JPS62158497A - 物質の定量法 - Google Patents
物質の定量法Info
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- JPS62158497A JPS62158497A JP29555086A JP29555086A JPS62158497A JP S62158497 A JPS62158497 A JP S62158497A JP 29555086 A JP29555086 A JP 29555086A JP 29555086 A JP29555086 A JP 29555086A JP S62158497 A JPS62158497 A JP S62158497A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は試料中に存在する又は反応に生成する過酸化水
素を消去する方法に関する。さらに詳しくは該過酸化水
素と一般式（１） 〔但し式中、ＺはＯＨ又はＮＲ，Ｒ，（Ｒ，、Ｒ３は同
−又は異なってよく水素、アルキル、置換アルキル、ア
シルを示す）を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は同−又は異な
ってよく水素、ハロゲン、アルキル、アルコキン、アミ
ノ、ニトロ、カルボキシル、スルホを示す〕で表される
フェノール又はアニリン又はそれらの誘導体（以下化合
物（１）という少とをパーオキシダーゼの存在下に反応
せしめて過酸化水素を別の化合物に変換する方法に関す
る。
素を消去する方法に関する。さらに詳しくは該過酸化水
素と一般式（１） 〔但し式中、ＺはＯＨ又はＮＲ，Ｒ，（Ｒ，、Ｒ３は同
−又は異なってよく水素、アルキル、置換アルキル、ア
シルを示す）を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は同−又は異な
ってよく水素、ハロゲン、アルキル、アルコキン、アミ
ノ、ニトロ、カルボキシル、スルホを示す〕で表される
フェノール又はアニリン又はそれらの誘導体（以下化合
物（１）という少とをパーオキシダーゼの存在下に反応
せしめて過酸化水素を別の化合物に変換する方法に関す
る。
過酸化水素は食品その他の漂白、殺菌等に用いられてい
るが残存する過酸化水素を除くため一般にカタラーゼ（
ＥＣ１，１１，１゜６）用いて過酸化水素を分解する方
法が知られている。しかしこの方法では微量の過酸化水
素が残り且つ分解速度も遅く、さらに優れた方法の開発
が望まれている。
るが残存する過酸化水素を除くため一般にカタラーゼ（
ＥＣ１，１１，１゜６）用いて過酸化水素を分解する方
法が知られている。しかしこの方法では微量の過酸化水
素が残り且つ分解速度も遅く、さらに優れた方法の開発
が望まれている。
過酸化水素の反応性について検討の結果、化合物（１）
がパーオキシダーゼの存在下に過酸化水。
がパーオキシダーゼの存在下に過酸化水。
素と掻めて迅速に反応し過酸化水素が極めて短時間に分
解されることがわかった。
解されることがわかった。
さらに検討の結果、上記の原理を酵素を用いて試料中の
特定の物質を定量する方法に適用することによって該物
質が極めて簡単に定量できることがわかった。
特定の物質を定量する方法に適用することによって該物
質が極めて簡単に定量できることがわかった。
即ち試料中に存在するある物質を定量する方法としてそ
の物質を基質とするオキシダーゼの作用によってその物
質を酸化し、化学量論的に生成する過酸化水素を定量す
ることによって該物質を定量する方法が知られている。
の物質を基質とするオキシダーゼの作用によってその物
質を酸化し、化学量論的に生成する過酸化水素を定量す
ることによって該物質を定量する方法が知られている。
定量されるべき物質に作用して直接過酸化水素を生成し
ない場合でもその物質に適当な酵素等を作用させてオキ
シダーゼによって直接酸化されうる物質に変換せしめれ
ば、この物質は上記方法によって定量されることができ
る。
ない場合でもその物質に適当な酵素等を作用させてオキ
シダーゼによって直接酸化されうる物質に変換せしめれ
ば、この物質は上記方法によって定量されることができ
る。
しかしながら、試料中に定量されるべき物質の正確な定
量を阻害する物質が含まれている場合には阻害物質をあ
らかじめ直接除去するか分解しておく必要がある。
量を阻害する物質が含まれている場合には阻害物質をあ
らかじめ直接除去するか分解しておく必要がある。
例えば物質のｔ１離形とエステル形の両物質を含有する
試料中のエステル形のみを定量す場合、一般にまず該物
質に作用するエステラーゼの作用によってエステル形を
Ｊｊｌｌｉ形とし、次いでオキシダーゼによって遊離形
を酸化して生成する過酸化水素の量からエステル形に由
来する遊離形と試料中の遊離形の合計量を定量する。次
いで元の試料にエステーゼを加えないでオキシダーゼの
みを用いて試料中の遊離形のみを定量し、合計量から遊
離形を差引くことによってエステル形の定量が行われて
いる。
試料中のエステル形のみを定量す場合、一般にまず該物
質に作用するエステラーゼの作用によってエステル形を
Ｊｊｌｌｉ形とし、次いでオキシダーゼによって遊離形
を酸化して生成する過酸化水素の量からエステル形に由
来する遊離形と試料中の遊離形の合計量を定量する。次
いで元の試料にエステーゼを加えないでオキシダーゼの
みを用いて試料中の遊離形のみを定量し、合計量から遊
離形を差引くことによってエステル形の定量が行われて
いる。
この場合試料にまずオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及
び化合物（１）を加えて反応させると遊離形の化合物は
酸化され、生成する過酸化水素は色素に導かれることな
く分解される。
び化合物（１）を加えて反応させると遊離形の化合物は
酸化され、生成する過酸化水素は色素に導かれることな
く分解される。
この反応物に該化合物のエステラーゼ及び発色剤を加え
て反応させ生成する色素によって着色した反応液の吸収
を測ることによってエステル形化合物の定量が簡単にで
きる。
て反応させ生成する色素によって着色した反応液の吸収
を測ることによってエステル形化合物の定量が簡単にで
きる。
本発明方法の原理は遊離形とエステル形の化合物を含有
する試料中のエステル形の定量のみならず、試料中の特
定の物質の定量において該物質に由来しない過酸化水素
の消去に適用できる。かかる適用によって定量分析が正
確に、速く、簡単にできる。
する試料中のエステル形の定量のみならず、試料中の特
定の物質の定量において該物質に由来しない過酸化水素
の消去に適用できる。かかる適用によって定量分析が正
確に、速く、簡単にできる。
一般式（Ｉ）においてＲ１−Ｒ５におけるアルキルは炭
素数１〜５のアルキル例えばメチノペエチノペプロピノ
ペｎ−ブチル、１−ブチル等を含む。Ｒ１及びＲ５にお
ける首換アルキルの置換基はヒドロキシノペアミノ、ア
シルアミノを示し、アシルアミノにおけるアシルはＲ１
におけるアシルと同一の意義を有する。
素数１〜５のアルキル例えばメチノペエチノペプロピノ
ペｎ−ブチル、１−ブチル等を含む。Ｒ１及びＲ５にお
ける首換アルキルの置換基はヒドロキシノペアミノ、ア
シルアミノを示し、アシルアミノにおけるアシルはＲ１
におけるアシルと同一の意義を有する。
Ｒ４・Ｒ５におけるアンルは炭素数２〜５のア／ル例え
ばアセチル、プロピオニル、ブチリル等を含む。
ばアセチル、プロピオニル、ブチリル等を含む。
Ｒ３−Ｒ３においてハロゲンはクロル、ブロム、ヨード
を示し、アルコキンは炭素数１〜５のアルコキン例えば
メトキン、エトキシ、プロポキン、ブトキシ等を含む。
を示し、アルコキンは炭素数１〜５のアルコキン例えば
メトキン、エトキシ、プロポキン、ブトキシ等を含む。
本発明で用いられる化合物（１）の具体例が次に示され
る。
る。
フェノール、２．４−ジクロルフェノール、ｐ−クロル
フェノール、２．４−ジブロムフェノール、Ｐ−ブロム
フエノーノペ２．３− シクロルフエノーノペ ２−ニ
トロフェノーノペ３−二）ロフェノール、２−アミノフ
ェノール、３−アミノフェノール、アニリン、２−ブロ
ムアニリン、３−ブロムアニリン、２−クロルアニリン
、３−クロルアニリン、オルトトルイジン、メクトルイ
ジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン、０−フェ
ニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ｐ−フェニレンジアミン、０
−アニシジン、メタアニンジン、○−クレゾール、ｍ−
クレゾール、２−メチル−２，６−シニトロフエノール
、２−メトキン−５′−ニトロアニリン、２−メチル−
５−ニトロアニリン、３．５−ジヒドロキントルエン、
３−メトキシフェノール、２−アミノ−５−メチルフェ
ノーノペ２−ヒドロキシ−３−メチルベンゾイックアシ
ッド、芝−ヒドロキンフェニル酢酸、２．３−ジメチル
フェノール、２．５−ジメチルフェノール、２−エチル
フェノール、３−エチルフェノール、２−メトキシメチ
ルフェノール、２．３−ジメチルアニリン、２．５−ジ
メチルアニリン、３．５−ジエチルアニリン、３−（ジ
メチルアミノ）フェノール、３−メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジ
エチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−１，３−フェニレ
ンジアミン、３．５−ジメチル−１，２−フェニレンジ
アミン。
フェノール、２．４−ジブロムフェノール、Ｐ−ブロム
フエノーノペ２．３− シクロルフエノーノペ ２−ニ
トロフェノーノペ３−二）ロフェノール、２−アミノフ
ェノール、３−アミノフェノール、アニリン、２−ブロ
ムアニリン、３−ブロムアニリン、２−クロルアニリン
、３−クロルアニリン、オルトトルイジン、メクトルイ
ジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン、０−フェ
ニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ｐ−フェニレンジアミン、０
−アニシジン、メタアニンジン、○−クレゾール、ｍ−
クレゾール、２−メチル−２，６−シニトロフエノール
、２−メトキン−５′−ニトロアニリン、２−メチル−
５−ニトロアニリン、３．５−ジヒドロキントルエン、
３−メトキシフェノール、２−アミノ−５−メチルフェ
ノーノペ２−ヒドロキシ−３−メチルベンゾイックアシ
ッド、芝−ヒドロキンフェニル酢酸、２．３−ジメチル
フェノール、２．５−ジメチルフェノール、２−エチル
フェノール、３−エチルフェノール、２−メトキシメチ
ルフェノール、２．３−ジメチルアニリン、２．５−ジ
メチルアニリン、３．５−ジエチルアニリン、３−（ジ
メチルアミノ）フェノール、３−メトキシ−Ｎ、Ｎ−ジ
エチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−１，３−フェニレ
ンジアミン、３．５−ジメチル−１，２−フェニレンジ
アミン。
本発明方法によって過酸化水素を消去するに際しては少
なくとも消去されるべき過酸化水素と当量、通常１０〜
１００倍当量の化合物ＣＩ）を加え、適当量、通常１〜
３０Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼを含むように調整すれ
ば極めて短時間に過酸化水素は消去される。
なくとも消去されるべき過酸化水素と当量、通常１０〜
１００倍当量の化合物ＣＩ）を加え、適当量、通常１〜
３０Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼを含むように調整すれ
ば極めて短時間に過酸化水素は消去される。
本発明で用いられる化合物（１）と過酸化水素との反応
によって過酸化水素が分解される時間を次の方法によっ
て測定した。
によって過酸化水素が分解される時間を次の方法によっ
て測定した。
各種のｐＨのグツドバッファ３ｍｌに３０ｍｇのトリト
ンＸ１００、パーオキンダーセ（ＰＯＤ＞４０Ｕを加え
、この液に４−アミノアンチピリン（４−ＡΔ） ０．
３ ｍｇ、又はは第１表に示す化合物（Ｉ）０．９ｍｇ
を加え、過酸化水素０．０６μｃを加えて攪拌し、加え
た過酸化水素の消長をＪＸｌｇｌＪするために化合物（
Ｈには４−ΔＡ ０．３ｍｇ、 ４−ΔＡには化合物
（１）０．９ｍｇを加えて径時的に呈色を追跡した。
ンＸ１００、パーオキンダーセ（ＰＯＤ＞４０Ｕを加え
、この液に４−アミノアンチピリン（４−ＡΔ） ０．
３ ｍｇ、又はは第１表に示す化合物（Ｉ）０．９ｍｇ
を加え、過酸化水素０．０６μｃを加えて攪拌し、加え
た過酸化水素の消長をＪＸｌｇｌＪするために化合物（
Ｈには４−ΔＡ ０．３ｍｇ、 ４−ΔＡには化合物
（１）０．９ｍｇを加えて径時的に呈色を追跡した。
４− Ａ Ａは化合物（■）、過酸化水素及びＰＯＤの
存在下で反応して色素を生成するので過酸化水素が化合
物（１）によって分解されていれば着色がみられないこ
とを利用している。
存在下で反応して色素を生成するので過酸化水素が化合
物（１）によって分解されていれば着色がみられないこ
とを利用している。
比色は化合物（１）がアニリン系の場合５５０ｎｍでフ
ェノール系の場合５００ｎｍで測定した。
ェノール系の場合５００ｎｍで測定した。
吸光度の増加がなくなる最少時間が第１表に示される。
又第１及び２図に化合物１．１２又は１４及び４− Ａ
Ａを用いたときの過酸化水素の消去速度を示す。
Ａを用いたときの過酸化水素の消去速度を示す。
試料中の特定の物質（物質Δという）又は試料中の定量
されるべき物質（物質Ｂという）から特定の物質Δを生
成する反応系における該物質へをオキシダーゼを用いて
分解し、生成する過酸化水素の量から定量する方法にお
いて、該物質Ａ以外の物質（物質Ｅという）の分解に由
来する過酸化水素を消去するために、試料中もしくは反
応系の物質Ｅに由来する過酸化水素と化合物（１）とを
パーオキシダーゼの存在下に反応させて該過酸化水素を
分解し、次いで物質Δ又は物質Ｂから定量的に過酸化水
素を生成せしめうる酵素を上記反応物に加えて生成する
過酸化水素を定量することによって物質へ又は物質Ｂが
簡単に定量できる。
されるべき物質（物質Ｂという）から特定の物質Δを生
成する反応系における該物質へをオキシダーゼを用いて
分解し、生成する過酸化水素の量から定量する方法にお
いて、該物質Ａ以外の物質（物質Ｅという）の分解に由
来する過酸化水素を消去するために、試料中もしくは反
応系の物質Ｅに由来する過酸化水素と化合物（１）とを
パーオキシダーゼの存在下に反応させて該過酸化水素を
分解し、次いで物質Δ又は物質Ｂから定量的に過酸化水
素を生成せしめうる酵素を上記反応物に加えて生成する
過酸化水素を定量することによって物質へ又は物質Ｂが
簡単に定量できる。
物質への例としてコレステロールエステルあるいはグリ
セロールエステルが含まれる。一般にこれらの物質を含
有する試料特に血清中にはこれらの遊離形の物質を含有
し、それ故前述の如くエステル形の定量は複雑となる。
セロールエステルが含まれる。一般にこれらの物質を含
有する試料特に血清中にはこれらの遊離形の物質を含有
し、それ故前述の如くエステル形の定量は複雑となる。
そこでこの場合試料にオキシダーゼ、化合物（１）及び
パーオキシダーゼを加えて遊離形を分解し生成する過酸
化水素も分解し、次いでエステル形を分解して遊離形と
する酵素及び発色剤を加えて生成する過酸化水素を色素
に導びき発色した反応液の吸収を測ることによってエス
テル形が定量できる。
パーオキシダーゼを加えて遊離形を分解し生成する過酸
化水素も分解し、次いでエステル形を分解して遊離形と
する酵素及び発色剤を加えて生成する過酸化水素を色素
に導びき発色した反応液の吸収を測ることによってエス
テル形が定量できる。
又、遊離コリンとコリン含有リン脂質を含有する試料か
らコリン含有リン脂質を求めるときにはコリン・オキシ
ダーゼ、パーオキシダーゼ及び化合物（Ｉ）を試料に加
えてｉＬＬ’Ｉコリン分解し、生成する過酸化水素も分
解し、次いでホスホリパーセＤ及び発色剤を加えてコリ
ン含有リン脂質を分解してコリンを生成させ、このコリ
ンが分解されて生成する過酸化すいそ定量すればコリン
含有リン脂質が簡単に定量できる。
らコリン含有リン脂質を求めるときにはコリン・オキシ
ダーゼ、パーオキシダーゼ及び化合物（Ｉ）を試料に加
えてｉＬＬ’Ｉコリン分解し、生成する過酸化水素も分
解し、次いでホスホリパーセＤ及び発色剤を加えてコリ
ン含有リン脂質を分解してコリンを生成させ、このコリ
ンが分解されて生成する過酸化すいそ定量すればコリン
含有リン脂質が簡単に定量できる。
その他血清中のクレアチニン、シアル酸等の定量にも本
発明方法の適用によって容易に定量できる。
発明方法の適用によって容易に定量できる。
本発明方法を適用して試料中の特定の物質を定量するに
際しては該物質を過酸化水素に導く工程上で該物質以外
の物質から過酸化水素を生成するような物質分解する酵
素、化合物（Ｉ）及びパーオキシダーゼを試料に加え、
必要に応じてバッファーを加えて酵素反応させる。試料
と酵素との親和性をよくするために必要に応じてトリト
ンｘ１００等の界面活性剤を加える。これらの試薬等は
前述の過酸化水素消去における量が用いられる。
際しては該物質を過酸化水素に導く工程上で該物質以外
の物質から過酸化水素を生成するような物質分解する酵
素、化合物（Ｉ）及びパーオキシダーゼを試料に加え、
必要に応じてバッファーを加えて酵素反応させる。試料
と酵素との親和性をよくするために必要に応じてトリト
ンｘ１００等の界面活性剤を加える。これらの試薬等は
前述の過酸化水素消去における量が用いられる。
次いで該本漬されるべき物質の分解酵素及び発色剤を通
常この種の定量で用いられる量加えた後発色した反応液
の可視部通常４００〜７００ｎｍの発色化合物の特徴的
吸収波長における吸収が測定される。
常この種の定量で用いられる量加えた後発色した反応液
の可視部通常４００〜７００ｎｍの発色化合物の特徴的
吸収波長における吸収が測定される。
用いられる発色剤としては４−ＡＡとフェノール等過酸
化水素の量に比例して化合物（Ｉ）と共同で発色する全
ての化合物を用いることができる。
化水素の量に比例して化合物（Ｉ）と共同で発色する全
ての化合物を用いることができる。
化合物（１）は発色化合物の１部として働き、化合物（
１）がアニリン系化合物の場合はフェノールを、フェノ
ール系化合物の場合は４−ＡＡのみを加えることによっ
て目的は達せられる。
１）がアニリン系化合物の場合はフェノールを、フェノ
ール系化合物の場合は４−ＡＡのみを加えることによっ
て目的は達せられる。
バッファーとしてはリン酸バッファー等、用いられる酵
素の至適ｐＨに応じて適宜選択して用いられる。
素の至適ｐＨに応じて適宜選択して用いられる。
以下に本発明の態様を示す実施例を説明する。
実施例１
試験管３本（Ａ、Ｂ、Ｃ）にフェノール３０μｍｏｌ
、）リド７Ｘ１００ ３０ｍｇ、バーオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１，１１，１，７） １０ Ｕ、コレステロール・オ
キシダーゼ（ＥＣ１，１，３，６＞ ６Ｕを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）２．Ｑｍｌを入れる。
、）リド７Ｘ１００ ３０ｍｇ、バーオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１，１１，１，７） １０ Ｕ、コレステロール・オ
キシダーゼ（ＥＣ１，１，３，６＞ ６Ｕを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）２．Ｑｍｌを入れる。
次いて試験管Ａのみに血清２０μｇ添加し、これらを３
７℃、１０分加温する。次いで４−アミノアンチピリン
１μｍ０１、コレステロール・エステラーセ（ＥＣ３，
１，１，１３） ３Ｕを含む０．１ Ｍリン酸緩衝液１
．Ｑｍｌ （ｐＨ７，３）を試験管Ａ、Ｂ、、Ｃに加え
る。しかるのち、Ｂにコレステロール標準液（コレステ
ロール２００ｍｇ／ｃ＋ｊ！水溶液）２０μｌｌｌを添
加、Ｃには精製水２０ｄを添加し、Ａ、Ｂ、Ｃを３１”
Ｃで１０分間インキベートする。反応後ダブルビーム分
光光度計にて試験管Ｃ液を対照にΔ。
７℃、１０分加温する。次いで４−アミノアンチピリン
１μｍ０１、コレステロール・エステラーセ（ＥＣ３，
１，１，１３） ３Ｕを含む０．１ Ｍリン酸緩衝液１
．Ｑｍｌ （ｐＨ７，３）を試験管Ａ、Ｂ、、Ｃに加え
る。しかるのち、Ｂにコレステロール標準液（コレステ
ロール２００ｍｇ／ｃ＋ｊ！水溶液）２０μｌｌｌを添
加、Ｃには精製水２０ｄを添加し、Ａ、Ｂ、Ｃを３１”
Ｃで１０分間インキベートする。反応後ダブルビーム分
光光度計にて試験管Ｃ液を対照にΔ。
Ｂ、Ｃの５００ｎｍにおける吸光度を測定した結果０．
１６８．０．２１５を得た。これよりＡ、Ｂの血清コレ
ステロールエステル値ハ１５６．２８ｍｇ／Ｊと計算さ
れた。
１６８．０．２１５を得た。これよりＡ、Ｂの血清コレ
ステロールエステル値ハ１５６．２８ｍｇ／Ｊと計算さ
れた。
尚コレステロール・エステル値を求める従来法は総コレ
ステロール値から遊離コレステロール値を差し引く方法
であった。次に従来法で前記血清を測定した。
ステロール値から遊離コレステロール値を差し引く方法
であった。次に従来法で前記血清を測定した。
遊離コレステロール値・試験管３本（Ａ、Ｂ、Ｃ）にフ
ェノ−／ｌ／３０ ｐ ｍｏｌ、トリドアＸ１００３０
ｍｇ、パーオキシダーゼＩＯＵ、コレステロールオキン
ダーセ６Ｕ、４−アミノアンチピリン１μｍｏｌを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，３）３、Ｑｍｌを加
え、試験管Δに血清２０μρ、Ｂにコレステロール標準
液（コレステロー２００ｍｇ／ａ＞２０μＱ、Ｃに精製
水２０μＱを添加し、３７℃１０分間インキベートする
。しかるのちダブルビーム分光光度計にてＣ液を対照に
、Δ、Ｂの５００ｎｍの吸光度を測定した結果０．０４
７．０．２１３を得た。これより血清中の遊離型コレス
テロール値は４４．１３ｍｇ／Ｊと算出された。
ェノ−／ｌ／３０ ｐ ｍｏｌ、トリドアＸ１００３０
ｍｇ、パーオキシダーゼＩＯＵ、コレステロールオキン
ダーセ６Ｕ、４−アミノアンチピリン１μｍｏｌを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，３）３、Ｑｍｌを加
え、試験管Δに血清２０μρ、Ｂにコレステロール標準
液（コレステロー２００ｍｇ／ａ＞２０μＱ、Ｃに精製
水２０μＱを添加し、３７℃１０分間インキベートする
。しかるのちダブルビーム分光光度計にてＣ液を対照に
、Δ、Ｂの５００ｎｍの吸光度を測定した結果０．０４
７．０．２１３を得た。これより血清中の遊離型コレス
テロール値は４４．１３ｍｇ／Ｊと算出された。
総コレステロール値：試験管３本（Δ、Ｂ、Ｃ）ニフェ
ノー／Ｉ７３０ ｐ ｍｏｌ、トリトンＸＬＯＯ３０ｍ
ｇ。
ノー／Ｉ７３０ ｐ ｍｏｌ、トリトンＸＬＯＯ３０ｍ
ｇ。
パーオキシダーゼ１０Ｕ１コレステロールオキシダーゼ
６いいコレステロールエステラーゼ３Ｕ１４−アミノア
ンチピリン１μｍｏｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，３）３．０ｍｌを加え、Ａに血清２０μ＆、Ｂに
コレステロールａｈａ ＜コレステロール２００ｍｇ／
Ｊ水溶液）２０塵、Ｃは精製水２０μｇを添加し３７℃
、１０分間反応を行う。しかるのちダブルビーム分光光
度計にてＣ液を対照にＡ、Ｂの５００１ｍの吸光度を求
めた結果、０．２１９．０．２１８を得これより総コレ
ステロール値２００．９２ｍｇ／ｄｌｌを算出した。
６いいコレステロールエステラーゼ３Ｕ１４−アミノア
ンチピリン１μｍｏｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，３）３．０ｍｌを加え、Ａに血清２０μ＆、Ｂに
コレステロールａｈａ ＜コレステロール２００ｍｇ／
Ｊ水溶液）２０塵、Ｃは精製水２０μｇを添加し３７℃
、１０分間反応を行う。しかるのちダブルビーム分光光
度計にてＣ液を対照にＡ、Ｂの５００１ｍの吸光度を求
めた結果、０．２１９．０．２１８を得これより総コレ
ステロール値２００．９２ｍｇ／ｄｌｌを算出した。
以上の結果から（エステル型コレステロール値）＝（総
コレステロール（ａ）−（遊離型コレステロール値）
＝２００．９２−４４．１３ ＝１５６．７９ｍｇ／Ｊ
となり、前述の本発明で得られた値に一致することを確
認した。
コレステロール（ａ）−（遊離型コレステロール値）
＝２００．９２−４４．１３ ＝１５６．７９ｍｇ／Ｊ
となり、前述の本発明で得られた値に一致することを確
認した。
実施例２
試験管３本（Ａ、Ｂ、Ｃ）にＮ−エチル−Ｎ−（３−メ
チルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン２μ
ｍｏｌ、）リドンＸ１００ ６０ｍｇ。
チルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン２μ
ｍｏｌ、）リドンＸ１００ ６０ｍｇ。
パーオキシダーゼ１０Ｕ１コレステロールオキシダーゼ
ＩＯＵを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６、０） ２
． Ｏ１ｌ！ｌを加え、試験管Δに血清２０頭添加し、
３７℃５分間インキベートする。加温後４−アミノアン
チピリン１μｍｏｌ、コレステロールエステラーゼ５Ｕ
を含む０．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６、０）１．０
ｍｌを試験管Ａ、Ｂ、（ｊ、：加える。しかるのち、已
にコレステロール標準液（コレステロール１００ｍｇ／
ａ水溶液）２０屑、Ｃに精製水２０屑を添加後３７℃５
分反応し、しかるのちダブルビーム分光光度計にてＣを
対照Ａ、Ｂの５５０ｎｍの吸光度値を測定し０．３７２
．０．２３５を得、コレステロールエステル値１５８．
３０ｍｇ／ａを算出した。
ＩＯＵを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６、０） ２
． Ｏ１ｌ！ｌを加え、試験管Δに血清２０頭添加し、
３７℃５分間インキベートする。加温後４−アミノアン
チピリン１μｍｏｌ、コレステロールエステラーゼ５Ｕ
を含む０．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６、０）１．０
ｍｌを試験管Ａ、Ｂ、（ｊ、：加える。しかるのち、已
にコレステロール標準液（コレステロール１００ｍｇ／
ａ水溶液）２０屑、Ｃに精製水２０屑を添加後３７℃５
分反応し、しかるのちダブルビーム分光光度計にてＣを
対照Ａ、Ｂの５５０ｎｍの吸光度値を測定し０．３７２
．０．２３５を得、コレステロールエステル値１５８．
３０ｍｇ／ａを算出した。
実施例３
試ＤｔＢ本（Ａ、Ｂ、Ｃ）にｐ−クロルフェノ−／Ｌ、
ｌ Ｑ μ ｍｏｌ、 ト リ ト ７Ｘ １
０ ０ ３ ０ｍｇ、ノ’−キシダーゼ２０Ｕ１
コリン・オキシダーゼ５Ｕを含むｐＨ７，５０，１Ｍ）
リス・塩酸緩衝液２．０ｍｌを加え、試験管Δに血清２
０ｄを加えて、Ａ。
ｌ Ｑ μ ｍｏｌ、 ト リ ト ７Ｘ １
０ ０ ３ ０ｍｇ、ノ’−キシダーゼ２０Ｕ１
コリン・オキシダーゼ５Ｕを含むｐＨ７，５０，１Ｍ）
リス・塩酸緩衝液２．０ｍｌを加え、試験管Δに血清２
０ｄを加えて、Ａ。
Ｂ、Ｃを３７℃５分間インキベートする。
その後、４−アミノアンチピリン１μｍｏｌ、ホスフォ
リパーゼＤ （ＥＣ３，１，４，４）０．６Ｕを含有す
るｐＨ７，５０，１Ｍ）リス−塩酸緩衝液１．Ｑｎ＋１
を加え、Ｂに標準液（コリン水溶液３００ｍｇ／ａｌ’
レシチン換算）２０Ａ１２、Ｃに精製水２０ｗＩを加え
て、３７℃５分間インキベートし、しかるのちダブルビ
ーム分光光度計にてＣを対照にＡ、Ｂの５０５ｎｍの吸
光度値０．３２３．０．５６３を得、コリン含有リン脂
質値１７２． Ｌ １ｍｇ／ａを算出した。
リパーゼＤ （ＥＣ３，１，４，４）０．６Ｕを含有す
るｐＨ７，５０，１Ｍ）リス−塩酸緩衝液１．Ｑｎ＋１
を加え、Ｂに標準液（コリン水溶液３００ｍｇ／ａｌ’
レシチン換算）２０Ａ１２、Ｃに精製水２０ｗＩを加え
て、３７℃５分間インキベートし、しかるのちダブルビ
ーム分光光度計にてＣを対照にＡ、Ｂの５０５ｎｍの吸
光度値０．３２３．０．５６３を得、コリン含有リン脂
質値１７２． Ｌ １ｍｇ／ａを算出した。
尚従来は遊離コリンと総コリン（遊離コリン＋コリン含
有リン脂質）を各々求め、その差よりコリン含有リン脂
質を求めていた。次に従来法で測定した結果を述べる。
有リン脂質）を各々求め、その差よりコリン含有リン脂
質を求めていた。次に従来法で測定した結果を述べる。
遊離コリン値：試験管３本（Ａ、Ｂ、Ｃ）にｐ−クロル
フェノールｌＯμｍｏ＋、トリトンＸ１００３０ｍｇ、
パーオキソダーゼ２０Ｕ１コリンオキシダーゼ５Ｕ１４
−アミノアンチピリン１μｍｏｌを含む０．１ Ｍ ）
リス塩酸緩衝液（１）８７．５ ） ３．０＋ｎｌを加
え、Ａに血清２０ρ、Ｂに標準液（コリン水溶液３００
ｍｇ／Ｊレンチン換算＞ ２０ｊｄｌＸＣに精製水２０
μＱを添加し、３７℃５分間インキベート後、ダブルビ
ーム分光光度計にてＣを対照にΔ。
フェノールｌＯμｍｏ＋、トリトンＸ１００３０ｍｇ、
パーオキソダーゼ２０Ｕ１コリンオキシダーゼ５Ｕ１４
−アミノアンチピリン１μｍｏｌを含む０．１ Ｍ ）
リス塩酸緩衝液（１）８７．５ ） ３．０＋ｎｌを加
え、Ａに血清２０ρ、Ｂに標準液（コリン水溶液３００
ｍｇ／Ｊレンチン換算＞ ２０ｊｄｌＸＣに精製水２０
μＱを添加し、３７℃５分間インキベート後、ダブルビ
ーム分光光度計にてＣを対照にΔ。
Ｂの５０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果０、０２
６．０．５５９を得、遊離コリン（レシチン換算）１３
．５９ ｍｇ／ ｄｅを算出した。
６．０．５５９を得、遊離コリン（レシチン換算）１３
．５９ ｍｇ／ ｄｅを算出した。
総コリン値：試験管３本（Ａ、 Ｂ、 Ｃ）にｐ−クロ
ルフェノ−／ｌ／１０ μｍｏｌ、 ）リド７Ｘ１０
０ ．３０ｍｇ。
ルフェノ−／ｌ／１０ μｍｏｌ、 ）リド７Ｘ１０
０ ．３０ｍｇ。
パーオキシダーゼ２０Ｕ１コリンオキシダーゼ５Ｕ１ホ
スフオリパーゼＤ０．６Ｕ、４−アミノアンチピリン１
μｍｏｌを含む０．１ Ｍ ） ！ｊス・塩酸緩衝液（
ｐ Ｈ７，５） ３．０ｍｌを分注し、八に血清２０ｍ
、Ｂに標準液（コリン水溶液３００ｍｇ／ｄルシチン換
算） ２０ａｔｉ、 ｃに精製水２０ｍを添加し、３７
℃５分間インキベート後ダブルビーム分光光度計にてＣ
を対照にＡ、Ｂの５０５ｎｍ吸光度を測定し０．３５１
．０．５６０を得た。総コリン含有リン脂質（レシチン
換算） １８８．０４ｍｇ／ ｔｉｌｌを算出した。
スフオリパーゼＤ０．６Ｕ、４−アミノアンチピリン１
μｍｏｌを含む０．１ Ｍ ） ！ｊス・塩酸緩衝液（
ｐ Ｈ７，５） ３．０ｍｌを分注し、八に血清２０ｍ
、Ｂに標準液（コリン水溶液３００ｍｇ／ｄルシチン換
算） ２０ａｔｉ、 ｃに精製水２０ｍを添加し、３７
℃５分間インキベート後ダブルビーム分光光度計にてＣ
を対照にＡ、Ｂの５０５ｎｍ吸光度を測定し０．３５１
．０．５６０を得た。総コリン含有リン脂質（レシチン
換算） １８８．０４ｍｇ／ ｔｉｌｌを算出した。
以上より、１８８．０４−１３．１９＝１７４．４５
ｍｇ ／ ｄＲとなり、従来法と前述の本発明法とが一
致した値が得られることを確Ｓ忍した。
ｍｇ ／ ｄＲとなり、従来法と前述の本発明法とが一
致した値が得られることを確Ｓ忍した。
実施例４
試験管３年（Ａ、Ｂ、Ｃ）にジメチルアニリン５μｍｏ
＋、）リド７Ｘ１００ ３０ｍｇ、パーオキシダーゼ４
０Ｕ１グリセロールオキンダーゼ５０Ｕを含む５ Ｑ
ｍ’Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２．０ｍｉを分注
し、八に血清２０薦添加、３７℃１０分間インキベート
後、４−アミノアンチピリン１μｍｏｌ、リポプロティ
ンリパーゼ（ＥＣ３，１，１，３） ０．５ Ｕを含む
５ＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ＬＯｍｌを加え
、Ｂにグリセロール標ζ液（２００ｍｇｚ＃ｊ！トリオ
レイン相当）２０頭、Ｃに精製水２０ｍを添加して３７
℃１０分間インキベート後ダブルビーム分光光度計にて
Ｃを対照にＡ、Ｂの５５０ｎｍにおける吸光度０． ｌ
６３．０．２２３を得、中性脂肪値１４６．１９ｍｇ
／ａを算出した。
＋、）リド７Ｘ１００ ３０ｍｇ、パーオキシダーゼ４
０Ｕ１グリセロールオキンダーゼ５０Ｕを含む５ Ｑ
ｍ’Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ２．０ｍｉを分注
し、八に血清２０薦添加、３７℃１０分間インキベート
後、４−アミノアンチピリン１μｍｏｌ、リポプロティ
ンリパーゼ（ＥＣ３，１，１，３） ０．５ Ｕを含む
５ＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） ＬＯｍｌを加え
、Ｂにグリセロール標ζ液（２００ｍｇｚ＃ｊ！トリオ
レイン相当）２０頭、Ｃに精製水２０ｍを添加して３７
℃１０分間インキベート後ダブルビーム分光光度計にて
Ｃを対照にＡ、Ｂの５５０ｎｍにおける吸光度０． ｌ
６３．０．２２３を得、中性脂肪値１４６．１９ｍｇ
／ａを算出した。
従来は血中の遊離グリセロールと総グリセロール（遊離
グリセロール＋中性脂肪）を別々に求め、その差から真
の中性脂肪値を求めていた。
グリセロール＋中性脂肪）を別々に求め、その差から真
の中性脂肪値を求めていた。
そこで従来法と本発明法の測定値を比較した。
遊離グリセロール値：試験管３本（Ａ、Ｂ、Ｃ）にジメ
チルアニリン５μｍ０１、トリトンＸ１００３０ｍｇ、
パーオキシダーゼ４０Ｕ１グリセロールオキシダーゼ５
０Ｕ、４−アミノアンチピリン１ｐ ｍｏｌを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０）、３、Ｑｍｌを分注
し、Ａに血ａ２０４、已に標準液（グリセロール水溶液
２００ｍｇ／Ｊ）リオレイン相当）２０ｄ、Ｃは精製水
２０ＩｄＩを添加し、１０分間インキベートし、ダブル
ビーム分光光度計にて、Ｃを対照にＡ、Ｂの５５０ｎｍ
の吸光度を測定し、０．０１０．０．２２５を得、遊離
グリセロール８．８９ｍｇ／ｄ１．を算出した。
チルアニリン５μｍ０１、トリトンＸ１００３０ｍｇ、
パーオキシダーゼ４０Ｕ１グリセロールオキシダーゼ５
０Ｕ、４−アミノアンチピリン１ｐ ｍｏｌを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０）、３、Ｑｍｌを分注
し、Ａに血ａ２０４、已に標準液（グリセロール水溶液
２００ｍｇ／Ｊ）リオレイン相当）２０ｄ、Ｃは精製水
２０ＩｄＩを添加し、１０分間インキベートし、ダブル
ビーム分光光度計にて、Ｃを対照にＡ、Ｂの５５０ｎｍ
の吸光度を測定し、０．０１０．０．２２５を得、遊離
グリセロール８．８９ｍｇ／ｄ１．を算出した。
総グリセロール：試験管３本（Ａ、Ｂ、Ｃ）にジメチル
アニリン５μｍｏｌ、）！ＪトンＸ１００３０ｍｇ、パ
ーオキシダーゼ４０Ｕ１グリセロールオキシダーゼ５０
Ｕ、ＩＪボブロチインリパーゼ０．５Ｕ、４−アミノア
ンチピリン１μｍｏｌを含むｐＨ７，０５０ｍＭリン酸
緩衝液３．Ｑｍｌを分注し、Ａに血ｉ’ｉ？ ２．０
、ｉｌｌ、已に標準液（グリセロール水溶液２００ｍｇ
／Ｊ）リオンイン相当）２０ｇ、Ｃに精製水２０塵を加
え、３７℃１０分間加温後ダブルビーム分光光度計にて
Ｃを対照にＡ、Ｂの５５０ｎｍにおける吸光度を求めた
結果０．１７３．０．２２４を辱、総グリセロール値１
５４．４６ｍｇ／ ｄｉ＜ ）リオレイン換算）を算
出した。以上の結果から１５４．４６−８、８９＝１４
５．５７ ｍｇ ／ ｄｉが中性脂肪として算出され、
従来法と法発明法がよく一致した。
アニリン５μｍｏｌ、）！ＪトンＸ１００３０ｍｇ、パ
ーオキシダーゼ４０Ｕ１グリセロールオキシダーゼ５０
Ｕ、ＩＪボブロチインリパーゼ０．５Ｕ、４−アミノア
ンチピリン１μｍｏｌを含むｐＨ７，０５０ｍＭリン酸
緩衝液３．Ｑｍｌを分注し、Ａに血ｉ’ｉ？ ２．０
、ｉｌｌ、已に標準液（グリセロール水溶液２００ｍｇ
／Ｊ）リオンイン相当）２０ｇ、Ｃに精製水２０塵を加
え、３７℃１０分間加温後ダブルビーム分光光度計にて
Ｃを対照にＡ、Ｂの５５０ｎｍにおける吸光度を求めた
結果０．１７３．０．２２４を辱、総グリセロール値１
５４．４６ｍｇ／ ｄｉ＜ ）リオレイン換算）を算
出した。以上の結果から１５４．４６−８、８９＝１４
５．５７ ｍｇ ／ ｄｉが中性脂肪として算出され、
従来法と法発明法がよく一致した。
実施例５
３％過酸化水素を含む食塩水中で５℃３日間漂白したカ
ズノコ１００ｇを２０ Ｕ ／ ｍｇカタラーゼ含有食
塩水１１に５℃３日間漬は過酸化水素を除去した。この
ときのカズノコの中の残存過酸化水素は２．５ ｐｐｍ
であり、以後４日日２．５．５日日２．４．２．４．６
日目２．４ ｐｐｍで分解は進まなかった。一方、３日
間カタラーゼ処理し過酸化水素残存２．５ｐｐｍになっ
たカズノコ１００ｇをメタメトキシジメチルアニリン３
μｍｏｌ、パーオキシダーゼ１０Ｕ ／ｍｌを含む溶液
１１に３０分浸漬したところ過酸化水素は０．５ ｐｐ
ｍ以下となった。
ズノコ１００ｇを２０ Ｕ ／ ｍｇカタラーゼ含有食
塩水１１に５℃３日間漬は過酸化水素を除去した。この
ときのカズノコの中の残存過酸化水素は２．５ ｐｐｍ
であり、以後４日日２．５．５日日２．４．２．４．６
日目２．４ ｐｐｍで分解は進まなかった。一方、３日
間カタラーゼ処理し過酸化水素残存２．５ｐｐｍになっ
たカズノコ１００ｇをメタメトキシジメチルアニリン３
μｍｏｌ、パーオキシダーゼ１０Ｕ ／ｍｌを含む溶液
１１に３０分浸漬したところ過酸化水素は０．５ ｐｐ
ｍ以下となった。
第１及び２図は、次の化合物を用いて過酸化水素を消去
したときの過酸化水素濃度（縦軸：μｍｏｌ ／ｍｌ
）と反応時間（横軸：秒）との関係を示す。 第１図 ■：化合物Ｎα１． ｐＨ６〃 ■：
〃Ｎｏ、 ｌ ４ 、 ｐＨ６，７５〃 ■：
〃 Ｎｏ、１２． ｐＨ５第２図 ４ＡＡ、 ｐ
Ｈ６ 特許出願人 （１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 便１００３００ 抄
したときの過酸化水素濃度（縦軸：μｍｏｌ ／ｍｌ
）と反応時間（横軸：秒）との関係を示す。 第１図 ■：化合物Ｎα１． ｐＨ６〃 ■：
〃Ｎｏ、 ｌ ４ 、 ｐＨ６，７５〃 ■：
〃 Ｎｏ、１２． ｐＨ５第２図 ４ＡＡ、 ｐ
Ｈ６ 特許出願人 （１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 便１００３００ 抄
Claims (1)
- （１）試料中に存在する過酸化水素もしくはオキシダー
ゼによって酸化されて過酸化水素を生成する物質を含有
する試料に該オキシダーゼを作用させて生成する過酸化
水素と一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、ＺはＯＨ又はＮＲ＿４Ｒ＿５（Ｒ＿４、Ｒ＿５
は同一又は異なってよく水素、アルキル、置換アルキル
、アシルを示す）を示し、Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｒ＿３は同
一又は異なってよく、水素、ハロゲン、アルキル、アル
コキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシル、スルホを示す
〕で表される化合物とをパーオキシダーゼの存在下に反
応させて過酸化水素を分解した後試料中の該オキシダー
ゼによって酸化されない定量すべき物質を該オキシダー
ゼによつて酸化されうる物質に酵素反応によって変換し
、生成した物質を該オキシダーゼの存在下に酸化して過
酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を定量するこ
とを特徴とする該定量すべき物質の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29555086A JPS62158497A (ja) | 1980-11-14 | 1986-12-11 | 物質の定量法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55159403A JPS5783287A (en) | 1980-11-14 | 1980-11-14 | Elimination of hydrogen peroxide |
| JP29555086A JPS62158497A (ja) | 1980-11-14 | 1986-12-11 | 物質の定量法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55159403A Division JPS5783287A (en) | 1980-11-14 | 1980-11-14 | Elimination of hydrogen peroxide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62158497A true JPS62158497A (ja) | 1987-07-14 |
| JPH0440000B2 JPH0440000B2 (ja) | 1992-07-01 |
Family
ID=26486215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29555086A Granted JPS62158497A (ja) | 1980-11-14 | 1986-12-11 | 物質の定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62158497A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02190198A (ja) * | 1988-11-17 | 1990-07-26 | Becton Dickinson & Co | ペルオキシダーゼ活性の高感度検出 |
| WO2021054432A1 (ja) * | 2019-09-19 | 2021-03-25 | 積水メディカル株式会社 | 酵素を用いる目的成分の測定方法及び測定試薬 |
-
1986
- 1986-12-11 JP JP29555086A patent/JPS62158497A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02190198A (ja) * | 1988-11-17 | 1990-07-26 | Becton Dickinson & Co | ペルオキシダーゼ活性の高感度検出 |
| WO2021054432A1 (ja) * | 2019-09-19 | 2021-03-25 | 積水メディカル株式会社 | 酵素を用いる目的成分の測定方法及び測定試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0440000B2 (ja) | 1992-07-01 |
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