, pH 7,4, haciendo una Solución A (0,2 M Trizma Base) añadiendo 24,2 g de Trizma base a 1 litro de agua destilada y una solución B (0,2 M HCl). Añadir 50 ml de Solución A, 41,4 ml de Solución B, y 108,6 ml de agua destilada para producir 0,05 M Tris/HCl, pH 7,4.
Para cada 400 ml de formulación de proteasa estabilizada, mezclar lo siguiente:
200 ml Tampón Tris/HCl, pH 7,4
200 ml Propilenglicol*
0,02 g Metabisulfito de Sodio*
0,294 g Cloruro de Calcio*
0,20 g Timerosal*
100 u Proteasa Alcalina Tipo VIII*
*Usado en forma comprada de Sigma Chemical Co.
Diluyente para Reactivos de Anticuerpo Primario y Secundario
El diluyente se preparó preparando un tampón de fosfato 0,1 M (PBS), pH 7,3. Se añadieron los siguientes reactivos de tampón y se mezclaron:
3 mg/ml (0,3%) globulinas de cabra (Sigma Chemical Co., cat. No. G5640)
0,1% Tween 20; y
0,05% timerosal.
Formulación DAB Estabilizada
Para preparar un litro de tampón de citrato-fosfato 7,5 mM, pH 5,3 se disuelven los siguientes reactivos en el siguiente orden en 800 ml de agua destilada:
1. 510,5 mg de ácido cítrico (Sigma C-7129),
2. 1,17 gm de fosfato de potasio (Sigma P-5504),
3. 1 ml de Tween 20 (Sigma P-1379),
4. 0,5 g timerosal
5. Añadir agua destilada a 1 L.
A continuación, preparar polietilenglicol 5% (PEG) (Sigma P-5413) en el tampón de citrato-fosfato disolviendo 5 g de PEG en 80 ml de tampón. A continuación diluir en 100 ml con tampón adicional. Disolver 95,05 mg de metabisulfito de sodio (MBS) (Sigma S-9000) en 5 ml de un tampón de citrato-fosfato que contiene 5% PEG (100 mM MBS) para preparar la Solución A. Diluir 100 \mul de la Solución A en 10 ml de tampón de citrato-fosfato que contiene 5% PEG (1 mM MBS) para preparar la solución B.
Disolver 20 mg de DAB (Sigma D-5637) en 10 ml de Solución B para producir 2 mg DAB/ml de tampón de citrato-fosfato 7,5 Mm, pH 5,3, que contiene metabisulfito de sodio 1,0 mM y 5% polietilenglicol. Después de la preparación, se guarda en la oscuridad a 2-8ºC hasta su uso.
Formulación de AEC estabilizado
Para preparar un litro de 0,1 M de tampón acetato, pH 5,0 disolver los siguientes reactivos en el siguiente orden para 800 ml de agua destilada:
1. 9,58 gm de acetato de sodio trihidrato (Sigma S-8625),
2. 1,70 ml de ácido acético glacial (Sigma A-6283),
3. 1,7 ml de Brij-35 (Sigma 430AG-6),
4. Añadir agua destilada hasta 1 L.
A continuación, preparar 5% polietilenglicol (PEG)(Sigma P-5413) en el tampón acetato disolviendo 5 g de PEG en 80 ml de tampón. Luego diluir hasta 100 ml con tampón adicional. Disolver 100 mg de AEC (Sigma A-5754) en 10 ml dimetilformamida (Baker 9221-01). Añadir 10 ml de AEC disuelto a 90 ml de tampón acetato con PEG. Permitir que la solución repose durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego filtrar la solución a través de un papel de filtro Whatman #1 para producir aproximadamente 1 mg/ml AEC, 0,1 M tampón acetato, pH 5, 0,5% polietilenglicol para preparar solución AEC.
Disolver 40,9 mg de sodio metabisulfito (MBS)(Sigma S-9000) en 10 ml de tampón acetato que contiene 5% PEG (21,5 mM MBS). Tritiar la solución de MBS en la solución de AEC hasta que el MBS inhibe la reacción de AEC aproximadamente 0,2 unidades de absorbancia. La concentración final de MBS varía desde aproximadamente 100 a 200 \muM, dependiendo de la pureza del lote de AEC. A continuación de la preparación, almacenar en oscuridad a 2-8ºC hasta su utilización. La tritiación se realizó como se describe a continuación.
El carbazol amino-etil cromóforo (AEC) está disponible en un producto aproximadamente 90% puro en SIGMA Chemical Company. El cromóforo no es puro y la precipitación del cromóforo se produce durante el procedimiento de solubilización descrito en el Ejemplo 1 cuando el AEC (disuelto en dimetilformamida) se añade al acetato de sodio tampón 0,1 M. Por lo tanto, la concentración final de AEC anterior a la adición de MBS no se conoce. Por lo tanto, la cantidad de MBS utilizada debe determinarse experimentalmente mediante tritiación para cada tanda de AEC líquido producido.
Una reacción enzimática del AEC se realiza en presencia de varias concentraciones de MBS para determinar la concentración de MBS que inhibe la reacción de AEC en aproximadamente 0,2 unidades de absorbancia. Esto usualmente es en el rango de 100 a 200 \muM MBS (concentración final). Los reactivos se describen a continua-
ción:
a. 483,4 \mul de AEC fresco (preparado como se describe en el Ejemplo 1, antes de la adición de MBS);
b. 8,4 \mul de 0,3 mg Avidin-D peroxidasa de rábano/ml 0,1 M tampón acetato de sodio, pH 5,0 que contiene 5% de polietilenglicol y 0,05% detergente Brij 35.
c. 8,4 \mul de 180 mM peróxido de hidrógeno en 0,1 M acetato de sodio tampón, pH 5 conteniendo 5% de polietilenglicol; y
d. 5,0 \mul de diferentes concentraciones de MBS en 0,2 M acetato de sodio tampón, pH 5,0 que contiene 5% de polietilenglicol y detergente Brij 35.
La tritiación se realizó como sigue. La mezcla de reacción se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación de la incubación, se añadieron 100 \mul de mezcla de reacción AEC a 900 \mul de agua desionizada (dilución 1:10). La absorbancia del AEC diluido se escanea desde 800 a 400 nm con un espectrofotómetro UV-VIS. El instrumento se ensaya en blanco con una dilución 1:10 de 0,1 M tampón acetato de sodio, pH 5,0 que contiene 5% de polietilenglicol con agua desionizada.
Se grafican las diferentes curvas de absorbancia, y se determina el pico de absorbancia a 480 nm para cada concentración de MBS. A partir de estos datos, se selecciona la concentración final apropiada de MBS y se añade suficiente MBS de la solución estándar 21,5 mM al volumen de la solución AEC. La solución final de AEC que contiene MBS se ensaya entonces y se compara con la solución AEC sin MBS para verificar que la curva de absorbancia para la solución que contiene MBS es aproximadamente 0,2 unidades de absorbancia inferior que la curva para la formulación no estabilizada. El reactivo completado se almacena refrigerado en la oscuridad hasta su uso.
Ejemplo 2 Procedimiento manual, indirecto de teñido biotina-avidina para detectar desmina
Una sección de tejido desparafinado se lavó utilizando la solución de enjuague mediante el rociado de aproximadamente 10 ml desde una botella de plástico blando sobre el portaobjetos sobre la sección de tejido. La sección de tejido se cubrió entonces con un líquido inhibidor de la evaporación mediante la adición de 500 \mul de dodecano. El procedimiento de lavado y la adición del líquido inhibidor de la evaporación se realizó de la misma forma hasta completar la parte restante del procedimiento a continuación del final de cada período de incubación.
Una solución de 3% H_{2}O_{2} en 0,1 M suero fisiológico tamponado con fosfato (0,1 M fosfato, 0,055 M NaCl), pH 7,3, 0,1% Tween 20 (200 \mul) se añadió al portaobjetos mediante el vertido de la solución sobre el líquido inhibidor de la evaporación. La solución de H_{2}O_{2} se incubó durante 5 min a 40ºC.
La solución de proteasa (200 \mul) se aplicó al portaobjetos y se incubó durante 5 min a 40ºC.
Para desmina, la solución primaria de anticuerpos (200 \mul) era ratón monoclonal anti-desmina (clon DE-R-11; Dako, Carpenteria, CA) diluido 1:7 dentro del diluyente descrito en el Ejemplo 1. Después de 5 min de incubación a 40ºC, el portaobjetos se lavó y se aplicó el líquido inhibidor de la evaporación.
La segunda solución de anticuerpos (200 \mul), preferentemente de cabra biotinilada con anticuerpos de anti-ratón, fracción Fab'2 (Jackson Inmuno Research) diluido 1:50 en diluyente, se incubó durante 5 min a 40ºC. Después de 5 min de incubación a 40ºC, el portaobjetos se lavó y se aplicó el líquido inhibidor de la evaporación.
Strepavidin marcado con peroxidasa (200 \mul)(Jackson Inmuno Research) diluido 1:100 en el diluyente de anticuerpo (con globulinas bovinas sustituidas por globulinas de cabra) preparado como se describe en el Ejemplo 1 se añadió al portaobjetos y se incubó durante 5 min a 40ºC. El portaobjetos se lavó y se aplicó el líquido inhibidor de la evaporación.
La solución DAB estabilizada (200 \mul) se añadió al portaobjetos. Una solución de 0,02% H_{2}O_{2} en 0,1 M PBS, pH 7,3, 0,1% Tween 20 se añadió y se mezcló con la solución DAB para iniciar la reacción. La mezcla se incubó a 40ºC durante 5 min.
El portaobjetos se lavó. Se aplicó el líquido inhibidor de la evaporación, y luego se mejoró el color de DAB con solución de sulfato de cobre (0,5% CuSO_{4} en 0,1 M tampón acetato, pH 5,0, 0,1% Tween 20) mediante la incubación de la solución durante 5 min a 40ºC. A continuación de la mejora de DAB, se lavó el portaobjetos, se contratiñó con hematoxilina, se deshidrató (usando alcohol/xileno) y se colocó un cubreobjetos.
Ejemplo 3 Procedimiento automatizado, indirecto de teñido biotina-avidina para detectar desmina
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 2 usando un aparato de teñido automatizado más preferido. El aparato se describe en detalle en una solicitud de propiedad común, publicada al mismo tiempo Nº Serie 07/488.601, presentada en Marzo, 2, 1990, titulada APARATO AUTOMATIZADO DE REACCION BIOLOGICA de Coperland
et al.
Se lavó una sección de tejido desparafinado, se colocó en el instrumento y se cubrió con el líquido inhibidor de la evaporación. El portaobjetos se extrajo después del enjuague a continuación de la mejora del DAB y el resto del procedimiento se realizó manualmente. Cada una de las etapas automatizadas se realizó a través del instrumento como se describe en el Ejemplo 2 con la excepción de que el período de incubación fue de 4 min 20 seg.
El procedimiento se repitió utilizando un período de incubación de 4 min 37 seg.
Ejemplo 4 Procedimiento automatizado, indirecto de teñido de biotina-avidina para detectar desmina
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 3 con las siguientes excepciones. La solución AEC, preparada como se describe en el Ejemplo 1, se usó en lugar de la solución DAB estabilizada, y el tampón en la solución de peróxido de hidrógeno fue acetato de sodio 0,1 M. A continuación del desarrollo del color, el portaobjetos se lavó, contra tiñó con hemotoxilina y se colocó un cubreobjetos con un medio de montaje acuoso.
Ejemplo 5 Estudio de actividad enzimática en la formulación de proteasa estabilizada
Dos muestras de formulación de proteasa estabilizada preferida para emplear en esta invención se prepararon como se describe en el ejemplo 1 con la excepción de que una muestra de la formulación omitió el timerosal. Cada solución se dividió en tres alícuotas y se colocó en viales. Los viales se colocaron en atmósferas a 2-8ºC, temperatura ambiente (RT, aproximadamente 23ºC), y 45ºC inmediatamente después se determinó la actividad enzimática de cada tanda (actividad inicial en el Día 0) usando un análisis de ensayo caseína. La actividad de cada vial a cada temperatura se midió entonces periódicamente el porcentaje de actividad enzimática inicial usando el mismo ensayo de caseína. El ensayo se realizó por triplicado y se tomó el valor promedio. Se realizaron gráficos usando el valor de 5,0 unidades de caseína de actividad (el promedio de actividad inicial) como 100%. Los resultados se ilustran en la Tabla 2 a continuación. Los valores de la actividad enzimática para la formulación sin timerosal se determinaron a las 11 semanas y con timerosal a las 10 semanas.
TABLA 2 Porcentaje de actividad enzimática inicial
2-8ºC RT 45ºC
Sin timerosal 100 100 25
Con timerosal 92 100 42
Como se muestra en la tabla, la formulación de proteasa estabilizada retuvo más de 90% de la actividad enzimática inicial de 2 a 8ºC y a temperatura ambiente durante 10 semanas.
También se proporciona un procedimiento para evitar la evaporación de reactivos aplicados a una región de ensayo de un portaobjetos que comprende cubrir dicha región de ensayo con un líquido inhibidor de la evaporación. El líquido inhibidor de la evaporación puede consistir esencialmente en un aceite de la familia de los alcanos de cadena media. El alcano puede tener de 10 a 16 carbonos. El líquido inhibidor de la evaporación puede consistir esencialmente de pentadecano.
También se proporciona un procedimiento de ensayo mejorado donde un reactivo o muestra de ensayo se une a una región de ensayo de un portaobjetos, comprendiendo la mejora cubrir dicha región de ensayo con un líquido inhibidor de la evaporación que consiste esencialmente en un aceite de cadena media de la familia de los alcanos. El procedimiento puede ser un procedimiento de teñido inmunohistoquímico. El procedimiento puede ser un procedimiento de hibridización in situ.
También se proporciona un procedimiento inmunohistoquímico que comprende, en el siguiente orden:
a. enjuagar una sección de tejido con una solución de enjuague acuosa que consiste esencialmente de una solución acuosa substancialmente libre de sales y una cantidad suficiente de un detergente biológico no iónico para reducir la tensión superficial para proporcionar el revestimiento uniforme de la solución;
b. aplicar una cantidad suficiente de un líquido inhibidor de la evaporación para cubrir dicha sección de tejido;
c. combinar un anticuerpo primario en un diluyente que consiste esencialmente en un tampón fisiológico y la fracción de globulina de suero no inmune de la misma especie como un segundo anticuerpo en una concentración de proteína suficiente para inhibir el enlace de anticuerpos no específicos con dicha sección de tejido durante un tiempo suficiente para completar substancialmente los enlaces de anticuerpos;
d. enjuagar dicho tejido con solución de enjuague que consiste esencialmente en solución acuosa substancialmente libre de sales y una cantidad suficiente de detergente biológico no iónico para reducir la tensión superficial para proporcionar un revestimiento uniforme de la solución;
e. aplicar suficiente cantidad de un líquido inhibidor de la evaporación para cubrir dicha sección de tejido;
f. combinar un segundo anticuerpo marcado en un diluyente que consiste esencialmente en un tampón fisiológico y la fracción de globulina de suero no inmune de la misma especie como dicho segundo anticuerpo en una concentración de proteína suficiente para inhibir enlaces de anticuerpos no específicos con dicha sección de tejido para completar substancialmente el enlace de anticuerpos;
g. enjuagar dicha sección de tejido con una solución de enjuague que consiste esencialmente en solución acuosa substancialmente libre de sales y una cantidad suficiente de detergente biológico no iónico para reducir la tensión superficial para proporcionar un revestimiento uniforme de la solución;
h. aplicar una cantidad suficiente de líquido inhibidor de la evaporación para cubrir dicha sección de tejido;
i. combinar reactivos de desarrollo del color con dicha sección de tejido durante un tiempo suficiente para el desarrollo del color; y
j. enjuagar dicha sección de tejido con una solución de enjuague que consiste esencialmente en solución acuosa substancialmente libre de sales y una cantidad suficiente de detergente biológico no iónico para reducir la tensión superficial para proporcionar un revestimiento uniforme de la solución.
En el procedimiento anterior que comprende las etapas (a) a (j) el marcador puede ser un marcador de peroxidasa y el procedimiento puede comprender adicionalmente, a continuación de la etapa (b) y antes de la (c):
i. combinar una solución de peróxido de hidrógeno con dicha sección de tejido durante un tiempo suficiente para substancialmente eliminar la actividad de la peroxidasa endógena;
ii. enjuagar dicha sección de tejido con una solución de enjuague que consiste esencialmente en una solución acuosa substancialmente libre de sal y una cantidad suficiente de detergente biológico no iónico para reducir la tensión superficial para proporcionar un laminado uniforme de la solución; y
iii. aplicar una cantidad suficiente de un líquido inhibidor de la evaporación para cubrir dicha sección de tejido.
Un procedimiento anterior puede comprender además después de la etapa (d) y antes de la etapa (e):
i. cubrir dicha sección de tejido con una solución de enzima proteolítica que comprende entre el 40 y el 60% de un glicol, un tampón fisiológico, una cantidad efectiva de un agente reductor, una fuente de iones de calcio en una concentración suficiente para mejorar la estabilidad de la enzima, una cantidad efectiva de dicha enzima, y opcionalmente, una cantidad efectiva de un preservativo durante un periodo de tiempo suficiente para desenmascarar los antígenos del tejido; y
ii. aplicar una cantidad suficiente de un líquido inhibidor de la evaporación para cubrir dicha sección de tejido.
El segundo anticuerpo etiquetado puede ser un anticuerpo biotinilado y el procedimiento puede comprender además, después de la etapa (h) y antes de la etapa (i):
i. combinar avidina etiquetada con peroxidasa en un diluyente adecuado con dicha sección de tejido durante un periodo de tiempo suficiente para completar substancialmente dicha unión biotina-avidina.
ii. enjuagar dicha sección de tejido con una solución de enjuague que consiste esencialmente en una solución acuosa substancialmente libre de sal y una cantidad suficiente de un detergente biológico no iónico para reducir la tensión superficial para proporcionar un laminado uniforme de la solución; y
iii. aplicar una cantidad suficiente de un líquido inhibidor de la evaporación para cubrir dicha sección de tejido.
Los reactivos de desarrollo del color de la etapa (i) pueden comprender una solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada que consiste esencialmente en:
(a) un cromoforo de peroxidasa con una concentración en el rango de trabajo de la enzima;
(b) un tampón ácido capaz de mantener un pH menor de 6,0;
(c) una cantidad efectiva de un agente reductor; y
(d) entre un 1 y un 10% de un glicol.

Claims (23)

1. Solución de enzima proteolítica estabilizada, que comprende:
a. del 40 al 60% de un glicol;
b. un tampón fisiológico;
c. una cantidad efectiva de un agente reductor;
d. una fuente de iones de calcio en una concentración suficiente para mejorar la estabilidad de la enzima;
e. una cantidad efectiva de dicha enzima.
2. Solución de enzima proteolítica estabilizada según la reivindicación 1, que también comprende una cantidad efectiva de un preservativo.
3. Solución de enzima proteolítica estabilizada según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que dicha enzima es una proteasa alcalina de tipo VIII.
4. Solución de enzima proteolítica estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho tampón es un tampón Tris con un pH de entre 7,0 y 7,5.
5. Solución de enzima proteolítica estabilizada según la reivindicación 4, en la que dicho tampón es 0,01 a 0,1 M Tris/HCl, pH 7,4.
6. Solución de enzima proteolítica estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho agente reductor se selecciona entre el grupo que consiste en ditiotreitol, ácido ascórbico y metabisulfito de sodio.
7. Solución de enzima proteolítica estabilizada según la reivindicación 6, en la que dicho agente reductor es un metabisulfito de sodio con una concentración entre 0,0005 y 0,05%.
8. Solución de enzima proteolítica estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho glicol es propilenglicol.
9. Solución de enzima proteolítica estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha fuente de iones de calcio es cloruro de calcio con una concentración entre 1 y 10 mM.
10. Solución de enzima proteolítica estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en la que dicho preservativo es timerosal con una concentración entre 0,001% y 0,1%.
11. Procedimiento de teñido inmunohistoquímico mejorado para una sección de tejido en el que los antígenos están desenmascarados, comprendiendo la mejora cubrir dicha sección de tejido con una solución de enzima proteolítica estabilizada que comprende un tampón fisiológico, entre un 40 y un 60% de glicol, una cantidad efectiva de un agente reductor, una fuente de iones de calcio en una concentración suficiente para mejorar la estabilidad de la enzima, y una cantidad efectiva de dicha enzima durante un periodo de tiempo suficiente para desenmascarar dichos antígenos.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la solución de enzima proteolítica estabilizada también comprende una cantidad efectiva de un preservativo.
13. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada que consiste esencialmente en:
a. un cromoforo de peroxidasa con una concentración en el rango de trabajo de la enzima;
b. un tampón ácido capaz de mantener un pH menor de 6,0;
c. una cantidad efectiva de un agente reductor; y
d. entre un 1 y un 10% de un glicol.
14. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada según la reivindicación 13, en la que dicho cromoforo de peroxidasa es tetradrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) y dicho tampón ácido es un tampón de citrato-fosfato con una concentración entre 5 y 10 mM.
15. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada según la reivindicación 13, en la que dicho cromoforo de peroxidasa es 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y dicho tampón ácido es un tampón de acetato con una concentración entre 0,01 y 0,5 M.
16. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que dicho agente reductor se selecciona entre el grupo que consiste en ditiotreitol, ácido ascórbico y metabisulfito de sodio.
17. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada según la reivindicación 16, en la que dicho agente reductor es metabisulfito de sodio.
18. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en la que dicho glicol es polietilenglicol.
19. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada según la reivindicación 18, en la que el polietilenglicol está presente en una concentración de entre el 1 y el 10%.
20. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, que comprende además un detergente en una cantidad suficiente para reducir la tensión superficial para proporcionar un laminado uniforme de la solución.
21. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada de tetradrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) según la reivindicación 13, que comprende:
a. 2 mM de tetradrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB);
b. entre 5 y 10 mM de tampón de citrato-fosfato, pH 5,0 a 5,5;
c. 0,0005 al 0,05% de metabisulfito de sodio;
d. entre el 1 y el 10% de polietilenglicol; y
e. opcionalmente, entre el 0,01 y el 5% (v/v) de detergente no iónico seleccionado entre un polioxietilenosorbitano y un éter de polioxietileno.
22. Solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) según la reivindicación 13, que comprende:
a. 1 mg/ml de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC);
b. entre 0,01 y 0,5 M de tampón de acetato, pH 4,5 a 5,5;
c. entre 0,0008 al 0,08% de metabisulfito de sodio;
d. entre el 1 y el 10% de polietilenglicol; y
e. opcionalmente, entre el 0,01 y el 5% (v/v) de detergente no iónico seleccionado entre un polioxietilenosorbitano y un éter de polioxietileno.
23. Procedimiento inmunoquímico basado en peroxidasa mejorado, comprendiendo la mejora combinar una solución de cromoforo de peroxidasa acuosa estabilizada que consiste esencialmente en un cromoforo de peroxidasa en una concentración en el rango de trabajo de dicho cromoforo de peroxidasa; un tampón ácido capaz de mantener un pH menor de 6,0; una cantidad efectiva de agente reductor; y un glicol en una concentración efectiva para estabilizar dicho cromoforo de peroxidasa con dicha peroxidasa.
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Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5420105A (en) * 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US6472217B1 (en) * 1990-03-02 2002-10-29 Ventana Medical Systems, Inc. Slide aqueous volume controlling apparatus
US5595707A (en) 1990-03-02 1997-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Automated biological reaction apparatus
US5696887A (en) * 1991-08-05 1997-12-09 Biotek Solutions, Incorporated Automated tissue assay using standardized chemicals and packages
US6225115B1 (en) 1992-03-04 2001-05-01 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding taurine and GABA transporters and uses thereof
US5656504A (en) * 1992-10-26 1997-08-12 Pharmacia Biosensor Ab Method of preventing undesired binding in solid phase assays
US5807999A (en) * 1993-02-01 1998-09-15 Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Monoclonal antibody that distinguishes between phosphorylated and nonphosphorylated histone H1 and uses therefor
US5439649A (en) * 1993-09-29 1995-08-08 Biogenex Laboratories Automated staining apparatus
US5487975A (en) * 1993-11-15 1996-01-30 Ventana Medical Systems, Inc. Biotin/avidin formulation
US5432056A (en) * 1993-11-15 1995-07-11 Ventana Medical Systems, Inc. Bisulfite-based tissue fixative
US5552087A (en) * 1993-11-15 1996-09-03 Ventana Medical Systems, Inc. High temperature evaporation inhibitor liquid
JP2717940B2 (ja) * 1994-11-04 1998-02-25 三洋化成工業株式会社 改良された免疫分析用洗浄液
US5874315A (en) * 1996-03-05 1999-02-23 Meridian Diagnostics, Inc. Method for staining stool parasites
JP3623303B2 (ja) * 1996-03-21 2005-02-23 株式会社三菱化学ヤトロン スライドプレート洗浄液及びそれを含むキット
US5804141A (en) * 1996-10-15 1998-09-08 Chianese; David Reagent strip slide treating apparatus
SE9700207D0 (sv) * 1997-01-24 1997-01-24 Erik Litborn A method of preventing evaporation from liquid samples in small volumes
US6489171B1 (en) 1997-04-18 2002-12-03 Cell Marque Corporation Chemical dispensing system and method
US5935276A (en) * 1997-07-29 1999-08-10 Texaco Inc Method of impeding the evaporation of a solvent and compositions useful therein
EP1082611A4 (en) * 1998-06-02 2003-01-15 Ventana Med Syst Inc METHODS OF COLORING BIOLOGICAL SAMPLES BY COMBINING REAGENTS INSTABLE ON THE OBJECT BLADE
US6855552B2 (en) * 1998-09-03 2005-02-15 Ventana Medical Systems Automated immunohistochemical and in situ hybridization assay formulations
US7550298B2 (en) * 1998-09-03 2009-06-23 Ventana Medical Systems, Inc. Automated immunohistochemical and in situ hybridization assay formulations
EP1004870A1 (en) * 1998-11-09 2000-05-31 Aurora Biosciences Corporation Liquid barriers for assays
US7897106B2 (en) * 1999-07-08 2011-03-01 Lee Angros Situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method
US8298485B2 (en) * 1999-07-08 2012-10-30 Lee H. Angros In situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method
US7951612B2 (en) * 1999-07-08 2011-05-31 Lee H. Angros In situ heat induced antigen recovery and staining apparatus and method
AU6079500A (en) 1999-07-08 2001-01-30 Lee Angros Antigen recovery and/or staining apparatus and method
CA2414198A1 (en) 2000-07-06 2002-01-17 Neurogen Corporation Melanin concentrating hormone receptor ligands
US6828154B1 (en) 2000-11-03 2004-12-07 Cytologix Corporation Staining method with chromic acid precursors
CA2492064C (en) * 2002-06-20 2016-03-15 Vision Biosystems Limited Biological reaction apparatus with draining mechanism
AU2003901871A0 (en) * 2003-03-31 2003-05-08 Vision Biosystems Limited A method and apparatus for fluid dispensation, preparation and dilation
US7648678B2 (en) 2002-12-20 2010-01-19 Dako Denmark A/S Method and system for pretreatment of tissue slides
CA2518569C (en) * 2003-03-10 2011-11-15 Expression Pathology, Inc. Liquid tissue preparation from histopathologically processed biological samples, tissues and cells
US9518899B2 (en) 2003-08-11 2016-12-13 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Automated reagent dispensing system and method of operation
US7744817B2 (en) * 2003-08-11 2010-06-29 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Manifold assembly
US7767152B2 (en) 2003-08-11 2010-08-03 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Reagent container and slide reaction retaining tray, and method of operation
US7501283B2 (en) * 2003-08-11 2009-03-10 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Fluid dispensing apparatus
US20050176026A1 (en) * 2003-09-05 2005-08-11 Franck Carl P. Liquid mixing reactor for biochemical assays
EP1697719B1 (en) * 2003-12-23 2018-09-19 Ventana Medical Systems, Inc. Method and apparatus for efficient thin film fluid processing of flat surfaces
GB0501590D0 (en) * 2005-01-25 2005-03-02 Ceres Power Ltd Processing of enhanced performance LSCF fuel cell cathode microstructure and a fuel cell cathode
JP5335420B2 (ja) 2005-05-24 2013-11-06 リー エイチ． アングロス， ｉｎｓｉｔｕ熱誘導抗原回復・着色装置および方法
JP5443756B2 (ja) * 2005-06-28 2014-03-19 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ オクラホマ カーボンナノチューブを成長および収集するための方法
EP1977214A2 (en) * 2006-01-13 2008-10-08 Ventana Medical Systems, Inc. Biological sample processing composition and method
US8459509B2 (en) 2006-05-25 2013-06-11 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Fluid dispensing apparatus
CA2858359C (en) 2006-11-01 2018-04-03 Ventana Medical Systems, Inc. Haptens, hapten conjugates, compositions thereof and method for their preparation and use
CA2687178C (en) 2007-05-23 2014-02-04 Ventana Medical Systems, Inc. Polymeric carriers for immunohistochemistry and in situ hybridization
JP2009121906A (ja) * 2007-11-14 2009-06-04 Japan Health Science Foundation 抗原賦活化方法
US8663929B2 (en) 2008-03-17 2014-03-04 University Of Miyazaki Method for detection of liver cancer cell using anti-glypican-3 antibody
CA2720728C (en) 2008-06-05 2018-04-03 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions comprising nanomaterials and method for using such compositions for histochemical processes
WO2010025425A1 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Angros Lee H Multiplexed microscope slide staining apparatus
JP4638555B1 (ja) * 2010-09-08 2011-02-23 田中貴金属工業株式会社 核酸又は免疫クロマトグラフィー用試薬組成物、核酸又は免疫クロマトグラフィー測定方法及び核酸又は免疫クロマトグラフィー測定用キット
EP2659000B1 (en) 2010-12-30 2016-08-10 Ventana Medical Systems, Inc. Enhanced deposition of chromogens utilizing pyrimidine analogs
US8752732B2 (en) 2011-02-01 2014-06-17 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Fluid dispensing system
EP2715370B1 (en) 2011-06-01 2018-02-28 Ventana Medical Systems, Inc. Dispenser with filter device
US8580568B2 (en) 2011-09-21 2013-11-12 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Traceability for automated staining system
US8932543B2 (en) 2011-09-21 2015-01-13 Sakura Finetek U.S.A., Inc. Automated staining system and reaction chamber
WO2013110549A1 (en) * 2012-01-23 2013-08-01 Ventana Medical Systems, Inc. Polymer stabilization of chromogen solutions
RU2662681C2 (ru) 2013-02-28 2018-07-26 Нитирей Байосайенсиз Инк. Набор даб-содержащего субстрата для окрашивания, производимого ферментом для мечения
HU230739B1 (hu) 2013-02-28 2018-01-29 3Dhistech Kft. Berendezés és eljárás tárgylemezek automatikus festésére, fedésére, digitalizálására integrált tárgylemez festő-fedő-digitalizáló automata berendezés segítségével
CN106030309B (zh) * 2013-12-12 2019-11-26 休斯敦大学系统 通用抗原修复化合物及其使用方法
ES2918325T3 (es) 2014-04-30 2022-07-15 Ventana Med Syst Inc Procedimiento de limpieza para precipitados de hemateína en aparatos de tinción automatizados
EP2985603A1 (en) * 2014-08-13 2016-02-17 Yantai AusBio Laboratories Co., Ltd. Method for carrying out a ligand binding assay and device for carrying out such a method
AU2016261279B2 (en) * 2015-05-10 2020-12-10 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions and methods for simultaneous inactivation of alkaline phosphatase and peroxidase enzymes during automated multiplex tissue staining assays
CN106018781B (zh) * 2016-05-19 2018-11-13 四川金域医学检验中心有限公司 一种组织切片的免疫组化操作方法
WO2018187697A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Emmert Buck Michael R High precision micropurification system and methods of use
TWI662961B (zh) * 2018-03-16 2019-06-21 共生地球生物科技有限公司 多重ｐＨ緩衝配方與胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑之緩衝組合物及其用途
US11237170B2 (en) 2018-12-04 2022-02-01 Aat Bioquest, Inc. Styryl phenols, derivatives and their use in methods of analyte detection
CN109781983A (zh) * 2019-03-14 2019-05-21 武汉原谷生物科技有限责任公司 一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法
CN110907255A (zh) * 2019-12-10 2020-03-24 武汉赛维尔生物科技有限公司 一种即用型免疫组化染色液及其制备方法和应用
CN112816685A (zh) * 2020-12-30 2021-05-18 苏州堪赛尔医学检验有限公司 免疫组化的免疫酶标方法以及用于免疫酶标方法的试剂盒
CN113484313B (zh) * 2021-07-23 2022-06-24 图凌(杭州)生物医药有限公司 用于免疫组化检测的dab显色试剂盒及其应用
CN114594245A (zh) * 2022-01-26 2022-06-07 浙江莱阅病理诊断科技有限公司 一种全自动免疫组化染色机适配的清洗缓冲液及其制备方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3050445A (en) * 1958-08-13 1962-08-21 Armour Pharma Stabilized trypsin solution
DK132327A (es) * 1968-07-16
GB2070767B (en) * 1980-03-03 1983-07-27 Abbott Lab Stabilizing the reaction product formed in enzyme immunoassays
JPS57203017A (en) * 1981-06-09 1982-12-13 Fujirebio Inc Purifying method of immunoglobulin
US4503143A (en) * 1982-08-20 1985-03-05 Btc Diagnostics Limited Partnership Enzyme immunoassay with two-part solution of tetramethylbenzidine as chromogen
US4971783A (en) * 1982-11-22 1990-11-20 The University Of Va Alumni Patents Foundation Tissue processing for immunofluorescence microscopy
US4615972A (en) * 1983-11-04 1986-10-07 Immuno Concepts, Inc. Stabilization of indicators for detecting enzyme activity
US4543333A (en) * 1984-06-05 1985-09-24 Novo Industri A/S Liquid proteinase concentrate and method for preparation
JPS61108387A (ja) * 1984-10-30 1986-05-27 Showa Denko Kk 酵素の安定化法及び安定化組成物
IL74205A (en) * 1985-01-31 1990-01-18 Savyon Diagnostics Ltd Method for carrying out enzyme assays utilizing stable chemical compositions containing hydrogen peroxide and a chromogen
US4824784A (en) * 1985-04-08 1989-04-25 Hygeia Sciences, Incorporated Chromogenic solution for immunoassay
US4731335A (en) * 1985-09-13 1988-03-15 Fisher Scientific Company Method for treating thin samples on a surface employing capillary flow
DE3541979A1 (de) * 1985-11-28 1987-06-04 Behringwerke Ag Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet mit stabilisator, verfahren zur herstellung und seine verwendung
US4965203A (en) * 1987-01-28 1990-10-23 Warner-Lambert Company Purified thrombin preparations
US4847208A (en) * 1987-07-29 1989-07-11 Bogen Steven A Apparatus for immunohistochemical staining and method of rinsing a plurality of slides
US5017471A (en) * 1988-08-26 1991-05-21 Epitope, Inc. Reagent for peroxidase detection
US5215885A (en) * 1990-10-23 1993-06-01 Beckman Instruments, Inc. Stable two-part chromogen substrate
US5206150A (en) * 1990-10-26 1993-04-27 University Of Kentucky Research Foundation Composition of, method of producing and method of using a stabilized formulation for assaying peroxidase activity
US5192657A (en) * 1990-12-18 1993-03-09 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Stabilized proteolytic solution and reagent kit

Also Published As

Publication number Publication date
US5418138A (en) 1995-05-23
US5225325A (en) 1993-07-06
JP2000046827A (ja) 2000-02-18
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ATE317978T1 (de) 2006-03-15
EP1030178A1 (en) 2000-08-23
EP0517818B9 (en) 2003-01-08
ATE217418T1 (de) 2002-05-15
EP0517818B1 (en) 2002-05-08
JP2966522B2 (ja) 1999-10-25
US5322771A (en) 1994-06-21
EP0517818A1 (en) 1992-12-16
EP0517818A4 (en) 1995-03-22

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