FR2516936A1 - Procede de mesure quantitative du phosphatidylglycerol - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE MESURE QUANTITATIVE DU PHOSPHATIDYLGLYCEROL. LE LIQUIDE CONTENANT DU PHOSPHATIDYLGLYCEROL EST TRAITE PAR UNE ENZYME POUR OBTENIR DU GLYCERO-3-PHOSPHATE, CET ENZYME ETANT APTE A JOUER LE ROLE D'UN CATALYSEUR DANS LA REACTION DE PREPARATION DU GLYCERO-3-PHOSPHATE ET DE DIGLYCERIDE A PARTIR DU PHOSPHATIDYLGLYCEROL ET DE L'EAU. ON MESURE QUANTITATIVEMENT LE GLYCERO-3-11-PHOSPHATE LIBERE. INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE.

Description

Procédé de mesure quantitative du phosphatidyl-

glycérol.

La présente invention est relative à un pro-

cédé nouveau de mesure quantitative du phosphatidyl-

glycérol. Le syndrome de gêne respiratoire (SGR) chez les nouveaux-nés, pendant la période périnatale, est

un problème grave et les décès qui lui sont dûs repré-

sentent un pourcentage élevé de l'ensemble des décès.

On considère que le SGR se produit en raison du dé-

faut d'agent tensio-actif pulmonaire Cet agent

est important pour empêcher une contraction des al-

véoles pulmonaires qui se dilatent immédiatement

après la naissance Le défaut de cet agent tensio-

actif pulmonaire emporte une atélectasie de respira-

tion et l'apparition d'un SGR En conséquence, si l'on peut prévoir l'apparition du SGR assez tôt et si

l'on peut commencer à soigner le nouveau-né assez -

tôt, on peut empêcher l'apparition du SGR, ou on peut le limiter à un cas bénin Il est donc nécessaire de mesurer cet agent tensio-actif pulmonaire Les moyens dont on dispose à cet effet peuvent être classés en gros en le procédé de mesure dans lequel on utilise

la propriété physique de l'agent tensio-actif pulmo-

naire, et le procédé dans lequel on détermine biochi-

miquement les constituants de l'agent tensio-actif

pulmonaire On a pratiqué ce dernier procédé en mesu-

rant le rapport des lipides tel que le rapport de la

lécithine à la sphingomyéline, celui du phosphatidyl-

glycérol au phosphatidylinositol ou par la mesure quantitative de la dipalmitoylphosphatidylcholine au moyen de la chromatographie en couche mince lAm J.

Obstet Gynecol, 440: 109 ( 1971); Am J Obstet.

Gynecol, 613: 125 ( 1976); Am Obstet J Gynecol, 894: 133 ( 1 N 79); Obstet & Gynecol, 295: 57 ( 1981); Am J Obstet Gynecol, 697: 138 ( 1980); etc l Les résultats de ces divers examens ont permis récemment de montrer que l'existence du phosphatidylglycérol

est un facteur important pour l'apparition du SGR.

Mais la mesure quantitative du phosphatidylglycérol était très difficile, parce qu'il n'existe qu'en une quantité ne représentant que le dixième environ de celle de la lécithine Jusqu'ici, comme procédé de mesure quantitative du phosphatidylglycérol, on

connaît le procédé par chromatographie en couche min-

ce dans lequel, après avoir éliminé le constituant

cellulaire du liquide amniotique par séparation cen-

trifuge, on extrait des constituants lipidiques de la phase qui surnager on sépare les constituants de cet

extrait par chromatographie en couche mince, on mesu-

re quantitativement chaque phospholipide, on obtient les rapports des divers phospholipides et on obtient la quantité de phosphatidylglycérol indirectement à partir de la teneur totale en phospholipides obtenue préalablement par la mesure quantitative de l'acide phosphorique suivant le procédé de combustion humide, lAm J Obstet Gynecol, 613: 125 ( 1976); Am J.

Obstet Gynecol, 1079: 135 ( 1979); Am J Obstet.

Gynecol, 899: 133 ( 1979); Am J Obstet Gynecol,

440: 109 ( 1971)l, ou par le procédé de mesure quanti-

tatif dans lequel on utilise la chromatographie liquide à vitesse élevée lJournal of Chromatography, 277: 223 ( 1981)l Mais ce procédé de chromatographie en couche mince a des inconvénients en ce qu'il faut de deux à trois jours pour extraire les constituants lipidiques du liquide amniotique, en ce que les opéra- tions sont compliquées et, en outre, en ce qu'il est nécessaire de chauffer à une température élevée, en raison de la détection des taches Ce procédé a

aussi l'inconvénient d'être un procédé de mesure in-

directe fondé sur les rapports de quantités relati-

ves à partir des taches et des phospholipides totaux, et de ne pas permettre d'effectuer le traitement simultané de nombreux échantillons parce que l'on met

en oeuvre la chromatographie en couche mince.

Or on a maintenant trouvé que, dans le liqui-

de contenant divers constituants lipidiques à exami-

ner, tel qu'un liquide amniotique, on peut déterminer quantitativement le phosphatidylglycérol seul, d'une

manière simple, commode et précise, en peu de temps.

On a trouvé, d'une manière tout à fait inattendue, que la phospholipase C lphospholipase C: 3,1,4,3, phosphotidylcholinecholinephosphohydrolasel, qui a l'action enzymatique de réaction sur la lécithine et

qui catalyse la réaction pour donner du 1,2-diglycé-

ride et de la phosphatidylcholine, réagit sur le

phosphatidylglycérol en donnant du glycéro-3-phospha-

te et du diglycéride et on obtient un procédé satis-

faisant de mesure quantitative du phosphatidylglycé-

rol en mesurant quantitativement seulement ce glycéro-

3-phosphate produit par la réaction et libéré De préférence, on peut mesurer quantitativement d'une

manière très satisfaisante seulement le phosphatidyl-

glycérol en mettant la phospholipase C à réagir sur

le liquide à examiner pour produire du glycéro-3-

phosphate en faisant réagir la glycérophosphate-

oxydase sur ce glycéro-phosphate et en mesurant la

quantité d'oxygène consommée ou l'eau oxygénée pro-

duite par la réaction L'invention est donc relative

à un procédé de mesure quantitative de phosphatidyl-

glycérol dans le liquide à examiner qui consiste à libérer du glycérol-3phosphate, par l'action d'une

enzyme qui joue le rôle du catalyseur dans la réac-

tion de préparation de glycéro-3-phosphate et de di-

glycéride à partir du phosphatidylglycérol et de

l'eau, et à mesurer ensuite quantitativement le glycé-

ro-3-phosphate produit L'invention a de préférence pour objet un procédé de mesure quantitative du phosphatidylglycérol dans le liquide à examiner qui consiste à effectuer la mesure quantitative par la combinaison des processus (a), (b) et (c) suivants

(a) libération du glycéro-3-phosphate en fai-

sant réagir la phospholipase C sur le phosphatidyl-

glycérol, (b) réaction du glycérophosphate oxydase sur le glycéro-3phosphate, puis (c) mesure de la quantité d'oxygène consommée

ou de l'eau oxygénée produite par la réaction.

Suivant l'invention, il est avantageux de pré-

parer chaque réactif dans une trousse destinée à la mesure quantitative et, en outre, on peut effectuer cette mesure quantitative à la température ambiante de 370 C environ, l'opération étant très simple et le temps-nécessaire à la réaction étant très bref De

plus, on peut mesurer d'une manière précise le phos-

phatidylglycérol à une concentration très basse, et

on peut mesurer directement la teneur en phosphatidyl-

glycérol, ce qui se révèle d'une grande utilité.

Comme la mesure peut être effectuée d'une manière sim-

ple et commode en peu de temps, on peut mesurer simul-

tanément plusieurs échantillons L'invention procure

donc un procédé utile de mesure quantitative du phos-

phatidylglycérol. Comme exemple de l'enzyme qui joue un rôle de

catalyseur dans la réaction de préparation de glycéro-

3-phosphate d et de glycéride à partir de phosphati- dylglycérol et d'eau, figure la phospholipase C. Cette phospholipase C est connue comme une enzyme qui

catalyse la réaction de préparation d'1 mole de diglycé-

rideet d'1 mnle de phosphatidylcholine, à partir d'l mole de lécithine et d'l mole d'eau (Commission des enzymes 3 1 4 3) Pour autant qu'une substance est un catalyseur de la réaction enzymatique mentionnée

ci-dessus, on peut l'utiliser et faire appel notam-

ment à celle obtenue par l'extraction de cellules contenant de la phospholipase C, ou d'un réactif enzymatique disponible sur le marché, par exemple une enzyme provenant d'un microorganisme obtenu par la

culture de microorganismes produisant de la phospho-

lipase C qui appartiennent au genre Streptomyces, tel que Streptomyces hachijoensis, souche A-1143 (FERM-P No 1329), Streptomyces albireticuli IFO

12737, Steptomyces cinnamoneum IFO 12852 (Strepto-

verticillium cinnamoneum sous espèce cinnamoneum IFO 12852), Streptomyces griseocarinensis IFO 12776 (Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776 lparmi

les bactéries appartenant au genre Streptomyces, cel-

les dont le système aérobactérien forme une vrille

sont distinguées du genre Streptomyces pour être dé-

nommées genre Streptoverticillium (Baldacci; 1958)l ou Clostridium welchii et Bacillus cereus l(demande de brevet publiée au Japon sous le No 1356/1978,

Lipid Metabolism P 214 ( 1960)l ou un réactif enzymati-

que de phospholipase C disponible sur le marché La

quantité de phospholipase C utilisée doit être modi-

fiée d'une manière appropriée, en fonction du temps nécessaire à la mesure et de la concentration de

phosphatidylglycérol et aucune limitation particuliè-

re ne lui est imposée C'est ainsi que pour un essai on peut utiliser de la phospholipase C habituellement à une concentration qui n'est pas inférieure à O,1 unité et, de préférence, à une concentration de 1 à

unités environ En outre, on utilise de préféren-

ce cette phospholipase C après l'avoir dissoute dans un tampon tel qu'un tampon Tris-H Cl, faiblement acide à faiblement alcalin, un tampon à l'acide citrique, un tampon à l'acide borique, un tampon PIPES-Na OH ou un tampon à l'imidazole et, si nécessaire, on peut

lui ajouter un agent tensio-actif tel que du dioxy-

cholate de sodium ou de l'albumine sérique Ensuite,

on mélange la solution enzymatique contenant de la phos-

pholipase C ainsi ajustée et le liquide à examiner et il se produit du glycéro-3-phosphate à partir du phosphatidylglycérol du liquide à examiner, avec consommation d'eau Le rapport de mélange des deux n'est pas limité d'une manière particulière, et on peut les mélanger à un rapport tel que, de préférence, de 1 à 100 unités environ de phospholipase C soient

contenues pour un seul essai du liquide à examiner.

La température de réaction peut être de 37 C environ et la durée de réaction celle qui est suffisante

pour la libération du glycéro-3-phosphate, cette du-

rée n'étant pas inférieure habituellement à 5 minutes

et n'étant pas inférieure, de préférence, à 10 minu-

tes On mesure ensuite quantitativement le glycéro-3-phosphate libéré par la réaction A partir de cette valeur de mesure

quantitative, on obtient la teneur en phosphatidyl-

glycérol du liquide à examiner.

Pour la mesure quantitative du glycéro-3-

phosphate, on peut utiliser divers procédés connus

pour la mesure chimique quantitative ou ceux utili-

sant des enzymes De préférence, il est simple et commode de faire appel à un procédé enzymatique de mesure quantitative dans lequel on utilise, pour la réaction, une espèce ou plusieurs espèces d'enzymes dont le substrat est le glycéro-3-phosphate et on mesure quantitativement le changement décelable de l'action enzymatique dans la réaction C'est ainsi, par exemple, que le procédé de type GPO de mesure

quantitative suivant lequel on fait réagir de la gly-

cérophosphate d'oxydase (GPO) sur le glycéro-3-phos-

phate libéré, de manière à consommer l'oxygène du mélange réactionnel pour obtenir de l'eau oxygénée,

est particulièrement simple et commode.

En outre, dans ce procédé de type GPO de mesure quantitative, la quantité d'oxygène consommée

dans la réaction liquide est mesurée par une élec-

trode à oxygène; la quantité d'eau oxygénée produite est mesurée par une électrode à l'eau oxygénée, en fonction du changement électrique, ou l'on mesure la

quantité d'oxygène ou d'eau oxygénée avec une électro-

de à enzyme montée dans une électrode à oxygène ou

dans une électrode à l'eau oxygénée, avec immobilisa-

tion de l'enzyme On peut former des enzymes immobili-

sés par divers moyens, tels que l'inclusion, l'adsorb-

tion et la fixation; c'est ainsi, par exemple, que

la GPO ou la GPO et la phospholipase C sont immobili-

sées par des moyens d'immobilisation connus, tels qu'un procédé suivant lequel la GPO ou la GPO et la phospholipase C sont incluses et immobilisées dans, de l'acrylamide, ou par un procédé suivant lequel la GPO ou la GPO et la phospholipase C sont mélangées

à une protéine telle que l'albumine, et les protéi-

nes sont réticulées pour provoquer l'immobilisation, ou un procédé suivant lequel la GPO ou la GPO et la phospholipase C sont incluses dans du collagène ou de la fibrome, ou sont liées à eux par covalence, ou un procédé suivant lequel la GPO ou-la GPO et la phospholipase C sont immobilisées par adsorbtion sur une résine polymère organique poreuse, ou par liaison covalente avec celle-ci, ou un procédé suivant lequel la GPO ou la GPO et la phospholipase C sont incluses

et immobilisées en utilisant une résine photodurcis-

sable L'enzyme immobilisée peut affecter la forme d'une membrane, d'une fibre, de grains ou avoir une forme tubulaire qui est utilisée, de préférence, pour une électrode à enzyme montée dans une électrode à oxygène ou une électrode à eau oxygénée, et on peut

utiliser l'enzyme immobilisée comme électrode à enzy-

me, cette enzyme immobilisée étant incorporée dans la partie de détection de l'électrode à utiliser, de sorte que la quantité d'enzyme efficace utilisée pour la mesure quantitative par des moyens électriques est

très petite.

En outre, on peut effectuer la mesure-rquanti-

tative de l'eau oxygénée en utilisant une composition à indicateur qui produit une matière décelable, par la réaction sur l'eau oxygénée Comme compositions à indicateur on utilise habituellement les compositions dont le changement peut être mesuré quantitativement

par des moyens spectroscopiques, par exemple une com-

position à réactif coloré dont le changement de coloration se produit dans le domaine visible, une

composition à réactif fluorescent qui est fluorescen-

te sous l'effet de rayons ultraviolets, ou une compo-

sition à réactif photogène qui donne de la lumière.

C'est ainsi, par exemple, que comme composition à

réactif colorant, on peut utiliser une matière conte-

nant une substance ayant une action peroxydase et un chromogène Comme substance ayant l'action peroxydase, on utilise souvent habituellement la peroxydase provenant du raifort et, comme chromogène, on utilise souvent habituellement l'association d'un accepteur

d'électrons et d'un composé phénolique -Comme accep-

teur d'électrons, on peut faire appel par exemple à la 4-aminoantipyrine, au 2-hydrazinobenzothiazole,à la

3-méthyl-2-benzothiazolone hydrazine, au 2-aminobenzo-

thazole, etc Comme composé phénolique, on peut utili-

ser par exemple le phénol, la 3-méthyl-N-éthyl-N-(O-

hydroxyéthyl)aniline, le 3,5-xylénol, la N,N-diméthyl-

aniline, la N,N-diéthylaniline, etc. Comme substrats lumineux d'une composition à réactif fluorescent ou d'une composition à réactif

photogène, on peut citer par exemple un bis( 2,4,6-

trichlorophénol)oxalate, la phénylthiohydantoine,

l'acide homovanillique, l'acide 4-hydroxyphénylacéti-

que, la vanillylamine, la 3-méthoxyéthylamine, l'aci-

de phlorétique, l'hordénine, le monoanion luminolique, la lucigénine, la wafine, etc Chacun d'entre eux peut être utilisé, si nécessaire, en association avec un accepteur d'électrons et/ou une substance ayant une action peroxydase pour la mesure quantitative de

l'eau oxygénée.

Il n'y a pas de limitation particulière pour la quantité du réactif enzymatique ou du chromogène

utilisé C'est ainsi, par exemple, qu'on peut utili-

ser pour un essai,habituellement pas moins de 0,05 unité, de préférence de O,1 à 200 unités de GPO et habituellement pas moins de 0,05 et, de préférence de O,1 à 500 unités de peroxydase On peut utiliser également une solution ajustée par de l'eau distillée

ou par une solution tampon faiblement acide, ou fai-

blement alcaline, telle que la concentration d'un accepteur d'électrons ou d'un composé phénolique ne soit pas inférieure habituellement à O,1 m M On peut utiliser ces réactifs séparément de la solution enzymatique de phospholipase C mentionnée ci-dessus ou on peut les mélanger à celle-ci avec, en outre,

la possibilité de constituer ces réactifs en une com-

position de mesure quantitative sous la forme d'une composition liophilisée ou d'un stratifié integré, en les appliquant sur des papiers filtres, des pellicules, etc. Le procédé de type GPO de mesure quantitative

présente une sensibilité élevée au glycéro-3-phospha-

te du liquide à examiner et, comme ce procédé n'est pas affecté par les impuretés du liquide à examiner, c'est un procédé excellent pour effectuer une mesure précise. La GPO utiliséepour ce procédé de type GPO peut être n'importe quelle enzyme pour autant qu'elle joue un rôle de catalyseur dans la réaction, afin de donner de l'acide dihydroxyacétone phosphorique et de

l'eau oxygénée à partir de glycéro-3-phosph-

ate et d'oxygène et, par exemple, du genre Streptococ-

cus, du genre Lactobacillus, du genre Lenconostoc,

des bactéries produisant de la glycérophosphate oxy-

dase qui appartiennent au genre Pediococcus (demande de brevet japonais non examinée No 72892/1978), une enzyme obtenue par la culture de bactéries produisant

de la glycérophosphate oxydase qui appartient au gen-

re Aerococcus (Aerococcus viridans, souche IFO 12219 et souche IFO 12317, demande de brevet japonais non examinée No 15746/1980) et des enzymes disponibles

sur le marché.

Comme autre procédé enzymatique de mesure quantitative du glycéro-3phosphate, on fait réagir de la glycérophosphate dihydrogénase qui

catalyse la réaction de production d'acide dihydroxy-

acetone phosphorique et de NAD de type réduit à partir du glycéro-3phosphate et du nicotine

adénine dinucléotide (NAD) sur du glycéro-3-phos-

ate libéré dans la solution à tester, en la pré-

sence de NAD pour produire de l'acide dihydroxyacéto-

ne phosphorique et du NAD de type réduit, et en mesu-

rant ensuite quantitativement ce NAD de type réduit de manière à pouvoir déterminer la quantité de glycéro-3-phosphate Quand on effectue la mesure

quantitative de ce NAD de type réduit, on peut utili-

ser habituellement la mesure de l'absorbance à une longueur d'onde de 340 nm environ, ou, après avoir

laissé se développer une coloration par un sel hydro-

soluble de tétrazolium, tel que le bromure de 3-( 4, -diméthyl)-2thiazolyl-2 H-tétrazolium, le chlorure

de 2-(p-iodophényl)-3-(p-nitrophény-l)-5-phényl-2 H-

tétrazolium, le chlorure de 3,3 '-( 3,3 '-diméthoxy-4,

4 '-biphénylène)-bisl 2-(p-nitrophényl-5-phényl-2 H-

tétrazoliumb (bleu de nitrotétrazolium), ou le 2,6-

dichlorophénolindophénol en la présence de diaphorase

ou de méthosulfate de phénazine, on mesure la colora-

tion en fonction des absorbances en utilisant leurs

longueurs d'onde particulièresd'absorption.

En outre, pour ce qui concerne ces enzymes,ces

réactifs et autres, il est simple et commode d'utili-

ser ceux disponibles sur le marché et l'on peut déter-

miner d'une manière appropriée la quantité qui doit

être utilisée De même, si nécessaire, on peut utili-

ser un agent tensio-actif ou un agent stabilisant et

ceux-ci peuvent être incorporés à diverses composi-

tions. En outre, comme liquide à examiner, on peut

utiliser n'importe quel échantillon pourvu qu'il con-

tienne du phosphatidylglycérol, par exemple des flui-

des de l'organisme, tels que le fluide amniotique.

Quand du fluide amniotique est le liquide à examiner, l'échantillon obtenu peut être utilisé

tel qu'il est, ou si la teneur en phosphatidylglycé-

rol est très faible, on peut concentrer l'échantillon

par exemple en soumettant 5 à 6 ml du fluide amnioti-

que échantillonné à une extraction par 15 à 18 ml d'un mélange chloroforme-méthanol ( 2:1), en recueil- lant la couche chloroformique par centrifugation à 2000 tours à la minute, et en l'évaporant à siccité dans de l'hydrogène gazeux pour obtenir les lipides totaux Ensuite, on dissout ces lipides totaux dans une quantité définie d'une solution à 1 % de Triton X-100 et on peut utiliser la solution obtenue comme échantillon de fluide amniotique De cette manière, chaque solution enzymatique de phospholipase C et et d'autre enzyme telle qu'utilisée dans les procédés

de type GPO de mesure quantitative mentionnés ci-

dessus et d'autres réactifs peuvent réagir successi-

vement ou simultanément sur la solution à examiner.

Dans ce cas, il n'y a pas de limite particulière sur

le rapport à utiliser du liquide à examiner au réac-

tif enzymatique et autres et, habituellement, on uti-

lise de 0,1 à 3 ml de la solution du réactif enzyma-

tique ou autres pour 0,01 ml à 1 ml du liquide à examiner Pour ce qui concerne les conditions de la réaction, il est-préférable d'effectuer la réaction à 370 C environ et, pour ce qui concerne la durée de

la réaction, on peut la choisir quelconque, pour au-

tant que la réaction soit complètement achevée; habi-

tuellement, on poursuit la réaction pendant pas moins de 5 minutes et, de préférence, pendant pas moins de l Ominutes Comme milieu de réaction, on utilise de l'eau, ou un tampon faiblement acide à faiblement

alcalin, comme solvant de chaque réactif.

Ainsi, par la mesure quantitative du liquide

à examiner, on peut mesurer directement et quantita-

tivement le phosphatidylglycérol en un temps très

court, jusqu'à une concentration extrêmement basse.

En outre, on n'a pas besoin d'effectuer d'opérations compliquées et on peut effectuer le procédé à la température normale Il s'ensuit qu'il s'agit là d'un bon procédé de mesure quantitative. Il n'y a pas non plus de limite particulière imposée au procédé de mesure de l'activité de la

phospholipase C et de la GPO utilisées dans les exem-

ples pratiques mentionnés ci-après, donnés uniquement à titre d'exemple:

(a) Procédé de mesure de l'activité de la phospholi-

pase C.

On mélange 0,1 ml d'une solution de phosphati-

dylcholine à 4 %,(séparée du jaune d'oeuf et purifiée), 0,3 ml d'un tampon à l'acide tris-chlorhydrique 0,1 M (p H 8,5) et 0,1 ml d'une solution aqueuse à 20 m M de

Mg C 12 et on ajoute au tout 0,1 ml d'une solution enzy-

matique contenant de la phospholipase C On laisse réagir le mélange à 37 C pendant 15 minutes et on met le milieu réactionnel en suspension par addition de 0,8 ml d'acide trichloroacétique à 3,6 % et de 0,1 ml d'albumine sérique à 5,5 %, puis on laisse reposer le mélange réactionnel au bain-marie pendant 20 minutes pour filtrer sur un papier filtre Toyo (No 5 B) et l'on prélève 0,5 ml de filtrat que l'on place dans un ballon de-décomposition Kjeldahl que l'on additionne de 0,55 ml de HC 104 à 60 %, et que l'on décompose pendant 2 heures à 170 C, le phosphore minéral libéré développant une coloration par addition de 0,5 ml d'une solution d'essai au sulfite d'amidol, de 0,25 ml de nmolybdate d'amonium à 3,3 % et de 3,2 ml d'eau Après avoir

laissé reposer à température ambiante pendant 20 minu-

tes, on mesure l'absorbance à la densité optique de 650 mp L'activité de l'enzyme qui dégage 1 p M/ml de phosphore minéral à la minute est définie comme étant

1 unité (U).

* (b) Procédé de mesure de l'activité de la GPO.

Tampon à l'acide tris-chlorhydrique 0,2 M (p H 8,0) 0,2 ml Peroxydase ( 0, 5 mg/ml, 45 U/ml) 0,1 ml 4-aminoantipyrine à 0,3 (P/V) 0,1 ml DL-glycéro3 phosphate 0,1 M 0,1 ml N,N-diméthylaniline (V/V) à 0,2 % 0,2 ml

Eau distillée 0,3 ml.

On charge un millilitre du liquide de réaction ayant la composition mentionnée ci-dessus dans un petit tube à essai, et on chauffe à 37 C pendant 3 minutes On ajoute 20 pl d'une solution enzymatique contenant de la GPO et on laisse réagir le mélange pendant 10 minutes Puis on met le milieu de réaction

en suspension par l'addition de 2,0 ml de laurylben-

zènesulfonate de sodium à 0,25 % (P/V) et on mesure l'absorbance du produit à une longueur d'onde de

565 nm.

On calcule l'activité de l'enzyme suivant l'équation: Activité de l'enzyme (U/ml) = ( 6 A) x ( 50) dans laquelle AA représente l'absorbance pendant 10

minutes à une longueur d'onde de 565 nm.

Les exemles suivants illustrent l'invention.

Les figures 1 et 2 représentent la courbe de

mesure quantitative du phosphatidylglycérol.

EXEMPLE 1

ml Tampon diméthylglutamate-Na OH 0,2 M 0,2 (p H 7,5) Ca C 12 à 10 m M 0, 2 Dioxycholate de sodium à 10 % 0,05 Albumine sérique du boeuf à 10 % 0,1 Solution contenant 40 U/ml de phospholipase C et 50 U/ml de GPO 0,1 Peroxydase à 45 U/ml 0,1 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,2 3-méthyl-N-éthyl-N ( hydroxyéthyl) 0,2 aniline à 0,3 % Eau distillée 0,85

On prépare 2,0 ml de la composition de réac-

tion pour la mesure quantitative du phosphatidyl-

glycérol ayant la composition mentionnée ci-dessus et

on y ajoute 50 Pl d'une solution à examiner qui con-

tient diverses teneurs en phosphatidylglycérol (ces teneurs varient de 20 N moles ê 100 N moles) et on fait réagir le mélange à 37 C pendant 25 minutes,

puis on mesure le développement de coloration du pig-

ment produit après la réaction, par l'absorbance à

la longueur d'onde de 550 nm (DO 550).

Les résultats obtenus sont représentés à la

figure 1 On obtient une relation linéaire satisfai-

sante en fonction de la teneur en phosphatidylglycé-

rol de la solution examinée.

Total 2,0 ml

EXEMPLE 2

ml Tampon au diméthylglutamate-Na OH à 0,2 0,2 M (pli 7,5) Dioxycholate de sodium à 10 % 0,05 Solution contenant 20 U/ml de phospholipase C et 50 U/ml de GPO 0,1 Peroxydase à 45 U/ml 0,1 4-aminoantipyrine à 0,3 % 0,2 Phénol à 0,3 % 0,2 Albumine sérique de boeuf à 1 % 0,1 Eau distillée 1,05

On prépare 2,0 ml de la composition de réac-

tion pour la mesure quantitative du phosphatidylglycé-

rol ayant la composition mentionnée ci-dessus et on

ajoute à cette solution 50 pl de la solution à exami-

ner contenant diverses teneurs en phosphatidylglycé-

rol (ces teneurs vont de l Onmoles à 100 N moles) On laisse le mélange réagir pendant 15 minutes à 37 C et l'on mesure la coloration du pigment produit après la réaction par l'absorbance à la longueur d'onde de

500 nm (DO 500).

Les résultats sont indiqués à la figure 2 o l'on obtient une courbe de mesure quantitative ayant une linéarité satisfaisante en fonction de la teneur

en phosphatidylglycérol.

À Total 2,0

Claims (9)

REVENDICATIONS

1 Procédé de mesure quantitative du phospha-

tidylglycérol dans un liquide, caractérisé en ce qu'il consiste à libérer du glycéro-3-phosphate par l'action d'une enzyme jouant un rôle de catalyseur dans la réaction de production de glycéro-3-phosphate et de diglycéride à partir de phosphatidylglycérol et d'eau,

et à mesurer ensuite quantitativement le glycéro-3-

phosphate libéré.

2 Procédé suivant la revendication 1, carac-

térisé en ce que l'enzyme qui joue un rôle de cataly-

seur dans la réaction de production de glycéro-3-

phosphate et de diglycéride à partir du phosphatidyl-

glycérol et de l'eau est la phospholipase C. 3 Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le liquide est un fluide de l'organisme.

4 Procédé de mesure quantitative du phospha-

tidylglycérol, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer les stades successifs suivants de: (a) libération du glycéro-3-phosphate en

faisant réagir la phospholipase C sur du phosphati-

dylglycérol,

(b) réaction de la glycérophosphate oxy-

dase sur le glycéro-3-phosphate, puis (c) mesure de la quantité d'oxygène

consommée ou d'eau oxygénée produite dans la réaction.

Procédé suivant la revendication 4, carac- térisé en ce qu'il consiste à effectuer la mesure

quantitative de l'oxygène par le procédé electrochimi-

que en utilisant une électrode à l'oxygène.

6 Procédé suivant la revendication 4, carac-

térisé en ce qu'il consiste à effectuer la mesure

quantitative de l'eau oxygénée par un procédé electro-

chimique en utilisant une électrode à l'eau oxygénée.

7 Procédé suivant la revendication 4, carac-

térisé en ce qu'il consiste à effectuer la mesure

quantitative de l'eau oxygénée en utilisant une compo-

sition à indicateur qui se transforme en un produit

décelable produit par la réaction sur l'eau oxygénée.

8 Procédé suivant la revendication 7, carac-

térisé en ce que la composition à indicateur est une composition engendrant une coloration, une composition fluorescente, ou une composition engendrant de la lumière.

9 Procédé suivant la revendication 8, carac-

térisé en ce que la composition engendrant une colora-

tion contient la substance ayant une action de peroxy-

dase et un précurseur de colorant.

Procédé suivant la revendication 9, carac-

térisé en ce que le précurseur de colorant est la 4-

aminoantipyrine et le phénol.

11 Procédé suivant la revendication 9, carac-

térisé en ce que le précurseur de colorant est la 4-

aminoantipyrine et la 3-méthyl-N-éthyl-N(<-hydroxy-

éthyl)aniline.

12 Procédé suivant la revendication 10 ou

11, caractérisé en ce que la mesure consiste à effec-

tuer unemesure d'absorbance à une longueur d'onde

de 500 nri environ.