CN110596367B - 一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法 - Google Patents

一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法，其中包括缓冲液、乳化剂、有机化合物、蛋白酶、螯合剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂和防腐剂；用该稳定剂配制出来的脑钠肽校准品，可以在2～8℃环境下保存3个月而浓度降低幅度控制在10％以内，在‑20℃中可以至少稳定保存12个月，解决了脑钠肽极度不稳定的特性，使得用脑钠肽抗原配出来的校准品可以稳定储存至少3个月，能够应用在体外诊断试剂的技术领域中，解决了在冷链运输过程中稳定性的问题，以及能有效延长试剂盒的有效期。

Description

一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种体外诊断试剂领域，具体涉及一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法。
背景技术
脑钠肽是一种具有利钠、舒张血管及抑制肾素功能的多肽类激素，属于脑钠肽原前体的蛋白酶裂解产物，由32个氨基酸残基组成，大量研究结果表明，脑钠肽可用于患者诊断、预后和治疗监测，心功能不全患者体内脑钠肽水平升高，血浆脑钠肽可以为左心功能不全和心力衰竭的诊断和治疗提供有用的临床信息，可以作为其他诊断性检查方法(如心电图、胸部X线和超声心动图)的补充，脑钠肽水平可用于评估心力衰竭的严重程度，血浆脑钠肽水平会随着心脏功能储备的生理性下降而升高，心力衰竭患者体内脑钠肽值升高。因此临床常用脑钠肽水平值来协助诊断和评估心力衰竭的严重程度。
脑钠肽是一种极度不稳定的分子，目前脑钠肽免疫检测系统通常采用合成的脑钠肽作为配制校准品的原料，但经证明，合成的脑钠肽在血浆和某些含蛋白酶的基质中非常不稳定，在2～8℃环境保存条件下，放置一夜，浓度降低大概30％左右，很不稳定，不适用于商业化，也给长途冷链运输方面带来很大的困难。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂及其制备方法，利用该稳定剂配制的脑钠肽校准品能在长途冷链运输中稳定存在。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂，由以下试剂组成：
0.5mol/L缓冲液、0.5-4.0wt％的蛋白酶抑制剂、0.02-0.10wt％的有机化合物、0.05-0.20wt％的螯合剂、0.05-0.10wt％的防腐剂、0.01-0.5wt％的表面活性剂、0.5wt％的乳化剂、1.0wt％的甘油和0.5wt％的BSA，其余由纯化水补足100wt％；其中，缓冲液为乙酸缓冲液、MOPS盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的任意一种；蛋白酶抑制剂包括抑肽酶、抑氨肽酶B和亮肽素中的一种或几种；有机化合物由2-氨基苯甲酰胺和硫代丙酰胺组成。
在上述配方体系中，缓冲液能阻碍能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂溶液pH的变化，乙酸缓冲液的缓冲pH范围是3.6-5.8、MOPS盐缓冲液的缓冲pH范围是6.5-7.9和柠檬酸盐缓冲液的缓冲pH范围是3.0-6.6。三者用于将在配制过程中将能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂的pH值稳定在各自的缓冲pH范围内。抑肽酶的靶蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，抑氨肽酶B的靶蛋白酶为氨基肽酶，亮肽素可抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、组织蛋酶B、血纤维蛋白溶酶和激肽释放酶。抑肽酶、抑氨肽酶和亮肽素的组合，剔除了上述提及的蛋白酶，使合成的脑钠肽能在BSA稳定存在，能有效延长脑钠肽校准品的有效期。
2-氨基苯甲酰胺和硫代丙酰胺作为碳水化合物，2-氨基苯甲酰胺含游离还原端的荧光标记聚糖，使得用能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂配制的脑钠肽校准品具有荧光标记灵敏度，当该脑肽纳校准品作为体外诊断试剂盒的标记物时能提高体外诊断试剂盒的准确性。
进一步，所述螯合剂为EDTA和/或DTPA。EDTA和DTPA都是氨基羧酸类。EDTA能与Mg2 +、Ca2+、Mn2+和Fe2+等二价金属离子结合的螯合剂。由于多数核酸酶类和有些蛋白酶类的作用需要Mg2+，故EDTA也常用做核酸酶和蛋白酶的抑制剂。DTPA是高效鳌合剂，鳌合性强，能迅速与钙、镁、铁、铅、铜、锰等离子生成水溶性络合物。两者能避免金属离子对BSA产生影响。
再进一步，所述防腐剂包括硫柳汞、Proclin300和叠氮钠中的一种或几种。硫柳汞和叠氮钠能有效预防有害微生物污染所致的潜在危害。Proclin300防腐剂是用于诊断试剂或产品中控制微生物含量的高效来灭菌剂。以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，ProClin 300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。ProClin 300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长以本发明的稳定剂配制的脑钠肽校准品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin 300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂，适用于体外诊断试剂盒。
进一步，所述表面活性剂包括Tween-20、Tween-40、NP-40、Triton X-100和十二烷基硫酸钠中的一种或几种。Tween-20、Tween-40、NP-40和Triton X-100均为非离子表面活性剂，十二烷基硫酸钠为阴离子表面活性剂。甘油作为助表面活性剂能使非离子表面活性剂插入在反胶团的结构中以增大反胶团的尺寸，从而能溶解较大相对分子质量的蛋白质。
再进一步，所述乳化剂为明胶，明胶能与十二烷基硫酸钠相互作用，从而提高体系的摩尔电导率荧光强度，使得利用本发明制备的稳定剂配制的脑钠肽校准品作为标记物在能在体外诊断试剂盒上更准确地检测出来。
一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
1)称取缓冲液、蛋白酶抑制剂、有机化合物、螯合剂、防腐剂、乳化剂、甘油、表面活性剂和BSA，混合后加入纯化水；
2)调节pH值为4.5后，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
进一步地，步骤2)选用3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、使用本发明制备的能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂配制的脑钠肽校准品，能有效延长脑钠肽校准品的有效期，使脑钠肽校准品在冷链运输过程中能稳定储存；
2、使用本发明制备的能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂配制的脑钠肽校准品能提高体外诊断试剂盒的准确性，由于脑钠肽校准品的稳定性提高了，降低了脑钠肽校准品作为标记物的项目研发的困难度，能广泛应用于体外诊断试剂技术领域中。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
在0.5mol/L的乙酸缓冲液中加入2.0wt％的抑肽酶、2.0wt％的抑氨肽酶B、2.0wt％的亮肽素、0.05wt％的2-氨基苯甲酰胺、0.05wt％的硫代丙酰胺、0.10wt％的EDTA、0.25wt％的Tween-20、0.05wt％叠氮钠、0.5wt％的明胶、1.0wt％甘油和0.5wt％的BSA，补足100wt％的纯化水后混匀，加入3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
实施例2
在0.5mol/L的MOPS盐缓冲液中加入2.0wt％的抑肽酶、2.0wt％抑氨肽酶B、2.0wt％亮肽素、0.05wt％的2-氨基苯甲酰胺、0.05wt％硫代丙酰胺、0.10wt％EDTA、0.25wt％Tween-20、0.05wt％叠氮钠，0.5wt％的明胶、1.0wt％的甘油和0.5wt％的BSA，补足100wt％的纯化水后混匀，加入3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
实施例3
在0.5mol/L的柠檬酸盐缓冲液中加入2.0wt％的抑肽酶、2.0wt％抑氨肽酶B、2.0wt％亮肽素、0.05wt％的2-氨基苯甲酰胺、0.05wt％硫代丙酰胺、0.10wt％EDTA、0.25wt％Tween-20、0.05wt％叠氮钠，0.5wt％的明胶、1.0wt％的甘油和0.5wt％的BSA，补足100wt％的纯化水后混匀，加入3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
实施例4
在0.5mol/L的乙酸缓冲液中加入0.5wt％的抑肽酶、0.5wt％抑氨肽酶B、0.5wt％亮肽素、0.02wt％的2-氨基苯甲酰胺、0.02wt％硫代丙酰胺、0.05wt％EDTA、0.01wt％Tween-20、0.01wt％叠氮钠，0.5wt％的明胶、1.0wt％的甘油、0.5wt％的BSA，补足100wt％的纯化水后混匀，加入3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
实施例5
在0.5mol/L的乙酸缓冲液中加入4wt％的抑肽酶、4wt％抑氨肽酶B、4wt％亮肽素、0.1wt％的2-氨基苯甲酰胺、0.1wt％硫代丙酰胺、0.1wt％EDTA、0.25wt％Tween-20、0.05wt％叠氮钠，0.5wt％的明胶、1.0wt％的甘油和0.5wt％的BSA，补足100wt％的纯化水后混匀，加入3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
实施例6
在0.5mol/L的乙酸缓冲液中加入2wt％的抑肽酶、2wt％抑氨肽酶B、2wt％亮肽素、0.05wt％的2-氨基苯甲酰胺、0.05wt％硫代丙酰胺、0.2wt％EDTA、0.5wt％Tween-20、0.1wt％叠氮钠，0.5wt％的明胶、1.0wt％的甘油和0.5wt％的BSA，补足100wt％的纯化水后混匀，加入3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
测定方案
购买HyTest公司的人脑钠肽抗原，浓度为5.47mg/ml，用实施例1-6配制的6个稳定剂分别将脑钠肽抗原稀释为10pg/ml、50pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml这6个浓度，再用普通稀释液将脑钠肽抗原稀释为同样的6个浓度点。购买进口脑钠肽检测试剂盒对上面所配制的各个浓度校准点进行测定，测定方案定为分别在2～8℃及-20℃环境保存，然后在第1天、3天、7天、14天、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、1年时候分别用进口试剂盒测定一次浓度，所得的数据整理成表格，以下是本发明具体实施例子得到的结果汇总(单位：pg/mL)。
实验组：实施例1
表1由实施例1的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在2-8℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000061
Figure BDA0002194284550000071
表2由实施例1的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在-20℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000072
Figure BDA0002194284550000081
实验组：实施例2
表3由实施例2的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在2-8℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000082
Figure BDA0002194284550000091
表4由实施例2的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在-20℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000092
实验组：实施例3
表5由实施例3的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在2-8℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000101
表6由实施例3的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在-20℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000102
/>
Figure BDA0002194284550000111
实验组：实施例4
表7由实施例4的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在2-8℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000112
/>
Figure BDA0002194284550000121
表8由实施例4的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在-20℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000122
/>
Figure BDA0002194284550000131
实验组：实施例5
表9由实施例5的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在2-8℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000132
/>
Figure BDA0002194284550000141
表10由实施例5的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在-20℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000142
实验组：实施例6
表11由实施例6的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在2-8℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000151
表12由实施例6的稳定剂稀释的脑钠肽抗原在-20℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000152
/>
Figure BDA0002194284550000161
对照组：正常人血清配制
表13由正常人血清配制的脑钠肽抗原在2-8℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000162
Figure BDA0002194284550000171
表14正常人血清配制的脑钠肽抗原在-20℃条件下随时间的浓度变化
Figure BDA0002194284550000172
从表1-14的实验结果进行分析得出，从上面表格的实验结果进行分析得出，对照组用正常人血清基质配制的浓度点稳定性很差，里面所含的脑钠肽分子每天都在不断的降解失效，在2～8℃环境中到第14天时候基本已经测不出浓度，即使在-20℃的低温条件下也一样降解幅度很大，因此不适用于充当脑钠肽的校准品工作稳定剂，而通过分析可以看出，实施例1、实施例3和实施例5配制出来的稳定剂效果最好，在2～8℃的储存条件下，可以保存三个月，然后浓度开始慢慢下降，在-20度条件下也至少可以稳定保存一年，稳定性大大提高，解决了冷链长途运输过程中稳定保存以及实际应用中校准品的准确性。而实施例2在2～8℃储存条件下，可以保存7天，即使在保存三个月后活性降解也在20％以内，比对照组的稳定性强。实施例1-3的区别点在于用于不同的缓冲液，由此可见，在其他试剂用量和种类都一致的前提下，使用0.5mol/L的乙酸缓冲液的稳定剂和0.5mol/L的柠檬酸盐缓冲液的稳定剂的效果要优于使用的0.5mol/L的MOPS盐缓冲液的稳定剂。实施例4在2-8℃的储存条件下能稳定保存两个月，即使在保存三个月后活性降解也在10％以内，比对照组的稳定性强。实施例6在2-8℃的储存条件下能稳定保存14天，即使在保存三个月后活性降解也在10％以内，比对照组的稳定性强。
因此本发明提供的一种能延长脑钠肽校准品效期的稳定剂，有效的解决了脑钠肽不能稳定存在的问题，提高了该项目试剂的质量，解决了长途冷链运输中脑钠肽校准品不稳定的问题。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂，其特征在于，由以下试剂组成：
0.5mol/L缓冲液、0.5-4.0wt％的蛋白酶抑制剂、0.02-0.10wt％的有机化合物、0.05-0.20wt％的螯合剂、0.05-0.10wt％的防腐剂、0.01-0.5wt％的表面活性剂、0.5wt％的乳化剂、1.0wt％的甘油和0.5wt％的BSA，其余由纯化水补足100wt％；其中，缓冲液为乙酸缓冲液、MOPS盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液中的任意一种；蛋白酶抑制剂包括抑肽酶、抑氨肽酶B和亮肽素中的一种或几种；有机化合物由2-氨基苯甲酰胺和硫代丙酰胺组成；所述防腐剂包括硫柳汞、Proclin300和叠氮钠中的一种或几种；所述乳化剂为明胶。
2.如权利要求1所述的能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂，其特征在于，所述螯合剂为EDTA和/或DTPA。
3.如权利要求1所述的能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂，其特征在于，所述表面活性剂包括Tween-20、Tween-40、NP-40、Triton X-100和十二烷基硫酸钠中的一种或几种。
4.如权利要求1-3任一所述的能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取缓冲液、蛋白酶抑制剂、有机化合物、螯合剂、防腐剂、乳化剂、表面活性剂、甘油和BSA，混合后加入纯化水；
2)调节pH值为4.5后，得到能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂。
5.如权利要求4所述的能延长脑钠肽校准品有效期的稳定剂的制备方法，其特征在于，步骤2)选用3mol/L盐酸溶液调节pH值为4.5。
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