JP3127216B2 - クレアチンキナーゼ活性測定試薬及びクレアチンキナーゼ活性測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、長期間安定でありかつ
正確に測定を行うことができるクレアチンキナーゼ活性
測定試薬及びクレアチンキナーゼ活性測定方法に関する
ものである。本発明は、臨床検査分野において特に重要
な生体由来試料中のクレアチンキナーゼ活性の測定に好
適なものである。

【０００２】

【従来の技術】クレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチン
ホスホキナーゼ、ＣＰＫ；以下ＣＫと略す）［Ｅ．Ｃ．
２．７．３．２］は、アデノシン三リン酸〔ＡＴＰ〕又
はアデノシン二リン酸〔ＡＤＰ〕を補酵素とし、下記の
反応を触媒する酵素である。

【０００３】

【化１】

【０００４】ＣＫは、骨格筋、心筋及び脳等に分布し、
エネルギー代謝上重要な役割を果たしている酵素であ
る。そして、このＣＫは二量体酵素であり、Ｍ型（筋
型）とＢ型（脳型）のサブユニットの組み合わせによ
り、ＭＭ型（ＣＫ−３）、ＭＢ型（ＣＫ−２）及びＢＢ
型（ＣＫ−１）の３種のアイソザイムが存在し、生体組
織中では骨格筋にＭＭ型が、心筋にＭＭ型とＭＢ型が、
脳にＢＢ型が多く存在する。

【０００５】生体由来試料中のＣＫ活性は、急性心筋梗
塞などの虚血性心疾患、多発性筋炎、進行性筋ジストロ
フィー症などの原発性筋疾患及び甲状腺機能異常などの
疾病において高値となるため、生体由来試料中のＣＫ活
性の測定はこれらの疾病の診断にとって大変有用なもの
である。

【０００６】また、心筋に多く存在しているＣＫのＭＢ
型アイソザイムの測定は、心筋梗塞に特異性の高い検査
として重要視されており、更にＭ型サブユニットの組織
型アイソフォームと血清型アイソフォームの比率の測定
は、急性心筋梗塞の早期診断の指標として注目されてき
ている。

【０００７】ＣＫ活性の測定は、下記の反応式（１）、
（２）及び（３）で示される反応により生成するβ−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）〔ＮＡ
ＤＨ〕又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（還元型）〔ＮＡＤＰＨ〕 （ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを総称して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと
する）の生成速度を３４０ｎｍにおける吸光度の増加速
度より算出することにより行われる。また、下記の反応
式（１）、（２）、（３）及び（４）で示される反応に
より生成するホルマザン色素の生成量を可視部の吸光度
を測ることにより求める方法も行われている。

【０００８】

【化２】

【０００９】しかしながら、ＣＫは血清等の生体由来試
料中で、温度依存性の不可逆的失活と活性中心のＳＨ基
がブロックされることによる可逆的失活により速やかに
不活性化されるので、活性測定時にチオール化合物を存
在させ、予備加温を行うことにより、ＣＫを活性化して
活性を測定する必要がある。

【００１０】このＣＫの活性化剤であるチオール化合物
としては、種々のものが使用されてきたが、近年は無臭
で取り扱い易く安価なことからＮ−アセチルシステイン
が広く用いられてきた。〔特開昭４９−１０６３９７号
公報〕 ところが、Ｎ−アセチルシステインは溶液中では不安定
であり、そのＳＨ基が少しずつ酸化されることによりＣ
Ｋを活性化する能力が低下してしまい、ＣＫ活性の測定
値も負の誤差を生じるようになる。更に、Ｎ−アセチル
システインの酸化物は、ＣＫの活性を阻害するとの報告
もある。〔Ｇｅｒｈａｒｄｔら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，３９，７３７−７４２
（１９７９）〕

【００１１】また、ＣＫの活性化剤として用いられる還
元型グルタチオン及びジチオスレイトールなどの他のチ
オール化合物も溶液中で更に不安定であり、測定値に誤
差を生じさせるようになるものであった。

【００１２】このように、チオール化合物を含むＣＫ活
性測定試薬及びチオール化合物を存在させるＣＫ活性測
定方法は不安定なものであり、長期間測定に使用するこ
とができないものであった。

【００１３】チオール化合物であるＮ−アセチルシステ
インを安定化することができ、３７℃での保存で最長１
４日間使用することができる測定試薬として、ジチオス
レイトール、メルカプトエタノール又はチオグリセロー
ルなどのＮ−アセチルシステイン以外のチオール化合物
（ＳＨ基含有化合物）とＮ−アセチルシステインとを含
有するＣＫ測定試薬が開示されている。〔特開昭６１−
２８９９００号公報〕しかしこれは、ジチオスレイトー
ルが高価であること、メルカプトエタノールは悪臭を放
つこと、そしてチオグリセロールは溶液状のため凍結乾
燥に適さないことなどの難点を有するものであった。

【００１４】また、やはりチオール化合物であるＮ−ア
セチルシステインを安定化することができ、４℃での保
存で２８日間使用することが可能な測定試薬として、少
なくともＮ−アセチルシステイン及びエチレンジアミン
四酢酸塩を含む試薬群とマグネシウムを含む試薬群に分
けて構成若しくは調製するＣＫ測定試薬が開示されてい
る。〔特開昭６２−１０４５９８号公報〕しかしこれ
は、第１試薬中にマグネシウムが存在せずヘキソキナー
ゼ（又はグルコキナーゼ）及びグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼによる反応が進行しないため、第１試
薬添加後の下記の反応式による試料ブランク反応の測定
値を第２試薬添加後の測定値から差し引くことにより、
溶血試料中のアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正
して正確なＣＫ活性の測定値を得ることができる、ダブ
ルカイネティック法と称される方法による測定を行えな
いという難点を有するものであった。

【００１５】

【化３】

【００１６】なお、近年液状の測定試薬の需要が高まっ
てきており、その製造、流通、保管及び使用の各段階を
通じての長期間の安定化が望まれていた。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、従来の
ＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法は不安定なもの
であり、長期間測定に使用することができないものであ
った。また、チオール化合物であるＮ−アセチルシステ
インを安定化し長期間使用することができるとして開示
されたＣＫ活性測定試薬は、高価な物質、悪臭を放つ物
質若しくは凍結乾燥に適さない物質などを使用するもの
であったり、又は溶血試料におけるアデニル酸キナーゼ
による正の誤差を補正して正確な測定値を得ることがで
きるダブルカイネティック法により測定を行えないとい
う難点を有するものであった。

【００１８】本発明者らは、この従来のＣＫ活性測定試
薬及びＣＫ活性測定方法が有する難点の解消を目指して
鋭意検討を行った結果、硫黄を中心原子とするオキソ酸
若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を測定試薬に含有さ
せることにより、長期間安定かつ正確にＣＫ活性を測定
することができることを見出し、安価であり、悪臭を有
さず、液状試薬と凍結乾燥試薬の両方の試薬形態に適用
でき、ダブルカイネティック法により測定を行え、かつ
長期間安定であって正確に測定を行うことができるＣＫ
活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法を完成するに至っ
た。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明は以下の発明を提
供する。 （１） チオール化合物を含むＣＫ活性測定試薬におい
て、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸
又はこれらの塩を含有することを特徴とするＣＫ活性測
定試薬。 （２） 硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチ
オ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫
酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸又は
ポリチオン酸である前記（１）のＣＫ活性測定試薬。 （３） チオール化合物を存在させるＣＫ活性測定方法
において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこの
チオ酸又はこれらの塩の共存下で測定を行うことを特徴
とするＣＫ活性測定方法。 （４） 硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチ
オ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫
酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸又は
ポリチオン酸である前記（３）のＣＫ活性測定方法。

【００２０】本発明において、硫黄を中心原子とするオ
キソ酸とは、ＳＯｍ（ＯＨ）ｎ〔ｍ，ｎはそれぞれ整
数〕で表されるプロトンとして解離しうる水素が酸素原
子に結合した酸のことである。

【００２１】また、本発明において、硫黄を中心原子と
するオキソ酸若しくはこのチオ酸のこのチオ酸とは、前
記の硫黄を中心原子とするオキソ酸の酸基に含まれる酸
素原子の一部又は全部が硫黄原子で置換された化合物の
ことである。

【００２２】本発明における、これらの硫黄を中心原子
とするオキソ酸若しくはこのチオ酸としては、例えば、
スルホキシル酸〔Ｈ₂ＳＯ₂〕、亜硫酸〔Ｈ₂ＳＯ₃〕、チ
オ亜硫酸〔Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₂〕、チオ硫酸〔Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₃〕、亜ジ
チオン酸〔Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₄〕、二亜硫酸〔Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₅〕、ジチ
オン酸〔Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₆〕、二硫酸〔Ｈ₂Ｓ₂Ｏ₇〕及びポリチ
オン酸〔Ｈ₂ＳｘＯ₆（ｘ＝３、４‥‥）〕などが挙げら
れる。

【００２３】本発明において、硫黄を中心原子とするオ
キソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩のこれらの塩
とは、前記の硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこ
のチオ酸のプロトンとして解離しうる水素の一部又は全
部がアルカリ金属、アルカリ土類金属、その他の金属又
は塩基性基で置換された化合物のことである。例えば、
このアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カ
リウム、ルビジウム及びセシウムなどが挙げられ、アル
カリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム、カ
ルシウム、ストロンチウム及びバリウムなどが挙げら
れ、そして塩基性基としては、アンモニウム基などが挙
げられる。

【００２４】これらの塩をより具体的に例示すると、亜
硫酸アンモニウム〔（ＮＨ₄）₂ＳＯ₃〕、亜硫酸カリウ
ム〔Ｋ₂ＳＯ₃〕、亜硫酸カルシウム〔ＣａＳＯ₃〕、亜
硫酸水素アンモニウム〔ＮＨ₄ＨＳＯ₃〕、亜硫酸水素ナ
トリウム〔ＮａＨＳＯ₃〕、亜硫酸ナトリウム〔Ｎａ₂Ｓ
Ｏ₃〕、亜硫酸バリウム〔ＢａＳＯ₃〕、亜硫酸ビスマス
〔Ｂｉ₂（ＳＯ₃）₃〕、亜硫酸水素カリウム〔ＫＨＳ
Ｏ₃〕、チオ硫酸アンモニウム〔（ＮＨ₄）₂Ｓ₂Ｏ₃〕、
チオ硫酸ナトリウム〔Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃〕、チオ硫酸バリウ
ム〔ＢａＳ₂Ｏ₃〕、チオ硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ
₂Ｏ₃〕、チオ硫酸カルシウム〔ＣａＳ₂Ｏ₃〕、チオ硫酸
カリウム〔Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₃〕、亜ジチオン酸ナトリウム〔Ｎ
ａ₂Ｓ₂Ｏ₄〕、亜ジチオン酸カリウム〔Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₄〕、亜
ジチオン酸カルシウム〔ＣａＳ₂Ｏ₄〕、二亜硫酸ナトリ
ウム〔Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₅〕、二亜硫酸カリウム〔Ｋ₂Ｓ
₂Ｏ₅〕、二亜硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ₂Ｏ₅〕、二亜硫
酸カルシウム〔ＣａＳ₂Ｏ₅〕、ジチオン酸ナトリウム
〔Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₆〕、二硫酸カリウム〔Ｋ₂Ｓ₂Ｏ₇〕、二硫
酸ナトリウム〔Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₇〕及び四チオン酸ナトリウ
ム〔Ｎａ₂Ｓ₄Ｏ₆〕などが挙げられる。

【００２５】本発明において、硫黄を中心原子とするオ
キソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩は、チオール
化合物を含むＣＫ活性測定試薬に含有させる。

【００２６】また本発明において、硫黄を中心原子とす
るオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩は、チオ
ール化合物と共存させてＣＫ活性の測定を行う。

【００２７】この硫黄を中心原子とするオキソ酸若しく
はこのチオ酸又はこれらの塩を含有又は共存させる濃度
は、０．００１〜１．０％が適当であり、０．００５〜
０．５％が好ましく、０．０１〜０．２％が特に好まし
い。

【００２８】本発明は、１試薬系及び２試薬系などの多
試薬系のいずれにおいても実施できるが、多試薬系の場
合、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸
又はこれらの塩は、少なくともチオール化合物を含む試
薬に含有又は共存させる必要がある。しかし、チオール
化合物を含まない試薬には含有又は共存させても、させ
なくてもどちらでも良い。

【００２９】本発明において、硫黄を中心原子とするオ
キソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩は、１種類又
は複数種類のものを含有又は共存させることができる。

【００３０】本発明において、チオール化合物は、ＳＨ
基を有する化合物で、ＣＫを活性化又は安定化すること
ができ、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレ
イトール、還元型グルタチオン、システイン、ジチオエ
リスリトール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウ
ム、チオグリセロール、２−チオグルコース、チオグリ
コール酸及び２−メルカプトエタノールなどが挙げら
れ、０．２〜１００ｍＭの濃度で含ませること又は存在
させることが適当である。

【００３１】本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測
定方法は、下記の反応によるＣＫ活性を測定するもので
あればいかなる測定原理のものにおいても実施すること
ができ、かつ効果を得ることができる。

【００３２】

【化４】

【００３３】例えば、下記の反応式（５）、（６）及び
（７）で示される反応により生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
生成速度を３４０ｎｍにおける吸光度の１分間当たりの
変化量より算出する測定原理のもの又は下記の反応式
（５）、（６）、（７）及び（８）で示される反応によ
り生成するホルマザン色素の生成量を可視部の吸光度を
測ることにより求める測定原理のものなどにおいても実
施することができる。

【００３４】

【化５】

【００３５】これらの測定原理において実施する場合、
クレアチンリン酸又はこの塩は５〜２５０ｍＭの濃度
で、ＡＤＰ又はこの塩は０．５〜５０ｍＭの濃度で、グ
ルコースは２〜２００ｍＭの濃度で、ヘキソキナーゼ又
はグルコキナーゼは１００〜３０，０００単位／Ｌの活
性値で、ＮＡＤ⁺若しくはＮＡＤＰ⁺又はこれらの塩は
０．２〜２０ｍＭの濃度で、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼは１００〜３０，０００単位／Ｌの活性
値で、テトラゾリウム塩は０．０２〜５ｍＭの濃度で、
ジアホラーゼは１０〜１０，０００単位／Ｌの活性値で
及び１−メトキシ−フェナジンメトサルフェートは０．
００５〜１．０ｍＭの濃度で用いれば良い。

【００３６】そして、ｐＨは、１試薬系にて測定を行う
場合にはｐＨ５〜ｐＨ８が好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ
７．５とすることが特に好ましい。多試薬系にて測定を
行う場合には試薬を混合した最終反応液のｐＨが、ｐＨ
５〜ｐＨ８となるのが好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．
５となることが特に好ましい。例えば、２試薬系にて測
定を行う場合、第１試薬はｐＨ５〜ｐＨ８の範囲内のｐ
Ｈとすることが好ましく、そして第２試薬はｐＨ６〜ｐ
Ｈ９の範囲内のｐＨとすることが好ましく、かつ第１試
薬と第２試薬を混合した最終反応液のｐＨをｐＨ５〜ｐ
Ｈ８とするのが好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５とす
ることが特に好ましい。

【００３７】なお、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びジアホラ
ーゼは、それぞれ前記の反応式（６）、（７）又は
（８）の反応を触媒するものであれば、いかなる由来の
もの及びいかなる調製法、操作法により得られたものを
も使用することができる。

【００３８】また、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ及
びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによる反応
に必要なマグネシウムイオンを、酢酸マグネシウム、塩
化マグネシウム又は硫酸マグネシウムなどのマグネシウ
ム塩を含ませるか又は存在させることにより用いること
ができ、その濃度は０．５〜１５０ｍＭが適当である。

【００３９】そして、エチレンジアミン四酢酸若しくは
この塩を０．１〜３０ｍＭの濃度で、ジアデノシンペン
タリン酸若しくはこの塩を１〜１００μＭの濃度で、ア
デノシン一リン酸〔ＡＭＰ〕若しくはこの塩を０．５〜
２５ｍＭの濃度で、イミダゾール若しくはグッド緩衝剤
などの緩衝剤を１０〜５００ｍＭの濃度で含ませるか又
は存在させることにより用いても良い。

【００４０】更に、アルブミンなどのタンパク質、糖類
若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウ
ムなどの防腐剤、妨害物質消去剤、界面活性剤、賦形剤
あるいはその他の活性化剤等を含ませるか又は存在させ
ても良い。

【００４１】本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測
定方法においては、下記の反応を触媒する６−ホスホグ
ルコノラクトナーゼを含ませるか又は存在させることも
できる。この場合は前記の反応式（７）の反応を促進で
きる点で好ましい。

【００４２】

【化６】

【００４３】この６−ホスホグルコノラクトナーゼは、
いかなる由来のもの及びいかなる調製法、操作法により
得られたものをも使用することができ、１０〜５０，０
００単位／Ｌの活性値で用いれば良い。

【００４４】本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測
定方法によりＣＫ活性の測定を行う場合において、ＣＫ
活性を測定する生体由来試料としては、例えばヒト又は
動物の血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾
液、汗、涙、腹水、羊水等の体液若しくは心臓、脳等の
臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉若しくは神経等の組織又は
細胞などを挙げることができる。

【００４５】本発明によりＣＫ活性の測定を行う場合、
測定は反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイ
ント法）のいずれによるものでも良く、測定ステップは
１ステップ法又は２ステップ法などの多ステップ法のい
ずれでも良く、測定波長は紫外部及び可視部の適当な波
長を使用することができ、測定反応の温度は３０℃又は
３７℃など測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素
が熱により失活しない範囲内の温度を設定すれば良く、
測定反応の開始方法はクレアチンリン酸若しくはこの塩
などの基質を加えることにより行う方法又は生体由来試
料を加えることにより行う方法などいずれの方法でも良
く、そして測定の手法は用手法又は自動分析装置などの
装置による方法のいずれをも用いることができる。

【００４６】また、本発明によりＣＫ活性の測定を行う
に当たり、溶血試料、ビリルビン高濃度試料又は乳び試
料などの妨害物質含有試料における測定値の誤差を補正
するため、試料ブランク値を差し引く方法により測定を
行っても良く、例えば前記のダブルカイネティック法な
どを用いることもできる。

【００４７】なお、本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ
活性測定方法は、ＭＢ型アイソザイムなどのＣＫアイソ
ザイムの測定及びＣＫのＭ型サブユニットのアイソフォ
ームの測定においても実施することができ、かつ効果を
得ることができる。この場合、Ｍ型若しくはＢ型のサブ
ユニットを阻害する抗体又はＭ型サブユニットの組織型
若しくは血清型のアイソフォームを阻害する抗体を生体
由来試料に含まれるＣＫに作用させ、本発明のＣＫ活性
測定試薬又はＣＫ活性測定方法によりＣＫ活性を測定す
ることによって行うことができる。

【００４８】

【作用】本発明は、チオール化合物を含むＣＫ活性測定
試薬において硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこ
のチオ酸又はこれらの塩を含有することを特徴とするＣ
Ｋ活性測定試薬及びチオール化合物を存在させるＣＫ活
性測定方法において硫黄を中心原子とするオキソ酸若し
くはこのチオ酸又はこれらの塩の共存下で測定を行うこ
とを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定方法であっ
て、長期間安定かつ正確にＣＫ活性を測定することがで
きるなどの効果を有するものであるが、その作用機序は
現在のところ明らかではない。強いて挙げるならば、硫
黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこ
れらの塩が含有又は共存することにより、チオール化合
物が安定化されて、前記の効果が発現されるのではない
かと推測される。

【００４９】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に詳
述するが、本発明はこの実施例によって何ら限定される
ものではない。

【００５０】実施例１ 血清試料のＣＫ活性の測定 チオール化合物であるＮ−アセチルシステインを含み、
硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又は
これらの塩である二亜硫酸カリウムを含有する本発明の
ＣＫ活性測定試薬を調製し、血清試料のＣＫ活性の測定
を行った。

【００５１】（１）ＣＫ活性測定試薬及び血清試料の調
製 第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨを６．００（２０℃）に
調整して第１試薬を調製した。 試薬成分 濃 度 二亜硫酸カリウム（ナカライテスク社製） ０．０３％ Ｎ−アセチルシステイン（ベーリンガーマンハイム社製） ２６．７ｍＭ イミダゾール １００ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ２．０ｍＭ 酢酸マグネシウム（４水和物） １０．０ｍＭ ＡＤＰ一カリウム塩 ２．０ｍＭ ＡＭＰ二ナトリウム塩 ６．６７ｍＭ ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩 １３．３μＭ Ｄ−グルコース（無水） ２０．０ｍＭ ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩 ２．６７ｍＭ ヘキソキナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製、酵母由来）３，９００単位／Ｌ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ユニチカ社製、微生物由来） ２，０００単位／Ｌ アジ化ナトリウム ０．０５％

【００５２】第２試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨを８．００（２０℃）に
調整して第２試薬を調製した。 試薬成分 濃 度 クレアチンリン酸二ナトリウム塩 １２０ｍＭ イミダゾール １２０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ２．０ｍＭ 酢酸マグネシウム（４水和物） １０．０ｍＭ ＡＤＰ一カリウム塩 ２．０ｍＭ Ｄ−グルコース（無水） ２０．０ｍＭ アジ化ナトリウム ０．０５％

【００５３】血清試料の調製 ＣＫ活性値６，０７０単位／Ｌのヒト血清試料をそれぞ
れ０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、
０．５ｍＬ、０．６ｍＬ、０．７ｍＬ、０．８ｍＬ及び
０．９ｍＬ分注し、これらに生理食塩水（０．９％塩化
ナトリウム水溶液）をそれぞれ０．９ｍＬ、０．８ｍ
Ｌ、０．７ｍＬ、０．６ｍＬ、０．５ｍＬ、０．４ｍ
Ｌ、０．３ｍＬ、０．２ｍＬ及び０．１ｍＬ加え混合し
て、１０段階に希釈された血清試料を調製した。

【００５４】（２）血清試料のＣＫ活性の測定 測定は日立製作所社製７１５０型自動分析装置にて行
い、前記のそれぞれの血清試料８μＬに第１試薬３００
μＬを加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬を１
００μＬ添加し３７℃で反応させ、主波長３４０ｎｍ及
び副波長４０５ｎｍにおける第１試薬添加後の試料ブラ
ンク反応の２分３６秒目（１３ポイント）から４分２４
秒目（２２ポイント）までの吸光度の１分間当たりの変
化量及び第２試薬添加後のＣＫ活性による反応の２分１
２秒目（３６ポイント）から５分目（５０ポイント）ま
での吸光度の１分間当たりの変化量よりＣＫ活性値の算
出を行った。（ダブルカイネティック法） なお、血清試料のＣＫ活性値は純水を試料とした時の吸
光度の１分間当たりの変化量を試薬盲検値として、下記
の計算式により求めた。

【００５５】

【数１】

【００５６】また、比較のため従来のＣＫ活性測定試薬
である二亜硫酸カリウムを含有しない第１試薬を調製し
対照試薬として、前記と同様にして血清試料のＣＫ活性
の測定を行った。

【００５７】これらの１０段階に希釈した血清試料の測
定結果を図１に示した。なお、この図１において、横軸
は血清試料の希釈率を、縦軸はＣＫ活性値を表し、そし
て○は本発明のＣＫ活性測定試薬による測定値を、●は
比較のための従来のＣＫ活性測定試薬である二亜硫酸カ
リウムを含有しない対照試薬による測定値を示す。

【００５８】

【図１】

【００５９】この図より、本発明のＣＫ活性測定試薬に
よるＣＫ活性の測定では、検量線が原点を通る直線であ
り、５，９００単位／Ｌ以上まで直線性を有し、かつ硫
黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこ
れらの塩を含有しない従来のＣＫ活性測定試薬によるも
のと同一の測定値を示すことがわかり、ＣＫ活性の測定
において充分な性能を持つことが確かめられた。

【００６０】実施例２ 従来のＣＫ活性測定試薬との相
関 本発明のＣＫ活性測定試薬による測定値と従来のＣＫ活
性測定試薬である日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測
定試薬による測定値との相関を確かめた。

【００６１】（１）本発明のＣＫ活性測定試薬による測
定 実施例１の（１）の及びに記載した方法に従って第
１試薬及び第２試薬を調製し、同じく実施例１の（２）
に記載した方法に従って６９検体のヒト血清試料のＣＫ
活性値の測定を行った。

【００６２】（２）日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性
測定試薬による測定 ＣＫ活性測定試薬の調製 ａ）第１試薬の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水
に溶解し、酢酸でｐＨを６．６０（３０℃）に調整して
第１試薬を調製した。 試薬成分 濃 度 Ｎ−アセチルシステイン（ベーリンガーマンハイム社製） ２３ｍＭ イミダゾール １１５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 ２．３ｍＭ 酢酸マグネシウム（４水和物） １１．３ｍＭ ＡＤＰ一カリウム塩 ２．３ｍＭ ＡＭＰ二ナトリウム塩 ５．８ｍＭ ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩 １１．５μＭ Ｄ−グルコース（無水） ２３ｍＭ ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩 ２．３ｍＭ ヘキソキナーゼ（オリエンタル酵母工業社製、酵母由来） ３，４５０単位／Ｌ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母工業社製、酵母由 来） １，７２５単位／Ｌ

【００６３】ｂ）第２試薬の調製 下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解し
て第２試薬を調製した。 試薬成分 濃 度 クレアチンリン酸二ナトリウム塩 ３４５ｍＭ

【００６４】血清試料のＣＫ活性の測定 前記本実施例の（１）にて測定を行った６９検体のヒト
血清試料を用い、それぞれの０．１０ｍＬに第１試薬
２．００ｍＬを加え３７℃で５分間予備加温を行った
後、３７℃で予備加温しておいた第２試薬を０．２０ｍ
Ｌ添加し３７℃で反応させ、日立製作所社製３２００型
分光光度計を用いて測光した３４０ｎｍにおける第２試
薬添加後のＣＫ活性による反応の２分目から４分目まで
の吸光度の１分間当たりの変化量より、ＣＫ活性値の算
出を行った。なお、血清試料のＣＫ活性値は、第２試薬
の替わりに純水を添加し同様に反応させた時の吸光度の
１分間当たりの変化量を試料ブランク反応による変化量
として、下記の計算式により求めた。

【００６５】

【数２】

【００６６】（３）得られた測定値の相関 前記本実施例の（１）の本発明のＣＫ活性測定試薬によ
る測定値と前記本実施例の（２）の日本臨床化学会常用
基準法ＣＫ活性測定試薬による測定値との相関を図２に
示した。なお、この図２において、横軸（ｘ軸）は日本
臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬による測定値
を、縦軸（ｙ軸）は本発明のＣＫ活性測定試薬による測
定値を表す。

【００６７】

【図２】

【００６８】この図より、本発明のＣＫ活性測定試薬に
よるＣＫ活性の測定と、従来のＣＫ活性測定試薬である
日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬によるＣＫ
活性の測定とでは、回帰式がｙ＝１．０３ｘ＋１．１、
相関係数がｒ＝１．０００と大変良好な相関を示し、同
一の測定値が得られることがわかった。従って、本発明
のＣＫ活性測定試薬によるＣＫ活性の測定値は、臨床検
査及び診断の場において、問題なく用いることができる
ことが確かめられた。

【００６９】実施例３ ２５℃での安定性の確認 本発明のＣＫ活性測定試薬を２５℃にて保存して、その
安定性を確かめた。

【００７０】（１）ＣＫ活性測定試薬の調製 第１試薬の調製 ａ）「０．０１％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％
二亜硫酸Ｎａ試薬」の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従い、０．０３
％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％二亜硫
酸ナトリウム又は０．０３％二亜硫酸ナトリウムを含有
させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１
％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％二亜硫酸Ｎａ試
薬」とした。

【００７１】ｂ）「０．０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及
び「０．０３％亜硫酸水素Ｎａ試薬」の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従い、０．０３
％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸
水素ナトリウム又は０．０３％亜硫酸水素ナトリウムを
含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．
０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸水
素Ｎａ試薬」とした。

【００７２】ｃ）「０．０１％亜硫酸Ｎａ試薬」及び
「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従い、０．０３
％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸
ナトリウム又は０．０３％亜硫酸ナトリウムを含有させ
た２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％亜
硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」とし
た。

【００７３】ｄ）「対照試薬」の調製 比較のため、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこ
のチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸カリウムを含有
しない第１試薬を実施例１の（１）のに記載した方法
に従い調製し、「対照試薬」とした。

【００７４】第２試薬の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従って第２試薬
を調製した。

【００７５】（２）ＣＫ活性測定試薬の保存 前記（１）ののａ）、ｂ）、ｃ）並びにｄ）の７種類
の第１試薬及び前記（１）のの第２試薬を、容量１０
０ｍＬの日立７１５０型自動分析装置用容器にそれぞれ
注入し、蓋をして、２５℃の恒温装置内にて保存した。

【００７６】（３）保存したＣＫ活性測定試薬による測
定 前記（２）の保存した７種類の第１試薬及び第２試薬を
用いて、２種類のヒト血清試料（試料１及び試料２）の
ＣＫ活性値を測定することにより、安定性を確かめた。
保存開始時、保存１カ月後、保存１カ月２週後及び保存
２カ月２週後の４時点において、実施例１の（２）に記
載した方法に従ってＣＫ活性値の測定を行った。

【００７７】この測定の結果を表１に示した。なお、こ
の表において表示した値はＣＫ活性の測定値〔単位／
Ｌ〕であり、またカッコ内の数値はその測定値の保存開
始時の測定値に対する相対比率を表す。

【００７８】

【表１】

【００７９】これより、硫黄を中心原子とするオキソ酸
若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有しない従来の
ＣＫ活性測定試薬は、２５℃での保存１カ月２週後では
保存開始時に比べて９％も測定値が低下してしまい、ま
た２５℃での保存２カ月２週後では１６〜１８％測定値
が低下してしまうのに対して、本発明の硫黄を中心原子
とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含
有するＣＫ活性測定試薬は、２５℃での保存１カ月２週
後においては保存開始時に比べて測定値に変化はなく、
また２５℃での保存２カ月２週後でも測定値の低下が抑
えられていることがわかる。よって、本発明のＣＫ活性
測定試薬による測定では、長期間安定かつ正確にＣＫ活
性の測定を行えることが確かめられた。

【００８０】実施例４ 種々のｐＨのＣＫ活性測定試薬
の２５℃での安定性の確認 種々のｐＨの本発明のＣＫ活性測定試薬を２５℃にて保
存して、その安定性を確かめた。

【００８１】（１）ＣＫ活性測定試薬の調製 第１試薬の調製 ａ）「ｐＨ６．０試薬」の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従い、ｐＨが
６．００（２０℃）の第１試薬を調製し、「ｐＨ６．０
試薬」とした。

【００８２】ｂ）「ｐＨ６．３試薬」の調製 ｐＨをｐＨ６．００からｐＨ６．３０（２０℃）に変え
る他は実施例１の（１）のに記載した方法に従って第
１試薬を調製し、「ｐＨ６．３試薬」とした。

【００８３】ｃ）「ｐＨ６．７試薬」の調製 ｐＨをｐＨ６．００からｐＨ６．７０（２０℃）に変え
る他は実施例１の（１）のに記載した方法に従って第
１試薬を調製し、「ｐＨ６．７試薬」とした。

【００８４】ｄ）「対照試薬」の調製 比較のため、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこ
のチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸カリウムを含有
せず、ｐＨがそれぞれｐＨ６．００（２０℃）、ｐＨ
６．３０（２０℃）又はｐＨ６．７０（２０℃）の３種
類の第１試薬を、実施例１の（１）のに記載した方法
に従い調製し、それぞれ「対照ｐＨ６．０試薬」、「対
照ｐＨ６．３試薬」、「対照ｐＨ６．７試薬」とした。

【００８５】第２試薬の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従って第２試薬
を調製した。

【００８６】（２）ＣＫ活性測定試薬の保存 前記（１）ののａ）、ｂ）、ｃ）並びにｄ）の６種類
の第１試薬及び前記（１）のの第２試薬を、容量１０
０ｍＬの日立７１５０型自動分析装置用容器にそれぞれ
注入し、蓋をして、２５℃の恒温装置内にて保存した。

【００８７】（３）保存したＣＫ活性測定試薬による測
定 前記（２）の保存した６種類の第１試薬及び第２試薬を
用いて、２種類のヒト血清試料（試料１及び試料２）の
ＣＫ活性値を測定することにより、安定性を確かめた。
保存開始時及び保存１カ月後の２時点において、実施例
１の（２）に記載した方法に従ってＣＫ活性値の測定を
行った。

【００８８】この測定の結果を表２に示した。なお、こ
の表において表示した値はＣＫ活性の測定値〔単位／
Ｌ〕であり、またカッコ内の数値はその測定値の保存開
始時の測定値に対する相対比率を表す。

【００８９】

【表２】

【００９０】これより、硫黄を中心原子とするオキソ酸
若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有しない従来の
ＣＫ活性測定試薬は、いずれも２５℃での保存１カ月後
では保存開始時に比べて約１０％前後測定値が低下して
しまうのに対して、本発明の硫黄を中心原子とするオキ
ソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有するＣＫ
活性測定試薬では、第１試薬のｐＨにかかわらずいずれ
のＣＫ活性測定試薬においても、２５℃での保存１カ月
後では保存開始時に比べて測定値にほとんど変化がない
ことがわかる。よって、本発明のＣＫ活性測定試薬によ
る測定では、ＣＫ活性測定試薬のｐＨにかかわらず長期
間安定かつ正確にＣＫ活性の測定を行えることが確かめ
られた。

【００９１】実施例５ ５℃での安定性の確認 本発明のＣＫ活性測定試薬を５℃にて保存して、その安
定性を確かめた。

【００９２】（１）ＣＫ活性測定試薬の調製 第１試薬の調製 ａ）「０．０１％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％
二亜硫酸Ｎａ試薬」の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従い、０．０３
％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％二亜硫
酸ナトリウム又は０．０３％二亜硫酸ナトリウムを含有
させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１
％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％二亜硫酸Ｎａ試
薬」とした。

【００９３】ｂ）「０．０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及
び「０．０３％亜硫酸水素Ｎａ試薬」の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従い、０．０３
％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸
水素ナトリウム又は０．０３％亜硫酸水素ナトリウムを
含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．
０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸水
素Ｎａ試薬」とした。

【００９４】ｃ）「０．０１％亜硫酸Ｎａ試薬」及び
「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従い、０．０３
％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸
ナトリウム又は０．０３％亜硫酸ナトリウムを含有させ
た２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％亜
硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」とし
た。

【００９５】ｄ）「対照試薬」の調製 比較のため、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこ
のチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸カリウムを含有
しない第１試薬を実施例１の（１）のに記載した方法
に従い調製し、「対照試薬」とした。

【００９６】第２試薬の調製 実施例１の（１）のに記載した方法に従って第２試薬
を調製した。

【００９７】（２）ＣＫ活性測定試薬の保存 前記（１）ののａ）、ｂ）、ｃ）並びにｄ）の７種類
の第１試薬及び前記（１）のの第２試薬を、容量１０
０ｍＬの日立７１５０型自動分析装置用容器にそれぞれ
注入し、蓋をして、５℃の冷蔵庫内にて保存した。

【００９８】（３）保存したＣＫ活性測定試薬による測
定 前記（２）の保存した７種類の第１試薬及び第２試薬を
用いて、２種類のヒト血清試料（試料１及び試料２）の
ＣＫ活性値を測定することにより、安定性を確かめた。
硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又は
これらの塩である二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナト
リウム又は亜硫酸ナトリウムの濃度が０．０１％の第１
試薬については保存開始時及び保存６カ月後の２時点に
おいて、また二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウ
ム又は亜硫酸ナトリウムの濃度が０．０３％の第１試薬
については保存開始時、保存６カ月後及び保存９カ月後
の３時点において、実施例１の（２）に記載した方法に
従ってＣＫ活性値の測定を行った。

【００９９】この測定の結果を表３に示した。なお、こ
の表において表示した値はＣＫ活性の測定値〔単位／
Ｌ〕であり、またカッコ内の数値はその測定値の保存開
始時の測定値に対する相対比率を表す。

【０１００】

【表３】

【０１０１】これより、硫黄を中心原子とするオキソ酸
若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有しない従来の
ＣＫ活性測定試薬は、５℃での保存６カ月後では保存開
始時に比べて７％も測定値が低下してしまい、また５℃
での保存９カ月後では１４％測定値が低下してしまうの
に対して、本発明の硫黄を中心原子とするオキソ酸若し
くはこのチオ酸又はこれらの塩を含有するＣＫ活性測定
試薬は、５℃での保存６カ月後においては保存開始時に
比べて測定値にほとんど変化はなく、また５℃での保存
９カ月後でも測定値の低下が抑えられていることがわか
る。よって、本発明のＣＫ活性測定試薬による測定で
は、長期間安定かつ正確にＣＫ活性の測定を行えること
が確かめられた。

【０１０２】

【発明の効果】本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性
測定方法は、その安定性が著しく改善されたものであ
る。

【０１０３】例えば、従来のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ
活性測定方法は、２５℃での保存１カ月２週後では保存
開始時に比べて９％も測定値が低下してしまい、また５
℃での保存６カ月後では保存開始時に比べて７％も測定
値が低下してしまって、長期間使用することができない
のに対して、本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測
定方法はほとんど測定値の低下を示さず長期間正確な測
定値を得ることができる。

【０１０４】つまり、本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣ
Ｋ活性測定方法は、安価であり、悪臭を有さず、液状試
薬と凍結乾燥試薬の両方の試薬形態に適用でき、溶血試
料におけるアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正す
ることができるダブルカイネティック法を適用でき、長
期間安定でありかつ長期間正確にＣＫ活性の測定を行う
ことができるという効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＣＫ活性測定試薬による測定及び従来
のＣＫ活性測定試薬による測定の直線性を示したグラフ
である。

【図２】本発明のＣＫ活性測定試薬による測定と日本臨
床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬による測定との相
関を示したグラフである。

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ
   活性測定試薬において、硫黄を中心原子とするオキソ酸
   若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有することを特
   徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
2. 【請求項２】硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこ
   のチオ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チ
   オ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸
   又はポリチオン酸である請求項１記載のクレアチンキナ
   ーゼ活性測定試薬。
3. 【請求項３】チオール化合物を存在させるクレアチンキ
   ナーゼ活性測定方法において、硫黄を中心原子とするオ
   キソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩の共存下で測
   定を行うことを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定
   方法。
4. 【請求項４】硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこ
   のチオ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チ
   オ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸
   又はポリチオン酸である請求項３記載のクレアチンキナ
   ーゼ活性測定方法。