JP4558119B2 - クレアチンキナーゼ検出用の液状試薬 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、請求項1の上位概念に属する液状試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】
クレアチンキナーゼは、身体において、ホスホクレアチン(クレアチンリン酸)へのクレアチンのATP依存のリン酸化を触媒する(順逆反応)。クレアチンキナーゼは、身体中に、特に、脳、心筋及び骨格筋系中に存在する。心筋の高いクレアチンキナーゼ値は、心筋梗塞時に現れ、骨格筋系の高いクレアチンキナーゼ値は、筋疾患(例えば、筋萎縮症)を示唆する。腎不全は、血清中のクレアチンキナーゼ活性の増加を伴う。
【0003】
したがって、クレアチンキナーゼ活性は、重要な臨床検査パラメータであり、ルーチンに測定される。
【0004】
クレアチンキナーゼ活性の通常の検出系は、下記反応式に基づき作用する:
【0005】
この検出時、クレアチンキナーゼ活性は、340nm における吸収測定によってNAD(P)H含量を介して間接的に求める。
【0006】
例えば、上記反応式に基づきクレアチンキナーゼを検出するための従来の液状試薬は、必要な基質、共基質及び酵素を含み、場合によっては更に、例えば、安定化又は殺菌を行う物質、などを含む。多くの場合、貯蔵中に不測な酵素分解反応が進行することのないように、検出反応に必要な試薬は、2つの別個の試薬成分に分割する。検出のため、反応成分を相互に混合して液状試薬(テスト試薬)を形成し、次いで始めて、被検試料のクレアチンキナーゼ活性に依存して検出反応が始まる。
【0007】
上述の検出法は、比較的確実であり、多くのクレアチンキナーゼ活性テストの基礎である。
【0008】
もちろん、クレアチンキナーゼは、例えば、血清中では、比較的急速に不活性となるという問題がある。したがって、上述の種類の液状試薬は、クレアチンキナーゼの活性化剤を含む。活性化剤としては、SH基を含む成分、標準的には、N−アセチルシステイン(以下、NACと略す)を使用する。なぜならば、NACは、凍結乾燥に適するからである。
【0009】
文献では、NACは、もちろん、条件付きで使用される活性化剤として評価されているに過ぎない(Morin,CLINICAL CHEMISTRY, Vol.23,No.9,1997年9月,p1569−1575)。特に、活性化剤としてのNACの効果は、長期間の貯蔵後、阻害剤の形成によって減少することが判明しており、したがって、NACを含む公知の多くの検出系には、NAC安定化のための特殊な物質を添加する。
【0010】
したがって、引用の刊行物には、NACに比して明らかに高い活性化能及び貯蔵安定性が認められる他の活性化剤、特に、チオグリセロールが推奨されている。
【0011】
本出願人の研究において、もちろん、クレアチンキナーゼ検出のための液状試薬におけるチオグリセロールの使用にも、特に、安定性に関して、問題がないわけではないということが判った。
【0012】
したがって、チオグリセロールは、公知の液状試薬に、主として別個に使用される。即ち、例えば、ドイツ特許DE3138602号には、2つの試薬成分を含み、その1つの試薬成分が、本質的に、チオグリセロール・緩衝剤である液状試薬が開示されている。この成分中に、チオグリセロールは、活性化剤として添加されている訳ではない。チオグリセロールを含む試薬成分は、白濁排除のため、本来の分析前に試料に添加する。次いで、透明化試料を、本来の検出試薬を含む第2試薬成分と混合する。
【0013】
WO95/30769には、1つの成分が主成分としてチオグリセロールを含み、活性化溶液として役立つ液状試薬が記載されている。検出に必要な残余の物質は、他の試薬成分に含まれている。上述の液状試薬の場合、チオグリセロールの安定性を改善できる。もちろん、添加成分によって(一般に、公知の液状試薬は、合計3つの別個の成分からなる)、取扱いが困難となる。
【0014】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、活性化剤としてチオグリセロールを含み、長期間安定であり、簡単な作業で各検出を実施できる、冒頭に述べた種類の液状試薬を創成することにある。
【0015】
【課題を解決するための手段】
この課題は、請求項1の特徴記載部分に開示の特徴を有する試薬によって解決される。
【0016】
かくして、下記物質を含む、クレアチンキナーゼ活性の検出のための液状試薬が得られる:グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(以下、G6PDHと略す)、ヘキソキナーゼ、ホスホクレアチン、グルコース、ADP、NAD(P)及びチオグリセロール。この場合、チオグリセロール及び少なくとも1つの他の物質が1つの成分に含まれ、G6PDH及び場合による残余の物質が他の試薬成分に含まれるように、本発明に基づき、物質を2つの別個の試薬成分に分割する。
【0017】
チオグリセロール及び場合による他の慣用の物質、例えば、NAD(P)、グルコース、ヘキソキナーゼ、ADP、AMP又はMGと、G6PDHとを本発明に基づき分離することによって、双方の試薬成分、即ち、液状試薬の貯蔵安定性を総合して有意に向上できるということが判った。
【0018】
本発明の他の実施の形態を従属請求項に示した。
【0019】
【発明の実施の形態】
液状試薬に含まれる少なくとも若干の物質の安定性がpH値に依存するということを考慮して、本発明の他の実施の形態に基づき、試薬成分は、異なるpH値を有する。物質を各成分に対応して分割した場合、かくして、貯蔵安定性が最適化される。
【0020】
この場合、1つの試薬成分は、8.0 から10.0の範囲の弱塩基性pH値(20℃において測定)に調整し、一方、他の試薬成分は、5.5 から7.0 の範囲の弱酸性pH値を有する。本発明の他の実施の形態に基づき、G6PDH及び/又はADPを弱塩基性試薬成分に添加するのが有利である。なぜならば、上記物質は、より高いpH値においてより安定であるからである。
【0021】
試薬成分の混合後に、完成した液状試薬(テスト試薬)のpH値が約6.0 −7.0 、特に、6.5 になるよう、試薬成分のpH値及び混合量比を選択するのが好ましい。
【0022】
これに関連して、1つの試薬成分中に、1つのpK値が8.0 から10.0の範囲のpH値にあり、他のpK値が約5.5 から7.0 の範囲のpH値にある両イオン性緩衝剤(zwitterionischer Puffer )を添加すれば、特に有利である。貯蔵中、上記緩衝剤は、試薬成分を塩基性pH値に調整し、他の試薬成分との混合後、6.0−7.0 、特に、6.5 の所望のpH値に調整する。上述のpH値の範囲にあるpK値を有する両イオン性緩衝剤、例えば、ビス−トリスプロパン緩衝剤を使用すれば、従来の緩衝剤を使用した場合に比して緩衝剤量を減少できる。
【0023】
更に、従来使用のG6PDHは、グルコース及びNAD(P)の存在下で、不測の応答を示すということが判明した。したがって、本発明の有利な実施の形態に基づき、3つの上記物質は、1つの試薬成分に同時には導入しない。
【0024】
他の問題は、チオグリセロールの安定性に関する。チオグリセロールの場合、酵素及びSH結合の安定化に従来使用されているタンパク質、例えば、BSA又はゼラチンは、寧ろ、安定性の低下を招く。したがって、タンパク質の代わりに、補助酵素(ヘキソキナーゼ及びG6PDH)の安定性を保持し、チオグリセロールを分解する成分を含んでいない糖誘導体、例えば、マンニトール又はポリエチレングリコール6000又は登録商品名Synperonic として得られる長鎖アルキル化合物を添加するのが好ましい。
【0025】
更に、グルコースの存在によってヘキソキナーゼが安定化されるということが判明した。したがって、1つの試薬成分中に上記双方の物質を導入するのが好ましい。
【0026】
本発明に係る試薬は、他の物質、例えば、酸化防止剤としてのEDTA,NaN3 及び殺菌添加剤としてのゲンタマイシン・硫酸塩を含むことができる。更に、アデニル酸キナーゼの競合阻害剤として、偽の肯定的な信号の危険性を減少するのに役立つAMP及びAP5 Aを添加できる。更に、ADPと共に前駆錯体を形成し、かくして、クレアチンキナーゼの活性を増大する酢酸マグネシウムを添加できる。
【0027】
チオグリセロールを含まない成分中に、更に、G6PDHの安定化のためのタンパク質、例えば、ゼラチン又はBSAを添加できる。
【0028】
更に、本発明は、チオグリセロールだけの使用に限定されるものではない。更に、他の活性化剤、例えば、冒頭に述べたNACを添加することもできる。
【0029】
本発明に基づき使用できる検出試薬は、例えば、下記組成を有することができる。
【0030】
試薬成分1 成分中の好ましい濃度 可能な濃度範囲
イミダゾール緩衝剤 82 mmol/L 50−150 mmol/L
EDTA 2.5 mmol/L 2−3 mmol/L
グルコース 25 mmol/L 20−50 mmol/L
酢酸マグネシウム 12.5 mmol/L 10−15 mmol/L
AMP 6.5 mmol/L 5−10 mmol/L
AP5 A 0.013 mmol/L 0.01−0.05 mmol/L
NADP 2.5 mmol/L 2−5 mmol/L
NaN3 0.095 %
ゲンタマイシン・硫酸塩 0.005 %
PEG6000 2.0 % 0.5 −5 %
マンニトール 1.0 % 1−5 %
Synperonic 0.1 % 0.05−0.2 %
ヘキソキナーゼ 7.5 kU/L 3−10 kU/L
チオグリセロール 26 mmol/L 20−100 mmol/L
NAC 0.2 mmol/L 0−2.0 mmol/L
pH値は、6.20±0.20(20℃において)に調整する。
【0031】
試薬成分2 成分中の好ましい濃度 可能な濃度範囲
G6P−DH 20 kU/L 10−30 kU/L
ビス−トリスプロパン 70 mmol/L 50−100 mmol/L
CP 50 mmol/L 30−70 mmol/L
ADP 5 mmol/L 3−6 mmol/L
NaN3 0.095 %
ゲンタマイシン・硫酸塩 0.005 %
ゼラチン 0.2 % 0.1 −0.5 %
マンニトール 1 % 1−5 %
Synperonic 0.1 % 0.05−0.2 %
pH値は、9.20±0.20(20℃において)に調整する。
【0032】
試薬成分を、混合割合4+1(4部の試薬成分1+1部の試薬成分2)で、相互に混合して、テスト試薬を形成する。
【0033】
上記データは、本発明に係る試薬の好ましい実施の形態に関する。もちろん、本発明は、より少数の物質又は他の物質、例えば、他の緩衝剤又は安定化剤などを含む他の組成にも及ぶものである。
Claims (7)
- 少なくとも下記物質;即ち、G6PDH、ヘキソキナーゼ、ホスホクレアチン、グルコース、ADP、NAD(P)及びチオグリセロールを含む、クレアチンキナーゼ活性検出用の液状試薬であって、物質が、2つの別個の試薬成分に分割されており、検出のために試薬成分を相互に混合する形式のものにおいて、G6PDHが、弱塩基性のpH値を有する1つの成分中に含まれており、チオグリセロールが、少なくとも1つの他の物質とともに弱酸性又は中性のpH値を有する他の成分に含まれていることを特徴とする試薬。
- 1つの試薬成分が、8.0 から10.0の範囲の弱塩基性のpH値に調整されており、他の成分が、5.5 から7.0 の範囲の弱酸性又は中性のpH値に調整されていることを特徴とする請求項1に係る試薬。
- 成分混合後に、テスト試薬中に6.0 から7.0 の範囲のpH値が生ずるように、試薬成分の混合量比及びpH値が選択されていることを特徴とする請求項2に係る試薬。
- 塩基性試薬成分中には、1つのpK値が8.0 から10.0の範囲のpH値にあり、他のpK値が5.5 から7.0 の範囲のpH値にある両イオン性緩衝剤が含まれていることを特徴とする請求項2又は3に係る試薬。
- G6PDH及びADPが、塩基性pH値を有する成分中に含まれていることを特徴とする請求項2〜4のいずれか1項に係る試薬。
- NAD(P)、グルコース及びG6PDHが、1つの成分中に同時には含まれていないことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に係る試薬。
- グルコース及びヘキソキナーゼが、1つの試薬成分中に含まれていることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に係る試薬。
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