DK167197B1 - Middel og fremgangsmaade til bilirubinresistent bestemmelse af urinsyre - Google Patents

Description

i DK 167197 B1

Opfindelsen angår et middel og en fremgangsmåde til bestemmelse af urinsyre i en flydende prøve. Det ved fremgangsmåden anvendte middel indeholder en uricase, en peroxidase, en phenol eller naph-thol samt 4-aminophenazon.

5 Den foreliggende opfindelse angår generelt diagnostiske under søgelser, herunder især undersøgelser, der kan anvendes til kvalitative og kvantitative bestemmelser af urinsyre i legemsvæsker såsom urin eller blod. Den angår især undersøgelser ved hvilke urinsyre omdannes til et oxiderende substans, såsom et peroxid.

10 Den oxidative koblingsreaktion mellem phenol og 4-aminophena zon, også kendt som 4-aminoantipyrin, der giver et rødt quinonimin-farvestof, har været kendt i lang tid og har været beskrevet af Emerson, J. Org. Chem. 8:417 (1943).

Reaktionen er blevet populær i klinisk kemi efter at Trinder, 15 [Ann. Cl in. Biochem, 6:24 (1969)] anvendte den til enzymatisk bestemmelse af glucose, baseret på reaktionsskemaet: glucose + 02 9lJ>C03.P oxidase—> gluconsyre + H202 2H202 + phenol + 4-aminophenazon Pero~^da-e > quinoniminfarvestof 20 +4H20.

Det chromogene system, phenol (inklusiv substituerede phenoler) + 4-aminophenazon + peroxidase, kaldet Emerson-Trinder systemet, bruges nu til kvantitativ bestemmelse af ikke blot glucose, men også cholesterol og urinsyre i serum, plasma og andre biologiske væsker.

25 Anvendelsen af dette system til bestemmelse af glucose er beskrevet i Meiattini, beskrivelsen til U.S. Patent No. 3.886.045 nu genudstedt som Re 29.498.

Det generelle reaktionsskema er som følger: 30 1) analyt + 02 iPggifik oxidase > oxideret analyt + ^ 2) CfiH, I6 5 \_qh peroxidase 35 H3C^ ^NH2 - C,H,.

i 6 5 3 /==v (farvet produkt) h3c^=^n " DK 167197 B1 2

Mange phenol er kan bruges i Emersom-Trinder reaktionen. Eksempler på de mest almindeligt anvendte i klinisk kemi er phenol; p-hydroxybenzoat; 2,4-dichlorophenol; 3,5-dichloro-2-hydroxybenzen-sulfonsyre. Ligeledes kan forskellige substituerede og usubstitu-5 erede naptholer anvendes.

Bestanddele i prøven som kan bestemmes omfatter glucose, cholesterol, urinsyre eller andre metaboliter, som kan oxideres af en specifik oxidase under samtidig dannelse af hydrogenperoxid. Oxidasen ved bestemmelsen af glucose er glucoseoxidase; cholesterol -10 oxidase til bestemmelse af cholesterol (cholesterolesterhydrolase tilsættes også for at hydrolysere esterificeret cholesterol); og uri case bestemmelse til bestemmelse af urinsyre.

Mængden af dannet farvestof, er proportional med koncentrationen af hydrogenperoxid og derfor med koncentrationen af bestand-15 delen i prøven. Således kan koncentrationen af prøvens bestanddel opnås ved en simpel måling af den omsatte opløsnings absorbans og sammenligning af denne måling med den for en standardopløsning af bestanddelen.

Den dannede farve kan måles i det synlige område, almindeligvis 20 mellem 500 og 550 nanometer (nm) (afhængig af den anvendte phenol); det kræver kun et kolorimeter eller et fotometer til det synlige lysområde.

Emerson-Trinders chromogene system har den store ulempe, at den oxidative koblingsreaktion påvirkes af reducerende forbindelser og 25 bilirubin, en metabolit som sædvanligvis er tilstede i serum i koncentrationer, der ikke er højere end 1 milligram pr. deciliter (mg/dl), men som kan nå meget høje niveauer (20 eller mere mg/dl) ved visse sygdomme. Højere koncentrationer af bilirubin end normalt påvirker den enzymatiske glucose-, cholesterol- og urinsyrebestem-30 mel se ved at nedsætte reaktionens farveudvikling. Interferensen forøges ved forøgelse af bil i rubinniveauet.

Forklaringen på negativ interferens for reducerende forbindelser (f.eks. ascorbinsyre) er ganske indlysende, eftersom de hovedsageligt virker som konkurrenter til chromogenet i den peroxi-35 dasekatalyserede reaktion med hydrogenperoxid, eller som blegemiddel på__den dannede farve. Interferens fra reducerede forbindelser er imidlertid ikke et virkeligt problem, i det mindste ikke i serum, hvor ascorbinsyre sjældent overskrider 3 mg/dl.

I modsætning hertil er interferens fra bilirubin et signifikant DK 167197 B1 3 problem ved bestemmelse af metaboliter i serum ved Emerson-Trinders chromogene system, og repræsenterer et stort negativt aspekt ved dette system i rutinelaboratoriepraksis, hvor der ofte forekommer hyperbilirubiniske prøver.

5 Bilirubins virkningsmekanisme er ganske kompleks, og forstås endnu ikke helt. Den bedste forklaring, der indtil videre er givet på problemet er den af Witte [Clin. Chem. 24:1778 (1978)], som tilskriver interferens fra bilirubin en eller flere af følgende faktorer: simple spektraleffekter, virkning som et alternativt 10 peroxidasesubstrat, eller destruktion af peroxidasereaktionens mellemprodukter.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en forbedret prøve til påvisning af urinsyre i en flydende prøve.

15 Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejbringe en forbedret prøve til påvisning af urinsyre, hvilken prøve i høj grad er modstandsdygtig overfor interfererende effekter fra bilirubin.

Dette formål opnås med midlet ifølge opfindelsen, hvilket middel er ejendommelig ved, at det udover de i krav l's indledning 20 angivne bestanddele indeholder et ferrocyanid.

Andre formål vil fremgå og en bedre forståelse af opfindelsen vil opnås ud fra den efterfølgende beskrivelse'og krav rettet mod foretrukne udførelsesformer for denne.

Som en del af den foreliggende opfindelse er det blevet opdag-25 et, at bilirubin interfererer stærkt med farveudviklende prøver af en type, der omfatter substitueret eller usubstitueret phenol og 4-aminophenazon, hovedsagelig ved to forskellige mekanismer: (1) ved at overlappe spektret for den ved reaktionen dannede farve, og derved medføre en positiv interferens, og (2) ved en kemisk mekanis-30 me, som diskuteret tidligere, hvilket bevirker en negativ interferens. Den positive interferens, som opstår ved den første mekanisme, kan reduceres ved at aflæse absorbansen ved en bølgelængde på 520 nm eller højere. Dette er imidlertid ikke tilfældet med hensyn til den anden mekanisme. Den spiller en yderst vigtig rolle, når 35 bilirubin er tilstede i en prøve i anormale koncentrationer og forårsager ukorrekte resultater ved de ovenfor beskrevne prøver.

I modsætning til sammensætningen ifølge den hidtil kendte teknik, er den ifølge den foreliggende opfindelse meget følsom over for tilstedeværelse af urinsyre i legemsvæsker, mens den også i det DK 167197 B1 4 væsentlige er resistent overfor bi li rubi ninterferens.

Dette overraskende resultat opnås ifølge den foreliggende opfindelse med en sammensætning til påvisning af urinsyre i en flydende prøve af den type, der omfatter midler, som er responsive 5 overfor tilstedeværelsen af urinsyre i prøven, phenol og 4-amino-phenazon, og som er bibragt resistens overfor bil i rubi ninterferens ved inkludering heri af reagensmidler, der omfatter en ferrocyani-dion.

Skønt der for klarhedens skyld bruges specifikke udtryk i den 10 efterfølgende beskrivelse, er disse udtryk kun beregnet på den specielle udførelsesform for opfindelsen, der er udvalgt som eksempelvis illustration, og de har ikke til formål at definere eller begrænse rækkevidden af opfindelsen.

Sammensætningen ifølge opfindelsen kan antage mange fysiske 15 former og omfatte en phenol - inklusive substituerede eller usubsti-tuerede phenol er - der er velkendt for sin anvendelighed til brug sammen med 4-aminophenazonindicatorforbindelser, i kombination med de reagensmidler, som omfatter en ferrocyanidion. Disse er beskrevet sammen med materialer såsom stabiliseringsmidler eller andre konven-20 tionelle additiver, som yderligere kan tilsættes om ønsket.

Foretrukne reagensmidler omfattende en ferrocyanidion indbefatter al kalimetal salte af ferrocyanid, såsom natrium- eller kaliumfer-rocyanid, såvel som en hvilken som helst anden ferrocyanidionkilde, inklusive et hvilket som helst salt eller system, der indeholder -4 25 eller er i stand til at frigive Fe(CN) g ioner.

Sammensætningen omfatter foruden reagensmidlet ifølge opfindelsen midler, der er responsive overfor tilstedeværelsen af urinsyre i en flydende prøve under dannelse af et oxiderende substans. Sådanne urinsyreresponsive midler er fortrinsvis af enzymatisk natur og 30 omfatter fortrinsvis uri case og et peroxidativt aktivt substans. De koncentrationer og reagenstyper, der er brugbare i de urinsyreresponsive midler, forventes at omfatte de allerede kendte inden for området. Prøvemidlet kan til bestemmelse af urinsyre anvendes som en opløsning. Opløsningsmidlerne til fremstilling af opløsningerne kan 35 være vand, fysiologiske opløsninger, organiske opløsningsmidler, sås.om methanol, eller blandinger heraf.

Sammensætningen anvendes fortrinsvis til at påvise urinsyre ved at tilsætte den til en prøve, såsom urin, cerebrospinal væske, supernatant fra vævskultur, og fortrinsvis serum, plasma eller DK 167197 B1 5 fuldblod.

Når sammensætningen anvendes i opløsningsform, anvendes reagensmidlet, der indeholder ferrocyanidionen, fortrinsvis i koncentrationer på fra ca. 1,0 mi kromol/li ter (/imol/1) og til en mættet 5 opløsnings. Det foretrukne område er fra ca. 5 /tmol/1 til ca. 50 /zmol/1. Når uricase er en del af det urinresponsive middel, ligger koncentrationerne heraf fortrinsvis på fra ca. 10 internationale enheder (I. U. )/1 i ter (1) til ca. 200 I.U./l. Når peroxidase i det mindste er et af de reagenter, der udgør det urinsyreresponsive 10 middel, er peroxidasekoncentrationerne fortrinsvis på fra ca. 10 I.U./l til ca. 200 I.U./l.

Enzymaktiviteten udtrykkes i internationale enheder (I.U.), en I.U. er den enzymaktivitetsmængde, der kræves for at katalysere omdannelsen af 1 mi kromol {μιηο']) af substratet pr. minut under 15 specificerede pH og temperaturforhold. Peberrodperoxidase og uricase, der er benyttet i eksemplerne kan fås fra The Research Products Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana.

Der er også tilvejebragt prøvemidler, som inkorporeres sammensætningen ifølge opfindelsen og en fremgangsmåde til fremstilling af 20 disse prøvemidler, hvilken fremgangsmåde omfatter inkorporering af en bærer, såsom en matrix, med sammensætningen. Når denne inkorporering foregår ved imprægnering med en opløsning af sammensætningen ifølge opfindelsen, tørres den således imprægnerede bærer. Foruden ved imprægnering kan midlerne ifølge den foreliggende opfindelse 25 fremstilles ved andre egnede inkorporeringsteknikker, såsom ved trykning eller påsprøjtning af sammensætningen på et substrat eller en matrix. Alternativt kan sammensætningen ifølge opfindelsen inkorporeres i en bærer, der har form af en presset eller formet tablet indeholdende sædvanligt bæremateriale.

30 Udtrykket bærer refererer til matrixer, der er uopløselige i og bibeholder deres strukturelle integritet, når de udsættes for fysiologisk eller anden væske. Egnede matrixer, som kan bruges, indbefatter papir, cellulose, træ, syntetisk harpiksuld, glasfiber, uvævede og vævede stoffer, gelatine, forskellige organiske polyme-35 rer, såsom polypropylen, og andre organiske materialer, der er velkendt som filmdannere af fagfolk inden for området. For nemheds skyld kan bæreren eller prøvemidlet forbindes med en uopløselig støtte- eller håndteringsorgan, som kan laves med polystyren.

Når prøvesammensætningen skal bruges til påvisning af urinsyre DK 167197 B1 6 i blod, dækkes overfladen af det imprægnerede bæremateriale fordelagtigt med en semipermeabel gennemsigtig dækfilm af ethyl cel lul ose eller andet egnet materiale. Dette kan udføres ved f.eks. at påføre et lag af ethyl cel lul ose opløst i benzen på overfladen af den 5 imprægnerede bærematrix og derpå fjerne opløsningsmidlet ved fordampningstørring.

Urinsyreindikatorer i form af behandlede bærematrixer eller prøvemidler opbevares ofte i anselige tidsrum før brug, og det er derfor ønskeligt at de valgte reagenser ikke er let autooxiderbare i 10 luft. Det er tilrådeligt at beskytte prøvemidlerne mod lyspåvirkning, og i nogle tilfælde er det ønskeligt at holde dem forseglet i en fugtafvisende emballage, som kun åbnes med det formål at fjerne en eller flere prøvemidler kort tid før brugen heraf.

Om ønsket kan en bærematrix behandles med et baggrundsfarvestof 15 med speciel farve, såsom gul, således at den farve, der dannes ved prøvningsreaktionen, blandes med baggrundsfarven til frembringelse af forskellige farvetoner svarende til koncentrationen af prøvebe-standdelen.

Midlet fremstilles fortrinsvis ved en enkelt dyppeproces.

20 Koncentrationen af de reagenter, der benyttes til dyppet, ligger fra _3 omkring 10 mM og op til en mættet opløsnings. Generelt mest anvendelig for 4-aminophenazon er en koncentration på omkring 0,2 mM. Peroxidasekoncentration ligger fra ca. 0,1 mg/dl til ca. 20 mg/dl i dyppeopløsningen. De til fremstilling af imprægneringsop-25 løsningen benyttede opløsningsmidler kan være vand, fysiologiske opløsninger, organiske opløsningsmidler eller kombinationer heraf.

Prøvemidlet anvendes med fordel ved en momentan dypning i en undersøgelsesprøve eller ved på anden måde at introducere en undersøgelsesprøve på bærematrixen, hvorved der fremkommer en påviselig 30 farveændring herpå, når urinsyre er tilstede. Prøvemidlet kan benyttes på samme måde hvadenten der undersøges prøver af plasma, serum eller andre legemsvæsker. Ved undersøgelse af fuldblod er det imidlertid at foretrække, at en bloddråbe kontaktes med overfladen af prøvemidlet.

35 EKSEMPEL I

Bestemmelse af urinsyre i serum med uricase oa oeroxidase/3,5-di chloro-2-hvdroxvbenzensulfonsvre/4-ami nophenazon.

Der blev fremstillet prøveopløsninger i overensstemmelse med den hidtil kendte teknik og den foreliggende opfindelse, og de blev DK 167197 B1 7 sammenlignet med hensyn til deres resistens overfor interfererende effekter fra bilirubin ved bestemmelse af urinsyre.

Prøveopløsninger blev fremstillet i overensstemmelse med den hidtil kendte teknik med følgende formulation: 5 phosphatpuffer 150 mmol/1, pH 7,0 uricase 60 I.U./l peroxidase 140 I.U./l 4-aminophenazon 0,24 mmol/1 3,5-di chloro-2-hydroxy- 10 benzensul fonsyre 2,0 mmol/1

Prøveopløsninger, der indeholdt sammensætningen ifølge opfindelsen blev fremstillet nøjagtig som ovenfor, men med tilsætning af 20 /zmol/l kaliumferrocyanid [K4Fe(CN)6].

En 2,0 ml delprøve af den kendte prøveopløsning blev pipetteret 15 i hvert reagensglas i første gruppe, og en 2,0 ml delprøve af opløsningen af sammensætningen ifølge opfindelsen blev pipetteret i hvert reagensglas i en anden gruppe. En parallel serie af prøver blev introduceret i reagensglassene i hver gruppe.

Serumprøver blev tilvejebragt, forenet og undersøgt for indhold 20 af urinsyre og bilirubin. Urinsyre blev tilsat til de sammenblandede sera til en koncentration på 6,0 mg/dl og opløsningen blev delt op i delprøver. Bilirubin blev tilsat i sådanne mængder, at der tilvejebragtes urinsyreopløsningsprøver, der havde bilirubinkoncentrationer på 0,7, 1,4, 2,2, 3,6, 5,0, 6,5, 8,8, 12,1, 16,7 og 23,4 mg/dl.

25 Andre urinsyreopløsningsdelprøver uden bilirubin blev benyttet som en standardopløsning.

Hver gruppe af reagensglas blev injiceret en parallel serie af 0,05 ml prøveopløsning indeholdende de forskellige bilirubinkoncentrationer, og reaktionen i disse reagensglas fik lov til at forløbe 30 i 15 minutter ved stuetemperatur. Absorbansaflæsningerne blev udført ved 520 nm mod de tilsvarende blindprøver, som var opnået ved at udlade uricase fra reagentformulationerne.

Resultaterne, der viser procent genfinding af urinsyre i prøver, til hvilke der benyttes prøvningssammensætninger ifølge den 35 kendte teknik og ifølge opfindelsen ved de forskellige koncentrationar af bilirubin er vist i tabel 1.

5

Tabel 1 DK 167197 B1 8

Urinsyre målt fprocent genfinding)

Bilirubin med uden (mg/dl) K4Fe(CN)6 K4Fe(CN)g 10 0,7 100,0 ± 1,2 100,0 ± 1,2 1,4 100,0 97,2 2,2 99,2 93,5 3,6 98,0 83,6 5,0 97,0 78,5 15 6,5 95,9 71,5 8,8 93,4 59,0 12,1 91,0 43,5 16,7 90,0 21,0 23,4 89,0 20

En bemærkelsesværdig kemisk interferens (omkring 6%) bemærkes i urinsyreundersøgelsen i fravær af ferrocyanid selv på et bi 1 i rubinniveau så lavt som 2 mg/dl, og dette er endnu mere dramatisk (mere end 20%) ved et niveau på 5 mg/dl.

25 Når der bruges ferrocyanid, reduceres den kemiske interferens fra bilirubin kraftigt (statistisk ikke signifikant ved 2 mg/dl bilirubin; 3% ved 5mg/dl; omkring 10% ved bilirubinniveauer så høje som 15-20 mg/dl).

30 EKSEMPEL II

Prøvemiddel til bestemmelse af urinsyre i urin med uricase og perox-idase/3,5-di chloro-2-hvdroxvbenzensulfonsvre/4-aminophenazon.

Der blev fremstillet prøvemidler indeholdende sammensætningen 35 ifølge den hidtil kendte teknik og den foreliggende opfindelse og deres resistene over for interfererende effekter fra bilirubin ved analyse for tilstedeværelse af urinsyre i urin.

En imprægneringsopløsning ifølge den hidtil kendte teknik blev fremstillet med følgende formulation: DK 167197 B1 9 phosphatpuffer 150 mmol/1, pH 7,0 uricase 150 I.U.

peroxidase 860 I.U.

4-aminophenazon 0,24 mmol 5 3,5-dichloro-2-hydroxy- benzensulfonsyre 2 mmol Η£θ til 1000 ml

Imprægneringsopløsninger indeholdende en sammensætning ifølge 10 den foreliggende opfindelse blev tilberedt nøjagtig som ovenfor, mén med tilsætning af 20jamol kaliumferrocyanid [K^Fe(CN)g].

Ark af Whatman nr. 17 filtrerpapir (Whatman, Inc. Clifton, N.J.) blev imprægneret til mætning med imprægneringsopløsninger og tørret ved 60° Celcius (C). Disse ark, der indeholdt den tørrede 15 rest af imprægneringsopløsningerne, blev tilskåret til 2,5 millimeter (mm) x 2,5 mm til dannelse af prøvemidler. Prøvemidlerne blev så forsynet med dobbeltsidet klæbetape og med dette fikseret til piasthåndtag.

Urinprøver blev tilvejebragt, forenet og undersøgt for indhold 20 af urinsyre og bi li urubin. Den forenede urin blev derpå fortyndet med 10 volumen destilleret vand. Urinsyre blev tilsat til den fortyndede urinpulje indtil en koncentration på 6 mg/dl urinsyre var opnået. Så blev bilirubin tilsat den fortyndede urinpulje til en koncentration på 10 mg/dl og tilvejebragte såleledes en prøveopløs-25 ning. Denne prøveopløsning blev opdelt i delprøver.

Prøvemidler fremstillet i overensstemmelse med opfindelsen blev momentært neddykket i en delprøve af urinsyreprøveopløsningen og prøvemidler fremstillet i overensstemmelser med den hidtil kendte teknik blev momentært neddykket i en anden delprøve heraf. Prøve-30 midlerne blev undersøgt visuelt for farveændring efter ca. 10 minutter.

Prøvemidler fremstillet i overensstemmel se med opfindelsen viste en distinkt prøveændring tilkendegivende tilstedeværelse af urinsyre, hvorimod forsøgsmidler indeholdende den hidtil kendte 35 sammensætning ikke skiftede farve, derved meddelende en falsk negativitet hvad angår urinsyre.

Claims (11)

1. Middel til bestemmelse af urinsyre i en flydende prøve, hvilket middel indeholder en uricase, en peroxidase, en phenol eller naphthol samt 4-aminophenazon, kendetegnet ved, at midlet 5 yderligere indeholder et ferrocyanid.

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at phenol -en er en usubstitueret phenol.

3. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at phenol-en er 3,5-dichloro-2-hydroxybenzensulfonsyre.

4. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder et ferrocyanid ionsalt.

5. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at ferro-cyanidionsaltet er natriumferrocyanid.

6. Middel ifølge krav 4, kendetegnet ved, at ferro- 15 cyanidionsaltet er kaliumferrocyanid.

7. Prøvemiddel, som omfatter en bærer inkorporeret med midlet ifølge et af kravene 1-6.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et prøvemiddel, k e nd e -tegnet ved, at en bærer inkorporeres med midlet ifølge krav 1.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at midlet inkorporeres i bæreren ved at imprægnere bæreren med en opløsning af midlet efterfulgt af tørring af den imprægnerede bærer.

10. Fremgangsmåde til bestemmelse af urinsyre i en flydende prøve, kendetegnet ved, at prøven kontaktes med midlet 25 ifølge krav 1, og at en eventuelt dannet resulterende farve observeres.

11. Fremgangsmåde til bestemmelse af urinsyre i en flydende prøve, kendetegnet ved, at prøven kontaktes med prøvemidlet ifølge krav 7, og at en eventuel herpå fremkommet farve 30 observeres. 35