JP2000189195A - クレアチンキナ―ゼ検出用の液状試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 活性化剤としてチオグリセロールを含み、長
期間安定であり、簡単な作業で各検出を実施できる、ク
レアチンキナーゼ活性検出用の液状試薬を提供する。 【解決手段】 試薬を２つの試薬成分に分割し、混合し
て検出に供するようにしたクレアチンキナーゼ活性検出
用液状試薬において、Ｇ６ＰＤＨを１つの成分中に含
み、チオグリセロールを少なくとも１つの他の物質と共
に他の成分に含ませて構成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、請求項１の上位概
念に属する液状試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】クレアチンキナーゼは、身体において、
ホスホクレアチン（クレアチンリン酸）へのクレアチン
のＡＴＰ依存のリン酸化を触媒する（順逆反応）。クレ
アチンキナーゼは、身体中に、特に、脳、心筋及び骨格
筋系中に存在する。心筋の高いクレアチンキナーゼ値
は、心筋梗塞時に現れ、骨格筋系の高いクレアチンキナ
ーゼ値は、筋疾患（例えば、筋萎縮症）を示唆する。腎
不全は、血清中のクレアチンキナーゼ活性の増加を伴
う。

【０００３】したがって、クレアチンキナーゼ活性は、
重要な臨床検査パラメータであり、ルーチンに測定され
る。

【０００４】クレアチンキナーゼ活性の通常の検出系
は、下記反応式に基づき作用する：

【０００５】この検出時、クレアチンキナーゼ活性は、
340nm における吸収測定によってＮＡＤ（Ｐ）Ｈ含量を
介して間接的に求める。

【０００６】例えば、上記反応式に基づきクレアチンキ
ナーゼを検出するための従来の液状試薬は、必要な基
質、共基質及び酵素を含み、場合によっては更に、例え
ば、安定化又は殺菌を行う物質、などを含む。多くの場
合、貯蔵中に不測な酵素分解反応が進行することのない
ように、検出反応に必要な試薬は、２つの別個の試薬成
分に分割する。検出のため、反応成分を相互に混合して
液状試薬（テスト試薬）を形成し、次いで始めて、被検
試料のクレアチンキナーゼ活性に依存して検出反応が始
まる。

【０００７】上述の検出法は、比較的確実であり、多く
のクレアチンキナーゼ活性テストの基礎である。

【０００８】もちろん、クレアチンキナーゼは、例え
ば、血清中では、比較的急速に不活性となるという問題
がある。したがって、上述の種類の液状試薬は、クレア
チンキナーゼの活性化剤を含む。活性化剤としては、Ｓ
Ｈ基を含む成分、標準的には、Ｎ−アセチルシステイン
（以下、ＮＡＣと略す）を使用する。なぜならば、ＮＡ
Ｃは、凍結乾燥に適するからである。

【０００９】文献では、ＮＡＣは、もちろん、条件付き
で使用される活性化剤として評価されているに過ぎない
（Ｍorin，CLINICAL CHEMISTRY, Ｖol．23，Ｎo.９，
1997年９月，ｐ1569−1575）。特に、活性化剤としての
ＮＡＣの効果は、長期間の貯蔵後、阻害剤の形成によっ
て減少することが判明しており、したがって、ＮＡＣを
含む公知の多くの検出系には、ＮＡＣ安定化のための特
殊な物質を添加する。

【００１０】したがって、引用の刊行物には、ＮＡＣに
比して明らかに高い活性化能及び貯蔵安定性が認められ
る他の活性化剤、特に、チオグリセロールが推奨されて
いる。

【００１１】本出願人の研究において、もちろん、クレ
アチンキナーゼ検出のための液状試薬におけるチオグリ
セロールの使用にも、特に、安定性に関して、問題がな
いわけではないということが判った。

【００１２】したがって、チオグリセロールは、公知の
液状試薬に、主として別個に使用される。即ち、例え
ば、ドイツ特許ＤＥ３１３８６０２号には、２つの試薬
成分を含み、その１つの試薬成分が、本質的に、チオグ
リセロール・緩衝剤である液状試薬が開示されている。
この成分中に、チオグリセロールは、活性化剤として添
加されている訳ではない。チオグリセロールを含む試薬
成分は、白濁排除のため、本来の分析前に試料に添加す
る。次いで、透明化試料を、本来の検出試薬を含む第２
試薬成分と混合する。

【００１３】ＷＯ９５／３０７６９には、１つの成分が
主成分としてチオグリセロールを含み、活性化溶液とし
て役立つ液状試薬が記載されている。検出に必要な残余
の物質は、他の試薬成分に含まれている。上述の液状試
薬の場合、チオグリセロールの安定性を改善できる。も
ちろん、添加成分によって（一般に、公知の液状試薬
は、合計３つの別個の成分からなる）、取扱いが困難と
なる。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
課題は、活性化剤としてチオグリセロールを含み、長期
間安定であり、簡単な作業で各検出を実施できる、冒頭
に述べた種類の液状試薬を創成することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】この課題は、請求項１の
特徴記載部分に開示の特徴を有する試薬によって解決さ
れる。

【００１６】かくして、下記物質を含む、クレアチンキ
ナーゼ活性の検出のための液状試薬が得られる：グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｇ６ＰＤＨ
と略す）、ヘキソキナーゼ、ホスホクレアチン、グルコ
ース、ＡＤＰ、ＮＡＤ（Ｐ）及びチオグリセロール。こ
の場合、チオグリセロール及び少なくとも１つの他の物
質が１つの成分に含まれ、Ｇ６ＰＤＨ及び場合による残
余の物質が他の試薬成分に含まれるように、本発明に基
づき、物質を２つの別個の試薬成分に分割する。

【００１７】チオグリセロール及び場合による他の慣用
の物質、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）、グルコース、ヘキソキ
ナーゼ、ＡＤＰ、ＡＭＰ又はＭＧと、Ｇ６ＰＤＨとを本
発明に基づき分離することによって、双方の試薬成分、
即ち、液状試薬の貯蔵安定性を総合して有意に向上でき
るということが判った。

【００１８】本発明の他の実施の形態を従属請求項に示
した。

【００１９】

【発明の実施の形態】液状試薬に含まれる少なくとも若
干の物質の安定性がｐＨ値に依存するということを考慮
して、本発明の他の実施の形態に基づき、試薬成分は、
異なるｐＨ値を有する。物質を各成分に対応して分割し
た場合、かくして、貯蔵安定性が最適化される。

【００２０】この場合、１つの試薬成分は、8.0 から1
0.0の範囲の弱塩基性ｐＨ値（20℃において測定）に調
整し、一方、他の試薬成分は、5.5 から7.0 の範囲の弱
酸性ｐＨ値を有する。本発明の他の実施の形態に基づ
き、Ｇ６ＰＤＨ及び／又はＡＤＰを弱塩基性試薬成分に
添加するのが有利である。なぜならば、上記物質は、よ
り高いｐＨ値においてより安定であるからである。

【００２１】試薬成分の混合後に、完成した液状試薬
（テスト試薬）のｐＨ値が約6.0 −7.0 、特に、6.5 に
なるよう、試薬成分のｐＨ値及び混合量比を選択するの
が好ましい。

【００２２】これに関連して、１つの試薬成分中に、１
つのｐＫ値が8.0 から10.0の範囲のｐＨ値にあり、他の
ｐＫ値が約5.5 から7.0 の範囲のｐＨ値にある両イオン
性緩衝剤（zwitterionischer Puffer ）を添加すれば、
特に有利である。貯蔵中、上記緩衝剤は、試薬成分を塩
基性ｐＨ値に調整し、他の試薬成分との混合後、6.0−
7.0 、特に、6.5 の所望のｐＨ値に調整する。上述のｐ
Ｈ値の範囲にあるｐＫ値を有する両イオン性緩衝剤、例
えば、ビス−トリスプロパン緩衝剤を使用すれば、従来
の緩衝剤を使用した場合に比して緩衝剤量を減少でき
る。

【００２３】更に、従来使用のＧ６ＰＤＨは、グルコー
ス及びＮＡＤ（Ｐ）の存在下で、不測の応答を示すとい
うことが判明した。したがって、本発明の有利な実施の
形態に基づき、３つの上記物質は、１つの試薬成分に同
時には導入しない。

【００２４】他の問題は、チオグリセロールの安定性に
関する。チオグリセロールの場合、酵素及びＳＨ結合の
安定化に従来使用されているタンパク質、例えば、ＢＳ
Ａ又はゼラチンは、寧ろ、安定性の低下を招く。したが
って、タンパク質の代わりに、補助酵素（ヘキソキナー
ゼ及びＧ６ＰＤＨ）の安定性を保持し、チオグリセロー
ルを分解する成分を含んでいない糖誘導体、例えば、マ
ンニトール又はポリエチレングリコール6000又は登録商
品名Ｓynperonic として得られる長鎖アルキル化合物を
添加するのが好ましい。

【００２５】更に、グルコースの存在によってヘキソキ
ナーゼが安定化されるということが判明した。したがっ
て、１つの試薬成分中に上記双方の物質を導入するのが
好ましい。

【００２６】本発明に係る試薬は、他の物質、例えば、
酸化防止剤としてのＥＤＴＡ，ＮａＮ₃ 及び殺菌添加剤
としてのゲンタマイシン・硫酸塩を含むことができる。
更に、アデニル酸キナーゼの競合阻害剤として、偽の肯
定的な信号の危険性を減少するのに役立つＡＭＰ及びＡ
Ｐ₅ Ａを添加できる。更に、ＡＤＰと共に前駆錯体を形
成し、かくして、クレアチンキナーゼの活性を増大する
酢酸マグネシウムを添加できる。

【００２７】チオグリセロールを含まない成分中に、更
に、Ｇ６ＰＤＨの安定化のためのタンパク質、例えば、
ゼラチン又はＢＳＡを添加できる。

【００２８】更に、本発明は、チオグリセロールだけの
使用に限定されるものではない。更に、他の活性化剤、
例えば、冒頭に述べたＮＡＣを添加することもできる。

【００２９】本発明に基づき使用できる検出試薬は、例
えば、下記組成を有することができる。

【００３０】試薬成分１ 成分中の好ましい濃度 可能な濃度範囲 イミダゾール緩衝剤 82 mmol/L 50−150 mmol/L ＥＤＴＡ 2.5 mmol/L ２−３ mmol/L グルコース 25 mmol/L 20−50 mmol/L 酢酸マグネシウム 12.5 mmol/L 10−15 mmol/L ＡＭＰ 6.5 mmol/L ５−10 mmol/L ＡＰ₅ Ａ 0.013 mmol/L 0.01−0.05 mmol/L ＮＡＤＰ 2.5 mmol/L ２−５ mmol/L ＮａＮ₃ 0.095 ％ ゲンタマイシン・硫酸塩 0.005 ％ ＰＥＧ６０００ 2.0 ％ 0.5 −５ ％ マンニトール 1.0 ％ １−５ ％ Ｓynperonic 0.1 ％ 0.05−0.2 ％ ヘキソキナーゼ 7.5 kU/L ３−10 kU/L チオグリセロール 26 mmol/L 20−100 mmol/L ＮＡＣ 0.2 mmol/L ０−2.0 mmol/L ｐＨ値は、6.20±0.20（20℃において）に調整する。

【００３１】試薬成分２ 成分中の好ましい濃度 可能な濃度範囲 Ｇ６Ｐ−ＤＨ 20 kU/L 10−30 kU/L ビス−トリスプロパン 70 mmol/L 50−100 mmol/L ＣＰ 50 mmol/L 30−70 mmol/L ＡＤＰ ５ mmol/L ３−６ mmol/L ＮａＮ₃ 0.095 ％ ゲンタマイシン・硫酸塩 0.005 ％ ゼラチン 0.2 ％ 0.1 −0.5 ％ マンニトール １ ％ １−５ ％ Ｓynperonic 0.1 ％ 0.05−0.2 ％ ｐＨ値は、9.20±0.20（20℃において）に調整する。

【００３２】試薬成分を、混合割合４＋１（４部の試薬
成分１＋１部の試薬成分２）で、相互に混合して、テス
ト試薬を形成する。

【００３３】上記データは、本発明に係る試薬の好まし
い実施の形態に関する。もちろん、本発明は、より少数
の物質又は他の物質、例えば、他の緩衝剤又は安定化剤
などを含む他の組成にも及ぶものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フランク クレツシュマール ドイツ国，01809 ドーナ オーテー ボ ルテン カール−オプ−ベーク 17 (72)発明者 カテイ ライン アイルランド国，クレア州，アイアールエ ル−エニス，ゴート ロード，ローザノア 36

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも下記物質；即ち、Ｇ６ＰＤ
   Ｈ、ヘキソキナーゼ、ホスホクレアチン、グルコース、
   ＡＤＰ、ＮＡＤ（Ｐ）及びチオグリセロールを含む、ク
   レアチンキナーゼ活性検出用の液状試薬であって、物質
   が、２つの別個の試薬成分に分割されており、検出のた
   めに試薬成分を相互に混合する形式のものにおいて、Ｇ
   ６ＰＤＨが、１つの成分中に含まれており、チオグリセ
   ロールが、少なくとも１つの他の物質とともに他の成分
   に含まれていることを特徴とする試薬。
2. 【請求項２】 １つの試薬成分が、5.5 から7.0 の範囲
   の弱酸性のｐＨ値に調整されており、他の成分が、8.0
   から10.0の範囲の弱塩基性のｐＨ値に調整されているこ
   とを特徴とする請求項１に係る試薬。
3. 【請求項３】 成分混合後に、テスト試薬中に6.0 から
   7.0 の範囲、特に、約6.5 のｐＨ値が生ずるように、試
   薬成分の混合量比及びｐＨ値が選択されていることを特
   徴とする請求項２に係る試薬。
4. 【請求項４】 塩基性試薬成分中には、１つのｐＫ値が
   8.0 から10.0の範囲のｐＨ値にあり、他のｐＫ値が5.5
   から7.0 の範囲のｐＨ値にある両イオン性緩衝剤が含ま
   れていることを特徴とする請求項２又は３に係る試薬。
5. 【請求項５】 Ｇ６ＰＤＨ及びＡＤＰが、塩基性ｐＨ値
   を有する成分中に含まれていることを特徴とする請求項
   ２〜４のいずれか１項に係る試薬。
6. 【請求項６】 ＮＡＤ（Ｐ）、グルコース及びＧ６ＰＤ
   Ｈが、１つの成分中に同時には含まれていないことを特
   徴とする請求項１〜５のいずれか１項に係る試薬。
7. 【請求項７】 グルコース及びヘキソキナーゼが、１つ
   の試薬成分中に含まれていることを特徴とする請求項１
   〜６のいずれか１項に係る試薬。