JP4182859B2 - クレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットおよびその安定化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、クレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットおよびその安定化方法に関する。更に詳細には、長期間安定なクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットであって、血清や血漿などの検体中に存在するミオキナーゼに影響されることなく、簡便にかつ正確に検体中のクレアチンキナーゼを測定することのできるクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キット、およびその安定化方法に関する。
クレアチンキナーゼ（以下、ＣＰＫと略記することもある）は、骨格筋、心筋、平滑筋、脳などに分布する酵素であり、クレアチンがＡＴＰの存在によりクレアチンリン酸に変換する反応を触媒しており、エネルギー代謝上重要な役割を果している。進行性筋ジストロフィー症、多発性筋症、急性心筋梗塞、甲状腺機能低下症などにおいては、ＣＰＫは高値を示し、ＣＰＫは筋障害、中でも心疾患を検出するための重要なマーカーとなっており、従ってＣＰＫ測定は従来から日常臨床検査において重要な項目となっている。
ＣＰＫの測定法としては、分析機器の性能の向上に伴い、ＵＶ法と言われる方法が広く使用されている。この測定方法は日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）より勧告法（非特許文献１）が提唱されており、この勧告法に基づいて各種の測定試薬が販売されている。これら従来のＣＰＫ測定は以下に示す反応式に基づいている。
ＣＰＫ：クレアチンキナーゼ
ＡＤＰ：アデノシン５’−二リン酸
ＡＴＰ：アデノシン５’−三リン酸
ＨＫ：ヘキソキナーゼ
ＮＡＤＰ＋：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
ＮＡＤＰＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
Ｇ６ＰＤＨ：グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素
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ＮＡＤＰＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
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即ち、検体中に存在するＣＰＫに対して、基質であるクレアチンリン酸とＡＤＰを作用させてクレアチンとＡＴＰに変換し、ここで生成するＡＴＰを、へキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水酵素により、ＮＡＤＰＨに導き、最終的に生成するＮＡＤＰＨを３４０ｎｍでの吸光度により測定して、検体中のＣＰＫを測定する。なお、ヘキソキナーゼに代えてグルコキナーゼを用いることもでき、またＮＡＤＰ＋に代えてＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を用いることもできる。ＮＡＤ＋を用いた場合には、最終的に生成するＮＡＤＨを３４０ｎｍでの吸光度により測定する。このようにしてＣＰＫを測定する際には、ＣＰＫは血清や血漿などの検体中においては不活性化されているため、活性化剤として、２−メルカプトール、還元型グルタチオン、ジチオトレイトール、チオグリセロールなどのチオール化合物を検体に添加する必要がある。上記した日本臨床化学会の勧告法では、活性化剤としてＮ−アセチルシステインが用いられている。
上記の反応式に基づいてＣＰＫを測定するために用いる測定用試薬は、通常各試薬を二つの試薬成分に分け、自動分析装置などに供されている。試薬成分を第一試薬、第二試薬に分ける際には、それぞれの試薬の安定性や、ＣＰＫ測定の際に妨害物質として作用する血清や血漿などの検体中に存在するミオキナーゼの影響を除くためのダブルカイネティック法と呼ばれる測定法などが考慮されて、それぞれの試薬組成、濃度が決定される。ミオキナーゼの影響を除くためのダブルカイネティック法は、検体中のミオキナーゼに、ＡＤＰを作用させてＡＴＰを発生させ、発生したＡＴＰを上記反応式で示したようにＣＰＫ測定の場合と同様にしてＮＡＤＰＨに導き、あらかじめ、ミオキナーゼの影響をＡＴＰ発生速度として測定しておき、その後に、ＣＰＫを測定する方法である。
近年、臨床検査薬の液状化が進み、長期間安定性を有する液状試薬が望まれるようになり、ＣＰＫ測定試薬においても同様であり、ＣＰＫ測定用液状試薬の安定化にはこれまでいろいろな方法が考えられてきた。例えば、特許文献１に提案されているように、ＣＰＫ活性化剤として推奨されているＮ−アセチルシステインを、やや強い酸性溶液中に保存する方法が挙げられる。しかし、この方法は第二試薬にＣＰＫ活性化剤を含むことになるため、ＣＰＫ測定の際にはラグタイムが発生する。また、この方法においては、検体中のミオキナーゼの影響を排除できないなどの問題がある。
更に、特許文献２にあるように、安定化剤として有機または無機イオウ化合物を添加する方法も提案されているが、問題の根本的な解決には至っていないといえる。例えば、添加するイオウ化合物自体が濃度によって、Ｎ−アセチルシステインとともにＣＰＫ活性化剤として働き、測定値が高くなる場合や逆にＣＰＫ阻害剤として働く場合がある。そのため、イオウ化合物を添加することで、ヒト血清や管理血清測定値が変動してしまい、上記した日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法による測定値と差が生じるため、標準液によって測定値の補正が必要になり、測定者の負担が大きくなるなどの問題がある。
一方、特許文献３には、ＮＡＤＰ＋、グルコース、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素を一つの成分中には含まず、更に、チオグリセロールを用いたＣＰＫ測定試薬が記載されている。しかし、この方法では、検体中のミオキナーゼの影響を排除できないという問題がある。
臨床化学、１９（２）、１８４−２０８（１９９０） 欧州特許公開０６８６５６１号公報
特表２００３−５１７２６４号公報
特開２０００−１８９１９５
一方、特許文献３には、ＮＡＤＰ＋、グルコース、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素を一つの成分中には含まず、更に、チオグリセロールを用いたＣＰＫ測定試薬が記載されている。しかし、この方法では、検体中のミオキナーゼの影響を排除できないという問題がある。
臨床化学、１９（２）、１８４−２０８（１９９０）
そこで、本発明の目的は、長期間安定なＣＰＫ測定用液状試薬キットであって、検体中のミオキナーゼの影響を排除し、かつ、標準液による補正が不必要であり、簡便でかつ正確なＣＰＫの測定を可能にするＣＰＫ測定用液状試薬キットおよびその安定化方法を提供することにある。
特許文献３には、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＮＡＤＰ＋、グルコースを一つの成分中に含むと、問題があると記載されている。本発明者らは、グルコースあるいは場合によりＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を特定の低濃度範囲でグルコース−６−リン酸脱水素酵素と共存させた場合には、測定用液状試薬は長期間安定となり、またＣＰＫ測定の際にミオキナーゼの影響も有効に排除でき、従って目的とするＣＰＫ測定用液状試薬およびその安定化方法が達成できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、第一試薬として、グルコース、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アデノシン５’−二リン酸、ヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼ、Ｎ−アセチルシステイン、およびＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含み、第二試薬として、クレアチンリン酸、およびグルコースを含む２試薬系のクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットにおいて、
ｉ）第一試薬中のグルコース濃度が０．０５〜０．４ｍＭであり、かつ、
ｉｉ）第二試薬中のグルコースの濃度が、第一試薬と第二試薬とを混合した時のグルコース終濃度で１６〜２５ｍＭになるように調整されている
ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットである。
ｉ）第一試薬中のグルコース濃度が０．０５〜０．４ｍＭであり、かつ、
ｉｉ）第二試薬中のグルコースの濃度が、第一試薬と第二試薬とを混合した時のグルコース終濃度で１６〜２５ｍＭになるように調整されている
ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットである。
更に本発明は、第一試薬として、グルコース、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アデノシン５’−二リン酸、ヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼ、Ｎ−アセチルシステイン、およびＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含み、第二試薬として、クレアチンリン酸、およびグルコースを含む２試薬系のクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットの安定化方法であって、
ｉ）第一試薬中のグルコース濃度を０．０５〜０．４ｍＭとし、かつ、
ｉｉ）第二試薬中のグルコースの濃度を、第一試薬と第二試薬とを混合した時のグルコース終濃度で１６〜２５ｍＭになるように調整する
ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットの安定化方法である。
ｉ）第一試薬中のグルコース濃度を０．０５〜０．４ｍＭとし、かつ、
ｉｉ）第二試薬中のグルコースの濃度を、第一試薬と第二試薬とを混合した時のグルコース終濃度で１６〜２５ｍＭになるように調整する
ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットの安定化方法である。
本発明により、長期間安定なＣＰＫ測定用液状試薬キットであり、かつ、簡単で正確にＣＰＫを測定できるＣＰＫ測定用液状試薬キットが提供される。例えば、本発明のＣＰＫ測定用測定液状試薬キットは、安定化剤として有機または無機イオウ化合物を用いる必要がないため、標準液による補正を必要とせずきわめて簡単にＣＰＫを測定できる。更に本発明のＣＰＫ測定用液状試薬キットは、血清や血漿などの検体中のミオキナーゼに影響されることなく、正確にＣＰＫを測定することができる。
以下、発明を更に詳細に説明する。
先ず、本発明のＣＰＫ測定用液状キット試薬を用いた血清や血漿などの検体中のＣＰＫ測定には、ダブルカイネティック法が採用されるため、説明の便宜上、このダブルカイネティック法を先に説明し、その後に、本発明のＣＰＫ測定用試薬キットおよびその安定化方法について説明する。
先ず、本発明のＣＰＫ測定用液状キット試薬を用いた血清や血漿などの検体中のＣＰＫ測定には、ダブルカイネティック法が採用されるため、説明の便宜上、このダブルカイネティック法を先に説明し、その後に、本発明のＣＰＫ測定用試薬キットおよびその安定化方法について説明する。
ダブルカイネティック法で血清や血漿などの検体中のクレアチンキナーゼを測定する原理を以下に説明する。まず第一段階として、検体に第一試薬を添加すると、検体中にＣＰＫ測定の際の妨害物質として存在するミオキナーゼは、マグネシウムとアデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）存在下でＡＴＰを発生させる。この段階でのＡＴＰ発生速度をあらかじめ測定しておく。この段階では、第一試薬にクレアチンリン酸が存在しないので、検体中のクレアチンキナーゼからは、ＡＴＰは発生しない。次いで、第二段階として、得られる混合液に、クレアチンリン酸を含む第二試薬を加える。これにより、検体中のクレアチンキナーゼからＡＴＰが発生し始める。この段階でのＡＴＰ発生速度を測定する。この段階でもミオキナーゼからは第一段階から引き続いてＡＴＰが発生し続ける。つまり、第二段階では、クレアチンキナーゼとミオキナーゼの両方の酵素からＡＴＰが生成するので、ＡＴＰ速度を合わせて測定していることになる。従って、検体中のクレアチンキナーゼによりＡＴＰを発生する速度は、第二段階のＡＴＰ発生速度から第一段階のミオキナーゼによるＡＴＰ発生速度を差し引くことにより求めることができる。これにより、検体中にミオキナーゼが存在していても、クレアチンキナーゼを正確に測定することができる。
第一段階および第二段階で発生するＡＴＰは、共役酵素であるヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼとグルコースにより、グルコース‐６‐リン酸に変換される。さらに、変換されたグルコース‐６‐リン酸はグルコース‐６‐リン酸脱水素酵素により、6-ホスホグルコン酸に変換される。このとき補酵素ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋は還元されてＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨになる。この反応で生成されるＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨの増加速度を波長３４０ｎｍの吸光度の増加速度として測定することで、ＡＴＰ発生速度としてとらえることができ、この発生速度に比例するＣＰＫ活性を求めることができる。
第一段階および第二段階で発生するＡＴＰは、共役酵素であるヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼとグルコースにより、グルコース‐６‐リン酸に変換される。さらに、変換されたグルコース‐６‐リン酸はグルコース‐６‐リン酸脱水素酵素により、6-ホスホグルコン酸に変換される。このとき補酵素ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋は還元されてＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨになる。この反応で生成されるＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨの増加速度を波長３４０ｎｍの吸光度の増加速度として測定することで、ＡＴＰ発生速度としてとらえることができ、この発生速度に比例するＣＰＫ活性を求めることができる。
本発明のＣＰＫ測定用液状試薬キットは、上記したダブルカイネティック法によりＣＰＫを測定するために用いられるものであり、第一試薬として、グルコース、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、アデノシン５’−二リン酸（ＡＤＰ）、共役酵素であるヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼ、ＣＰＫ活性化剤であるＮ−アセチルシステイン、および補酵素であるＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含み、第二試薬として、ＣＰＫの基質であるクレアチンリン酸、およびグルコース、場合により更にＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含む。
各試薬成分の濃度は、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に基づく場合には、第一試薬および第二試薬の測定に供されるそれぞれの試薬量により計算で求めることができる。
第一試薬の緩衝液は、従来公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、ｐＨ６．０〜８．０に緩衝能を持つ緩衝液、たとえばＩＦＣＣ、ＪＳＣＣ勧告法に使用されるｐＨ６．０〜８．０のイミダゾール緩衝液であれば何ら問題なく使用することができる。また、複数の緩衝液を組み合わせて第一試薬のｐＨをｐＨ６．０〜８．０に設定することもできる。第一試薬のｐＨは、安定性の点からｐＨ６．０〜７．０が好ましい。第二試薬の緩衝液も、公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、第一試薬と同様にイミダゾールなどが使用できる。また、緩衝液のｐＨは特に規定されないが、第一試薬と混合した際にｐＨ６．６付近となるようにｐＨおよび緩衝液濃度を設定するのが好ましい。
各試薬成分の濃度は、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に基づく場合には、第一試薬および第二試薬の測定に供されるそれぞれの試薬量により計算で求めることができる。
第一試薬の緩衝液は、従来公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、ｐＨ６．０〜８．０に緩衝能を持つ緩衝液、たとえばＩＦＣＣ、ＪＳＣＣ勧告法に使用されるｐＨ６．０〜８．０のイミダゾール緩衝液であれば何ら問題なく使用することができる。また、複数の緩衝液を組み合わせて第一試薬のｐＨをｐＨ６．０〜８．０に設定することもできる。第一試薬のｐＨは、安定性の点からｐＨ６．０〜７．０が好ましい。第二試薬の緩衝液も、公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、第一試薬と同様にイミダゾールなどが使用できる。また、緩衝液のｐＨは特に規定されないが、第一試薬と混合した際にｐＨ６．６付近となるようにｐＨおよび緩衝液濃度を設定するのが好ましい。
本発明においては、第一試薬中のグルコース濃度は、０．０５〜０．４ｍMであり、好ましくは０．０５〜０．３ｍＭ、特に好ましくは０．１〜０．２５ｍＭである。０．４ｍＭを超えると試薬の安定性が悪くなりやすく、０．０５ｍＭ未満であると検体中のミオキナーゼの影響を受けやすくなる。また、第二試薬中のグルコース濃度は、第一試薬と第二試薬とを合わせたときの濃度が１６〜２５ｍＭとなるように調整され、好ましくは２０ｍＭ程度になるように調整される。第一試薬および第二試薬のグルコース濃度をこのようにすることにより、液状試薬キットの安定化が図れ、かつ検体中のＣＰＫ測定の際の妨害物質であるミオキナーゼの影響を排除することができる。
本発明においては、第一試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋の濃度は通常０．０１〜５ｍＭ、好ましくは、０．０１〜０．６ｍＭである。第二試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋の濃度は、終濃度で好ましくは１〜５ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ程度になるように調整される。第一試薬および第二試薬のグルコース濃度と共に、ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋の濃度をこのようにすることにより、更に、液状試薬キットの安定化が図れ、かつ検体中のＣＰＫ測定の際の妨害物質であるミオキナーゼの影響を排除することができる。
本発明においては、第一試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋の濃度は通常０．０１〜５ｍＭ、好ましくは、０．０１〜０．６ｍＭである。第二試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋の濃度は、終濃度で好ましくは１〜５ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ程度になるように調整される。第一試薬および第二試薬のグルコース濃度と共に、ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋の濃度をこのようにすることにより、更に、液状試薬キットの安定化が図れ、かつ検体中のＣＰＫ測定の際の妨害物質であるミオキナーゼの影響を排除することができる。
本発明においては、Ｎ−アセチルシステインは第一試薬に含まれる。検体中のクレアチニンキナーゼを第一段階であらかじめ活性化しておくためである。第一試薬中に含まれるＮ−アセチルシステイン濃度は、終濃度で好ましくは２〜１００ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭとなる濃度である。
本発明に用いられるヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼとしては、その由来は特に限定されない。第一試薬中のヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼ濃度は、終濃度で通常１０００Ｕ／ｌ以上となる濃度が好ましく、更に好ましくは終濃度で１５００〜５０００Ｕ／ｌである。同様に、グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素としては、その由来は特に限定されない。グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素の濃度としては、終濃度が通常５００Ｕ／ｌ以上、好ましくは終濃度１０００〜５０００Ｕ／ｌとなる濃度である。
第二試薬に用いるクレアチンリン酸の濃度は、終濃度で通常１〜５００ｍＭ、好ましくは終濃度１０〜１００ｍＭとなる濃度である。
本発明に用いられるヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼとしては、その由来は特に限定されない。第一試薬中のヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼ濃度は、終濃度で通常１０００Ｕ／ｌ以上となる濃度が好ましく、更に好ましくは終濃度で１５００〜５０００Ｕ／ｌである。同様に、グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素としては、その由来は特に限定されない。グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素の濃度としては、終濃度が通常５００Ｕ／ｌ以上、好ましくは終濃度１０００〜５０００Ｕ／ｌとなる濃度である。
第二試薬に用いるクレアチンリン酸の濃度は、終濃度で通常１〜５００ｍＭ、好ましくは終濃度１０〜１００ｍＭとなる濃度である。
上記の第一試薬および第二試薬には、上記の成分の他に、必要により、一般的に添加される成分である、ＥＤＴＡ等のキレート化剤やアジ化ナトリウムなどの防腐剤、各種界面活性化剤を適宜添加することができる。また、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法にて規定されているヘキソキナーゼの活性化剤であるマグネシウムイオン、ミオキナーゼの阻害剤（ＡＭＰ、ＡＰ５Ａ等）を適宜添加することができる。
このように第一試薬および第二試薬で構成されたＣＰＫ測定用液状試薬キットによって、血清や血漿などの検体中のＣＰＫの測定に供される。本発明の測定用液状試薬キットを用いて検体中のＣＰＫを測定する場合、用いる検体と第一試薬と第二試薬の容量比は、使用する自動分析装置により異なるが、通常１：（１０〜１００）：（３〜２５）である。
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
このように第一試薬および第二試薬で構成されたＣＰＫ測定用液状試薬キットによって、血清や血漿などの検体中のＣＰＫの測定に供される。本発明の測定用液状試薬キットを用いて検体中のＣＰＫを測定する場合、用いる検体と第一試薬と第二試薬の容量比は、使用する自動分析装置により異なるが、通常１：（１０〜１００）：（３〜２５）である。
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
グルコースに対するＣＰＫ測定試薬の安定性
グルコースに対するＣＰＫ測定用液状試薬の安定性を検証した。即ち、１００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．６０）にグルコース以外の各試薬を添加した試薬に対して、グルコースを２０ｍＭから０．２ｍＭまで適宜添加した第一試薬を調製した。第二試薬は、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．２０）にクレアチンリン酸、グルコースを添加した試薬を調製した。なお、第二試薬のグルコースは、第一試薬と混合した際に、この混合液中のグルコース濃度が２０ｍＭとなるように添加した。試薬組成は下記に記した。これらの試薬組成、濃度は日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に基づいている。
グルコースに対するＣＰＫ測定用液状試薬の安定性を検証した。即ち、１００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．６０）にグルコース以外の各試薬を添加した試薬に対して、グルコースを２０ｍＭから０．２ｍＭまで適宜添加した第一試薬を調製した。第二試薬は、１００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．２０）にクレアチンリン酸、グルコースを添加した試薬を調製した。なお、第二試薬のグルコースは、第一試薬と混合した際に、この混合液中のグルコース濃度が２０ｍＭとなるように添加した。試薬組成は下記に記した。これらの試薬組成、濃度は日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に基づいている。
第一試薬組成
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ６．６０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
ＮＡＤＰ＋ ２．５５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５５ｍＭ
ＡＭＰ ６．３７５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．７５μＭ
Ｎ−アセチルシステイン ２５．５ｍＭ
ヘキソキナーゼ ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素 ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース ２０ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、
０．３ｍＭ、０．２ｍＭまたは０．１ｍＭ
第二試薬組成
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ８．２０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
クレアチンリン酸 １５３ｍＭ
グルコース ２０ｍＭ、９６ｍＭ、９８ｍＭ、
９８．８ｍＭ、９９．２ｍＭまたは
９９．６ｍＭ
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ６．６０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
ＮＡＤＰ＋ ２．５５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５５ｍＭ
ＡＭＰ ６．３７５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．７５μＭ
Ｎ−アセチルシステイン ２５．５ｍＭ
ヘキソキナーゼ ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素 ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース ２０ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、
０．３ｍＭ、０．２ｍＭまたは０．１ｍＭ
第二試薬組成
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ８．２０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
クレアチンリン酸 １５３ｍＭ
グルコース ２０ｍＭ、９６ｍＭ、９８ｍＭ、
９８．８ｍＭ、９９．２ｍＭまたは
９９．６ｍＭ
ＣＰＫの活性は日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料としてコントロール血清４μＬに対し第一試薬１６０μＬ、第二試薬４０μＬを反応させ、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍとし、該分析装置のダブルカイネティック機能で１０〜１６および２４〜３４測光ポイント間（Ｒ１添加後３分後から５分後およびＲ２添加後３分後から５分後に相当）において、それぞれの吸光度変化率を追跡した。ＣＰＫの活性値は分析装置内で下記式より算出される。
ＣＰＫ活性値（ＩＵ／Ｌ）＝{（ΔＥ２／ｍｉｎ）／ε×（Ｖ２／ｖ）×１０６}−{（ΔＥ１／ｍｉｎ）／ε×（Ｖ１／ｖ）×１０６}
ΔＥ１／ｍｉｎ：１０〜１６ポイント間の１分間あたりの吸光度変化率
ΔＥ２／ｍｉｎ：２４〜３４ポイント間の１分間あたりの吸光度変化率
ε：モル分子吸光係数（ＮＡＤＰＨの場合、６．２２×１０３ Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）
Ｖ１：反応液量（試料＋第一試薬）
Ｖ２：反応液量（試料＋第一試薬＋第二試薬）
ｖ：試料液量
ＣＰＫ活性値（ＩＵ／Ｌ）＝{（ΔＥ２／ｍｉｎ）／ε×（Ｖ２／ｖ）×１０６}−{（ΔＥ１／ｍｉｎ）／ε×（Ｖ１／ｖ）×１０６}
ΔＥ１／ｍｉｎ：１０〜１６ポイント間の１分間あたりの吸光度変化率
ΔＥ２／ｍｉｎ：２４〜３４ポイント間の１分間あたりの吸光度変化率
ε：モル分子吸光係数（ＮＡＤＰＨの場合、６．２２×１０３ Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）
Ｖ１：反応液量（試料＋第一試薬）
Ｖ２：反応液量（試料＋第一試薬＋第二試薬）
ｖ：試料液量
調製した第一試薬および第二試薬は冷蔵(４℃)にて９ヶ月間保存しその後にＣＰＫ測定に用いた。
ＣＰＫ測定用液状試薬の安定性は、コントロール血清の測定値の変動として確認した。なお、コントロール血清はＪＳＣＣ準拠法で測定したときＣＲＰ活性値が１５４ＩＵ/Ｌのものを使用し、ＣＰＫ活性値の変動を防ぐため−８０℃にて保存した。ＣＰＫ活性値の結果を表１に示す。
ＣＰＫ測定用液状試薬の安定性は、コントロール血清の測定値の変動として確認した。なお、コントロール血清はＪＳＣＣ準拠法で測定したときＣＲＰ活性値が１５４ＩＵ/Ｌのものを使用し、ＣＰＫ活性値の変動を防ぐため−８０℃にて保存した。ＣＰＫ活性値の結果を表１に示す。
表１に示したように、第一試薬中のグルコース濃度が０．５ｍＭ以上になると、コントロール血清測定値が調製後９ヶ月目には低下してしまうことがわかる。したがって、第一試薬中のグルコース濃度は０．４ｍＭ以下が望ましいといえる。
ミオキナーゼの影響
第一試薬中のグルコース濃度を変化させた場合のミオキナーゼの影響を検証した。前述したように、ミオキナーゼの反応により生成されるＡＴＰはグルコースとヘキソキナーゼの作用およびグルコース‐６‐リン酸脱水素酵素により、最終的にＮＡＤＰＨが生成される。ダブルカイネティック法では、この反応のためにグルコースを消費することになるので、第一試薬中のグルコース濃度を低下させたときに、ミオキナーゼの影響としてＣＰＫ測定値へ影響を及ぼす可能性があると考えられるため実験を行った。
ＣＰＫ測定試薬は実施例１にて調製した試薬をそのまま使用した。試料は、コントロール血清にミオキナーゼを０〜５００Ｕ／Ｌまで添加したものを使用した（容量比１００：７）。また、ＣＰＫ活性値はダブルカイネティック法を用い、実施例１と同様に算出した。結果を表２に示す。
第一試薬中のグルコース濃度を変化させた場合のミオキナーゼの影響を検証した。前述したように、ミオキナーゼの反応により生成されるＡＴＰはグルコースとヘキソキナーゼの作用およびグルコース‐６‐リン酸脱水素酵素により、最終的にＮＡＤＰＨが生成される。ダブルカイネティック法では、この反応のためにグルコースを消費することになるので、第一試薬中のグルコース濃度を低下させたときに、ミオキナーゼの影響としてＣＰＫ測定値へ影響を及ぼす可能性があると考えられるため実験を行った。
ＣＰＫ測定試薬は実施例１にて調製した試薬をそのまま使用した。試料は、コントロール血清にミオキナーゼを０〜５００Ｕ／Ｌまで添加したものを使用した（容量比１００：７）。また、ＣＰＫ活性値はダブルカイネティック法を用い、実施例１と同様に算出した。結果を表２に示す。
表２に示したように、第一試薬中のグルコース濃度に関わらず測定値に変動がないことから、ミオキナーゼの影響はないといえる。つまり、第一試薬中のグルコース濃度を０．１ｍＭという低濃度にした場合でも、ダブルカイネティック法での測定に全く支障がないことがわかる。
グルコースおよびＮＡＤＰ ＋ に対するＣＰＫ測定試薬の安定性
グルコースおよびＮＡＤＰ＋に対するＣＰＫ測定試薬の安定性を検証した。即ち、１００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．６０）にＮＡＤＰ＋以外の各試薬を添加した試薬に対して、ＮＡＤＰ＋を２．５５ｍＭから０．２５５ｍＭまで適宜濃度添加した第一試薬を調製した。なお、グルコース濃度は０．２ｍＭとした。第二試薬は、１００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２０）にクレアチンリン酸、グルコース、ＮＡＤＰ＋を添加した試薬を調製した。第二試薬のＮＡＤＰ＋濃度は、第一試薬と混合した際に、この混合液中のＮＡＤＰ＋濃度が２ｍＭとなるように添加した。試薬組成は下記に記した。これらの試薬組成、濃度は実施例１と同様に日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に基づいている。また、調製した第一試薬および第二試薬は実施例１と同様に９ヶ月間冷蔵保存した。
グルコースおよびＮＡＤＰ＋に対するＣＰＫ測定試薬の安定性を検証した。即ち、１００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．６０）にＮＡＤＰ＋以外の各試薬を添加した試薬に対して、ＮＡＤＰ＋を２．５５ｍＭから０．２５５ｍＭまで適宜濃度添加した第一試薬を調製した。なお、グルコース濃度は０．２ｍＭとした。第二試薬は、１００ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２０）にクレアチンリン酸、グルコース、ＮＡＤＰ＋を添加した試薬を調製した。第二試薬のＮＡＤＰ＋濃度は、第一試薬と混合した際に、この混合液中のＮＡＤＰ＋濃度が２ｍＭとなるように添加した。試薬組成は下記に記した。これらの試薬組成、濃度は実施例１と同様に日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に基づいている。また、調製した第一試薬および第二試薬は実施例１と同様に９ヶ月間冷蔵保存した。
第一試薬組成
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ６．６０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
ＮＡＤＰ＋ ２．５５ｍＭ、１．２７５ｍＭ、
０．５１ｍＭまたは０．２５５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５５ｍＭ
ＡＭＰ ６．３７５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．７５μＭ
Ｎ−アセチルシステイン ２５．５ｍＭ
ヘキソキナーゼ ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素 ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース ０．２ｍＭ
第二試薬組成
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ８．２０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
クレアチンリン酸 １５３ｍＭ
グルコース ９９．２ｍＭ
ＮＡＤＰ＋ ０ｍＭ、５．１ｍＭ、８．１６ｍＭまたは
９．１８ｍＭ
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ６．６０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
ＮＡＤＰ＋ ２．５５ｍＭ、１．２７５ｍＭ、
０．５１ｍＭまたは０．２５５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５５ｍＭ
ＡＭＰ ６．３７５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．７５μＭ
Ｎ−アセチルシステイン ２５．５ｍＭ
ヘキソキナーゼ ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース‐６‐リン酸脱水素酵素 ３８２５Ｕ／Ｌ
グルコース ０．２ｍＭ
第二試薬組成
イミダゾール １００ｍＭ ｐＨ８．２０
酢酸マグネシウム四水和物 １０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ ２ｍＭ
クレアチンリン酸 １５３ｍＭ
グルコース ９９．２ｍＭ
ＮＡＤＰ＋ ０ｍＭ、５．１ｍＭ、８．１６ｍＭまたは
９．１８ｍＭ
ＣＰＫ活性値はダブルカイネティック法を用い、実施例１と同様に算出した。
また、測定試料も実施例１と同一のコントロール血清を使用し、調製後９ヶ月目まで測定し、ＣＰＫ測定試薬の安定性を検証した。結果を表３に示す。
また、測定試料も実施例１と同一のコントロール血清を使用し、調製後９ヶ月目まで測定し、ＣＰＫ測定試薬の安定性を検証した。結果を表３に示す。
表３に示したように、特に第一試薬中のグルコース濃度が０．２ｍMで、ＮＡＤＰ＋濃度が０．０１ｍＭ〜０．６ｍＭの時に、コントロール血清測定値は調製後９ヶ月目まで低下しないことがわかる。
ミオキナーゼの影響
実施例２にて述べたように、ダブルカイネティック法を用いる測定では第一試薬中のＮＡＤＰ＋もグルコースと同様に消費されるため、第一試薬中のＮＡＤＰ＋濃度を変化させた場合のミオキナーゼの影響を検証した。
ＣＰＫ測定試薬は実施例３にて調製した試薬をそのまま使用した。試料は、実施例２と同様に、コントロール血清にミオキナーゼを０〜５００Ｕ／Ｌまで添加したものを使用した。また、ＣＰＫ活性値はダブルカイネティック法を用い算出した。結果を表４に示す。
実施例２にて述べたように、ダブルカイネティック法を用いる測定では第一試薬中のＮＡＤＰ＋もグルコースと同様に消費されるため、第一試薬中のＮＡＤＰ＋濃度を変化させた場合のミオキナーゼの影響を検証した。
ＣＰＫ測定試薬は実施例３にて調製した試薬をそのまま使用した。試料は、実施例２と同様に、コントロール血清にミオキナーゼを０〜５００Ｕ／Ｌまで添加したものを使用した。また、ＣＰＫ活性値はダブルカイネティック法を用い算出した。結果を表４に示す。
表４に示したように、第一試薬中のＮＡＤＰ＋濃度に関わらず測定値に変動がないことから、ミオキナーゼの影響はないといえる。つまり、第一試薬中のＮＡＤＰ＋濃度を０．２５５ｍＭという低濃度にした場合でも、ダブルカイネティック法での測定に全く支障がないことがわかる。
以上に詳細に説明した通り、本発明により、長期間安定なＣＰＫ測定用液状試薬キットであり、かつ、簡単で正確にＣＰＫを測定できるＣＰＫ測定用液状キットが提供される。本発明のＣＰＫ測定用測定液状試薬キットは、安定化剤として有機または無機イオウ化合物を用いる必要がないため、標準液による補正を必要とせずきわめて簡単にＣＰＫを測定できる。更に本発明のＣＰＫ測定用液状試薬キットは、血清や血漿などの検体中のミオキナーゼに影響されることなく、正確にＣＰＫを測定することができる。
Claims (5)
- 第一試薬として、グルコース、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アデノシン５’−二リン酸、ヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼ、Ｎ−アセチルシステイン、およびＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含み、第二試薬として、クレアチンリン酸、およびグルコースを含む２試薬系のクレアチンキナーゼ測定用液状キットにおいて、
ｉ）第一試薬中のグルコース濃度が０．０５〜０．４ｍＭであり、かつ、
ｉｉ）第二試薬中のグルコースの濃度が、第一試薬と第二試薬とを混合した時のグルコース終濃度で１６〜２５ｍＭになるように調整されている
ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キット。 - 第一試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋濃度が０．０１〜０．６ｍＭであり、かつ、第二試薬がＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含み、第二試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋濃度が、第一試薬と第二試薬とを混合した時の終濃度で１〜５ｍＭになるように調整されている請求項１の液状試薬キット。
- 検体中のクレアチンキナーゼ測定の際に、標準液による測定値の補正が必要とされる安定化剤を実質的に含むことなく安定化され、かつ、検体中のクレアチンキナーゼを測定する際に検体中のミオキナーゼの影響を排除できる請求項１または２の液状試薬キット。
- 第一試薬として、グルコース、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アデノシン５’−二リン酸、ヘキソキナーゼもしくはグルコキナーゼ、Ｎ−アセチルシステイン、およびＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含み、第二試薬として、クレアチンリン酸、およびグルコースを含む２試薬系のクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットの安定化方法であって、
ｉ）第一試薬中のグルコース濃度を０．０５〜０．４ｍＭとし、かつ、
ｉｉ）第二試薬中のグルコースの濃度を、第一試薬と第二試薬とを混合した時のグルコース終濃度で１６〜２５ｍＭになるように調整する
ことを特徴とするクレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットの安定化方法。 - 第一試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋濃度を０．０１〜０．６ｍＭとし、かつ、第二試薬中にＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含有させ、第二試薬中のＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋濃度を、第一試薬と第二試薬とを混合した時の終濃度で１〜５ｍＭになるように調整する請求項４の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003370758A JP4182859B2 (ja) | 2003-10-30 | 2003-10-30 | クレアチンキナーゼ測定用液状試薬キットおよびその安定化方法 |
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