JP3719742B2 - ビリルビン測定用試薬および測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体中の総ビリルビンおよび直接型ビリルビンの測定用試薬および測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体中のビリルビンは直接型ビリルビンと間接型ビリルビンとに大別され、溶血性貧血や溶血性黄疸等の病態では間接型ビリルビン量が増大し、閉塞性黄疸等の病態では直接型ビリルビン量が増大することが知られており、臨床診断上ビリルビンの分別定量は重要である。
臨床検査においてビリルビンを測定する試薬としては総ビリルビン測定用試薬と直接型ビリルビン測定試薬が知られている。
ビリルビンオキシダーゼを用いる酵素法でビリルビンを測定する際に該酵素反応を促進する方法として、界面活性剤、芳香族カルボン酸、サルファ剤およびプロテアーゼよりなる群から選ばれる１種または２種以上の反応促進物質を用いる方法(特公平３−３６５２０)、フェリシアン化カリウムを配合する方法(特公平３−７９９９８)、フェノール類およびアニリン類の１種または２種以上の化合物により促進させる方法(特開平３−１７５９９７、特開平３−１７５９９８)、等が知られている。しかし、これらの方法を用いてもｐＨが酸性域では反応促進効果は不十分で、また、フェリシアン化カリウムを用いて十分に反応を促進させようとした場合にはフェリシアン化カリウムの添加量が多くなり、有害物質の排出基準を越えてしまう欠点がある。
【０００３】
またビリルビンオキシダーゼを用いた酵素法で直接型ビリルビンを測定する方法としては、ｐＨ３.５〜４.５の緩衝液にビリルビンオキシダーゼを配合し測定する方法(特公昭６１−４４０００)、ビリルビンオキシダーゼおよび陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ５〜６の酸性緩衝液からなる試薬を作用させて測定する方法(特公平５−９０６６)、ｐＨ９乃至１１の範囲の緩衝液中でビリルビンを含有する試料に陰イオン界面活性剤の共存下でビリルビンオキシダーゼを作用させる方法(特公平５−６８２４０)、ｐＨ２.０乃至３.３のフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムを含む緩衝液中で測定する方法(特開昭６４−５４９９)、ビリルビンオキシダーゼを反応させてビリルビンの変化を光学的に測定する直接型ビリルビン測定用試薬において、フッ素化合物または還元剤を共存させ測定する方法(特開平５−２７６９９２)、等が知られている。しかし、これらの測定法には直接型ビリルビンに対する反応を十分にした場合、一部の間接型ビリルビンに対しても反応してしまうという問題や、分別性が十分得られる条件にした場合直接型ビリルビンに対する反応性が悪くなる等の問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ビリルビンオキシダーゼを作用させて総ビリルビンおよび直接型ビリルビンを光学的に測定する際、上述のような欠点のないより改良された測定用試薬および測定方法の開発が望まれており、とくにビリルビンオキシダーゼの必要量を少なくでき、コストが低減された測定試薬および測定方法、さらに、直接型ビリルビンのみを正確に定量する試薬および方法の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる要望に答える改良されたビリルビン測定用試薬および測定方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、ビリルビンオキシダーゼを作用させてビリルビンを測定する試薬にフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物を添加することにより、ビリルビンオキシダーゼの反応性がはるかに強くなることを見いだし、さらに、間接型ビリルビンに対する反応抑制作用を有するキレート剤の１種または２種以上を添加することにより直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応のみを抑制することができることを見いだし、さらに、かかるキレート剤の１種または２種以上を添加した試薬に該キレート剤の間接型ビリルビンに対する反応抑制作用を強める作用を有する金属イオンおよび金属錯体(以下、単に金属イオン類と称することがある)の１種または２種以上を併用し添加することにより、間接型ビリルビンに対する反応抑制作用が強くなることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
(１) ビリルビンオキシダーゼを用いる総ビリルビン測定試薬において、反応促進剤として、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物を配合することを特徴とする総ビリルビン測定用試薬、
(２) ビリルビンオキシダーゼを用いる直接型ビリルビン測定試薬において、反応促進剤として、該熟成物、およびキレート剤の１種または２種以上を配合することを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬、
(３) 該熟成物、キレート剤に加えて、さらに金属イオンおよび金属錯体から選ばれる１種または２種以上を配合することを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬、
ならびに、これらの試薬を用いた総ビリルビン測定方法および直接型ビリルビン測定方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼを作用させて総ビリルビンおよび直接型ビリルビンを光学的に測定する際、特定の熟成物の存在下に測定することを特徴とし、さらに、熟成物とキレート剤の存在下に直接型ビリルビンを測定すること、および、熟成物とキレート剤に加えて金属イオン類の存在下に直接型ビリルビンを測定することを特徴とし、反応のｐＨは総ビリルビンでは通常６.０〜９.０、好ましくは７.０〜８.０とし、直接型ビリルビンは通常３.０から５.０、好ましくは３.５〜４.５、さらに好ましくは３.５から４.０とする。
【０００８】
本発明で用いるチオール化合物としてはＬ−システイン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＤＬ−ホモシステイン、還元型グルタチオン、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、２−メルカプトベンズイミダゾール等、スルフィド化合物としてはＬ−メチオニン、Ｌ−エチオニン、３−メチルチオプロピオン酸、２−(エチルチオ)エタノール等、スルホキシド化合物としてはジメチルスルホキシド、テトラメチレンスルホキシド等、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体としてはチオ尿素、チオシナミン等が挙げられる。これらチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体(以下、単にチオ化合物類と称す)は、単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて使用出来る。これらのうちＬ−システイン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＤＬ−ホモシステイン、ジチオエリスリトール、グルタチオン還元型、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムは効果が大きく、この中でも還元性の弱いＬ−メチオニンは多量に入れてもビリルビンオキシダーゼの活性を阻害しないので特に好ましい。
【０００９】
これらチオ化合物類の添加量は、十分に反応促進効果が得られる量であり、また、ビリルビンオキシダーゼの活性を阻害しない量であれば特に限定するものではなく、一般に反応液中の最終濃度が１μＭ以上であれば、所望の効果が得られる。また、通常使用する濃度としては、最終濃度として１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、２μＭ〜１０ｍＭ、さらに好ましくは５μＭ〜１ｍＭである。
【００１０】
本発明で用いるキレート剤としては、ニトリロトリス(メチレンホスホン酸)三ナトリウム塩(以下ＮＴＰＯと称す)、ジアミノプロパノール四酢酸(以下ＤＰＴＡ−ＯＨと称す)、ジエチレントリアミン五酢酸(以下ＤＴＰＡと称す)、エチレンジアミン二プロピオン酸塩(以下ＥＤＤＰと称す)、エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ´−ビス(メチレンホスホン酸)・1/2Ｈ2Ｏ(以下ＥＤＤＰＯと称す)、エチレンジアミンテトラキス(メチレンホスホン酸)(以下ＥＤＴＰＯと称す)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(以下ＧＥＤＴＡと称す)、ビス(２−ヒドロキシベンジル)エチレンジアミン二酢酸(以下ＨＢＥＤと称す)、ヘキサメチレンジアミン四酢酸(以下ＨＤＴＡと称す)、ニトリロ三酢酸(以下ＮＴＡと称す)、トリエチレンテトラミン六酢酸(以下ＴＴＨＡと称す)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム銅(II)(以下ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕと称す)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム亜鉛(II)(以下ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｚｎと称す)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムニッケル(II)(以下ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｎｉと称す)等が挙げられる。また、これらキレート剤は単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて使用できる。これらの中でもＮＴＰＯ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＰＯ、ＨＢＥＤ、ＴＴＨＡは効果が大きく、好ましいキレート剤であり、また、これらのうちＮＴＰＯが特に好ましい。
【００１１】
これらキレート剤の添加量は、間接型ビリルビンの反応抑制効果が十分に得られ、直接型ビリルビンの反応に影響を与えない量であれば特に限定するものではなく、本発明のキレート剤を単独で用いる場合、反応液中の最終濃度が５ｍＭ以上であれば、所望の効果が得られる。通常使用する濃度としては、最終濃度として１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭである。また、キレート剤を金属イオン類と組み合わせて用いると、キレート剤による間接型ビリルビンの反応抑制効果は数段に強くなる。したがって、該併用の場合には、キレート剤の反応液中の最終濃度が１ｍＭ以上であれば所望の効果が得られ、通常使用する濃度としては、最終濃度として１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜２５ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭ〜１５ｍＭである。
【００１２】
本発明で用いる金属イオン類としては、二価のマンガンイオン(硫酸マンガン(II)、塩化マンガン(II)、マンガン(II)アセチルアセトネート、酢酸マンガン(II)、ホウ酸マンガン(II)、炭酸マンガン(II)等)、三価のマンガンイオン(マンガン(III)アセチルアセトネート、酢酸マンガン(III)等)、二価の銅イオン(硫酸銅、酢酸銅、銅(II)アセチルアセトネート等)、二価の鉄イオン(硫酸第一鉄、リン酸第一鉄、塩化第一鉄等)等の金属イオン、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムマンガン(II)(以下、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎと称す)またはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム銅(II)(以下、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕと称す)等の金属錯体が挙げられる。また、本発明の金属イオン類は単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて使用出来る。これらのうち二価のマンガンが特に好ましく、硫酸マンガン、塩化マンガン、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎなどを用いるのが好ましい。
金属イオン類の添加量は、本発明のキレート剤と組み合わせた場合に間接型ビリルビンに対する反応抑制効果が十分に得られ、直接型ビリルビンに対する反応に影響を与えない量であれば特に限定するものではなく、一般に反応液中の最終濃度が０.２５ｍＭ以上であれば所望の効果が得られる。通常使用する濃度としては、最終濃度として０.２５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ、さらに好ましくは５〜１５ｍＭである。
【００１３】
ビリルビンオキシダーゼとしては公知の酵素がいずれも用いられ、例えば、ミロセシウム(Myrothecium)属由来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachydermatsumodae)の産生するビリルビンオキシダーゼ等が挙げられる。ビリルビンオキシダーゼの使用量は所望の酵素活性を示す範囲で適宣用いられるが、通常、反応液中に０.０４〜１０単位／ml、好ましくは、直接型ビリルビン測定用には、０.１〜８単位／mlの範囲で用いられる。
【００１４】
本発明の直接型ビリルビン測定用試薬を用いると、熟成物の存在下に本発明のキレート剤を５ｍＭ以上添加することにより直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応のみを抑制することができる。キレート剤の濃度は実用に際してビリルビンオキシダーゼの作用を阻害しない範囲であれば特に規定されるものではない。また、本発明のキレート剤を添加した直接型ビリルビン測定用試薬に金属イオン類を０.２５ｍＭ以上共存させることにより間接型ビリルビンの反応抑制効果は数段に強くなり、本発明のキレート剤の必要量を少なくすることができる。
【００１５】
本発明において、ビリルビンオキシダーゼによる酵素反応を促進させるために用いられるフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類とは、単に両者が存在すれば足りるものではなく、両者を予め熟成させておく必要がある。熟成とは、調製物質同士を適当な状態、好ましくは溶液下に混合し、一定のｐＨ、温度のもとで、適度な時間放置することによって、その間にゆっくりと物理的または化学的反応を行なわせ、目的の酵素の反応性を促進するという性状を得ることである。
本発明においては、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類とから調製される熟成物を用いることにより、それら両化合物を試薬使用時に単に混合して配合した場合や、キット試薬において、別々に調製したものを用時配合した場合などに比べて、後記実施例にも示されるように、より強いビリルビンオキシダーゼの反応促進効果が達成される。
【００１６】
このような熟成物を調製するには、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類から選ばれる１種または２種以上をそれぞれ適切な濃度になるように精製水で溶かし、乳酸、塩酸、リン酸、硫酸等のｐＨ調整剤を用いてｐＨを２.０〜５.５、好ましくはｐＨ３.０〜４.５、さらに好ましくはｐＨ３.７に調整し、適度な温度で、通常５℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜３７℃、さらに好ましくは２５℃〜３０℃で、適度な時間、通常１日以上、好ましくは２〜３０日間、さらに好ましくは４〜１４日間放置することにより得られる。また、総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬において熟成物は、反応のｐＨを調製する第一試薬(緩衝液)とビリルビンオキシダーゼを含有する第二試薬(酵素試薬)とを有する二試薬系の測定試薬に適用した場合、第一試薬と第二試薬のどちらに添加しても効果は得られる。
なお、本発明の熟成物は、予め調製したものを試薬系に配合するのが一般的であるが、試薬系で調製してもよい。例えば、キット試薬において、上記の反応条件を満たすような第一試薬(緩衝液)中にフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類の１種または２種以上を配合し、その試薬系で保存中に熟成物を生成させてもよい。
【００１７】
本発明の方法において、直接型ビリルビン測定用試薬の調製に用いる本発明のキレート剤や金属イオン類は、第一試薬と第二試薬とを有する二試薬系の測定試薬に適用した場合、第一試薬と第二試薬のどちらに添加しても効果は得られる。かくして、本発明の総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬は、所望の成分を、所望の量で混合、溶解等するごとき常法により粉末等の固形状、液状等の試薬とすることができる。また、これらを個別の剤型にして組み合わせたキットとすることもできる。また、必要により、本発明の総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬には、緩衝剤や防腐剤、界面活性剤、等の他の成分を適宣添加ないしは組み合わせてもよい。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例における本発明の効果を調べるために使用した処方(総ビリルビン測定用基本処方、直接型ビリルビン測定用基本処方)およびビリルビンの測定条件を次に示す。
【００１９】
基本処方
総ビリルビン測定用基本処方：
総ビリルビン測定用第一試薬としては１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)にトリトンＸ−１００ ０.０５％、コール酸ナトリウム１３.９ｍＭを添加したものを用い、総ビリルビン測定用第二試薬としては１０ｍＭビシン緩衝剤(ｐＨ１０.０)にビリルビンオキシダーゼ(ミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１由来、天野製薬社製)０.５ Ｕ／ｍｌを添加したものを用いた。
【００２０】
直接型ビリルビン測定用基本処方：
直接型ビリルビン測定用第一試薬としては４００ｍＭクエン酸−乳酸緩衝液(ｐＨ３.７)にトリトン Ｘ−１００ ０.０５ ％を添加しているものを用い、直接型ビリルビン測定用第二試薬としては１０ｍＭビシン緩衝剤(ｐＨ１０.０)にビリルビンオキシダーゼ(ミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１由来、天野製薬社製)１ Ｕ／ｍｌを添加したものを用いた。
【００２１】
測定法
ビリルビン検体１０μｌに第一試薬２７０μｌを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬９０μｌを加えて５分間インキュベートする。この時の第一試薬添加５分後と第二試薬添加２.５分後または５分後における吸光度の変化(主波長４５０ｎｍ／副波長６００ｎｍ)を測定し、予め測定しておいた該値のビリルビンの標準血清の吸光度の変化と対比させビリルビンの濃度を測定した。
【００２２】
実施例１
熟成物によるビリルビンオキシダーゼの反応促進効果：
直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭとチオ化合物類５０μＭを含有するように調整し、ｐＨ３.７で３０℃５日間(チオ化合物としてＤＬ−ホモシステインを用いる場合は７日間)熟成させた試薬を使用し、上記測定方法によりビリルビンの高値の検体を測定した。その吸光度変化を直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭのみを添加して上記熟成条件で処理した試薬を対照として比較した。その結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
効果の有無の判定は第一試薬添加５分後から第二試薬添加２.５分後までにおける吸光度の変化(主波長４５０ｎｍ／副波長６００ｎｍ)が対照と比較して明らかに大きくなっているものを効果のあるものと判定した。(表の吸光度変化が対照と比較して大きくなった場合に反応は促進されたと判定する)
表１に示すごとく、フェロシアン化カリウムとチオ化合物類を混合して熟成したもので反応促進効果があることが認められた。
【００２５】
また、直接型ビリルビン測定用基本処方(フェロ，メチオニン無添加)と、直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加した熟成前の試薬(フェロ，メチオニン熟成前)と直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬(フェロ，メチオニン熟成後)とで反応性を比較した結果を図１に示す。この図１よりフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを直接型ビリルビン測定用第一試薬に溶解しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた場合に、明らかに反応が促進されていることがわかる。
【００２６】
また、総ビリルビン測定用基本処方(フェロ，メチオニン無添加)と、総ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加した熟成前の試薬(フェロ，メチオニン熟成前)と総ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬(フェロ，メチオニン熟成後)とで反応性を比較した結果を図２に示す。この図２よりフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを総ビリルビン測定用第一試薬に溶解しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた場合、明らかに反応が促進されていることがわかる。
【００２７】
実施例２
熟成物によりビリルビンオキシダーゼの反応を促進させた場合にキレート剤を添加した時の間接型ビリルビンに対する反応抑制効果：
直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭとＬ−メチオニン５０μＭを添加し、ｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬に、キレート剤を５０ｍＭ含有するように調製し、キレート剤による間接型ビリルビンに対する反応抑制効果を上記測定方法により測定し比較した。その結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】
効果の有無の判定は直接型ビリルビンに対する反応には影響を与えず、間接型ビリルビンに対する反応のみ抑制するものを効果のあるものと判定した。(表の吸光度変化が対照と比較して半分以下になった場合に反応は抑制されたと判定する)
表２に示すごとく、キレート剤の中でもＮＴＰＯ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＰＯ、ＧＥＤＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＤＴＡ、ＮＴＡ、ＴＴＨＡ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｚｎ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｎｉ等で直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応を抑制する効果があることが認められた。特にＮＴＰＯの効果が顕著であった。
【００３０】
実施例３
熟成物によりビリルビンオキシダーゼの反応を促進させ、それに本発明のキレート剤を添加して間接型ビリルビンの反応を抑制した場合における、金属イオン類を添加することによる間接型ビリルビンの反応抑制効果の向上：
直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム２５μＭとＬ−メチオニン５０μＭを溶解しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬に、キレート剤としてＮＴＰＯを５０ｍＭ含有するように調製し、それに各金属イオンおよび金属錯体を５ｍＭ含有するように添加して、間接型ビリルビンの反応抑制効果を上記測定方法により測定し比較した。その結果を表３に示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】
効果の有無の判定は、直接型ビリルビンに対する反応には影響を与えず、間接型ビリルビンに対する反応のみ抑制するものを効果のあるものと判定した。(表の吸光度変化が対照と比較して小さくなった場合に反応は抑制されたと判定する)
表３に示すごとく、マンガンイオン、銅イオン、鉄イオン等で直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応を抑制する効果を促進する効果があることが認められた。特にマンガンイオンの効果が顕著であった。
【００３３】
実施例４
ジアゾ法(別法)による直接型ビリルビン測定用試薬(ジアゾ法)と、直接型ビリルビン測定用基本処方にフェロシアン化カリウム５μＭとメチオニン５０μＭとをｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬にＮＴＰＯ １０ｍＭを添加し、さらにＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎ ５ｍＭを添加した処方(本法)との相関関係を図３に示す。この図３より、本法はジアゾ法と良い相関関係が得られることが示される。
【００３４】
実施例５
直接型ビリルビン測定用基本処方にフェロシアン化カリウム５μＭとメチオニン５０μＭを添加しｐＨ３.７で３０℃、５日間熟成し、さらにＮＴＰＯ １０ｍＭおよびＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎ ５ｍＭを添加した第一試薬を７℃で保存し、その安定性を調べた。下記コントロール血清（血清１，２，３）に、調製時の第一試薬またはそれを７℃で４カ月または７カ月保存したものを添加し、その５分後と第二試薬（ビリルビンオキシダーゼ含有試薬）添加５分後の吸光度変化を測定した。
コントロール血清
血清１：国際試薬(株)製 ビリトロール Ｌot.３３００
血清２：国際試薬(株)製 ビリトロール Ｌot.４１１２
血清３：三光純薬(株)製 ＥＸＡ ビリルビン Ｌot.３７０１１
その結果を表４に示す。表中の値は第一試薬添加５分後と第二試薬添加５分後における吸光度変化を示す。この表より７℃で４カ月および７カ月保存した試薬においても調製時とほぼ同じ吸光度変化が得られることから、本法を用いた試薬は溶液状態で７カ月間安定であることがわかる。
【００３５】
【表４】
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、ビリルビンオキシダーゼを用いて総ビリルビンおよび直接型ビリルビンを光学的に測定する際、熟成物の存在下に測定することによりビリルビンオキシダーゼの必要量を少なくすることでき、さらに、総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬のコストを低減することができる。また、熟成物とキレート剤の１種または２種以上の存在下で直接型ビリルビンのみを測定することができる。さらに、熟成物とキレート剤の１種または２種以上との存在下に直接型ビリルビンを測定する際、金属イオン類の１種または２種以上を存在させることにより、キレート剤の必要量を少なくすることができ、さらに直接型ビリルビン測定用試薬のコストを低減することができる。また、本発明の熟成物、キレート剤、および金属イオン類は液状にしても安定なものなので、総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬の液状試薬に有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 直接型ビリルビンの測定において、本発明の熟成物によるビリルビンオキシダーゼの反応促進効果を示すための、時間の経過による吸光度変化を示すグラフである。
【図２】 総ビリルビンの測定において、本発明の熟成物によるビリルビンオキシダーゼの反応促進効果を示すための、時間の経過による吸光度変化を示すグラフである。
【図３】 直接型ビリルビン測定法において、本発明方法と従来法のジアゾ法との相関関係を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体中の総ビリルビンおよび直接型ビリルビンの測定用試薬および測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体中のビリルビンは直接型ビリルビンと間接型ビリルビンとに大別され、溶血性貧血や溶血性黄疸等の病態では間接型ビリルビン量が増大し、閉塞性黄疸等の病態では直接型ビリルビン量が増大することが知られており、臨床診断上ビリルビンの分別定量は重要である。
臨床検査においてビリルビンを測定する試薬としては総ビリルビン測定用試薬と直接型ビリルビン測定試薬が知られている。
ビリルビンオキシダーゼを用いる酵素法でビリルビンを測定する際に該酵素反応を促進する方法として、界面活性剤、芳香族カルボン酸、サルファ剤およびプロテアーゼよりなる群から選ばれる１種または２種以上の反応促進物質を用いる方法(特公平３−３６５２０)、フェリシアン化カリウムを配合する方法(特公平３−７９９９８)、フェノール類およびアニリン類の１種または２種以上の化合物により促進させる方法(特開平３−１７５９９７、特開平３−１７５９９８)、等が知られている。しかし、これらの方法を用いてもｐＨが酸性域では反応促進効果は不十分で、また、フェリシアン化カリウムを用いて十分に反応を促進させようとした場合にはフェリシアン化カリウムの添加量が多くなり、有害物質の排出基準を越えてしまう欠点がある。
【０００３】
またビリルビンオキシダーゼを用いた酵素法で直接型ビリルビンを測定する方法としては、ｐＨ３.５〜４.５の緩衝液にビリルビンオキシダーゼを配合し測定する方法(特公昭６１−４４０００)、ビリルビンオキシダーゼおよび陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ５〜６の酸性緩衝液からなる試薬を作用させて測定する方法(特公平５−９０６６)、ｐＨ９乃至１１の範囲の緩衝液中でビリルビンを含有する試料に陰イオン界面活性剤の共存下でビリルビンオキシダーゼを作用させる方法(特公平５−６８２４０)、ｐＨ２.０乃至３.３のフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムを含む緩衝液中で測定する方法(特開昭６４−５４９９)、ビリルビンオキシダーゼを反応させてビリルビンの変化を光学的に測定する直接型ビリルビン測定用試薬において、フッ素化合物または還元剤を共存させ測定する方法(特開平５−２７６９９２)、等が知られている。しかし、これらの測定法には直接型ビリルビンに対する反応を十分にした場合、一部の間接型ビリルビンに対しても反応してしまうという問題や、分別性が十分得られる条件にした場合直接型ビリルビンに対する反応性が悪くなる等の問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ビリルビンオキシダーゼを作用させて総ビリルビンおよび直接型ビリルビンを光学的に測定する際、上述のような欠点のないより改良された測定用試薬および測定方法の開発が望まれており、とくにビリルビンオキシダーゼの必要量を少なくでき、コストが低減された測定試薬および測定方法、さらに、直接型ビリルビンのみを正確に定量する試薬および方法の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる要望に答える改良されたビリルビン測定用試薬および測定方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、ビリルビンオキシダーゼを作用させてビリルビンを測定する試薬にフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物を添加することにより、ビリルビンオキシダーゼの反応性がはるかに強くなることを見いだし、さらに、間接型ビリルビンに対する反応抑制作用を有するキレート剤の１種または２種以上を添加することにより直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応のみを抑制することができることを見いだし、さらに、かかるキレート剤の１種または２種以上を添加した試薬に該キレート剤の間接型ビリルビンに対する反応抑制作用を強める作用を有する金属イオンおよび金属錯体(以下、単に金属イオン類と称することがある)の１種または２種以上を併用し添加することにより、間接型ビリルビンに対する反応抑制作用が強くなることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
(１) ビリルビンオキシダーゼを用いる総ビリルビン測定試薬において、反応促進剤として、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物を配合することを特徴とする総ビリルビン測定用試薬、
(２) ビリルビンオキシダーゼを用いる直接型ビリルビン測定試薬において、反応促進剤として、該熟成物、およびキレート剤の１種または２種以上を配合することを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬、
(３) 該熟成物、キレート剤に加えて、さらに金属イオンおよび金属錯体から選ばれる１種または２種以上を配合することを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬、
ならびに、これらの試薬を用いた総ビリルビン測定方法および直接型ビリルビン測定方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼを作用させて総ビリルビンおよび直接型ビリルビンを光学的に測定する際、特定の熟成物の存在下に測定することを特徴とし、さらに、熟成物とキレート剤の存在下に直接型ビリルビンを測定すること、および、熟成物とキレート剤に加えて金属イオン類の存在下に直接型ビリルビンを測定することを特徴とし、反応のｐＨは総ビリルビンでは通常６.０〜９.０、好ましくは７.０〜８.０とし、直接型ビリルビンは通常３.０から５.０、好ましくは３.５〜４.５、さらに好ましくは３.５から４.０とする。
【０００８】
本発明で用いるチオール化合物としてはＬ−システイン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＤＬ−ホモシステイン、還元型グルタチオン、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、２−メルカプトベンズイミダゾール等、スルフィド化合物としてはＬ−メチオニン、Ｌ−エチオニン、３−メチルチオプロピオン酸、２−(エチルチオ)エタノール等、スルホキシド化合物としてはジメチルスルホキシド、テトラメチレンスルホキシド等、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体としてはチオ尿素、チオシナミン等が挙げられる。これらチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体(以下、単にチオ化合物類と称す)は、単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて使用出来る。これらのうちＬ−システイン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＤＬ−ホモシステイン、ジチオエリスリトール、グルタチオン還元型、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムは効果が大きく、この中でも還元性の弱いＬ−メチオニンは多量に入れてもビリルビンオキシダーゼの活性を阻害しないので特に好ましい。
【０００９】
これらチオ化合物類の添加量は、十分に反応促進効果が得られる量であり、また、ビリルビンオキシダーゼの活性を阻害しない量であれば特に限定するものではなく、一般に反応液中の最終濃度が１μＭ以上であれば、所望の効果が得られる。また、通常使用する濃度としては、最終濃度として１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、２μＭ〜１０ｍＭ、さらに好ましくは５μＭ〜１ｍＭである。
【００１０】
本発明で用いるキレート剤としては、ニトリロトリス(メチレンホスホン酸)三ナトリウム塩(以下ＮＴＰＯと称す)、ジアミノプロパノール四酢酸(以下ＤＰＴＡ−ＯＨと称す)、ジエチレントリアミン五酢酸(以下ＤＴＰＡと称す)、エチレンジアミン二プロピオン酸塩(以下ＥＤＤＰと称す)、エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ´−ビス(メチレンホスホン酸)・1/2Ｈ2Ｏ(以下ＥＤＤＰＯと称す)、エチレンジアミンテトラキス(メチレンホスホン酸)(以下ＥＤＴＰＯと称す)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(以下ＧＥＤＴＡと称す)、ビス(２−ヒドロキシベンジル)エチレンジアミン二酢酸(以下ＨＢＥＤと称す)、ヘキサメチレンジアミン四酢酸(以下ＨＤＴＡと称す)、ニトリロ三酢酸(以下ＮＴＡと称す)、トリエチレンテトラミン六酢酸(以下ＴＴＨＡと称す)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム銅(II)(以下ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕと称す)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム亜鉛(II)(以下ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｚｎと称す)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムニッケル(II)(以下ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｎｉと称す)等が挙げられる。また、これらキレート剤は単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて使用できる。これらの中でもＮＴＰＯ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＰＯ、ＨＢＥＤ、ＴＴＨＡは効果が大きく、好ましいキレート剤であり、また、これらのうちＮＴＰＯが特に好ましい。
【００１１】
これらキレート剤の添加量は、間接型ビリルビンの反応抑制効果が十分に得られ、直接型ビリルビンの反応に影響を与えない量であれば特に限定するものではなく、本発明のキレート剤を単独で用いる場合、反応液中の最終濃度が５ｍＭ以上であれば、所望の効果が得られる。通常使用する濃度としては、最終濃度として１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜２００ｍＭ、さらに好ましくは５０ｍＭ〜１００ｍＭである。また、キレート剤を金属イオン類と組み合わせて用いると、キレート剤による間接型ビリルビンの反応抑制効果は数段に強くなる。したがって、該併用の場合には、キレート剤の反応液中の最終濃度が１ｍＭ以上であれば所望の効果が得られ、通常使用する濃度としては、最終濃度として１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜２５ｍＭ、さらに好ましくは５ｍＭ〜１５ｍＭである。
【００１２】
本発明で用いる金属イオン類としては、二価のマンガンイオン(硫酸マンガン(II)、塩化マンガン(II)、マンガン(II)アセチルアセトネート、酢酸マンガン(II)、ホウ酸マンガン(II)、炭酸マンガン(II)等)、三価のマンガンイオン(マンガン(III)アセチルアセトネート、酢酸マンガン(III)等)、二価の銅イオン(硫酸銅、酢酸銅、銅(II)アセチルアセトネート等)、二価の鉄イオン(硫酸第一鉄、リン酸第一鉄、塩化第一鉄等)等の金属イオン、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムマンガン(II)(以下、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎと称す)またはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム銅(II)(以下、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕと称す)等の金属錯体が挙げられる。また、本発明の金属イオン類は単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて使用出来る。これらのうち二価のマンガンが特に好ましく、硫酸マンガン、塩化マンガン、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎなどを用いるのが好ましい。
金属イオン類の添加量は、本発明のキレート剤と組み合わせた場合に間接型ビリルビンに対する反応抑制効果が十分に得られ、直接型ビリルビンに対する反応に影響を与えない量であれば特に限定するものではなく、一般に反応液中の最終濃度が０.２５ｍＭ以上であれば所望の効果が得られる。通常使用する濃度としては、最終濃度として０.２５〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭ、さらに好ましくは５〜１５ｍＭである。
【００１３】
ビリルビンオキシダーゼとしては公知の酵素がいずれも用いられ、例えば、ミロセシウム(Myrothecium)属由来ビリルビンオキシダーゼ、エビタケ(Trachydermatsumodae)の産生するビリルビンオキシダーゼ等が挙げられる。ビリルビンオキシダーゼの使用量は所望の酵素活性を示す範囲で適宣用いられるが、通常、反応液中に０.０４〜１０単位／ml、好ましくは、直接型ビリルビン測定用には、０.１〜８単位／mlの範囲で用いられる。
【００１４】
本発明の直接型ビリルビン測定用試薬を用いると、熟成物の存在下に本発明のキレート剤を５ｍＭ以上添加することにより直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応のみを抑制することができる。キレート剤の濃度は実用に際してビリルビンオキシダーゼの作用を阻害しない範囲であれば特に規定されるものではない。また、本発明のキレート剤を添加した直接型ビリルビン測定用試薬に金属イオン類を０.２５ｍＭ以上共存させることにより間接型ビリルビンの反応抑制効果は数段に強くなり、本発明のキレート剤の必要量を少なくすることができる。
【００１５】
本発明において、ビリルビンオキシダーゼによる酵素反応を促進させるために用いられるフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類とは、単に両者が存在すれば足りるものではなく、両者を予め熟成させておく必要がある。熟成とは、調製物質同士を適当な状態、好ましくは溶液下に混合し、一定のｐＨ、温度のもとで、適度な時間放置することによって、その間にゆっくりと物理的または化学的反応を行なわせ、目的の酵素の反応性を促進するという性状を得ることである。
本発明においては、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類とから調製される熟成物を用いることにより、それら両化合物を試薬使用時に単に混合して配合した場合や、キット試薬において、別々に調製したものを用時配合した場合などに比べて、後記実施例にも示されるように、より強いビリルビンオキシダーゼの反応促進効果が達成される。
【００１６】
このような熟成物を調製するには、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類から選ばれる１種または２種以上をそれぞれ適切な濃度になるように精製水で溶かし、乳酸、塩酸、リン酸、硫酸等のｐＨ調整剤を用いてｐＨを２.０〜５.５、好ましくはｐＨ３.０〜４.５、さらに好ましくはｐＨ３.７に調整し、適度な温度で、通常５℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜３７℃、さらに好ましくは２５℃〜３０℃で、適度な時間、通常１日以上、好ましくは２〜３０日間、さらに好ましくは４〜１４日間放置することにより得られる。また、総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬において熟成物は、反応のｐＨを調製する第一試薬(緩衝液)とビリルビンオキシダーゼを含有する第二試薬(酵素試薬)とを有する二試薬系の測定試薬に適用した場合、第一試薬と第二試薬のどちらに添加しても効果は得られる。
なお、本発明の熟成物は、予め調製したものを試薬系に配合するのが一般的であるが、試薬系で調製してもよい。例えば、キット試薬において、上記の反応条件を満たすような第一試薬(緩衝液)中にフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオ化合物類の１種または２種以上を配合し、その試薬系で保存中に熟成物を生成させてもよい。
【００１７】
本発明の方法において、直接型ビリルビン測定用試薬の調製に用いる本発明のキレート剤や金属イオン類は、第一試薬と第二試薬とを有する二試薬系の測定試薬に適用した場合、第一試薬と第二試薬のどちらに添加しても効果は得られる。かくして、本発明の総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬は、所望の成分を、所望の量で混合、溶解等するごとき常法により粉末等の固形状、液状等の試薬とすることができる。また、これらを個別の剤型にして組み合わせたキットとすることもできる。また、必要により、本発明の総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬には、緩衝剤や防腐剤、界面活性剤、等の他の成分を適宣添加ないしは組み合わせてもよい。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例における本発明の効果を調べるために使用した処方(総ビリルビン測定用基本処方、直接型ビリルビン測定用基本処方)およびビリルビンの測定条件を次に示す。
【００１９】
基本処方
総ビリルビン測定用基本処方：
総ビリルビン測定用第一試薬としては１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.２)にトリトンＸ−１００ ０.０５％、コール酸ナトリウム１３.９ｍＭを添加したものを用い、総ビリルビン測定用第二試薬としては１０ｍＭビシン緩衝剤(ｐＨ１０.０)にビリルビンオキシダーゼ(ミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１由来、天野製薬社製)０.５ Ｕ／ｍｌを添加したものを用いた。
【００２０】
直接型ビリルビン測定用基本処方：
直接型ビリルビン測定用第一試薬としては４００ｍＭクエン酸−乳酸緩衝液(ｐＨ３.７)にトリトン Ｘ−１００ ０.０５ ％を添加しているものを用い、直接型ビリルビン測定用第二試薬としては１０ｍＭビシン緩衝剤(ｐＨ１０.０)にビリルビンオキシダーゼ(ミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１由来、天野製薬社製)１ Ｕ／ｍｌを添加したものを用いた。
【００２１】
測定法
ビリルビン検体１０μｌに第一試薬２７０μｌを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、第二試薬９０μｌを加えて５分間インキュベートする。この時の第一試薬添加５分後と第二試薬添加２.５分後または５分後における吸光度の変化(主波長４５０ｎｍ／副波長６００ｎｍ)を測定し、予め測定しておいた該値のビリルビンの標準血清の吸光度の変化と対比させビリルビンの濃度を測定した。
【００２２】
実施例１
熟成物によるビリルビンオキシダーゼの反応促進効果：
直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭとチオ化合物類５０μＭを含有するように調整し、ｐＨ３.７で３０℃５日間(チオ化合物としてＤＬ−ホモシステインを用いる場合は７日間)熟成させた試薬を使用し、上記測定方法によりビリルビンの高値の検体を測定した。その吸光度変化を直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭのみを添加して上記熟成条件で処理した試薬を対照として比較した。その結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
効果の有無の判定は第一試薬添加５分後から第二試薬添加２.５分後までにおける吸光度の変化(主波長４５０ｎｍ／副波長６００ｎｍ)が対照と比較して明らかに大きくなっているものを効果のあるものと判定した。(表の吸光度変化が対照と比較して大きくなった場合に反応は促進されたと判定する)
表１に示すごとく、フェロシアン化カリウムとチオ化合物類を混合して熟成したもので反応促進効果があることが認められた。
【００２５】
また、直接型ビリルビン測定用基本処方(フェロ，メチオニン無添加)と、直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加した熟成前の試薬(フェロ，メチオニン熟成前)と直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬(フェロ，メチオニン熟成後)とで反応性を比較した結果を図１に示す。この図１よりフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを直接型ビリルビン測定用第一試薬に溶解しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた場合に、明らかに反応が促進されていることがわかる。
【００２６】
また、総ビリルビン測定用基本処方(フェロ，メチオニン無添加)と、総ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加した熟成前の試薬(フェロ，メチオニン熟成前)と総ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを添加しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬(フェロ，メチオニン熟成後)とで反応性を比較した結果を図２に示す。この図２よりフェロシアン化カリウム５μＭおよびメチオニン５０μＭを総ビリルビン測定用第一試薬に溶解しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた場合、明らかに反応が促進されていることがわかる。
【００２７】
実施例２
熟成物によりビリルビンオキシダーゼの反応を促進させた場合にキレート剤を添加した時の間接型ビリルビンに対する反応抑制効果：
直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム５μＭとＬ−メチオニン５０μＭを添加し、ｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬に、キレート剤を５０ｍＭ含有するように調製し、キレート剤による間接型ビリルビンに対する反応抑制効果を上記測定方法により測定し比較した。その結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
効果の有無の判定は直接型ビリルビンに対する反応には影響を与えず、間接型ビリルビンに対する反応のみ抑制するものを効果のあるものと判定した。(表の吸光度変化が対照と比較して半分以下になった場合に反応は抑制されたと判定する)
表２に示すごとく、キレート剤の中でもＮＴＰＯ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＤＴＰＡ、ＥＤＤＰ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＰＯ、ＧＥＤＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＤＴＡ、ＮＴＡ、ＴＴＨＡ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｚｎ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｎｉ等で直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応を抑制する効果があることが認められた。特にＮＴＰＯの効果が顕著であった。
【００３０】
実施例３
熟成物によりビリルビンオキシダーゼの反応を促進させ、それに本発明のキレート剤を添加して間接型ビリルビンの反応を抑制した場合における、金属イオン類を添加することによる間接型ビリルビンの反応抑制効果の向上：
直接型ビリルビン測定用第一試薬にフェロシアン化カリウム２５μＭとＬ−メチオニン５０μＭを溶解しｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬に、キレート剤としてＮＴＰＯを５０ｍＭ含有するように調製し、それに各金属イオンおよび金属錯体を５ｍＭ含有するように添加して、間接型ビリルビンの反応抑制効果を上記測定方法により測定し比較した。その結果を表３に示す。
【００３１】
【表３】
効果の有無の判定は、直接型ビリルビンに対する反応には影響を与えず、間接型ビリルビンに対する反応のみ抑制するものを効果のあるものと判定した。(表の吸光度変化が対照と比較して小さくなった場合に反応は抑制されたと判定する)
表３に示すごとく、マンガンイオン、銅イオン、鉄イオン等で直接型ビリルビンに対する反応を抑制することなく間接型ビリルビンに対する反応を抑制する効果を促進する効果があることが認められた。特にマンガンイオンの効果が顕著であった。
【００３３】
実施例４
ジアゾ法(別法)による直接型ビリルビン測定用試薬(ジアゾ法)と、直接型ビリルビン測定用基本処方にフェロシアン化カリウム５μＭとメチオニン５０μＭとをｐＨ３.７で３０℃５日間熟成させた試薬にＮＴＰＯ １０ｍＭを添加し、さらにＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎ ５ｍＭを添加した処方(本法)との相関関係を図３に示す。この図３より、本法はジアゾ法と良い相関関係が得られることが示される。
【００３４】
実施例５
直接型ビリルビン測定用基本処方にフェロシアン化カリウム５μＭとメチオニン５０μＭを添加しｐＨ３.７で３０℃、５日間熟成し、さらにＮＴＰＯ １０ｍＭおよびＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎ ５ｍＭを添加した第一試薬を７℃で保存し、その安定性を調べた。下記コントロール血清（血清１，２，３）に、調製時の第一試薬またはそれを７℃で４カ月または７カ月保存したものを添加し、その５分後と第二試薬（ビリルビンオキシダーゼ含有試薬）添加５分後の吸光度変化を測定した。
コントロール血清
血清１：国際試薬(株)製 ビリトロール Ｌot.３３００
血清２：国際試薬(株)製 ビリトロール Ｌot.４１１２
血清３：三光純薬(株)製 ＥＸＡ ビリルビン Ｌot.３７０１１
その結果を表４に示す。表中の値は第一試薬添加５分後と第二試薬添加５分後における吸光度変化を示す。この表より７℃で４カ月および７カ月保存した試薬においても調製時とほぼ同じ吸光度変化が得られることから、本法を用いた試薬は溶液状態で７カ月間安定であることがわかる。
【００３５】
【表４】
【発明の効果】
本発明によれば、ビリルビンオキシダーゼを用いて総ビリルビンおよび直接型ビリルビンを光学的に測定する際、熟成物の存在下に測定することによりビリルビンオキシダーゼの必要量を少なくすることでき、さらに、総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬のコストを低減することができる。また、熟成物とキレート剤の１種または２種以上の存在下で直接型ビリルビンのみを測定することができる。さらに、熟成物とキレート剤の１種または２種以上との存在下に直接型ビリルビンを測定する際、金属イオン類の１種または２種以上を存在させることにより、キレート剤の必要量を少なくすることができ、さらに直接型ビリルビン測定用試薬のコストを低減することができる。また、本発明の熟成物、キレート剤、および金属イオン類は液状にしても安定なものなので、総ビリルビン測定用試薬および直接型ビリルビン測定用試薬の液状試薬に有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 直接型ビリルビンの測定において、本発明の熟成物によるビリルビンオキシダーゼの反応促進効果を示すための、時間の経過による吸光度変化を示すグラフである。
【図２】 総ビリルビンの測定において、本発明の熟成物によるビリルビンオキシダーゼの反応促進効果を示すための、時間の経過による吸光度変化を示すグラフである。
【図３】 直接型ビリルビン測定法において、本発明方法と従来法のジアゾ法との相関関係を示すグラフである。
Claims (13)
- ビリルビンオキシダーゼを用いる総ビリルビン測定試薬において、反応促進剤として、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物を配合することを特徴とする総ビリルビン測定用試薬。
- ビリルビンオキシダーゼを用いる直接型ビリルビン測定試薬において、反応促進剤として、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物、および間接型ビリルビンに対する反応抑制作用を有するキレート剤の１種または２種以上を配合することを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬。
- チオール化合物がＬ−システイン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、ＤＬ−ホモシステイン、還元型グルタチオン、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムまたは２−メルカプトベンズイミダゾール、スルフィド化合物がＬ−メチオニン、Ｌ−エチオニン、３−メチルチオプロピオン酸または２−(エチルチオ)エタノール、スルホキシド化合物がジメチルスルホキシドまたはテトラメチレンスルホキシド、チオ尿素の誘導体がチオシナミンである請求項１または２に記載の試薬。
- 該熟成物がフェロシアン化カリウムとメチオニンとの熟成物である請求項１に記載の試薬。
- 該試薬が溶液状態である請求項４に記載の試薬。
- 該キレート剤がニトリロトリス(メチレンホスホン酸)三ナトリウム塩(ＮＴＰＯ)、ジアミノプロパノール四酢酸(ＤＰＴＡ−ＯＨ)、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、エチレンジアミン二プロピオン酸塩(ＥＤＤＰ)、エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ'−ビス(メチレンホスホン酸)・1/2Ｈ2Ｏ(ＥＤＤＰＯ)、エチレンジアミンテトラキス(メチレンホスホン酸)(ＥＤＴＰＯ)、グリコールエーテルジアミン四酢酸(ＧＥＤＴＡ)、ビス(２−ヒドロキシベンジル)エチレンジアミン二酢酸(ＨＢＥＤ)、ヘキサメチレンジアミン四酢酸(ＨＤＴＡ)、ニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)、トリエチレンテトラミン六酢酸(ＴＴＨＡ)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム銅(II)(ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕ)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム亜鉛(II)(ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｚｎ)またはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムニッケル(II)(ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｎｉ)である請求項２または３に記載の試薬。
- 金属イオンおよび金属錯体から選ばれる１種または２種以上をさらに配合することを特徴とする請求項２，３または６に記載の試薬。
- 該金属イオンが二価のマンガンイオン、三価のマンガンイオン、二価の銅イオンまたは二価の鉄イオン、金属錯体がエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムマンガン(II)(ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎ)またはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム銅(II)(ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｃｕ)である請求項７に記載の試薬。
- 該熟成物がフェロシアン化カリウムとメチオニンの熟成物であり、該キレート剤がニトリロトリス(メチレンホスホン酸)三ナトリウム塩(ＮＴＰＯ)およびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムマンガン(II)(ＥＤＴＡ−２Ｎａ−Ｍｎ)である請求項２に記載の試薬。
- 該試薬が溶液状態であることを特徴とする請求項９に記載の試薬。
- ビリルビンオキシダーゼを用いる総ビリルビン測定方法において、反応促進剤として、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物を添加することを特徴とする総ビリルビン測定方法。
- ビリルビンオキシダーゼを用いる直接型ビリルビン測定方法において、反応促進剤として、フェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムとチオール化合物、スルフィド化合物、スルホキシド化合物、チオ尿素およびチオ尿素の誘導体から選ばれる１種または２種以上との熟成物、および間接型ビリルビンに対する反応抑制作用を有するキレート剤の１種または２種以上を添加することを特徴とする直接型ビリルビン測定方法。
- 金属イオンおよび金属錯体から選ばれる１種または２種以上をさらに添加することを特徴とする請求項１２に記載の測定方法。
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