JPH06277097A - 血清中の二酸化炭素の測定のための安定な単一液体試薬 - Google Patents
血清中の二酸化炭素の測定のための安定な単一液体試薬Info
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- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 血清中の二酸化炭素の測定のための安定な単
一液体試薬を提供すること。 【構成】 アルカリ性条件下における血清及び体液中の
二酸化炭素の測定のための、液体の、時間安定な、単一
のアッセイ用試薬であって、下記の水溶液を含む該試薬 （ａ）反応的に安定化したホスホエノールピルベートカ
ルボキシラーゼ及び診断的に有効な量で存在する第１の
診断用基質 （ｂ）診断的に有効な量の第２の基質 （ｃ）第２の基質と生成物との反応により第２の基質の
酸化型を形成する、診断的に有効な量の第２の診断用酵
素、及び （ｄ）少なくとも１種の安定化用酵素及び、第２の基質
の酸化を阻止するのに十分な量であるが、血清中の二酸
化炭素の尺度として第２の基質の酸化型を形成する第２
の基質と生成物との反応において第２の基質の酸化型の
測定を阻害するには不十分な量で存在する該安定化用酵
素の対応する基質（上記の溶液は、約５〜１１のｐＨを
有する）。
一液体試薬を提供すること。 【構成】 アルカリ性条件下における血清及び体液中の
二酸化炭素の測定のための、液体の、時間安定な、単一
のアッセイ用試薬であって、下記の水溶液を含む該試薬 （ａ）反応的に安定化したホスホエノールピルベートカ
ルボキシラーゼ及び診断的に有効な量で存在する第１の
診断用基質 （ｂ）診断的に有効な量の第２の基質 （ｃ）第２の基質と生成物との反応により第２の基質の
酸化型を形成する、診断的に有効な量の第２の診断用酵
素、及び （ｄ）少なくとも１種の安定化用酵素及び、第２の基質
の酸化を阻止するのに十分な量であるが、血清中の二酸
化炭素の尺度として第２の基質の酸化型を形成する第２
の基質と生成物との反応において第２の基質の酸化型の
測定を阻害するには不十分な量で存在する該安定化用酵
素の対応する基質（上記の溶液は、約５〜１１のｐＨを
有する）。
Description
【０００１】
【発明の分野】この発明は、血清及びその他の体液中の
二酸化炭素の測定のための安定な単一試薬に関する。
二酸化炭素の測定のための安定な単一試薬に関する。
【０００２】
【発明の背景】その他の医療用及び研究室用の情報に関
して、血清の全ＣＯ2 の測定は、酸塩基状態の評価に必
要である。高ＣＯ2 含量は、補償呼吸性アシドーシス及
び代謝性アルカローシスにおいて観られる。低ＣＯ2 含
量は、補償呼吸性アルカローシス及び代謝性アシドーシ
スにおいて観られる。
して、血清の全ＣＯ2 の測定は、酸塩基状態の評価に必
要である。高ＣＯ2 含量は、補償呼吸性アシドーシス及
び代謝性アルカローシスにおいて観られる。低ＣＯ2 含
量は、補償呼吸性アルカローシス及び代謝性アシドーシ
スにおいて観られる。
【０００３】血清又は血漿中の全二酸化炭素は、２つの
主要な化学的形態、溶解ＣＯ2 及び重炭酸（ＨＣＯ3 -）
アニオン、で存在する。少ない形態は、炭酸及び炭酸イ
オン及び血漿蛋白質のカルバミノ誘導体である。
主要な化学的形態、溶解ＣＯ2 及び重炭酸（ＨＣＯ3 -）
アニオン、で存在する。少ない形態は、炭酸及び炭酸イ
オン及び血漿蛋白質のカルバミノ誘導体である。
【０００４】化学分析器による全二酸化炭素の測定に用
いる方法は、血清へのアルカリの添加による全二酸化炭
素形態のＨＣＯ3 - への定量的変換を含む。次いで、重
炭酸塩を酵素的にＮＡＤＨ消費にリンクさせ、下記の反
応により分光測光的に定量する：
いる方法は、血清へのアルカリの添加による全二酸化炭
素形態のＨＣＯ3 - への定量的変換を含む。次いで、重
炭酸塩を酵素的にＮＡＤＨ消費にリンクさせ、下記の反
応により分光測光的に定量する：
【化１】 （式中、ＰＥＰＣは、ホスホエノールピルベートカルボ
キシラーゼであり、ＭＤＨは、マレートデヒドロゲナー
ゼである）。３４０ｎｍにおける吸収の減少は、ＣＯ2
の血清中の濃度に関連する。これに関して一層詳しく
は、血清中の二酸化炭素を測定するための種々の他の方
法が、Clinical Chemistry, Kaplan等、TheC. V. Mosby
Company (1984) 1056-58 頁に記載されており、本明
細書中に参考として援用する。
キシラーゼであり、ＭＤＨは、マレートデヒドロゲナー
ゼである）。３４０ｎｍにおける吸収の減少は、ＣＯ2
の血清中の濃度に関連する。これに関して一層詳しく
は、血清中の二酸化炭素を測定するための種々の他の方
法が、Clinical Chemistry, Kaplan等、TheC. V. Mosby
Company (1984) 1056-58 頁に記載されており、本明
細書中に参考として援用する。
【０００５】ＣＯ2 及び他の血清成分の測定のための診
断用試薬は、しばしば、限られた安定性に悩まされた。
一般に、市販品は、少なくとも一部分を凍結乾燥する必
要のある組成物に限られた。一度再構成すると、その試
薬組成物は、２〜１０℃の通常の貯蔵における限られた
安定性及び室温における一層短い安定性しか有しない。
断用試薬は、しばしば、限られた安定性に悩まされた。
一般に、市販品は、少なくとも一部分を凍結乾燥する必
要のある組成物に限られた。一度再構成すると、その試
薬組成物は、２〜１０℃の通常の貯蔵における限られた
安定性及び室温における一層短い安定性しか有しない。
【０００６】ＣＯ2 用試薬について、その不安定性は、
次の２つの主要因子により引き起こされた：ＤＡＤＨの
ＮＡＤへの急速分解及びホスホエノールピルベートカル
ボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）の急速な酵素活性の喪失。
次の２つの主要因子により引き起こされた：ＤＡＤＨの
ＮＡＤへの急速分解及びホスホエノールピルベートカル
ボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）の急速な酵素活性の喪失。
【０００７】Crowther等の米国特許第５，１１６，７２
８号（ここでは、「’７２８」と記す）は、参考とし
て、組み合せたときに血清中の二酸化炭素の検出のため
の診断用試薬を形成する２成分組成物を開示している。
Crowther等は、ＮＡＤＨの分解産物、ＮＡＤをＮＡＤＨ
へ戻すために安定化反応の利用を記載している。これ
は、Modrovich の米国特許第４，３９４，４４９号（こ
こでは、「’４４９」と記す）の特定の応用であり、本
明細書中に参考として援用する。
８号（ここでは、「’７２８」と記す）は、参考とし
て、組み合せたときに血清中の二酸化炭素の検出のため
の診断用試薬を形成する２成分組成物を開示している。
Crowther等は、ＮＡＤＨの分解産物、ＮＡＤをＮＡＤＨ
へ戻すために安定化反応の利用を記載している。これ
は、Modrovich の米国特許第４，３９４，４４９号（こ
こでは、「’４４９」と記す）の特定の応用であり、本
明細書中に参考として援用する。
【０００８】Modrovich の’４４９は、不安定な補酵素
が再生反応により安定化し得ることを教示している。安
定化した補酵素溶液を、再生すべき補酵素を含む水溶液
に再生用酵素を添加することにより調製する。再生用酵
素の添加に加えて、酵素が触媒作用を働かせる基質も又
添加する。再生用酵素及び基質の補酵素溶液又はアッセ
イ系への添加は、補酵素の再生を与え、こうして、結果
として、補酵素の安定化を与える。基質及び酵素との相
互作用において他の補酵素型（即ち、それぞれ、酸化型
又は還元型）を生成する還元又は酸化された型等の補酵
素型も又、補酵素溶液又はアッセイ系に加えてよい。例
えば、補酵素ＮＡＤ又はＮＡＤＨを用いた場合、もしＮ
ＡＤＨを安定化することが望ましいならば、ＮＡＤをそ
の溶液にＮＡＤＨを生成するための適当な酵素及び基質
と共に添加してよい。補酵素変換型の存在は、その存在
により、補酵素が変換又は分解し始めるとすぐにその補
酵素を生成し始めるので、補酵素の再生を助成する。
が再生反応により安定化し得ることを教示している。安
定化した補酵素溶液を、再生すべき補酵素を含む水溶液
に再生用酵素を添加することにより調製する。再生用酵
素の添加に加えて、酵素が触媒作用を働かせる基質も又
添加する。再生用酵素及び基質の補酵素溶液又はアッセ
イ系への添加は、補酵素の再生を与え、こうして、結果
として、補酵素の安定化を与える。基質及び酵素との相
互作用において他の補酵素型（即ち、それぞれ、酸化型
又は還元型）を生成する還元又は酸化された型等の補酵
素型も又、補酵素溶液又はアッセイ系に加えてよい。例
えば、補酵素ＮＡＤ又はＮＡＤＨを用いた場合、もしＮ
ＡＤＨを安定化することが望ましいならば、ＮＡＤをそ
の溶液にＮＡＤＨを生成するための適当な酵素及び基質
と共に添加してよい。補酵素変換型の存在は、その存在
により、補酵素が変換又は分解し始めるとすぐにその補
酵素を生成し始めるので、補酵素の再生を助成する。
【０００９】’７２８特許は、ＣＯ2 の検出のための２
成分試薬系を記載している。第１の成分は、第１の診断
用酵素のための第１の診断用基質、還元型の補酵素、緩
衝液（適宜）、補酵素の酸化型を還元する安定剤酵素、
安定剤酵素の基質、酸化型の補酵素（適宜）、第１又は
第２の診断用酵素の一つの速度制限的量及び他の診断用
酵素の非速度制限的量を含む。第２成分は、２種の診断
用酵素を含む。
成分試薬系を記載している。第１の成分は、第１の診断
用酵素のための第１の診断用基質、還元型の補酵素、緩
衝液（適宜）、補酵素の酸化型を還元する安定剤酵素、
安定剤酵素の基質、酸化型の補酵素（適宜）、第１又は
第２の診断用酵素の一つの速度制限的量及び他の診断用
酵素の非速度制限的量を含む。第２成分は、２種の診断
用酵素を含む。
【００１０】これらの診断用酵素は、マレートデヒドロ
ゲナーゼ（ＭＤＨ）及びホスホエノールピルベートカル
ボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）であることが知られている。
Crowther等の明細書において、ＰＥＰＣが不安定である
のでＭＤＨが速度制限的診断用酵素であることが論じら
れている。
ゲナーゼ（ＭＤＨ）及びホスホエノールピルベートカル
ボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）であることが知られている。
Crowther等の明細書において、ＰＥＰＣが不安定である
のでＭＤＨが速度制限的診断用酵素であることが論じら
れている。
【００１１】本発明の譲受人は、血清及び血漿中の種々
の成分の測定用の液体試薬の利用を長いこと進めてき
た。この探究は、常に、単一試薬を開発し、それは、製
造時に溶液又はエマルジョン中ですべての成分を合わせ
ることが出来、凍結乾燥したアッセイ用成分の場合のよ
うな、使用時にアッセイ溶液を再構成する際及び多成分
組成物の使用の際の誤り（成分を合わせるときに生じ得
る誤り）を除去するものである。これは、製造時に完全
な品質制御を可能とし、使用時にアッセイ用組成物を処
方する際のユーザー側における誤りの可能性を除去又は
最小化する。
の成分の測定用の液体試薬の利用を長いこと進めてき
た。この探究は、常に、単一試薬を開発し、それは、製
造時に溶液又はエマルジョン中ですべての成分を合わせ
ることが出来、凍結乾燥したアッセイ用成分の場合のよ
うな、使用時にアッセイ溶液を再構成する際及び多成分
組成物の使用の際の誤り（成分を合わせるときに生じ得
る誤り）を除去するものである。これは、製造時に完全
な品質制御を可能とし、使用時にアッセイ用組成物を処
方する際のユーザー側における誤りの可能性を除去又は
最小化する。
【００１２】市販可能な単一試薬組成物であるために
は、製造地での貯蔵、世界の任意の地域への発送及び目
的地における使用までの貯蔵を可能にするだけ十分な安
定性並びに使用中の安定性を有していなければならな
い。しばしば、この探究は、２〜１０℃において１２〜
１８か月の最小耐用年数（一般にストレス試験として言
及される加速安定性試験における、４１℃での３日間に
相当）を有する溶液を処方することである。
は、製造地での貯蔵、世界の任意の地域への発送及び目
的地における使用までの貯蔵を可能にするだけ十分な安
定性並びに使用中の安定性を有していなければならな
い。しばしば、この探究は、２〜１０℃において１２〜
１８か月の最小耐用年数（一般にストレス試験として言
及される加速安定性試験における、４１℃での３日間に
相当）を有する溶液を処方することである。
【００１３】単一試薬溶液を形成する能力は又、再構成
された凍結乾燥組成物及び濃縮した多成分系を安定化す
る能力をも増大する。この再構成又は濃縮した多成分系
の安定性を増大する能力は、劣化する前に使用出来ずに
浪費される試薬の量を減少させる。
された凍結乾燥組成物及び濃縮した多成分系を安定化す
る能力をも増大する。この再構成又は濃縮した多成分系
の安定性を増大する能力は、劣化する前に使用出来ずに
浪費される試薬の量を減少させる。
【００１４】それ故、単一の、液体の安定な二酸化炭素
用試薬を供給する必要がある。この試薬系は、多成分試
薬系の必要を排除する。それは又、更にＮＡＤＨを安定
化するために利用すべき速度制限的診断用酵素の必要を
も排除する。
用試薬を供給する必要がある。この試薬系は、多成分試
薬系の必要を排除する。それは又、更にＮＡＤＨを安定
化するために利用すべき速度制限的診断用酵素の必要を
も排除する。
【００１５】
【発明の要約】本発明により、血清中の二酸化炭素の測
定用の安定な単一液体試薬を提供する。この試薬は、反
応的に安定化したホスホエノールピルベートカルボキシ
ラーゼ（ＰＥＰＣ）である第１の酵素、ホスホエノール
ピルベートカルボキシラーゼ用の第１の診断用基質（好
ましくは、ホスホエノールピルベート）、第１の診断反
応の生成物と第２の診断反応のための基質との間の反応
を触媒し得る第２の診断用酵素（好ましくは、マレート
デヒドロゲナーゼ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフェートの還元型（ＮＡＤＰＨ）である第
２の診断用基質、ＮＡＤＨの安定化用の試薬（それら
は、対応する基質の存在下で、酸化型のニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はそのリン酸塩Ｎ
ＡＤＰを、診断反応を有意に妨害することなくＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨを十分に安定化する速度で、還元型ＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換し得る少なくとも１つの安定
化酵素を含む）の水溶液として処方する。補助因子は、
反応性安定化ＰＥＰＣの安定性の更なる増大を提供する
ために望ましい（好ましくは、ｄ−ビオチンであり、適
宜、ポリオール及び／又はゼラチンも又、ＰＥＰＣの安
定性を更に増大するために添加してよい）。この溶液
は、約５〜１１（好ましくは、約８．０〜９．５）のｐ
Ｈを有する。適宜、このｐＨを、許容可能ｐＨ範囲に緩
衝し得る緩衝剤の添加により維持する（両性イオン性緩
衝剤が好適に用いられる）。抗菌性安定剤も又、適宜、
加えてよく、操作中、無菌条件を利用して汚染の危険を
減らすことが出来る。
定用の安定な単一液体試薬を提供する。この試薬は、反
応的に安定化したホスホエノールピルベートカルボキシ
ラーゼ（ＰＥＰＣ）である第１の酵素、ホスホエノール
ピルベートカルボキシラーゼ用の第１の診断用基質（好
ましくは、ホスホエノールピルベート）、第１の診断反
応の生成物と第２の診断反応のための基質との間の反応
を触媒し得る第２の診断用酵素（好ましくは、マレート
デヒドロゲナーゼ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフェートの還元型（ＮＡＤＰＨ）である第
２の診断用基質、ＮＡＤＨの安定化用の試薬（それら
は、対応する基質の存在下で、酸化型のニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はそのリン酸塩Ｎ
ＡＤＰを、診断反応を有意に妨害することなくＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨを十分に安定化する速度で、還元型ＮＡ
ＤＨ又はＮＡＤＰＨに変換し得る少なくとも１つの安定
化酵素を含む）の水溶液として処方する。補助因子は、
反応性安定化ＰＥＰＣの安定性の更なる増大を提供する
ために望ましい（好ましくは、ｄ−ビオチンであり、適
宜、ポリオール及び／又はゼラチンも又、ＰＥＰＣの安
定性を更に増大するために添加してよい）。この溶液
は、約５〜１１（好ましくは、約８．０〜９．５）のｐ
Ｈを有する。適宜、このｐＨを、許容可能ｐＨ範囲に緩
衝し得る緩衝剤の添加により維持する（両性イオン性緩
衝剤が好適に用いられる）。抗菌性安定剤も又、適宜、
加えてよく、操作中、無菌条件を利用して汚染の危険を
減らすことが出来る。
【００１６】ＣＯ2 を測定するために反応する成分を、
診断に有効な量で供給する。即ち、濃度を、それらが用
いられる診断用装置の運転特性にぴったり合わせる。診
断当量を、３７℃で１０分以内、３０℃で１２分以内又
は２０℃で１５分以内で診断が達成されるようにデザイ
ンする。米国における標準運転温度は３７℃である。
診断に有効な量で供給する。即ち、濃度を、それらが用
いられる診断用装置の運転特性にぴったり合わせる。診
断当量を、３７℃で１０分以内、３０℃で１２分以内又
は２０℃で１５分以内で診断が達成されるようにデザイ
ンする。米国における標準運転温度は３７℃である。
【００１７】この発明の安定な単一液体試薬は、２〜１
０℃で１８か月を超える保存寿命（４１℃で３日を超え
る安定性に相当）を有する。
０℃で１８か月を超える保存寿命（４１℃で３日を超え
る安定性に相当）を有する。
【００１８】
【詳細な解説】本発明は、血清及びその他の体液中の二
酸化炭素の測定のための単一の安定な液体試薬に向けら
れている。本発明の単一液体試薬を用いて、二酸化炭素
をアルカリ性診断用媒質中で重炭酸塩に変換し、更に、
第１の基質（好ましくは、ホスホエノールピルベート）
をＰＥＰＣの存在下で反応性生成物（好ましくは、オキ
シロアセテート）及び無機リン酸塩に変換する。第２の
診断用酵素（好ましくは、ＭＤＨ）又はＮＡＤＰＨ及び
ＮＡＤＨの存在下において、生成物オキサロアセテート
をマレートに還元し且つＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをＮＡ
Ｄに酸化する。ＮＡＤＨのＮＡＤへの又はＮＡＤＰＨの
ＮＡＤＰへの変換は、約３４０ｎｍの波長で監視するこ
とが出来る。
酸化炭素の測定のための単一の安定な液体試薬に向けら
れている。本発明の単一液体試薬を用いて、二酸化炭素
をアルカリ性診断用媒質中で重炭酸塩に変換し、更に、
第１の基質（好ましくは、ホスホエノールピルベート）
をＰＥＰＣの存在下で反応性生成物（好ましくは、オキ
シロアセテート）及び無機リン酸塩に変換する。第２の
診断用酵素（好ましくは、ＭＤＨ）又はＮＡＤＰＨ及び
ＮＡＤＨの存在下において、生成物オキサロアセテート
をマレートに還元し且つＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをＮＡ
Ｄに酸化する。ＮＡＤＨのＮＡＤへの又はＮＡＤＰＨの
ＮＡＤＰへの変換は、約３４０ｎｍの波長で監視するこ
とが出来る。
【００１９】変換速度は、試料中のＣＯ2 濃度に比例す
る。終点及び速度型反応をＣＯ2 の測定において利用す
ることが出来る。何れにしても、このＣＯ2 測定のため
の基本的反応は下記の通りである：
る。終点及び速度型反応をＣＯ2 の測定において利用す
ることが出来る。何れにしても、このＣＯ2 測定のため
の基本的反応は下記の通りである：
【化２】
【００２０】ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが水溶液中でＮＡ
Ｄ+ に分解される非常に不安定な基質であるということ
は周知である。この安定化反応は、ＮＡＤＨをＮＡＤ+
から再生する駆動力を供給することに基づいている。’
４４９特許に開示されているように、ＮＡＤＨをＮＡＤ
+ から形成する反応の触媒に関与する任意の酵素又は酵
素系及びその対応する基質は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ
を安定化するために利用し得る。かかる系の非制限的例
は、下記を含む：
Ｄ+ に分解される非常に不安定な基質であるということ
は周知である。この安定化反応は、ＮＡＤＨをＮＡＤ+
から再生する駆動力を供給することに基づいている。’
４４９特許に開示されているように、ＮＡＤＨをＮＡＤ
+ から形成する反応の触媒に関与する任意の酵素又は酵
素系及びその対応する基質は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ
を安定化するために利用し得る。かかる系の非制限的例
は、下記を含む：
【表１】
【００２１】他の酵素−基質の組合せも又用い得る。ヘ
キソキナーゼ／グルコース ６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ−グルコースの組合せは、この発明の組成物中
でＮＡＤＨを安定化するために好適に用い得る。
キソキナーゼ／グルコース ６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ−グルコースの組合せは、この発明の組成物中
でＮＡＤＨを安定化するために好適に用い得る。
【００２２】ＮＡＤ+ をＮＡＤＨに変換する反応の速度
がＮＡＤ+ をＮＡＤＨに直ちに変換するように早過ぎる
ならば、この試薬は、ＮＡＤＨのＮＡＤ+ への変換の速
度又は程度を測定することが出来ないので、ＣＯ2 反応
に用いることが出来ない。
がＮＡＤ+ をＮＡＤＨに直ちに変換するように早過ぎる
ならば、この試薬は、ＮＡＤＨのＮＡＤ+ への変換の速
度又は程度を測定することが出来ないので、ＣＯ2 反応
に用いることが出来ない。
【００２３】それ故、ＮＡＤ+ のＮＡＤＨへの又はＮＡ
ＤＰ+ のＮＡＤＰＨへの変換の速度がほぼ保存時におけ
るＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの分解速度であって上記の診
断用反応により引き起こされるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ
のＮＡＤ+ 又はＮＡＤＰ+ への変換速度を含まず且つ用
いる酵素−基質量が丁度ＮＡＤＨをレコード基質として
維持するのに必要な量であることが重要である。
ＤＰ+ のＮＡＤＰＨへの変換の速度がほぼ保存時におけ
るＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの分解速度であって上記の診
断用反応により引き起こされるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ
のＮＡＤ+ 又はＮＡＤＰ+ への変換速度を含まず且つ用
いる酵素−基質量が丁度ＮＡＤＨをレコード基質として
維持するのに必要な量であることが重要である。
【００２４】ヘキソキナーゼは活性がマグネシウムによ
り制御されるということは公知である。マグネシウムの
存在量を制御することにより、ヘキソキナーゼの活性を
制御し、それにより、グルコースのグルコース−６−ホ
スフェートへの変換を制御し、更に、ＮＡＤ+ のＮＡＤ
Ｈへの変換速度を制御することが出来る。
り制御されるということは公知である。マグネシウムの
存在量を制御することにより、ヘキソキナーゼの活性を
制御し、それにより、グルコースのグルコース−６−ホ
スフェートへの変換を制御し、更に、ＮＡＤ+ のＮＡＤ
Ｈへの変換速度を制御することが出来る。
【００２５】好ましくは、マグネシウムを酢酸マグネシ
ウムとして添加し且つその利用可能性をエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤の利用により制御
することが出来る。
ウムとして添加し且つその利用可能性をエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤の利用により制御
することが出来る。
【００２６】安定化反応を制御する他の方法は、溶液に
添加する安定化酵素の量又は溶液に添加する対応する基
質の量を制御することによる。かかる技術は、当業者に
は周知であり、この発明の好適組成物の成分を列挙した
表１に示してある。
添加する安定化酵素の量又は溶液に添加する対応する基
質の量を制御することによる。かかる技術は、当業者に
は周知であり、この発明の好適組成物の成分を列挙した
表１に示してある。
【００２７】この発明の鍵となる要件は、反応的に安定
化されたＰＥＰＣを用いることである。その反応的安定
化の方法は、１９９２年３月２６日出願の、同時係属の
米国特許出願第７／８５８，３９９号に詳細に記載され
ており、本明細書中に参考として援用する。
化されたＰＥＰＣを用いることである。その反応的安定
化の方法は、１９９２年３月２６日出願の、同時係属の
米国特許出願第７／８５８，３９９号に詳細に記載され
ており、本明細書中に参考として援用する。
【００２８】一般に、ＰＥＰＣは、水性媒質中で縮合剤
又は架橋剤の存在下で生物安定剤と反応させることによ
り反応的に安定化される。この技術において、適当な冷
凍条件（即ち、０℃より高く、約１０℃以下）下でＰＥ
ＰＣ溶液を先ず供給し、それに、生物安定剤の溶液を低
温（０℃より高く約１０℃以下）で攪拌しながらゆっく
りと添加する。これに続いて、ＰＥＰＣと生物安定剤と
の間の共有結合の形成を促進する縮合剤の溶液に添加す
る。この縮合剤は、反応を引き起こし且つ／又は反応に
参加し及び可溶性の安定化した生成物の部分となる。
又は架橋剤の存在下で生物安定剤と反応させることによ
り反応的に安定化される。この技術において、適当な冷
凍条件（即ち、０℃より高く、約１０℃以下）下でＰＥ
ＰＣ溶液を先ず供給し、それに、生物安定剤の溶液を低
温（０℃より高く約１０℃以下）で攪拌しながらゆっく
りと添加する。これに続いて、ＰＥＰＣと生物安定剤と
の間の共有結合の形成を促進する縮合剤の溶液に添加す
る。この縮合剤は、反応を引き起こし且つ／又は反応に
参加し及び可溶性の安定化した生成物の部分となる。
【００２９】用語「生物安定剤」は、不安定な分析物
（ここでは、ＰＥＰＣ）との架橋共有反応に参加して直
接又は縮合剤を介して活性型の分析物を不動化する生物
学的物質を意味する。
（ここでは、ＰＥＰＣ）との架橋共有反応に参加して直
接又は縮合剤を介して活性型の分析物を不動化する生物
学的物質を意味する。
【００３０】用語「縮合剤又は架橋剤」は、生物安定剤
及び不安定な分析物を含む共有架橋反応を引き起こし又
はそれに参加する化合物を意味する。
及び不安定な分析物を含む共有架橋反応を引き起こし又
はそれに参加する化合物を意味する。
【００３１】不安定な分析物への結合に用いられる生物
安定剤は、分析物上の部位と反応性の１つ以上の部位を
元々含むか又は含むように修飾し得る、水溶性の、親水
性化合物である。これらの生物安定剤は、ポリアルギニ
ン、ポリ−ｄｌ−リジン、ポリ−ｌ−リジン、ポリ−ｄ
ｌ−アスパラギン酸塩、ポリ−ｌ−アスパラギン酸塩、
ポリ−ｌ−グルタミン酸、ポリスクシニル化リジン（Ｐ
ＳＬ）等のバイオポリマーを含む。
安定剤は、分析物上の部位と反応性の１つ以上の部位を
元々含むか又は含むように修飾し得る、水溶性の、親水
性化合物である。これらの生物安定剤は、ポリアルギニ
ン、ポリ−ｄｌ−リジン、ポリ−ｌ−リジン、ポリ−ｄ
ｌ−アスパラギン酸塩、ポリ−ｌ−アスパラギン酸塩、
ポリ−ｌ−グルタミン酸、ポリスクシニル化リジン（Ｐ
ＳＬ）等のバイオポリマーを含む。
【００３２】縮合剤は、架橋反応を開始し及びそれに参
加することが出来る。それらは、生物安定剤と不安定な
分析物との間の共有結合を開始する適当な反応性の基を
含む分子である。縮合剤は、反応を活性化し及び／又は
それに参加することが出来、例えば、生物安定剤と分析
物との間の架橋基として作用する。
加することが出来る。それらは、生物安定剤と不安定な
分析物との間の共有結合を開始する適当な反応性の基を
含む分子である。縮合剤は、反応を活性化し及び／又は
それに参加することが出来、例えば、生物安定剤と分析
物との間の架橋基として作用する。
【００３３】この共有結合は、同じ官能基間又は異なる
官能基間の何れかであってよい。３つの型の縮合剤があ
る。即ち、ホモ二官能性試薬、ヘテロ二官能性試薬及び
ゼロ距離試薬。これらの範疇に適合する数百の試薬があ
る。
官能基間の何れかであってよい。３つの型の縮合剤があ
る。即ち、ホモ二官能性試薬、ヘテロ二官能性試薬及び
ゼロ距離試薬。これらの範疇に適合する数百の試薬があ
る。
【００３４】ホモ二官能性試薬において、不安定な分析
物と生物安定剤との間の反応に関与する官能基は同じで
ある。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる特異性の非
類似の反応性の基を含む。ゼロ距離（zero-length ）試
薬は、特殊なクラスの化合物である。それらは、何ら追
加の原子又は分子を導入することなく、蛋白質の２つの
化学基の直接結合を誘導する。
物と生物安定剤との間の反応に関与する官能基は同じで
ある。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる特異性の非
類似の反応性の基を含む。ゼロ距離（zero-length ）試
薬は、特殊なクラスの化合物である。それらは、何ら追
加の原子又は分子を導入することなく、蛋白質の２つの
化学基の直接結合を誘導する。
【００３５】この反応性安定化技術は、ＰＥＰＣが水溶
液中でその酵素活性を保持することを可能にする。ＰＥ
ＰＣの安定化のための現在の好ましい技術を、本出願の
実施例１に記載する。
液中でその酵素活性を保持することを可能にする。ＰＥ
ＰＣの安定化のための現在の好ましい技術を、本出願の
実施例１に記載する。
【００３６】補助因子を用いて、更に、ＰＥＰＣの安定
性を増大させることが出来る。好適補助因子は、ｄ−ビ
オチンである。ソルビトール、マンニトール、トレハロ
ース等のポリオール、及び／又はゼラチンを用いて、更
に、ＰＥＰＣの安定性を増大させることが出来る。この
発明のアッセイ用溶液は、約５〜１１（好ましくは、約
８．０〜９．５）のｐＨを有する。溶液のｐＨは、許容
し得るｐＨ範囲内に緩衝し得る両性イオン性緩衝剤の添
加によって維持することが出来る。かかる緩衝剤は、
（２−［（２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ］
−−エタンスルホン酸、（Ｎ−［２−アセタミド］−２
−イミノ二酢酸、（３−［１，１−ジメチル−２−ヒド
ロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスル
ホン酸、（Ｎ，Ｎ−ビス［２ヒドロキシエチル］−２−
アミノエタンスルホン酸、（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロ
キシエチル］−グリシン、（３−［シクロヘキシルアミ
ノ］−１−プロパンスルホン酸、（２−｛Ｎ−シクロヘ
キシルアミノ］−エタンスルホン酸、（Ｎ−［２−モル
ホリノ］エタンスルホン酸、（３−［Ｎ−モルホリノ］
プロパンスルホン酸）、（３−［Ｎ−トリス（ヒドロキ
シメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンス
ルホン酸）、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン
等、及びこれらの混合物を含む。更に、抗菌性安定剤
を、適宜、添加してよい。かかる抗菌剤は、アジ化ナト
リウム、抗生物質等を含む。操作中に無菌条件を利用し
て汚染の危険を減じることが出来る。
性を増大させることが出来る。好適補助因子は、ｄ−ビ
オチンである。ソルビトール、マンニトール、トレハロ
ース等のポリオール、及び／又はゼラチンを用いて、更
に、ＰＥＰＣの安定性を増大させることが出来る。この
発明のアッセイ用溶液は、約５〜１１（好ましくは、約
８．０〜９．５）のｐＨを有する。溶液のｐＨは、許容
し得るｐＨ範囲内に緩衝し得る両性イオン性緩衝剤の添
加によって維持することが出来る。かかる緩衝剤は、
（２−［（２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ］
−−エタンスルホン酸、（Ｎ−［２−アセタミド］−２
−イミノ二酢酸、（３−［１，１−ジメチル−２−ヒド
ロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスル
ホン酸、（Ｎ，Ｎ−ビス［２ヒドロキシエチル］−２−
アミノエタンスルホン酸、（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロ
キシエチル］−グリシン、（３−［シクロヘキシルアミ
ノ］−１−プロパンスルホン酸、（２−｛Ｎ−シクロヘ
キシルアミノ］−エタンスルホン酸、（Ｎ−［２−モル
ホリノ］エタンスルホン酸、（３−［Ｎ−モルホリノ］
プロパンスルホン酸）、（３−［Ｎ−トリス（ヒドロキ
シメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンス
ルホン酸）、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン
等、及びこれらの混合物を含む。更に、抗菌性安定剤
を、適宜、添加してよい。かかる抗菌剤は、アジ化ナト
リウム、抗生物質等を含む。操作中に無菌条件を利用し
て汚染の危険を減じることが出来る。
【００３７】本発明の溶液は酸性ｐＨとして供給してよ
いが、このアッセイがアルカリ条件下で行なわれること
は理解される。これは、アッセイ溶液を試料と合わせる
か又はその混合物をアルカリ化することによる結果であ
ってよい。
いが、このアッセイがアルカリ条件下で行なわれること
は理解される。これは、アッセイ溶液を試料と合わせる
か又はその混合物をアルカリ化することによる結果であ
ってよい。
【００３８】これらの好適な溶液は、約０．１〜１００
ｇ／ｌ（好ましくは、約０．４ｇ／ｌ）のトリス、約
０．００１〜１０（好ましくは、約０．２ｇ／ｌ）のＥ
ＤＴＡ、約０．１〜１００ｇ／ｌ（好ましくは、約２ｇ
／ｌ）のグルコース、約０．１〜１００ｇ／ｌ（好まし
くは、約５ｇ／ｌ）の基質、約０．０１〜５０ｇ／ｌ
（好ましくは、約０．５ｇ／ｌ）のＡＴＰ、約０．０１
〜２０ｇ／ｌ（好ましくは、約０．４ｇ／ｌ）のアジ化
ナトリウム（抗菌剤として）、約０．０１〜５ｇ／ｌ
（好ましくは、約０．２４４ｇ／ｌ）のビタミンＨ、０
〜約２００ｍｌ／ｌ（好ましくは、約４０ｍｌ／ｌ）の
ソルビトールとゼラチンとの混合物、約０．６〜２．０
ｇ／ｌ（好ましくは、約１．３ｇ／ｌ）のＮＡＤＨ、２
５℃で、約２〜２，０００Ｕ／ｌ（好ましくは、２５℃
で、約２００Ｕ／ｌ）のヘキソキナーゼ、２５℃で、
０．１〜２，０００Ｕ／ｌ（好ましくは、約２０Ｕ／
ｌ）のＧ６ＰＤＨ、約２００〜５，０００（好ましく
は、約５００Ｕ／ｌ）のＭＤＨ、３７℃で、約２００〜
２，０００Ｕ／ｌ（好ましくは、約５００Ｕ／ｌ）のＰ
ＥＰＣを含む水溶液である（該溶液は、約８．７５〜
９．２５のｐＨを有する）。
ｇ／ｌ（好ましくは、約０．４ｇ／ｌ）のトリス、約
０．００１〜１０（好ましくは、約０．２ｇ／ｌ）のＥ
ＤＴＡ、約０．１〜１００ｇ／ｌ（好ましくは、約２ｇ
／ｌ）のグルコース、約０．１〜１００ｇ／ｌ（好まし
くは、約５ｇ／ｌ）の基質、約０．０１〜５０ｇ／ｌ
（好ましくは、約０．５ｇ／ｌ）のＡＴＰ、約０．０１
〜２０ｇ／ｌ（好ましくは、約０．４ｇ／ｌ）のアジ化
ナトリウム（抗菌剤として）、約０．０１〜５ｇ／ｌ
（好ましくは、約０．２４４ｇ／ｌ）のビタミンＨ、０
〜約２００ｍｌ／ｌ（好ましくは、約４０ｍｌ／ｌ）の
ソルビトールとゼラチンとの混合物、約０．６〜２．０
ｇ／ｌ（好ましくは、約１．３ｇ／ｌ）のＮＡＤＨ、２
５℃で、約２〜２，０００Ｕ／ｌ（好ましくは、２５℃
で、約２００Ｕ／ｌ）のヘキソキナーゼ、２５℃で、
０．１〜２，０００Ｕ／ｌ（好ましくは、約２０Ｕ／
ｌ）のＧ６ＰＤＨ、約２００〜５，０００（好ましく
は、約５００Ｕ／ｌ）のＭＤＨ、３７℃で、約２００〜
２，０００Ｕ／ｌ（好ましくは、約５００Ｕ／ｌ）のＰ
ＥＰＣを含む水溶液である（該溶液は、約８．７５〜
９．２５のｐＨを有する）。
【００３９】表１は、本発明に従い且つ速度又は終点法
によるＣＯ2 測定に実行可能であることが見出された特
定の配合を示している。表１において、Ａ及びＣは、ア
ナライザーと共に用いる５倍濃縮溶液である（使用時
に、アッセイ用組成物を、水４部及びアッセイ溶液１部
で、希釈する）。これらの組成物の配合において、安定
化したＰＥＰＣを実施例１に従って安定化する。
によるＣＯ2 測定に実行可能であることが見出された特
定の配合を示している。表１において、Ａ及びＣは、ア
ナライザーと共に用いる５倍濃縮溶液である（使用時
に、アッセイ用組成物を、水４部及びアッセイ溶液１部
で、希釈する）。これらの組成物の配合において、安定
化したＰＥＰＣを実施例１に従って安定化する。
【００４０】特定の配合物を提供するが、必須成分は、
診断的に有効な量で供給する。用語「診断的に」有効な
量は、アッセイを３７℃（体温）で１０分以内、３０℃
で１２分以内又は２５℃で１５分以内で達成すること
（市販の質量分光計に対する標準的設計の運転パラメー
ター）を可能にする濃度を意味する。
診断的に有効な量で供給する。用語「診断的に」有効な
量は、アッセイを３７℃（体温）で１０分以内、３０℃
で１２分以内又は２５℃で１５分以内で達成すること
（市販の質量分光計に対する標準的設計の運転パラメー
ター）を可能にする濃度を意味する。
【００４１】実施例２、３及び４において示すすべての
結果は、Roche Cobas Bio アナライザーを用いて得られ
た。配合物Ａ及びＣについて、アッセイ用組成物は、使
用前に手作業で希釈した（水４部及びアッセイ用組成物
１部）。すべての反応を、終点アッセイとして行なった
（但し、実施例６は、速度アッセイとして行なった）。
アッセイのパラメーターは、下記のように定めた：
結果は、Roche Cobas Bio アナライザーを用いて得られ
た。配合物Ａ及びＣについて、アッセイ用組成物は、使
用前に手作業で希釈した（水４部及びアッセイ用組成物
１部）。すべての反応を、終点アッセイとして行なった
（但し、実施例６は、速度アッセイとして行なった）。
アッセイのパラメーターは、下記のように定めた：
【表２】
【００４２】２５ｍＥｇ／ｌ ＮＥＲＬ標準を、較正と
して、各アッセイに用いた。
して、各アッセイに用いた。
【表３】
【００４３】
【実施例】実施例１及び対照１ ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰ
Ｃ）の安定化 ５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０
ｍｇ／ｍｌのトリス及び５０ｍｇ／ｍｌのアスパラギン
酸マグネシウムを含む水性塩基にＰＥＰＣを溶解するこ
とによりＰＥＰＣの２０ｍｇ／ｍｌ溶液を作成した（ｐ
Ｈ調節なし）。
Ｃ）の安定化 ５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０
ｍｇ／ｍｌのトリス及び５０ｍｇ／ｍｌのアスパラギン
酸マグネシウムを含む水性塩基にＰＥＰＣを溶解するこ
とによりＰＥＰＣの２０ｍｇ／ｍｌ溶液を作成した（ｐ
Ｈ調節なし）。
【００４４】１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド及びポリスクシニル化リジン
（ＰＳＬ）のＤＭＳＯ溶液を、それぞれ、１００ｍｇ／
ｍｌ及び２０ｍｇ／ｍｌの濃度で作成した。
ロピル）−カルボジイミド及びポリスクシニル化リジン
（ＰＳＬ）のＤＭＳＯ溶液を、それぞれ、１００ｍｇ／
ｍｌ及び２０ｍｇ／ｍｌの濃度で作成した。
【００４５】ＰＳＬ溶液をＰＥＰＣ溶液に氷浴上で攪拌
しながら滴下して加えてから、ＥＤＡＣ溶液を加え、混
合物を４℃で４日間貯蔵し、そして３５℃で２日間イン
キュベートした。
しながら滴下して加えてから、ＥＤＡＣ溶液を加え、混
合物を４℃で４日間貯蔵し、そして３５℃で２日間イン
キュベートした。
【００４６】表２は、表１のパイロットＢにおけるＰＥ
ＰＣの安定性を比較する。対照は、最初に安定化するこ
となくパイロットＢに添加したＰＥＰＣである。
ＰＣの安定性を比較する。対照は、最初に安定化するこ
となくパイロットＢに添加したＰＥＰＣである。
【表４】
【００４７】実施例２ 表１の組成物Ｄを、配合時（４℃）及び４１℃で３日間
のストレスをかけた後に用いて、血清中のＣＯ2 をアッ
セイする能力を測定した。その結果を表３に示す（工業
用ＮＥＲＬ標準使用）。これらの結果は、４℃の試薬と
４１℃で３日のストレスを与えた試薬との間に１０％未
満の差しかないことを確立している。これは、予測され
る４℃での長期の試薬安定性を示す。このデータを図１
にプロットし且つ表３に示す。
のストレスをかけた後に用いて、血清中のＣＯ2 をアッ
セイする能力を測定した。その結果を表３に示す（工業
用ＮＥＲＬ標準使用）。これらの結果は、４℃の試薬と
４１℃で３日のストレスを与えた試薬との間に１０％未
満の差しかないことを確立している。これは、予測され
る４℃での長期の試薬安定性を示す。このデータを図１
にプロットし且つ表３に示す。
【表５】 更に、３８０ｎｍで初期吸光度を、４℃及び４１℃で３
日間の両試薬について測定した。これは、このアッセイ
がＮＡＤＨのＮＡＤ+ への変換を試料中のＣＯ2濃度の
関数として測定することに基づいているので重要であ
る。ＭＤＨ及び安定化ＰＥＰＣの安定性も又、ストレス
の後に測定した。結果は、表４にある。
日間の両試薬について測定した。これは、このアッセイ
がＮＡＤＨのＮＡＤ+ への変換を試料中のＣＯ2濃度の
関数として測定することに基づいているので重要であ
る。ＭＤＨ及び安定化ＰＥＰＣの安定性も又、ストレス
の後に測定した。結果は、表４にある。
【表６】 これは、この試薬組成物中のＭＤＨの本来の安定性及び
実施例１で示した方法により最初に安定化することによ
って得られたＰＥＰＣの安定性を示す。
実施例１で示した方法により最初に安定化することによ
って得られたＰＥＰＣの安定性を示す。
【００４８】実施例３ 次の研究において、配合時の表１の組成物Ｄと４１℃で
３日のストレスの後の組成物との間の相関関係をＮＥＲ
Ｌ標準とｃｈｅｍＴＲＡＫ対照（レベル１、２及び３）
を用いて測定した。この相関関係の測定値を、表５に示
し及び図２にプロットする。この相関関係は、完全な相
関関係を１としたときに０．９９８５であった。
３日のストレスの後の組成物との間の相関関係をＮＥＲ
Ｌ標準とｃｈｅｍＴＲＡＫ対照（レベル１、２及び３）
を用いて測定した。この相関関係の測定値を、表５に示
し及び図２にプロットする。この相関関係は、完全な相
関関係を１としたときに０．９９８５であった。
【表７】
【００４９】実施例４ 実施例３と同じ手順に従って、再び研究を行ない（代り
に３０人の異なる患者からのヒト血清を用いた）、図３
に示すように、相関関係は、この研究については、０．
９９８４であった。このプールは、幾つかのヒト試料を
合わせたものであった。その結果のＣＯ2 濃度は、「未
稀釈」で示した。１／５、２／５、３／５及び４／５の
試料は、塩溶液によるプールの希釈である。これは、試
薬の希釈可能性因子を評価するために行なった。これ
は、試薬の販売可能性を見積もるときに重要なステップ
である。
に３０人の異なる患者からのヒト血清を用いた）、図３
に示すように、相関関係は、この研究については、０．
９９８４であった。このプールは、幾つかのヒト試料を
合わせたものであった。その結果のＣＯ2 濃度は、「未
稀釈」で示した。１／５、２／５、３／５及び４／５の
試料は、塩溶液によるプールの希釈である。これは、試
薬の希釈可能性因子を評価するために行なった。これ
は、試薬の販売可能性を見積もるときに重要なステップ
である。
【００５０】強化プール１、２、３及び４は、重炭酸ナ
トリウムを添加することによりＣＯ2 濃度を増加させた
「未稀釈」プールからの試料であった。
トリウムを添加することによりＣＯ2 濃度を増加させた
「未稀釈」プールからの試料であった。
【００５１】結果を、表６に示す。
【表８】
【００５２】実施例５ 再び、ＮＥＲＬ及びＣｈｅｍＴＲＡＫ対照を用いて、表
１の組成物Ｃについて、配合時の組成物と４１℃で３日
のストレスの後の組成物との相関関係を算定した。表７
に示し且つ図４にプロットした結果は、０．９９９１の
相関係数を確立した。ｃｈｅｍＴＲＡＫは、Medical An
alysis Systems, Inc.の商品である。
１の組成物Ｃについて、配合時の組成物と４１℃で３日
のストレスの後の組成物との相関関係を算定した。表７
に示し且つ図４にプロットした結果は、０．９９９１の
相関係数を確立した。ｃｈｅｍＴＲＡＫは、Medical An
alysis Systems, Inc.の商品である。
【表９】
【００５３】更に、３８０ｎｍで初期吸光度を、４℃及
び４１℃で３日間の両試薬について測定した。ＭＤＨ及
び安定化ＰＥＰＣの安定性も又、ストレス後に測定し
た。測定前に、試薬１部に４部の水を加えて希釈した。
結果は、表８にある。
び４１℃で３日間の両試薬について測定した。ＭＤＨ及
び安定化ＰＥＰＣの安定性も又、ストレス後に測定し
た。測定前に、試薬１部に４部の水を加えて希釈した。
結果は、表８にある。
【表１０】 再び、これは、天然のＭＤＨ及び安定化ＰＥＰＣの両者
について、良い安定性を示している。
について、良い安定性を示している。
【００５４】実施例６ 実施例５と同じ手順に従って（但し、終点アッセイの代
りに速度アッセイを行なった）、３０人の異なる患者か
らのヒト血清を用いて、研究を繰り返し、図５に示すよ
うに、相関関係は、この研究については、０．９９６９
であった。このプールは、幾つかのヒト試料を合わせた
ものであった。その結果のＣＯ2 濃度は、「未稀釈」で
示した。１／５、２／５、３／５及び４／５の試料は、
塩溶液でのプールの希釈であった。
りに速度アッセイを行なった）、３０人の異なる患者か
らのヒト血清を用いて、研究を繰り返し、図５に示すよ
うに、相関関係は、この研究については、０．９９６９
であった。このプールは、幾つかのヒト試料を合わせた
ものであった。その結果のＣＯ2 濃度は、「未稀釈」で
示した。１／５、２／５、３／５及び４／５の試料は、
塩溶液でのプールの希釈であった。
【００５５】強化プール１、２及び３は、重炭酸ナトリ
ウムを添加することによりＣＯ2 濃度を増加させた「未
稀釈」プールからの試料であった。
ウムを添加することによりＣＯ2 濃度を増加させた「未
稀釈」プールからの試料であった。
【００５６】結果を、表９に示す。
【表１１】 再び、これは、天然のＭＤＨ及び安定化ＰＥＰＣの両者
について、良い安定性を示している。
について、良い安定性を示している。
【図１】ＮＥＲＬ標準を使用した、配合時及び４１℃で
３日間のストレスの後の、ＣＯ2 アッセイ用組成物につ
いての、ＣＯ2 のアッセイ値と理論値の相関を示すグラ
フである（データは、表２に記載してある）。
３日間のストレスの後の、ＣＯ2 アッセイ用組成物につ
いての、ＣＯ2 のアッセイ値と理論値の相関を示すグラ
フである（データは、表２に記載してある）。
【図２】配合時のＣＯ2 回収（Ｘ）の、４１℃で３日間
のストレスを加えた組成物（ｍＥｑ／Ｌ）（Ｙ）に対す
るプロットである（相関係数は、０．９９８５であり、
データは、表４に記載してある）。
のストレスを加えた組成物（ｍＥｑ／Ｌ）（Ｙ）に対す
るプロットである（相関係数は、０．９９８５であり、
データは、表４に記載してある）。
【図３】配合時（Ｘ）及び４１℃で３日間のストレスの
後のアッセイ用組成物（Ｙ）を用いた、３０人の個人か
ら得たヒト血清からのＣＯ2 回収のプロットである（デ
ータは、表５に記載したものである）。
後のアッセイ用組成物（Ｙ）を用いた、３０人の個人か
ら得たヒト血清からのＣＯ2 回収のプロットである（デ
ータは、表５に記載したものである）。
【図４】ＮＥＲＬ標準及び３chemTRAKレベルを使用した
ＣＯ2 回収の、５×組成物（表１）を用いた回収に対す
るプロットである（配合時（Ｘ）及び４１℃で３日間の
ストレスの後（Ｙ））。
ＣＯ2 回収の、５×組成物（表１）を用いた回収に対す
るプロットである（配合時（Ｘ）及び４１℃で３日間の
ストレスの後（Ｙ））。
Claims (20)
- 【請求項１】 アルカリ性条件下における血清及び体液
中の二酸化炭素の測定のための、液体の、時間安定な、
単一のアッセイ用試薬であって、下記の水溶液を含む該
試薬 （ａ）反応的に安定化したホスホエノールピルベートカ
ルボキシラーゼ及び反応的に安定化したホスホエノール
ピルベートカルボキシラーゼの存在下で重炭酸イオンと
反応して、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド及び還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェートからなる群より選択する第２の基質
と反応する生成物を形成するのに十分な診断的に有効な
量で存在する第１の診断用基質 （ｂ）診断的に有効な量の第２の基質 （ｃ）第２の基質と生成物との反応により第２の基質の
酸化型を形成する、診断的に有効な量の第２の診断用酵
素、及び （ｄ）少なくとも１種の安定化用酵素及び、第２の基質
の酸化を阻止するのに十分な量であるが、血清中の二酸
化炭素の尺度として第２の基質の酸化型を形成する第２
の基質と生成物との反応において第２の基質の酸化型の
測定を阻害するには不十分な量で存在する該安定化用酵
素の対応する基質（上記の溶液は、約５〜１１のｐＨを
有する）。 - 【請求項２】 補助因子を与えて、更に、反応的に安定
化したホスホエノールピルベートカルボキシラーゼを安
定化した、請求項１に記載のアッセイ用試薬。 - 【請求項３】 補助因子がｄ−ビオチンである、請求項
２に記載のアッセイ用試薬。 - 【請求項４】 ポリオール、ゼラチン及びそれらの混合
物からなる群より選択する第２の基質に対する第２の安
定剤を更に含む、請求項１に記載のアッセイ用試薬。 - 【請求項５】 第１の診断用基質がホスホエノールピル
ベートである、請求項１に記載のアッセイ用試薬。 - 【請求項６】 第２の診断用酵素がマレートデヒドロゲ
ナーゼである、請求項１に記載のアッセイ用試薬。 - 【請求項７】 第２の診断用酵素がマレートデヒドロゲ
ナーゼである、請求項５に記載のアッセイ用試薬。 - 【請求項８】 第２の基質に対する安定化用酵素がヘキ
ソキナーゼであり、対応する基質がグルコースとグルコ
ース−６−リン酸との混合物である、請求項１に記載の
アッセイ用試薬。 - 【請求項９】 ヘキソキナーゼの制御用のマグネシウム
イオン及びマグネシウム用のキレート剤を供給した、請
求項８に記載のアッセイ用組成物。 - 【請求項１０】 アデノシン−５’−三リン酸を、第２
の基質に対する追加の安定剤として供給した、請求項４
に記載のアッセイ用組成物。 - 【請求項１１】 溶液のｐＨを両性イオン性緩衝剤によ
り維持する、請求項１に記載のアッセイ用組成物。 - 【請求項１２】 血清中の二酸化炭素の測定のための、
液体の、時間安定性の、単一試薬であって、約０．１〜
１００ｇ／ｌの緩衝剤、約０．００１〜１０ｇ／ｌのマ
グネシウム用キレート剤、約０．１〜１００ｇ／ｌのグ
ルコース、約０．１〜１００ｇ／ｌのホスホエノールピ
ルベートトリ（シクロヘキシルアンモニウム）塩、０．
０１〜約５０ｇ／ｌのアデノシン−５−三リン酸、０．
０１〜約５ｇ／ｌのｄ−ビオチン、０〜２００ｍｌ／ｌ
のソルビトールとゼラチンとの混合物、０．６〜約２ｇ
／ｌのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、約２〜
２０００Ｕ／ｌのヘキソキナーゼ（２５℃で測定）、
０．１〜約５０００Ｕ／ｌのグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（２５℃で測定）、２００〜約５０００
Ｕ／ｌのマレートデヒドロゲナーゼ、約２００〜５００
０Ｕ／ｌの安定化したホスホエノールピルベートカルボ
キシラーゼ（３７℃で測定）を含む、二酸化炭素を含ま
ない水溶液を含む、上記の試薬（該組成物は、約５〜１
１のｐＨを有する）。 - 【請求項１３】 溶液が約８．７〜９．５のｐＨを有す
る、請求項１２に記載の組成物。 - 【請求項１４】 緩衝剤が両性イオン性緩衝剤である、
請求項１２に記載の組成物。 - 【請求項１５】 緩衝剤が両性イオン性緩衝剤である、
請求項１３に記載の組成物。 - 【請求項１６】 両性イオン性緩衝剤がトリス（ヒドロ
キシメチルアミノエタン）である、請求項１４に記載の
組成物。 - 【請求項１７】 両性イオン性緩衝剤がトリス（ヒドロ
キシメチルアミノエタン）である、請求項１５に記載の
組成物。 - 【請求項１８】 抗菌性安定剤が存在する、請求項１２
に記載の組成物。 - 【請求項１９】 抗菌性安定剤が、約０．０１〜２０ｇ
／ｌの量で存在するアジ化ナトリウムである、請求項１
２に記載の組成物。 - 【請求項２０】 血清中の二酸化炭素の測定のための、
時間安定性の、単一試薬であって、約０．４〜２ｇ／ｌ
のトリス（ヒドロキシメチルアミノエタン）、約０．２
〜１ｇ／ｌのエチレンジアミン四酢酸、約２〜１０ｇ／
ｌのグルコース、約０．５〜２０ｇ／ｌのホスホエノー
ルピルベートトリ（シクロヘキシルアンモニウム）塩、
０．５〜約２．５ｇ／ｌのアデノシン−５−三リン酸、
０．４〜約２ｇ／ｌのアジ化ナトリウム、約０．６４〜
３．２ｇ／ｌの酢酸マグネシウム、０．２４〜１．２ｇ
／ｌのｄ−ビオチン、約４０ｍｌ／ｌのソルビトールと
ゼラチンとの混合物、１．３〜約６．５ｇ／ｌのニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド、約２００〜１０００
Ｕ／ｌのヘキソキナーゼ（２５℃で測定）、２０〜約１
００Ｕ／ｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（２５℃で測定）、５００〜約２５００Ｕ／ｌのマレー
トデヒドロゲナーゼ、約５００〜２５００Ｕ／ｌの反応
的に安定化したホスホエノールピルベートカルボキシラ
ーゼ（３７℃で測定）を含む水溶液を含む、上記の試薬
（該組成物は、約８．７５〜９．２５のｐＨを有す
る）。
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-
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