CN106030309B - 通用抗原修复化合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
用于含醛交联剂固定的组织中抗原修复和氨基酸、肽和蛋白质或其上表位检测改善的抗原修复剂化合物、混合物和制剂以及方法。固定组织与除醛剂溶液接触引起与醛的反应活性,由此修复抗原并改善对氨基酸、肽和蛋白质或表位的检测。还提供试剂盒,其中包含抗原修复剂,可选的用于染色或检测所述蛋白质或抗原或表位的组分,以及试剂盒使用说明。还提供鉴定抗原修复剂的方法。将固定蛋白质与待测试剂接触并一同在溶液中加热。质谱法检得蛋白质峰表示待测试剂是抗原修复剂。
Description
相关申请交叉引用
本申请根据35U.S.C§119(e)要求美国临时申请62/037,905(申请日: 2014年8月15日,已放弃)和美国临时申请61/915,271(申请日:2013年12月12 日,已放弃)的优先权,本申请通过援引吸纳上述两临时申请的全部内容。
联邦资助说明
本发明得到国立卫生研究院(National Institutes of Health)给予的第1R15AG039008-01号政府资助。政府对本发明拥有一定的权利。
发明背景
发明领域
本发明主要涉及组织学,涉及经含醛交联剂(即基于醛的交联剂)保存的组 合物或组织中蛋白质的检测。具体地说,本发明提供一种抗原修复的方法,其 中用除醛剂来修复组合物或组织中因醛类固定剂而化学改性的蛋白质。
相关技术说明
临床病理实验室用于保存生物材料的常用固定剂有多种,例如戊二醛、 甲醛和丙酮及其他有机溶剂。然而,大多数固定过程用到含醛交联剂,如甲醛 和戊二醛。固定剂溶液一般为含水甲醛溶液,其中含有钠的磷酸盐,配制成 具有缓冲能力且大致等渗的溶液,所述缓冲能力在加入少量强酸或强碱后以尽 可能小的波动将pH稳定在pH7.2-7.6。固定溶液将甲醛或戊二醛加到蛋白质的多 种基团上,例如胺族基团、酚类基团、硫醇类基团和羟基类基团,由此先形成一 系列可逆修饰,包括亚胺、烯胺、羟基亚甲基和两个胺族基团之间的亚甲基交联 。随着甲醛固定的继续,会形成蛋白质分子之间或之内可逆的分子间和分子内交联,由此形成致密的网络,这会妨碍石蜡渗透或/和与抗体分子的接 触。结果,目标抗原可能被可逆甚至非可逆的掩蔽,或者表位因与含醛固定剂 反应而化学改性或破坏。
尽管已有多种免疫组化蛋白质法和分析蛋白质法被广泛并高实用性地用 于纯化蛋白、蛋白质提取物、细胞或组织样本,仍迫切需要进一步的改进。所述 改进可以是关于例如更温和的细胞或组织固定、抗原修复或/和结果再现性的 改进、以及标准程序(例如甲醛固定)中受损的相应抗原或表位上抗体应 用的改进。
因此,本领域公认需要更好方法来消除蛋白质掩蔽和修复抗原。尤 其,现有技术缺乏这样的方法和化合物:它们易于经设置或配制用来逆转固定 组织中与蛋白质发生的醛反应,具体通过逆转蛋白质中胺族基团(amine groups) 上亚胺、烯胺、亚甲基羟基的形成、逆转氨基之间亚甲基交联的形成、以及蛋 白质上其他可逆醛改性。本发明实现了本领域长期以来的上述需求。
发明概述
本发明是关于一种针对用含醛交联剂固定的组织修复抗原并改善氨基 酸、肽和蛋白质检测的方法。本发明方法包括:第一步,制备除醛剂溶液。然 后,使得用含醛交联剂固定的组织与该溶液接触;其中,除醛剂与含醛交联剂 的醛类之间反应从而修复固定组织中的抗原并改善固定组织中氨基酸、肽和蛋 白质的检测。由于醛和醛加合物以可逆平衡的状态存在于固定组合物或组织, 加热和最佳pH条件下,除醛剂能使平衡向释放醛的方向移动,由此去除可逆醛 加合物,于是消除蛋白质掩蔽。本发明一种相关方法进一步包括加热溶液至约 60℃至约125℃,在醛与醛加合物之间达成可逆平衡。本发明另一种相关方法 还包括通过组织染色来检测去掩蔽的蛋白质或抗原或其所含表位。
本发明还涉及可用于上述方法的制剂,其为包含化合物或化合物之混合物 的溶液。所述化合物可以是除醛剂或除醛剂的混合物。所述制剂包含除醛剂, 可选的非离子表面活性剂和稳定剂,它们包含于热溶液中,浓度为与掩蔽蛋白 反应的有效浓度。
本发明还涉及一种试剂盒,其中包含抗原净化剂化合物和/或制剂,可用 于本发明的抗原修复方法。所述试剂盒还包含染色剂、染料、抗体或能用于检 测去掩蔽蛋白质、肽、表位或抗原的其他组分,还包含试剂盒的使用说明。
本发明还涉及用本文所述制剂来减少组织中加热所致自体荧光的方法。 本发明还涉及在蛋白质去掩蔽之后增强荧光强度且同时用溶液中本文所述可 选的非离子表面活性剂对石蜡包埋样品去石蜡的方法。
本发明还涉及鉴定抗原修复剂的方法。该方法中,于含水溶液中用含醛 交联剂固定蛋白质,将所得溶液冻干,得到固定蛋白质。将固定蛋白质加入含 有待定是否为抗原修复剂的化合物的溶液,加热含有所述待定化合物和固定蛋 白质的溶液。用质谱法检测该蛋白质,检出该蛋白质则表明待定物质是抗原修 复剂。
后文将述及目前认为优选的实施方式,仅以公开为目的,从中可看出本 发明还包含其他内容、特征和优点。
附图说明
籍此,可以获知并详细了解如上所述本发明特征、优点和目的以及其他 内容如何展现,对于以上所概括本发明更具体的描述可能需要结合附图中展示 的具体实施方式。这些附图是本申请说明书的一部分。然而,附图所示为本发 明的优选实施方式,不构成本发明实施方式范围的限制。
图1A-1B展示含取代马来酸酐(图1A)和马来酸或(Z)-2-丁烯二酸(图1B) 的基本结构。
图2A-2D显示胶原IV的抗原修复和免疫检测。对多聚甲醛固定的组织 进行抗原修复,采用TBST(图2A),低pH(6.0)柠檬酸钠(图2B),胃蛋白酶预 处理(图2C)和0.05%马来酸酐预处理(图2D)。
图3A-3C显示免疫组化分析所见固定组织中的抗原修复。用免疫荧光检 看多聚甲醛固定组织的冷冻切片(图3A),用免疫荧光检看甲醛固定的石蜡包埋 组织(图3B),用免疫组化法和DAB发色团检看甲醛固定的石蜡包埋组织(图3C) 。
图4A-4E是固定脉管组织中采用马来酸(图4A)、马来酸酐(图4B)、2,3- 二甲基马来酸酐(图4C)、富马酸(图4D)和琥珀酸(图4E)的抗原修复比较。
图5A-5D显示内皮素-1(图5A)、VEGF(图5B)、冯·威利布兰德因子(vonWillebrand)(图5C)、α-平滑肌肌动蛋白和胶原IV两者(图5D)的修复。
图6A-6B显示随马来酸浓度升高,经加热固定脑组织匀浆中测得的蛋白 质浓度(图6A),与之相比,斑点杂交显示的GAPDH对应升高(图6B)。
图7中的显微图像显示多聚甲醛固定的成人脑组织经抗原修复后其中血 管的胶原IV染色。
图8A-8B中的显微图像显示与仅用0.05%抗坏血酸(图8A)相比,添加非 离子表面活性剂Triton X-100令抗原修复后荧光增强(图8B)。
图9A-9C中的显微图像显示与不加5%抗坏血酸的非加热组织(图9A)和 经加热组织(图9B)相比,加有5%抗坏血酸的经加热组织中自体荧光降低(图 9C)。
图10A-10C显示多聚甲醛固定的石蜡包埋脑组织脱蜡:加热至70℃, 约30分钟,溶液中加2.8mM谷胱甘肽(图10A),5%抗坏血酸(图10B)和2.8mM 谷胱甘肽+5%抗坏血酸(图10C)。
图11A-11L显示经福尔马林处理的血管紧张肽-I(图11A-11B)抗原修复 效果的质谱图,采用的是pH=3.5的水(图11C),pH=5.5的水(图11D),5%咪 唑啉酮(图11E),5%柠檬酸(图11F),5%胍(图11G),5%马来酸(图11H),5% 的Tris缓冲液,pH=3.5(图11I),5%抗坏血酸(图11J),5%羟胺(图11K)和 5%半胱氨酸(图11L)。
图12A-12D显示经福尔马林处理的ACTH(图12A)抗原修复效果的质谱 图,采用的是5%马来酸(图12B),5%抗坏血酸(图12C)和水(图12D)。ACTH 经福尔马林室温下处理48小时。
发明详述
本文中,以下词汇和表述的含义如下所述。充分另作说明,本文中的科 技术语的含义即本领域技术人员通识所知。
本文中,单数形式涵盖复数含义。权利要求中,“包含/包括”之类表述 后的单数形式表示单数或复数。本文中,“另一”或“其他”可以表示就某一 权利要求元素或组分而言相同或不同的第二份或第二种或更多份、更多种。 “包含/包括”等涵盖性开放式限定表示可含有更多元素。
本文中,权利要求中的“或”表示“和/或”,除非明示单选或选项间彼 此排斥(尽管本申请公开的内容既支持单选也支持“和/或”)。
本文中,“约”表示数值含义,包括例如数字、分数和百分比,无论是 否明示。“约”一般表示本领域技术人员能够理解为与明示数值等效(例如功能 或结果相同)的一定范围内的数值(例如明示值的+/-5-10%)。有时,“约”还可 以包括与舍入所得有效数字最接近的舍入前数值。
本文中,“去掩蔽”指固定组织中抗原修复和/或改善其中氨基酸、肽和 蛋白质的检测。
本发明实施方式之一中,提供的是固定组织中抗原修复和改善其中氨基 酸、肽和蛋白质检测的方法,其步骤包括:制备除醛剂溶液;使得用含醛交联 剂固定的组织与所述溶液接触;其中,除醛剂与含醛交联剂的醛反应从而修复 固定组织中的抗原并改善固定组织中氨基酸、肽和蛋白质的检测。
继此实施方式,该方法还可包括将溶液加热至约60℃至约125℃约30 分钟至约48小时,在此温度,醛与醛加合物之间存在可逆平衡。该进一步实 施方式中,这些化合物的溶液降低了加热后组织中的自体荧光。继此实施方式, 该方法还可包括对组织进行染色来检测被修复的蛋白质或抗原或其所包含的 表位。
各种实施方式中,除醛剂溶液的浓度为约0.05%至约30%。并且,溶液 的pH维持在视具体除醛剂而定的一定范围内。此外,各种实施方式中,代表 性的含醛交联剂可以是甲醛或戊二醛。除醛剂可见表1所列,但不限于此。具 体地说,所述化合物可以是:氨基乙醇,N-甲基氨基乙醇,2-(羟甲基)哌啶, 2-(羟甲基)吡咯烷,N-苄基氨基乙醇,亚氨基(二乙醇),2-氨基-2-甲基-1,3-丙 二醇;丝氨酸,苏氨酸,壳聚糖,三(羟甲基)氨基甲烷,精氨酸,赖氨酸,甘 氨酸,组氨酸,5-羟色氨酸,肌肽,胍,吗啉,2-(羟甲基)哌啶,氨,碳酸铵, 羟胺,O-烷基化羟胺,N-烷基化羟胺,O,N-烷基化羟胺,羟甲基胺,甲氧基胺, 二丁胺,三亚乙基四胺,苄胺,噻苯咪唑(thiabendazole),苯并三唑,三唑, 二氢吲哚,苯并胍胺,3,4-二氨基苯甲酸,4-氨基苯甲酸甲酯,苯胺;1-氨基-2- 吲哚;聚氧化烯胺;聚酰胺型胺,邻氨基苯甲酸,邻氨基苯甲酸甲酯,邻氨基 苯甲酰胺;邻苯二胺;4-氨基苯甲酸;3,4-二氨基苯甲酸;肼,N-甲基肼,N- 苯肼,甲基酰肼,2,4-二硝基苯基酰肼,脲,尿囊素,咪唑啉酮,苯巴比妥, 甘脲,双缩脲,半胱胺,半胱氨酸,谷胱甘肽,亚硫酸氢钠,对巯基苯甲酰胺, 丙二酰胺,草酰胺,乙酰乙酰胺,草酰胺,焦谷氨酸,琥珀酰胺,乙二胺-N,N’- 二乙酰乙酰胺,N-(2-乙基己基)乙酰乙酰胺,N-(3-苯丙基)乙酰乙酰胺,聚酰胺 ;聚酰胺酯,山梨糖醇,己二醇,葡萄糖,纤维素,羟基香茅醇,双甲酮,抗 坏血酸,戊二酮,2-丁酮,环己酮,2,2-二甲基-1,3-二噁烷-4,6-二酮,2-戊酮, 5,5-二甲基-1,3-环己二酮,脱氢乙酸,1,3-二羟基丙酮二聚体,没食子酸甲酯, 没食子酸乙酯,没食子酸丙酯,焦棓酚,水杨酰胺;水杨酰苯胺;4,5-二羟基 -2,7-萘二磺酸,柠康酸,马来酸酐,2,3-二甲基马来酸酐,1(E)-2-丁烯二酸二 甲酯,2-硫烷基丁-2-烯二酸,丁-2-烯二酸,(E)-3-硝基丙-2-烯酸酯,(E)-2,3- 二氘化丁-2-烯二酸,(Z)-2-甲氧基丁-2-烯二酸,(Z)-2-过氧羟基丁-2-烯二酸, 2-甲氧基丁-2-烯二酸,(Z)-2-氟丁-2-烯二酸酯,4-氧代戊-2-烯酸,(E)-2,3-二氯 丁-2-烯二酸,二氯马来酸,(Z)-2-碘代丁-2-烯二酸,(E)-2,3-二氘化丁-2-烯二 酸,(Z)-2-羟基-3-甲基丁-2-烯二酸,2,3-二氘化丁-2-烯二酸,(E)-3-硝基丁-2- 烯酸,丁-2-烯二酸酯或盐,(E)-4-氯-4-氧代丁-2-烯酸酯或盐,(E)-2,3-二氟丁 -2-烯二酸酯或盐,(E)-4-羟基-4-氧代丁-2-烯酸酯或盐,氢富马酸酯或盐 (hydrogen fumarate),(Z)-2-硫烷基丁-2-烯二酸,2,3-二氟富马酸,(E)-4-羟基-2-甲基-4-氧代丁-2-烯酸酯或盐,一氟代富马酸酯或盐,氟代富马酸,(Z)-2- 氯丁-2-烯二酸,2-过氧羟基丁-2-烯二酸,过氧马来酸,2-氯-3-甲基丁-2-烯二 酸,2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸,2-丁烯二酸,[(E)-3-羧基-1-羟基亚丙-2-烯基]氧 鎓,(E)-2-甲基丁-2-烯二酸酯或盐,2-甲基富马酸酯/盐,柠康酸,2,3-二氯马 来酸,3,4-二氯-5-羟基呋喃-2(5H)-酮,3-氯羰基丙烯酸乙酯,(E)-4-氧代戊-2- 烯酸乙酯,[(Z)-3-羧基丙-2-烯酰]氧鎓,(Z)-丁-2-烯二酸,马来酸二甲酯,富马 酸二甲酯;活性碳,氧化铝;二氧化硅;胺官能化的二氧化硅;滑石;沸石; 或多官能有机物,其中既具有伯胺或仲胺基团又具有羧酸、酚、酰胺、羟基、脲、酯或巯基基团,至少其中之一会与醛反应;环糊精;或上述化合物的各种 组合。
各种实施方式中,除醛剂溶液还可含有约0.1%至约5%的非离子表面活 性剂用于石蜡包埋样品脱蜡和增强抗原修复后的荧光强度。非离子表面活性剂 的代表性例子包括但不限于:聚西托醇1000(Cetomacrogol 1000),鲸蜡硬脂 醇,鲸蜡醇,椰油酰胺二乙醇胺,椰油酰胺单乙醇胺,癸基葡糖苷,IGEPAL CA-630,异鲸蜡醇聚醚-20(Isoceteth-20),月桂基葡糖苷,NP-40,Nonidet P-40,壬苯醇醚-9,壬苯醇醚,月桂酸单甘油酯,八乙二醇单十二烷基醚,油 醇,泊洛沙姆,泊洛沙姆407,聚甘油聚蓖麻油酸酯,聚山梨酸酯,脱水山梨 醇单硬脂酸酯,脱水山梨醇三硬脂酸酯;硬脂醇;Triton X-10;吐温80;辛基 -、癸基、十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麦芽糖苷和脱氧胆酸。
这些实施方式中,溶液中还可包含稳定剂。稳定剂的代表性例子包括但 不限于:防腐剂,抗真菌剂,抗细菌剂,染料,颜料,阴离子洗涤剂,金属盐, 抗氧化剂,或它们的各种组合。优选实施方式之一中,稳定剂是谷胱甘肽,浓 度约2mM至约400mM。
本发明另一实施方式中,提供的是一种制剂,其中,于溶液中含有一种 化合物或多种化合物的混合物、可选的非离子表面活性剂和稳定剂(如上所述), 它们包含在热溶液中,浓度为与掩蔽蛋白质发生反应的有效浓度,pH范围取 决于作为有效除醛剂的具体化合物,所处温度使醛与醛加合物之间形成平衡或 加速达到所述平衡。尤其,所述制剂可于含水溶液中含有所述化合物或化合物 混合物,浓度约0.05%至约30%,可选地还含有非离子表面活性剂,浓度约 0.1至约5%,以及稳定剂。稳定剂例如但不限于:防腐剂,抗真菌剂,抗细菌 剂,染料,颜料,阴离子洗涤剂,金属盐,抗氧化剂或其组合。
本发明另一实施方式提供的是用于修复固定组织中目标蛋白质的试剂 盒,其中包含除醛剂(如前文所述),可选的非离子表面活性剂(如前文所述),稳 定剂(如前文所述),染色剂,染料或抗体,以及该试剂盒的使用说明。
本发明另一实施方式提供的是鉴定抗原修复剂的方法,其步骤包括:于 含水溶液中用含醛交联剂固定蛋白质,将所得溶液冻干,得到固定蛋白质;将 固定蛋白质加入含有待定是否为抗原修复剂的化合物的溶液里;加热含有所述 待定化合物和固定蛋白质的溶液;用质谱法检测该蛋白质;检出代表该蛋白质 的峰则表明待定物质是抗原修复剂。该实施方式中,所述含醛交联剂包含约4% 甲醛的水溶液。所述溶液加热至约60℃至约125℃约30分钟至48小时。
本文中提供了可用于对含醛交联剂固定的组织中被掩蔽蛋白质进行去 掩蔽和检测的方法、化合物和试剂盒。尤其,在特定pH范围具有除醛剂功能 的化合物都能够用于抗原修复。此类化合物具有对获释醛的反应活性,所述获 释醛来自固定剂与组织中蛋白质在醛固定时所成加合物的水解,反应推动醛与 醛加合物之间的平衡向在组织中产生(甲)醛的方向移动。代表性可用化合物如 表1所示。
表1
如实施例中所述,本文中的方法采用配制于溶液例如水溶液中、浓度约 0.05%至30%的化合物。在优化pH范围加热固定组织能释放出醛类,释出的 醛能与溶液中的化合物反应从而去除目标蛋白质上的掩蔽。制剂中可采用一种 化合物或多种化合物的混合物。去掩蔽后,可根据目标蛋白质,用选自以下所 述的方法对一种或多种目标蛋白进行检查:染色,免疫组化分析或组织病理学 分析或其他本领域已知方法。
在固定组织中,这些化合物能够令蛋白质(例如脉管蛋白)被明确检出, 同时保存组织形态。并且,这些化合物能够原位保留用常规核酸结合性染料 (例如DAPI)进行的DNA检测,由此能够进行组织病理学分析中的多色成像 。
因此,还提供了用于本文所述各种方法的新化合物及其制剂。制剂可含 有可选的非离子表面活性剂,这既能增强蛋白质去掩蔽后的荧光强度又能去除 石蜡包埋样品的石蜡,省略了另行脱蜡的步骤。非离子表面活性剂包括但不限 于:聚西托醇1000,鲸蜡硬脂醇,鲸蜡醇,椰油酰胺二乙醇胺,椰油酰胺单 乙醇胺,癸基葡糖苷,IGEPAL CA-630,异鲸蜡醇聚醚-20,月桂基葡糖苷, NP-40,Nonidet P-40,壬苯醇醚-9,壬苯醇醚,月桂酸单甘油酯,八乙二醇 单十二烷基醚,油醇,泊洛沙姆,泊洛沙姆407,聚甘油聚蓖麻油酸酯,聚山 梨酸酯,脱水山梨醇单硬脂酸酯,脱水山梨醇三硬脂酸酯;硬脂醇;Triton X-10 ;吐温80;以及辛基-、癸基、十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麦芽糖苷和脱氧胆 酸。
本文中还提供了用于固定组织中蛋白质去掩蔽的试剂盒。此类试剂盒可 包含一种或多种本文所述新型化合物或其制剂,以及抗体或其他用于检测的试 剂。此类试剂盒可实现一步法抗原修复,可用于多种蛋白质的检测。用所述 试剂盒,使用者可采用多种条件下保存的固定组织,例如多聚甲醛、福尔 马林、乙醇或石蜡块等条件下保存的固定组织,对这些固定组织进行简单的 化学处理,然后用蛋白印迹、ELISA等定量技术对蛋白质进行分析。这些应用 使得本领域普通技术人员能够对大量目前因固定导致感应性丢失而不能用于 定量分析的保存样品进行分析。
以下实施例仅用于说明本发明的多种实施方式,不构成对本发明任何意 义上的限制。
实施例1
化合物
能够在特定pH范围与醛反应的代表性除醛剂包括但不限于:氨基乙醇衍 生物,包括:氨基乙醇,N-甲基氨基乙醇,2-(羟甲基)哌啶,2-(羟甲基)吡咯烷, N-苄基氨基乙醇,亚氨基(二乙醇),2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇;丝氨酸,苏氨 酸,壳聚糖,三(羟甲基)氨基甲烷,氨基酸及其衍生物,包括精氨酸、赖氨酸、 甘氨酸、组氨酸、5-羟色氨酸、肌肽,其他含胺和含苯胺化合物,包括胍、吗 啉、2-(羟甲基)哌啶、氨、碳酸铵、羟胺、O-烷基化羟胺、N-烷基化羟胺、O,N- 烷基化羟胺、羟甲基胺、甲氧基胺、二丁胺、三亚乙基四胺、苄胺、噻苯咪唑、苯并三唑、三唑、二氢吲哚、苯并胍胺、3,4-二氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸甲 酯、苯胺;1-氨基-2-吲哚;聚氧化烯胺;聚酰胺型胺,邻氨基苯甲酸,邻氨基 苯甲酸甲酯,邻氨基苯甲酰胺;邻苯二胺;4-氨基苯甲酸;3,4-二氨基苯甲酸 ;肼和酰肼衍生物,包括:肼、N-甲基肼、N-苯肼、甲基酰肼、2,4-二硝基苯 基酰肼,脲衍生物,包括:脲、尿囊素、咪唑啉酮、苯巴比妥、甘脲、双缩脲, 硫醇衍生物,包括:半胱胺、半胱氨酸、谷胱甘肽、亚硫酸氢钠、邻巯基苯甲酰胺,酰胺衍生物,包括:丙二酰胺、草酰胺、乙酰乙酰胺、草酰胺、焦谷氨 酸、琥珀酰胺、乙二胺-N,N’-二乙酰乙酰胺、N-(2-乙基己基)乙酰乙酰胺、N-(3- 苯丙基)乙酰乙酰胺、聚酰胺;聚酰胺酯,羟基化合物,包括:山梨糖醇、己二 醇、葡萄糖、纤维素、羟基香茅醇,酮衍生物,包括:双甲酮、抗坏血酸、戊 二酮、2-丁酮、环己酮、2,2-二甲基-1,3-二噁烷-4,6-二酮、2-戊酮、5,5-二甲基 -1,3-环己二酮、脱氢乙酸、1,3-二羟基丙酮二聚体,酚衍生物,包括:没食子 酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、焦棓酚、水杨酰胺;水杨酰苯胺;4,5- 二羟基-2,7-萘二磺酸,酸和酯衍生物,包括:马来酸、柠康酸、马来酸酐、2,3- 二甲基马来酸酐、1(E)-2-丁烯二酸二甲酯、2-硫烷基丁-2-烯二酸、丁-2-烯二 酸、(E)-3-硝基丙-2-烯酸酯或盐、(E)-2,3-二氘化丁-2-烯二酸、(Z)-2-甲氧基丁 -2-烯二酸、(Z)-2-过氧羟基丁-2-烯二酸、2-甲氧基丁-2-烯二酸、(Z)-2-氟丁-2- 烯二酸酯、4-氧代戊-2-烯酸、(E)-2,3-二氯丁-2-烯二酸、二氯马来酸、(Z)-2- 碘代丁-2-烯二酸、(E)-2,3-二氘化丁-2-烯二酸、(Z)-2-羟基-3-甲基丁-2-烯二酸、 2,3-二氘化丁-2-烯二酸、(E)-3-硝基丁-2-烯酸、丁-2-烯二酸酯或盐、(E)-4-氯-4- 氧代丁-2-烯酸酯或盐、(E)-2,3-二氟丁-2-烯二酸酯或盐、(E)-4-羟基-4-氧代丁 -2-烯酸酯或盐、氢富马酸酯或盐、(Z)-2-硫烷基丁-2-烯二酸、2,3-二氟富马酸、 (E)-4-羟基-2-甲基-4-氧代丁-2-烯酸酯或盐、一氟富马酸酯或盐、氟代富马酸、(Z)-2-氯丁-2-烯二酸、2-过氧羟基丁-2-烯二酸、过氧马来酸、2-氯-3-甲基丁-2- 烯二酸、2-氯-3-甲基丁-2-烯二酸、2-丁烯二酸、[(E)-3-羧基-1-羟基亚丙-2-烯 基]氧鎓、(E)-2-甲基丁-2-烯二酸酯或盐、2-甲基富马酸酯/盐、柠康酸、2,3-二 氯马来酸、3,4-二氯-5-羟基呋喃-2(5H)-酮、3-氯羰基丙烯酸乙酯、(E)-4-氧代 戊-2-烯酸乙酯、[(Z)-3-羧基丙-2-烯酰]氧鎓、(Z)-丁-2-烯二酸、马来酸二甲酯、 富马酸二甲酯;固相材料,包括:活性碳,氧化铝;二氧化硅;胺官能化的二 氧化硅;滑石;沸石;或多官能有机物,其中既具有伯(胺)或仲(胺)基团又具有 羧酸、羟基、脲、酚、酰胺、酯或巯基基团,至少其中之一能与醛反应;环糊 精;或上述化合物的各种组合。
实施例2
甲醛固定组织中的抗原修复:一般方法
将少量的一种化合物或多种化合物的混合物(例如选自表1的化合物)加 入水中,浓度为0.05%。将此溶液加热至约70℃至约95℃约30分钟。由此 发生的化学反应实现化学表位的去掩蔽或修复。将甲醛固定的组织在此热溶液 中放置约30分钟,然后进行清洗。然后可对组织进行染色来检测目标蛋白质 。结果显示,多聚甲醛固定组织中脉管蛋白胶原IV的抗原修复和免疫检测, 用马来酸酐效果最佳(图2A-2D)。
实施例3
抗原修复与多种不同免疫组化分析法交叉相容
本文所述抗原修复方法适用于多种形式的组织加工样本,并增强这些样 本中蛋白质的可视性。显微图像显示,用免疫荧光检看,多聚甲醛固定的组织 冷冻切片可视性增强,采用DAB发色团的免疫组化法检看甲醛固定的石蜡包 埋组织可视性增强(图3A-3D)。
实施例4
以马来酸、马来酸酐和2,3-二甲基马来酸酐作为抗原修复剂
用琥珀酸酐作为校验。在如实施例1所述制备的化合物的溶液中加热多 聚甲醛固定的组织样本,检看组织中的血管。马来酸(图4A)、马来酸酐(图4B) 和2,3-甲基马来酸酐相关组织中,显示抗原修复成功,血管可见(图4C)。图 4D显示采用这些化合物α、β双键处的顺式构型获得的活性显著高于用富马酸 处理所得活性,富马酸含反式构型,其活性显著低。作为对比,图4E显示琥 珀酸酐处理的组织中未见脉管系统。这表明,就抗原修复而言,顺式构型为优 。
实施例5
成年小鼠脑组织中采用马来酸酐的脉管抗原修复
12月龄的C57黑色6J小鼠和六月龄的笼养于有控环境条件下,采用常规 12小时昼夜周期。致死后,将脑于4%多聚甲醛中4℃固定72小时,然后转入 70%乙醇溶液于4℃保存。对组织进行石蜡处理,采用常规脱水和包埋,然后进 行间隔5μm的切片。冷冻切片组织用“最佳切片温度复合物(OCT)”(Tissue-Tek) 包埋后于-80℃冷冻;用冷冻切片机(Leica)切50μm的切片。在对不同处理方 法的研究中,用相邻切片进行比较。
对碳酸酐溶液孵育的切片,将50μm的切片在含有0.2%Triton X-100的 PBS中孵育三次,每次10分钟,然后将切片在已预热至95℃、蒸馏水配制的 0.05%马来酸酐(SigmaAldrich)溶液中浸45分钟。将切片冷却至室温后换4次 PBS清洗15min,然后进行免疫组化法处理。
用马来酸酐处理甲醛固定的组织,以此去除通常因醛固定而掩蔽的多种 脉管相关抗原的掩蔽。内皮素-1、VEGF、冯·威利布兰德因子以及,采用双重 标记,α-平滑肌肌动蛋白和胶原IV(图5A-5D)去掩蔽,采用已知在组织中有效 的抗体。
实施例6
甲醛固定脑组织的组织匀浆的抗原修复
因为会造成组织交联和改性,醛固定会明显损伤固定组织使其不能用于 定量分析技术以检测蛋白质,例如不能用于Lowry试验和BCA试验、斑点杂 交试验或蛋白质印迹试验。本实施例显示,本发明能够恢复可检测蛋白。图6A 显示,在不同浓度马来酸存在下加热由脑制备的甲醛-固定蛋白质匀浆,BCA 试验可定量的蛋白质水平升高近8倍,表明可得游离氨基酸增加。然而,非固 定蛋白质类似地在马来酸存在下加热很容易被BCA检出,且浓度恒定(数据略) 。图6B是可测知GAPDH蛋白的斑点杂交比较,显示采用这些化合物显著、 可测地提高特定蛋白质的水平。甲醛处理的组织用浓度从1.6%到12.8%的马 来酸处理,并于95℃加热30分钟,GAPDH检测显示平行升高。相比之下, 未处理的甲醛交联组织中无法测到GAPDH。
实施例7
成人脑脉管系统中的抗原修复
多聚甲醛固定的石蜡包埋成人脑组织用2,3-二甲基马来酸如前文所述进 行抗原修复。用胶原IV检测血管(图7)。
实施例8
添加Triton使得抗原修复后荧光增强
将多聚甲醛固定的石蜡包埋脑组织脱蜡,于溶液中加热至70℃、30分 钟,然后用胶原IV检测血管(图8A-8B)。488nM激发成像。在5.0%抗坏血酸 溶液中添加0.5%TritonX-100,与不加Trition X-100的样品(图8B)相比显著提 升染色均匀度和强度(图8A)。
实施例9
抗原修复制剂处理降低自体荧光
将多聚甲醛固定的石蜡包埋脑组织脱蜡,于溶液中至70℃加热30分钟, 488nM激发成像(图9A-9C)。成像的曝光和时间都相同。与不加热的组织(图 9A)相比,仅于水中加热的组织(图9B)显示组织自体荧光增强。相同条件下添 加5%抗坏血酸显著降低了可见的自体荧光(图9C)。
实施例10
添加谷胱甘肽提高化合物稳定性
将多聚甲醛固定的石蜡包埋脑组织脱蜡,于溶液中至70℃加热30分钟, 488nM激发成像并放大20倍(图10A-10C)。以相同曝光和时间获得各20倍放 大图像。与5%抗坏血酸存在下加热组织(阴性对照)(图10B)相比,没有抗坏血 酸存在时,谷胱甘肽对组织没有影响(图10A)。向5%抗坏血酸中添加2.8mM 谷胱甘肽(图10C)提高了抗坏血酸的稳定性,同时保留染色效果。
实施例11
采用不同除醛化合物的抗原修复(血管紧张肽I)
血管紧张肽I用福尔马林室温下处理48小时。化合物:pH=3.5的水(图 11C),pH=5.5的水(图11D),5%咪唑啉酮(图11E),5%柠檬酸(图11F),5% 胍(图11G),5%马来酸(图11H),pH=3.5的Tris缓冲液(图11I),抗坏血酸(图 11J),羟胺(图11K),半胱氨酸(图11L),各自与经处理的血管紧张肽I一起95℃ 加热45分钟,以考察各化合物的抗原修复能力。用质谱法分别于化合物处理 前和处理后分析血管紧张肽I的组成。将福尔马林处理前(图11A)和处理后(图 11B)的血管紧张肽I样品作为试验的对照。结果如图(11A-11L)所示。m/z1296 处的峰代表非改性血管紧张肽I。m/z 1308处的峰代表带有1个亚甲基单元的 血管紧张肽I,m/z 1320处的峰代表带有2个亚甲基单元的血管紧张肽I。m/z 1238处的峰代表带有1个亚甲基单元和1个羟甲基(hydromethyl)的血管紧张 肽I。m/z 1350处的峰代表带有2个亚甲基单元和1个羟甲基的血管紧张肽I 。
图11A-11B显示血管紧张肽I完全转化为福尔马林加合物。图11C-11D 揭示,pH=3.5的水具有修复福尔马林加合物的能力,但pH=5.5的水基本没有 。图11B、11D和11G比较显示5%马来酸和5%咪唑啉酮都能够显著减少带 2个亚甲基的血管紧张肽I(m/z 1320),由此得到更多非修饰血管紧张肽I(m/z 1296)。图10B与图10F比较显示5%柠檬酸(45分钟,95℃)能够显著减少带 2个亚甲基单元的血管紧张肽I(m/z 1320)和带1个亚甲基单元和1个羟基亚 甲基的血管紧张肽I(m/z 1338)。图11G显示5%胍修复带1个亚甲基单元和 1该羟基亚甲基的血管紧张肽I(m/z 1338)的能力最弱,对于带2个亚甲基单 元的血管紧张肽I(m/z 1320)的含量没有影响。并且,图11B与图E以及 11I-11L比较显示,5%柠檬酸、pH=3.5的5%Tris缓冲液、5%抗坏血酸、5% 羟胺和5%半胱氨酸都能够显著修复福尔马林加合物。
实施例12
用除甲醛剂的抗原修复(促肾上腺皮质激素(ACTH))
ACTH(18-39)肽室温下用福尔马林处理48小时(图12A)。然后分别用 5%马来酸(图12B)、5%抗坏血酸(图12C)和pH=3.5的水(图12D)对经福尔马 林处理的ACTH肽于90℃处理45分钟。用质谱法分析经福尔马林处理且经 各处理后的ACTH的组成。用图12A-12D所示结果来考察各试剂逆转甲醛加 合物的能力。图12A显示ACTH经福尔马林处理后的组成,福尔马林处理产 生高含量的带2个亚甲基单元的ACTH(m/z 2489)和带1个亚甲基单元的ACTH(m/z 2477)。仅测到少量带3个亚甲基单元的ACTH。图12A、12B和 12C比较显示5%马来酸和5%抗坏血酸的98℃、45分钟处理都能够将改性 ACTH(带1、2或3个亚甲基的ACTH;分别对应m/z 2477、2489和2501峰) 几乎完全转化为非改性ACTH(m/z 2465)。
本发明非常适合实现本发明所述以及自身隐含的目的和优点。以上所述 具体实施方式仅用于说明,本发明有多种不同但等同的变换和实施方式,都具 有本文中所述的优点和效果,这些对于本领域技术人员来说显而易见。并且, 除了权利要求所述之外,本文中的构建或设计中的细节没有限制。因此,显然, 以上具体实施方式是可以改变的,而所有此类改变都涵盖于本发明构思和范围 之内。并且,除非专利权人明确给出了清楚的定义,权利要求中的术语符合其 本意和惯常理解的含义。
Claims (9)
1.一种用于固定组织中抗原修复和改善氨基酸、肽和蛋白质检测的方法,其步骤包括:
制备含有除醛剂的溶液,其中所述除醛剂选自马来酸或马来酸酐、2,3-二甲基马来酸酐、抗坏血酸、咪唑啉酮、半胱氨酸、其盐、或其组合;以及
令用基于醛的交联剂固定的组织与所述溶液接触;
在最佳pH3.5-5.5的范围内加热所述溶液,
其中所述溶液的pH范围处于所述除醛剂与基于醛的交联剂的特定反应范围内;
其中,所述除醛剂与所述基于醛的交联剂的醛基之间的反应修复固定组织中的所述抗原并改善固定组织中氨基酸、肽和蛋白质的检测。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述基于醛的交联剂是甲醛或戊二醛。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述除醛剂在所述溶液中的浓度是0.05%至30%。
4.如权利要求1所述的方法,还包括:
将所述溶液加热至60℃至125℃从而在醛与醛加合物之间达成可逆平衡。
5.如权利要求4所述的方法,其中,所述溶液降低加热后组织中的自体荧光。
6.如权利要求1所述的方法,还包括对组织进行染色来检测所述蛋白质、肽。
7.如权利要求1所述的方法,其中,所述溶液还包含0.1%至5%的非离子表面活性剂,所述非离子表面活性剂去除石蜡包埋样品中的石蜡并增强抗原修复后的荧光强度。
8.如权利要求7所述的方法,其中,所述非离子表面活性剂是聚西托醇1000,鲸蜡硬脂醇,鲸蜡醇,椰油酰胺二乙醇胺,椰油酰胺单乙醇胺,癸基葡糖苷,IGEPAL CA-630,异鲸蜡醇聚醚-20,月桂基葡糖苷,Nonidet P-40,壬苯醇醚-9,壬苯醇醚,月桂酸单甘油酯,八乙二醇单十二烷基醚,油醇,泊洛沙姆,聚甘油聚蓖麻油酸酯,聚山梨酸酯,脱水山梨醇单硬脂酸酯,脱水山梨醇三硬脂酸酯;硬脂醇;Triton X-10;辛基-、癸基、十二烷基-吡喃葡萄糖苷或-麦芽糖苷或脱氧胆酸。
9.如权利要求1所述的方法,其中,所述溶液还含有稳定剂,所述稳定剂选自防腐剂,抗真菌剂,抗细菌剂,染料,颜料,阴离子洗涤剂,金属盐,抗氧化剂或其组合。
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