WO2021054432A1 - 酵素を用いる目的成分の測定方法及び測定試薬 - Google Patents

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朋久 西尾
光章 山本
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    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a target component using an enzyme and a measuring reagent.
  • triglyceride In the field of clinical examination, triglyceride (TG) has established its clinical significance as a diagnostic marker for dyslipidemia.
  • TG triglyceride
  • an external free glycerol derived from, for example, a brain pressure-lowering drug is used as a sample prior to the measurement of TG in a blood sample, which is a standardization response method based on the method recommended by the Japanese Society of Clinical Chemistry (JSCC).
  • JSCC Japanese Society of Clinical Chemistry
  • the glycerol measuring reagent for clinical examination based on the enzymatic method is a TG measuring reagent consisting of two reagents for the above-mentioned elimination method, that is, a method for measuring the TG remaining after erasing free glycerol in a sample (hereinafter referred to as TG measuring reagent).
  • a total glycerol measurement method using a two-reagent system (hereinafter, may be referred to as a total glycerol measurement method or a two-reagent system).
  • This reagent is basically the same as the above-mentioned elimination method / two-reagent system, but by changing the composition of the first reagent, hydrogen peroxide generated from free glycerol in the sample is retained without being decomposed. It differs from the elimination method and the two-reagent system in that it does.
  • Non-Patent Document 1 the hydrogen peroxide generated from the free glycerol and the hydrogen peroxide produced from the TG in the sample by the second reagent are measured together, so that the total glycerol is measured.
  • this reagent has not been commercialized and has not been used clinically.
  • the present invention provides a two-reagent-based total glycerol measuring reagent suitable for commercialization and clinical application, and a total glycerol measuring method using the two-reagent-based reagent.
  • the present invention provides: [1] A reagent for measuring a target component in a blood sample. Equipped with a first reagent and a second reagent, The first reagent contains (1) an enzyme that acts on a target component to cause a structural change in the measurement precursor 1, (2) ascorbic acid oxidase, and (3) 4-aminoantipyrine. The second reagent contains (1) an enzyme that phosphorylates the measurement precursor 1, (2) a ferrocyanide, and (3) an aniline-based redox condensation compound or a phenol-based redox condensation compound. reagent. [2] The target component is total glycerol, and the target component is total glycerol.
  • the measurement precursor 1 is free glycerol
  • the enzyme contained in the first reagent (1) that acts on the target component to cause a structural change in the measurement precursor 1 is lipoprotein lipase.
  • the enzyme that phosphorylates the measurement precursor 1 contained in the second reagent is glycerol kinase.
  • the aniline-based oxidation-reduction condensation compound is N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-acetylethylenediamine (EMAE), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-.
  • the group in which the phenolic oxidation-reduction-condensation compound comprises p-chlorophenol, p-bromphenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromphenol, and 2,4-dichlorophenol sulfonate.
  • the influence of interfering substances and the case where the reagent in a solution state is stored for a long period of time which becomes a problem when commercializing a two-reagent system total glycerol measuring reagent and a total glycerol measuring method using the same.
  • the resulting fluctuations in the measured values of the target components are simultaneously improved.
  • the present invention provides a two-reagent-based total glycerol measuring reagent suitable for commercialization and clinical application, and a total glycerol measuring method using the two-reagent-based reagent.
  • the influence of interfering substances and the fluctuation of the measured value of the target component (known concentration) that occurs when the reagent in the solution state is stored for a long period of time, which are problems in clinical application or commercialization of the two-reagent system total glycerol measurement reagent. It is possible to solve the decrease in correlation with, especially the increase in price).
  • the present inventors diligently studied the total glycerol measurement method and the two-reagent system. As a result, the present inventors first decompose TG in the blood sample into free glycerol by lipoprotein lipase (LPL) in the first reaction using the first reagent, and then the second reaction using the second reagent. Then, glycerol kinase (GK) was allowed to act on both the free glycerol produced by the decomposition and the free glycerol that coexisted in the sample from the beginning to generate glycerol-3-phosphate (G-3-P).
  • LPL lipoprotein lipase
  • GPO glycerol-3-phosphate oxidase
  • POD peroxidase
  • total glycerol can be measured by inducing a condensation reaction between 4-aminoantipyrine and an aniline-based oxidation-reduction condensation compound or phenol-based oxidation-reduction condensation compound to generate a dye, and then optically quantifying the dye. I found that.
  • the present invention provides a two-reagent system total glycerol measuring reagent containing a first reagent containing LPL and a second reagent containing GK for carrying out the above-mentioned total glycerol measuring method / two-reagent system. To do.
  • conventional glycerol measurement reagents are derived from auxiliary components such as ascorbic acid oxidase (ASOD) and ferrocyanide used for the purpose of scavenging ascorbic acid and bilirubin, which are interfering substances in blood samples, and glycerol by an enzymatic method. It contains enzymes and coloring components for quantifying hydrogen peroxide, such as oxidase, 4-aminoantipyrine, aniline-based redox-condensed compound or phenol-based redox-condensed compound.
  • ASOD ascorbic acid oxidase
  • ferrocyanide used for the purpose of scavenging ascorbic acid and bilirubin
  • the present inventors have two reagents that contain all of the auxiliary components, enzymes, and color-developing components required for the above-mentioned conventional glycerol measurement reagents, and have improved fluctuations in glycerol measurement values after long-term storage in a solution state. Further studies were conducted on the system total glycerol measuring reagent.
  • the present inventors have added auxiliary components such as ASOD and ferrocyanide to the first reagent containing LPL and the second reagent containing GK. , And the measurement of ascorbic acid and bilirubin by prescribing a specific combination of enzymes and coloring components for enzymatic methods such as oxidase, 4-aminoantipyrine, aniline-based oxidation-reduction condensation compound or phenol-based oxidation-reduction condensation compound. It has been found that it is possible to improve the fluctuation of the glycerol measurement value (decrease in correlation with known concentration, especially increase in value) that occurs after long-term storage of the reagent in the solution state after satisfactorily avoiding interference with the system.
  • auxiliary components such as ASOD and ferrocyanide
  • the present invention relates to a two-reagent system total glycerol measuring reagent and a total glycerol measuring method using the reagent.
  • the main reaction of the total glycerol measurement method according to the present invention is as follows. [First step] The blood sample and the first reagent containing LPL are mixed, and the TG in the sample is decomposed into free glycerol. [Second step] GK was allowed to act on both the free glycerol produced by the decomposition and the free glycerol that coexisted in the sample from the beginning to produce glycerol-3-phosphate (G-3-P), and the G-3-P was produced.
  • Glycerol-3-phosphate oxidase (GPO) is allowed to act on P to generate hydrogen peroxide, and then the produced hydrogen peroxide is used to condense 4-aminoantipyrine with 4-aminoantipyrine in the presence of POD.
  • a dye is produced by inducing a condensation reaction with a compound or a phenol-based oxidation-reduction condensation compound, and the dye is optically quantified.
  • blood samples examples include serum, plasma and the like.
  • LPL Lipoprotein lipase
  • LPL Lipoprotein lipase
  • TG glycerol molecule
  • VLDL very low density lipoprotein
  • ApoC-II ApoC-II
  • the second step uses the glycerokinase / glycerophosphate oxidase method, which oxidizes glycerol-3-phosphate produced from free glycerol with glycerol-3-phosphate oxidase (GPO) using GK in the presence of ATP. Can be done.
  • GPO glycerol-3-phosphate oxidase
  • hydrogen peroxide which is the final product, is quantified and obtained as the amount of glycerol.
  • Glycerol kinase [Glycerol kinase: GK] Glycerol kinase (EC 2.71.30), also called glycero kinase, produces glycerol-3-phosphate using free glycerol and ATP as substrates.
  • GK commercially available enzymes such as GK-Z (Asahi Kasei) and GYK-311 (Toyobo) can be used.
  • Glycerol-3-phosphate oxidase GPO
  • Glycerol-3-phosphate oxidase EC 1.1.3.21
  • Glycerotriphosphate oxidase acts on free glycerol phosphorylated at the 3-position to produce hydrogen peroxide.
  • GPO a commercially available enzyme, G3O-321 (Toyobo) or the like can be used.
  • the generated hydrogen peroxide is used to induce a condensation reaction between 4-aminoantipyrine and an aniline-based redox condensation compound or a phenol-based redox condensation compound in the presence of POD to induce a dye. Is generated and the dye is optically quantified.
  • the aniline-based redox-condensation compound or the phenol-based redox-condensation compound used here include the compounds described in Japanese Patent Publication No. 60-3480 and clinical examination; Vol. 41, No. 9, 1014-1019 (1997). be able to.
  • aniline-based oxidation-reduction condensation compounds include N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-acetylethylenediamine (EMAE) and N-ethyl-N- (3-methylphenyl)-.
  • N'-Succinylethylenediamine MBE
  • N-Ethyl-N- (2-Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline DAOS
  • N- (2-Hydroxy-3-sulfopropyl) -3 , 5-Dimethoxyaniline HSDA
  • TOOS N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methyl Aniline
  • TOOS N-ethyl-N-sulfobutyl-m-toluidine
  • EMBmT N-ethyl-N-sulfobutyl-m-toluidine
  • phenolic redox condensation compound examples include p-chlorophenol, p-bromphenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromphenol, 2,4-dichlorophenol sulfonate and the like. However, it is not limited to these.
  • POD used in the quantification of hydrogen peroxide is horseradish-derived peroxidase.
  • a nonionic surfactant an additive that enhances the action of producing glycerol and fatty acids from monoglyceride (for example, monoglyceride lipase) ), Additives, co-enzymes, etc. that enhance the action of each enzyme for measuring the produced glycerol, but are not limited thereto.
  • the nonionic surfactant include Triton (registered trademark) X-100 (for example, manufactured by Roam & Hass), and examples of additives that enhance the action of each enzyme for measuring glycerol.
  • the additive examples include magnesium chloride and the like as an additive for enhancing the action of glycerol kinase, and examples of the coenzyme include ApoC-II and copper.
  • a component for keeping the pH of the reaction system constant such as Good's buffer, can be appropriately selected and used in the reaction system. These components may be contained in the first reagent or may be contained in the second reagent.
  • the second reagent containing 4-aminoantipyrine and used in the second step is (1) an enzyme that phosphorylates the measurement precursor 1, (2) a ferrocyanide, and (3) aniline. It contains a system-based oxidation-reduction condensation compound or a phenol-based oxidation-reduction condensation compound.
  • GPO glycerol-3-phosphate oxidase
  • POD peroxidase
  • the target component is TG (total free glycerol)
  • the measurement precursor 1 is free glycerol
  • the enzyme that phosphorylates the measurement precursor 1 is glycerol kinase (GK).
  • Ascorbic acid oxidase decomposes ascorbic acid into dehydroascorbic acid and water in the presence of dissolved oxygen.
  • the cofactor for this enzyme is copper.
  • ASOD a commercially available enzyme, AsOD (Roche), or the like can be used.
  • ferrocyanide include potassium ferrocyanide and sodium ferrocyanide. Both ASOD and ferrocyanide are known as means of avoiding the effects of interfering substances in enzymatic methods.
  • the content of essential components in the two-reagent-based total glycerol measuring reagent of the present invention, the presence or absence of addition of optional components, and the prescribed amount thereof can be appropriately applied to conventionally known knowledge, and are not limited in any way.
  • Total glycerol measurement method Measurement value of total glycerol by one reagent system reagent (Triglyceride E-Test Wako: Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is in the range of 50 mg / dL to 900 mg / dL, and for the one reagent system. Serum (50 samples) in which the measured values of the reagents (hereinafter referred to as known concentrations) and the measured values of TG with the reagent for elimination method / two reagents (Choletest TG: Sekisui Medical) do not deviate by ⁇ 12% or more. It was used.
  • Interfering substance added sample ⁇ Above 1. Several samples were taken from the 50 samples of No. 1 and mixed, and adjusted so that the glycerol value in the total glycerol measurement method and the reagent for one reagent system was 150 mg / dL. Interfering substance-added samples were prepared by adding conjugated bilirubin (BIL-C; interference check A plus, Sysmex) or ascorbic acid (Vit. C) at a predetermined concentration to these samples.
  • BIL-C conjugated bilirubin
  • Vit. C ascorbic acid
  • Table 1 shows the results of examining the correlation between the glycerol measurement results from the sample and the known concentration (“Correlation” section).
  • the measured values after storage at 37 ° C. for 2 weeks were well correlated with the known concentration (coefficient of determination R 2 was about 1), but were compared.
  • the frequency of appearance of the sample whose value was higher than the known concentration (+ 3% or more of the known concentration) was high (10 cases for each comparative example).
  • the recovery rate of the ascorbic acid (Vit.C) 0 mg / dL-added sample was set as the recovery rate of Example 1.
  • 2 were both 98%, but in Comparative Examples 1, 2 and 3, 10% after storage at 37 ° C. for 1 week (Comparative Examples 1 and 2), 4 ° C. after storage for 2 weeks. It was also confirmed that the recovery rate was significantly reduced to 30% (Comparative Example 3).
  • BIL-C conjugated bilirubin

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Abstract

血液試料中の目的成分の測定試薬。該測定試薬は第一試薬、及び第二試薬を備え、該第一試薬は、（１）目的成分に作用して測定前駆体１に構造変化を生じさせる酵素、（２）アスコルビン酸オキシダーゼ、及び（３）４－アミノアンチピリン、を含有し、該第二試薬は、（１）該測定前駆体１をリン酸化する酵素、（２）フェロシアン化物、及び（３）アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物、を含有する。

Description

酵素を用いる目的成分の測定方法及び測定試薬
　本発明は、酵素を用いる目的成分の測定方法及び測定試薬に関する。
　臨床検査の分野において、トリグリセリド（ＴＧ）は、脂質異常症の診断マーカーとして、その臨床的意義が確立している。日本におけるＴＧ測定法としては、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に基づく標準化対応法である、血液試料中のＴＧの測定に先立ち、例えば脳圧降下薬等に由来する外来の遊離グリセロールを試料中より消去し、次いで試料中のＴＧを遊離グリセロールに変換して、酵素法により測定する方法（いわゆる「消去法」）が普及している。一方、諸外国においては、試料中に共存する遊離グリセロールを消去せず、ＴＧから変換された遊離グリセロールとあわせて測定し、該測定された総グリセロールの測定値をＴＧの値として取得する「総グリセロール測定法（以下、総グリセロール測定法ということがある）」が標準法として採用されている。測定法の国際標準化の観点より、本邦においても消去法から総グリセロール測定法への移行が議論されている。
　酵素法に基づく臨床検査用のグリセロール測定試薬としては、前記した消去法、つまり試料中の遊離グリセロールを消去した後に残存するＴＧを測定する方法のための、二試薬よりなるＴＧ測定試薬（以下、消去法・二試薬系ということがある）と、総グリセロール測定法、つまり試料中の遊離グリセロールをＴＧと一緒に測定する方法のための、一試薬よりなるグリセロール測定試薬（以下、総グリセロール測定法・一試薬系ということがある）が主に使用されている。
　一方、二試薬系を用いた総グリセロール測定法（以下、総グリセロール測定法・二試薬系ということがある）も存在する。この試薬は、原理的には前記した消去法・二試薬系と同様であるが、第一試薬の組成を変更することにより、試料中の遊離グリセロールから生成した過酸化水素を分解させずに保持する点で消去法・二試薬系と異なる。これにより、該遊離グリセロールから生じる過酸化水素と、第二試薬により試料中のＴＧから生成した過酸化水素とが一緒に測定されるので、総グリセロールが測定される（非特許文献１）。しかし、この試薬は商用化されておらず、臨床では用いられていない。
医学検査，Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．２：２０９－２１５（２０１６）
　従来、二試薬系を用いた総グリセロール測定法の報告は僅かであり、これを商用化、及び臨床応用する際の課題も知られていなかった。本発明は、商用化及び臨床応用に適した二試薬系総グリセロール測定試薬、ならびに該二試薬系試薬を用いた総グリセロール測定方法を提供する。
　本発明は以下を提供する。
〔１〕血液試料中の目的成分の測定試薬であって、
　第一試薬、及び第二試薬を備え、
　該第一試薬は、（１）目的成分に作用して測定前駆体１に構造変化を生じさせる酵素、（２）アスコルビン酸オキシダーゼ、及び（３）４－アミノアンチピリン、を含有し、
　該第二試薬は、（１）測定前駆体１をリン酸化する酵素、（２）フェロシアン化物、及び（３）アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物、を含有する、
試薬。
〔２〕前記目的成分が総グリセロールであり、
　前記測定前駆体１が遊離グリセロールであり、
　前記第一試薬に含まれる（１）目的成分に作用して測定前駆体１に構造変化を生じさせる酵素がリポ蛋白リパーゼであり、
　前記第二試薬に含まれる（１）測定前駆体１をリン酸化する酵素がグリセロールキナーゼである、
〔１〕記載の試薬。
〔３〕前記アニリン系酸化還元縮合化合物が、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－スクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、及びＮ－エチル－Ｎ－スルホブチル－ｍ－トルイジン（ＥＳＢｍＴ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物である、〔１〕又は〔２〕記載の試薬。
〔４〕前記フェノール系酸化還元縮合化合物が、ｐ－クロルフェノール、ｐ－ブロムフェノール、２，４－ジクロルフェノール、２，４－ジブロムフェノール、及び２，４－ジクロルフェノールスルホネートからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物である、〔１〕又は〔２〕記載の試薬。
〔５〕前記第二試薬がパーオキシダーゼをさらに含有する、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の試薬。
〔６〕前記第一試薬又は第二試薬がグリセロール－３－リン酸オキシダーゼをさらに含有する、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の試薬。
〔７〕〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の試薬を用いる、血液試料中の目的成分の測定方法。
　本発明によれば、二試薬系総グリセロール測定試薬、及びこれを用いた総グリセロール測定法を商用化する際に課題となる、妨害物質の影響と、溶液状態の試薬を長期間保存した場合に生じる目的成分測定値の変動（既知濃度との相関性の低下、特に高値化）とが同時に改善される。
　本発明は、商用化及び臨床応用に適した二試薬系総グリセロール測定試薬、ならびに該二試薬系試薬を用いた総グリセロール測定方法を提供する。本発明は二試薬系総グリセロール測定試薬を臨床応用又は商用化する際に課題となる、妨害物質の影響と、溶液状態の試薬を長期間保存した場合に生じる目的成分測定値の変動（既知濃度との相関性の低下、特に高値化）を解決し得る。
　本発明者らは、総グリセロール測定法・二試薬系について鋭意検討した。その結果、本発明者らはまず、第一試薬を用いた第一反応で、血液試料中のＴＧをリポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）により遊離グリセロールに分解し、次いで第二試薬を用いた第二反応で、該分解により生じた遊離グリセロールと該試料中に当初より共存していた遊離グリセロールの両方にグリセロールキナーゼ（ＧＫ）を作用させてグリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）を生成させた後、当該Ｇ－３－Ｐにグリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）を作用させて過酸化水素を生成させ、続いて、当該生成した過酸化水素を用いて、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下、４－アミノアンチピリンと、アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物との縮合反応を導いて色素を生成させ、該色素を光学的に定量する方法により、総グリセロール測定が可能であることを見出した。したがって、本発明は、上記の総グリセロール測定法・二試薬系を実施するための、ＬＰＬを含有する第一試薬と、ＧＫを含有する第二試薬とを含む二試薬系総グリセロール測定試薬を提供する。
　しかしながら、上記した本発明者らが見出した総グリセロール測定法・二試薬系には、溶液状態の試薬を長期間保存したときに、グリセロール測定値の変動（既知濃度との相関性の低下、特に高値化）を生じる場合があることが確認された。こうした試薬を長期間保存した後のグリセロール測定値の変動を改善することが望まれた。また従来のグリセロール測定試薬には、血液試料中の妨害物質であるアスコルビン酸やビリルビンを消去する目的で用いられるアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＤ）やフェロシアン化物などの補助成分、及び、酵素法によりグリセロール由来の過酸化水素を定量するための酵素や発色成分、例えばオキシダーゼ、４－アミノアンチピリン、アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物、などが含まれる。そこで本発明者らは、前記した従来のグリセロール測定試薬で必要とされる補助成分、酵素、発色成分を全て含み、かつ溶液状態で長期間保存後のグリセロール測定値の変動が改善された二試薬系総グリセロール測定試薬について、さらに検討を行った。
　その結果、本発明者らは、上記の総グリセロール測定法・二試薬系において、ＬＰＬを含有する第一試薬、及びＧＫを含有する第二試薬に対して、ＡＳＯＤ、フェロシアン化物などの補助成分、及びオキシダーゼ、４－アミノアンチピリン、アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物などの酵素法のための酵素や発色成分を、特定の組み合わせで処方することにより、アスコルビン酸及びビリルビンの測定系への妨害回避を良好に行った上で、溶液状態の試薬を長期間保存した後に生じるグリセロール測定値の変動（既知濃度との相関性の低下、特に高値化）を改善できることを見出した。
　酵素法によるグリセロール測定における妨害物質の影響を低減させる成分として公知のＡＳＯＤ、フェロシアン化物の二試薬系試薬への特定の処方により、該試薬を長期間保存した後に生じるグリセロール測定値の変動（既知濃度との相関性の低下、特に高値化）が改善されることは今まで報告されておらず、全く意外なことであった。
　以下に、実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、二試薬系総グリセロール測定試薬、及び該試薬を用いた総グリセロール測定法に係るものである。本発明による総グリセロール測定法の主反応は、以下のとおりである。
［第一工程］
　血液試料とＬＰＬを含む第一試薬とを混合し、該試料中のＴＧを遊離グリセロールに分解する。
［第二工程］
　当該分解により生じた遊離グリセロールと該試料中に当初より共存していた遊離グリセロールの両方にＧＫを作用させてグリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）を生成させ、当該Ｇ－３－Ｐにグリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）を作用させて過酸化水素を生成させ、次いで当該生成した過酸化水素を用いて、ＰＯＤの存在下、４－アミノアンチピリンと、アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物との縮合反応を導いて色素を生成させ、該色素を光学的に定量する。
　次に、各工程について詳細に説明する。
［第一工程：ＴＧから遊離グリセロールへの分解］
　第一工程では、血液試料中のＴＧをＬＰＬにより遊離グリセロールに分解する。生成したＴＧ由来の遊離グリセロールと、該試料中に当初から存在した遊離グリセロールとが、第二工程の反応に供される。
［血液試料］
　血液試料の例としては、血清、血漿などが挙げられる。
［ＬＰＬ：リポ蛋白リパーゼ］
　リポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）（ＥＣ　３．１．１．３４）（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｐａｓｅ）は、リパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーであり、膵リパーゼや肝リパーゼ、内皮リパーゼを包含する。ＬＰＬは、キロミクロン及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）中に存在する３つの遊離脂肪酸が結合したグリセロール分子（トリグリセリド：ＴＧ）を加水分解する水溶性酵素で、補因子としてＡｐｏＣ－IIを必要とする。ＬＰＬは、市販されている酵素、例えば、ＬＰＬ－３１４（東洋紡）等を使用することができる。
［第二工程：遊離グリセロールの定量］
　第二工程は、ＡＴＰの存在下、ＧＫを用いて遊離グリセロールから生成されるグリセロール－３－リン酸をグリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）で酸化させる、グリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法を用いて行うことができる。本工程では、最終生成物である過酸化水素を定量し、グリセロール量として取得する。
［グリセロールキナーゼ：ＧＫ］
　グリセロールキナーゼは（ＥＣ　２．７．１．３０）は、グリセロキナーゼとも称され、遊離グリセロールとＡＴＰを基質としてグリセロール－３－リン酸を生成する。ＧＫは、市販されている酵素、例えば、ＧＫ－Ｚ（旭化成）、ＧＹＫ－３１１（東洋紡）等を使用することができる。
［グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ：ＧＰＯ］
　グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２１）は、グリセロ３リン酸オキシダーゼとも称され、３位がリン酸化された遊離グリセロールに作用して、過酸化水素を生成する。ＧＰＯは、市販されている酵素、Ｇ３Ｏ－３２１（東洋紡）等を使用することができる。
［過酸化水素の定量］
　過酸化水素の定量においては、生成された過酸化水素を用いて、ＰＯＤの存在下、４－アミノアンチピリンと、アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物との縮合反応を導いて色素を生成させ、該色素を光学的に定量する。ここで用いられるアニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物としては、例えば、特公昭６０－３４８０号や臨床検査；４１巻９号、１０１４－１０１９（１９９７）に記載された化合物を挙げることができる。
　アニリン系酸化還元縮合化合物のより具体的な例としては、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－スクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホブチル－ｍ－トルイジン（ＥＳＢｍＴ）などを挙げることができるが、これらに限定されない。このうちＥＳＢｍＴが好適である。
　フェノール系酸化還元縮合化合物のより具体的な例としては、ｐ－クロルフェノール、ｐ－ブロムフェノール、２，４－ジクロルフェノール、２，４－ジブロムフェノール、２，４－ジクロルフェノールスルホネート等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　該過酸化水素の定量において用いられるＰＯＤの例としては、西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼが挙げられる。
　さらに、グリセロールの分析を良好に行うために必要に応じて反応系に添加される成分として、非イオン性界面活性剤、モノグリセリドからグリセロール及び脂肪酸が生成される作用を高める添加剤（例えば、モノグリセリドリパーゼ）、生成されたグリセロールを測定するための各酵素の作用を高める添加剤、補酵素、などが挙げられるが、これらに限定されない。該非イオン性界面活性剤の例としては、トリトン（登録商標）Ｘ－１００（例えばローム・アンド・ハス社製）等が挙げられ、グリセロールを測定するための各酵素の作用を高める添加剤の例としては、グリセロールキナーゼの作用を高める添加剤として塩化マグネシウム等が挙げられ、補酵素としてはＡｐｏＣ－II、銅などが挙げられる。さらに、反応系のｐＨを一定に保つための成分、例えばグッドバッファーなどを、適宜選択して反応系に用いることができる。これらの成分は、第一試薬に含有されていても、第二試薬に含有されていてもよい。
　本発明において重要なのは、第一工程に用いられる第一試薬が、（１）血液試料中の目的成分に作用して測定前駆体１に構造変化を生じさせる酵素、（２）アスコルビン酸オキシダーゼ、及び（３）４－アミノアンチピリンを含有し、かつ、第二工程に用いられる第二試薬が、（１）該測定前駆体１をリン酸化する酵素、（２）フェロシアン化物、及び（３）アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物を含有していることである。なお、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）は、第一試薬、第二試薬のいずれに含有させても、本発明の効果を得ることができる。パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）は、第二試薬に含有させることが実用的である。
　本発明において、好ましくは、該目的成分はＴＧ（総遊離グリセロール）であり、該測定前駆体１は遊離グリセロールであり、該目的成分に作用して該測定前駆体１に構造変化を生じさせる酵素がリポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）であり、該測定前駆体１をリン酸化する酵素がグリセロールキナーゼ（ＧＫ）である。
　アスコルビン酸オキシダーゼ（Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ：ＥＣ１．１０．３．３、ＡＳＯＤ）は、アスコルビン酸を溶存酸素の存在下、デヒドロアスコルビン酸と水に分解する。この酵素の補因子は銅である。ＡＳＯＤは、市販されている酵素、ＡｓＯＤ（ロシュ）等を使用することができる。フェロシアン化物の例としては、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウムなどを挙げることができる。ＡＳＯＤも、フェロシアン化物も、酵素法における妨害物質の影響の回避手段として公知である。
　本発明の二試薬系総グリセロール測定試薬における必須成分の含有量、及び任意成分の添加有無やその処方量は、従来公知の知見を適宜に適用することが可能であり、何ら制限を受けない。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［試験１］
　ＬＰＬを第一試薬、ＧＫ及びＰＯＤを第二試薬に添加し、他の成分は、表１のとおり第一試薬又は第二試薬に添加して、二試薬系グリセロール測定試薬を調製した。第一試薬及び第二試薬における各成分の組み合わせがグリセロール測定に及ぼす効果を調べた。効果の評価では、表１記載の各処方の第一試薬及び第二試薬（ともに溶液状態）それぞれを、４℃で２週間保存、３７℃で１週間保存、又は３７℃で２週間保存した後に、試料（妨害物質非添加）及び妨害物質添加試料のグリセロールを測定し、その測定値を比較した。
１．試料
・総グリセロール測定法・一試薬系用試薬（トリグリセライド　Ｅ－テストワコー：富士フイルム和光純薬）による総グリセロールの測定値が５０ｍｇ／ｄＬ～９００ｍｇ／ｄＬの範囲にあり、かつ当該一試薬系用試薬の測定値（以下、既知濃度とする）と、消去法・二試薬系用試薬（コレステストＴＧ：積水メディカル）でのＴＧの測定値が±１２％以上乖離していない血清（５０試料）を使用した。
２．妨害物質添加試料
・上記１．の５０試料から何点かの試料を取り分けて混合し、総グリセロール測定法・一試薬系用試薬でのグリセロール値が１５０ｍｇ／ｄＬになるように調整した。これらの試料に抱合型ビリルビン（ＢＩＬ－Ｃ；干渉チェックＡプラス、シスメックス）、又はアスコルビン酸（Ｖｉｔ．Ｃ）を所定の濃度添加した妨害物質添加試料を調製した。
３．試験試薬
・表１参照。
・試料、第一試薬、及び第二試薬の３つが混合された時点の主成分の濃度は以下である。
　ＬＰＬ：１０００Ｕ／Ｌ
　ＧＫ：１０９５Ｕ／Ｌ
　ＧＰＯ：１５００Ｕ／Ｌ
　ＰＯＤ：１５６０Ｕ／Ｌ
　４－アミノアンチピリン（４－ＡＡＰ）：０．４２ｍＭ
　ＡＳＯＤ：３３０Ｕ／Ｌ
　フェロシアン化カリウム（Ｆｅ－Ｋ）：１０μＭ
　ＥＳＢｍＴ：１．１３ｍＭ
４．測定
・測定装置：ＪＣＡ－ＢＭ９１３０（日本電子）
・分析方式：ＥＰＡ
・測定波長（副／主）：８０５ｎｍ／５９６ｎｍ
・測光ポイント：主ＤＥＴ　Ｐ．ｌ－Ｐ．ｍ－Ｐ．ｎ　０－９５－９８
　　　　　　　　副ＤＥＴ　Ｐ．ｌ－Ｐ．ｍ－Ｐ．ｎ　４４－４７
・反応時間：１０分
・試料の前希釈（前希釈試料）：血清／生理食塩液：３０μＬ／１２０μＬ
・前希釈試料量／第一試薬量／第二試薬量：３μＬ／６０μＬ／２０μＬ
５．結果
　試験試薬による上記１．の試料からのグリセロール測定結果と既知濃度との相関を調べた結果を表１に示す（「相関」の項）。実施例１、２及び比較例１、２、３のいずれにおいても、３７℃、２週間保存後の測定値は既知濃度と良好に相関していたが（決定係数Ｒ2が約１）、比較例１、２、３においては、既知濃度に対して高値化（既知濃度の＋３％以上）する試料の出現頻度が高かった（各比較例につきそれぞれ１０例）。
　３７℃、２週間保存後の試験試薬によるアスコルビン酸（Ｖｉｔ．Ｃ）５０ｍｇ／ｄＬ添加試料の測定では、アスコルビン酸（Ｖｉｔ．Ｃ）０ｍｇ／ｄＬ添加試料の測定値に対する回収率として、実施例１，２はともに９８％であったが、比較例１、２、３ではより緩和な３７℃、１週間保存後で１０％（比較例１，２）、４℃、２週間保存後であっても３０％（比較例３）と、顕著な回収率の低下が確認された。一方、３７℃、２週間保存後の試験試薬による抱合型ビリルビン（ＢＩＬ－Ｃ）５０ｍｇ／ｄＬ添加試料の測定では、実施例１、２と比較例１、２、３の間で回収率に顕著な差を認めなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
６．考察
　実施例１、２では、アスコルビン酸（Ｖｉｔ．Ｃ）による測定の妨害が抑制されていたことから、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯＤ）が溶液状態の試薬中で安定化されていると考えられた。加えて、実施例１、２では、既知濃度＋３％以上高値の試料の出現が抑制された。一方、比較例１、２、３では、いずれの比較例でも既知濃度に対して測定濃度が高値となる傾向がみられた。
　アスコルビン酸は、自身の有する還元性によりオキシダーゼ反応で生じた過酸化水素を消費するため、オキシダーゼ－パーオキシダーゼ系の測定妨害物質である。そのため試薬中のＡＳＯＤの安定性不良の影響は、既知濃度に対する測定濃度の低値として現れると予測された。しかし本試験では、比較例１、２、３においてアスコルビン酸が添加されているにも拘わらず、既知濃度に対して測定濃度が高値となる傾向がみられた。このことから、各比較例における測定濃度と既知濃度との間に乖離を生じる機序は、公知のアスコルビン酸による妨害の機序とは別の未知の機序であったことが考えられた。このような未知の機序に対してＡＳＯＤの処方が有効であったことは意外なことである。またＡＳＯＤの効果は、併用するフェロシアン化カリウム（Ｆｅ－Ｋ）の配置によっても影響を受けていた。これもまた意外なことである。

Claims (7)

  1. 　血液試料中の目的成分の測定試薬であって、
    　第一試薬、及び第二試薬を備え、
    　該第一試薬は、（１）目的成分に作用して測定前駆体１に構造変化を生じさせる酵素、（２）アスコルビン酸オキシダーゼ、及び（３）４－アミノアンチピリン、を含有し、
    　該第二試薬は、（１）測定前駆体１をリン酸化する酵素、（２）フェロシアン化物、及び（３）アニリン系酸化還元縮合化合物又はフェノール系酸化還元縮合化合物、を含有する、
    試薬。
  2. 　前記目的成分が総グリセロールであり、
    　前記測定前駆体１が遊離グリセロールであり、
    　前記第一試薬に含まれる（１）目的成分に作用して測定前駆体１に構造変化を生じさせる酵素がリポ蛋白リパーゼであり、
    　前記第二試薬に含まれる（１）測定前駆体１をリン酸化する酵素がグリセロールキナーゼである、
    請求項１記載の試薬。
  3. 　前記アニリン系酸化還元縮合化合物が、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－スクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、及びＮ－エチル－Ｎ－スルホブチル－ｍ－トルイジン（ＥＳＢｍＴ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物である、請求項１又は２記載の試薬。
  4. 　前記フェノール系酸化還元縮合化合物が、ｐ－クロルフェノール、ｐ－ブロムフェノール、２，４－ジクロルフェノール、２，４－ジブロムフェノール、及び２，４－ジクロルフェノールスルホネートからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物である、請求項１又は２記載の試薬。
  5. 　前記第二試薬がパーオキシダーゼをさらに含有する、請求項１～４のいずれか１項記載の試薬。
  6. 　前記第一試薬又は第二試薬がグリセロール－３－リン酸オキシダーゼをさらに含有する、請求項１～５のいずれか１項記載の試薬。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項記載の試薬を用いる、血液試料中の目的成分の測定方法。
     
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6024200A (ja) * 1983-07-18 1985-02-06 Wako Pure Chem Ind Ltd トリグリセライドの定量方法及び定量用試薬
JPS62158497A (ja) * 1980-11-14 1987-07-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 物質の定量法
JPH07303497A (ja) * 1994-05-13 1995-11-21 Toyobo Co Ltd 生体成分の測定方法および測定用試薬組成物
JP2002233363A (ja) * 2001-02-08 2002-08-20 Unitika Ltd アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬
JP2003043035A (ja) * 2001-08-01 2003-02-13 Toyobo Co Ltd 液状試薬原料の製造方法および組成物
JP2003066040A (ja) * 2001-08-21 2003-03-05 Toyobo Co Ltd 液状試薬原料の製造方法および組成物
JP2006081471A (ja) * 2004-09-16 2006-03-30 Toyobo Co Ltd 生体成分測定用試薬及び測定方法
WO2007037419A1 (ja) * 2005-09-30 2007-04-05 Denka Seiken Co., Ltd. 生体試料中の２項目の測定対象物の同時分別定量方法
JP2008022862A (ja) * 2007-09-28 2008-02-07 Wako Pure Chem Ind Ltd カタラーゼ安定化剤を用いた成分測定用試薬
JP2008037862A (ja) * 2006-07-10 2008-02-21 Kyowa Medex Co Ltd アニリン誘導体、並びに、これを用いる試料中の定量すべき成分の定量方法、定量用試薬及び定量用キット

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62158497A (ja) * 1980-11-14 1987-07-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 物質の定量法
JPS6024200A (ja) * 1983-07-18 1985-02-06 Wako Pure Chem Ind Ltd トリグリセライドの定量方法及び定量用試薬
JPH07303497A (ja) * 1994-05-13 1995-11-21 Toyobo Co Ltd 生体成分の測定方法および測定用試薬組成物
JP2002233363A (ja) * 2001-02-08 2002-08-20 Unitika Ltd アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬
JP2003043035A (ja) * 2001-08-01 2003-02-13 Toyobo Co Ltd 液状試薬原料の製造方法および組成物
JP2003066040A (ja) * 2001-08-21 2003-03-05 Toyobo Co Ltd 液状試薬原料の製造方法および組成物
JP2006081471A (ja) * 2004-09-16 2006-03-30 Toyobo Co Ltd 生体成分測定用試薬及び測定方法
WO2007037419A1 (ja) * 2005-09-30 2007-04-05 Denka Seiken Co., Ltd. 生体試料中の２項目の測定対象物の同時分別定量方法
JP2008037862A (ja) * 2006-07-10 2008-02-21 Kyowa Medex Co Ltd アニリン誘導体、並びに、これを用いる試料中の定量すべき成分の定量方法、定量用試薬及び定量用キット
JP2008022862A (ja) * 2007-09-28 2008-02-07 Wako Pure Chem Ind Ltd カタラーゼ安定化剤を用いた成分測定用試薬

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