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Verfahren und Mittel zur quantita-
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tiven Bestimmung von Wasserstoffperoxid und deren Anwendung Die Erfindung
betrifft ein Verfahren und ein Mittel zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid.
Diese Bestimmungsmethode wird bekanntermaßen zur quantitativen Bestimmung bestimmter
Stoffe, wie Harnsäure, Cholesterin, von Triglyceriden, Glucose und Phospholipiden,
insbesondere in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Liquor oder Urin, verwendet, aus
denen mit Hilfe spezifischer Oxidasen Wasserstoffperoxid gebildet wird.
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Die Bildung eines roten Chinoniminfarbstoffes durch oxidative Kupplung
von Phenol und 4-Aminophenazon (4-Aminoantipyrin) ist beispielsweise aus J. Org.
Chem. 8, Seite 417 (1943) bekannt. Die Anwendung dieses chromogenen Systems in der
klinischen Chemie zur quantitativen Bestimmung von Glucose ist in Ann. Clin. Biochem.
6, Seite 24 (1969) beschrieben. Hierbei wird die Glucose mit Sauerstoff in Gegenwart
von Glucoseoxidase zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid umgesetzt, das mit Phenol
und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase den Chinoniminfarbstoff bildet.
Da die gebildete Farstoffmenge der Wasserstoffperoxidkonzentration proportional
ist, läßt sich anhand kolorimetrischer oder photometrischer Messungen durch einen
Vergleich mit einer bekannten Standardlösung die Wasserstoffperoxidkonzentration
bestimmen. Diese in der klinischen Chemie anwendbare Reaktion wird als Trinder-Reaktion
bezeichnet Ähnliche in der klinischen Chemie anwendbare chromogene Systeme zur Bestimmung
von Wasserstoffperoxid bestehen aus einer aminoaromatischen Säure und einem 4-Aminoantipyrin
(DE-OS 3 003 490) oder einem aromatischen Amin und einem Hydrazon (DE-OS 2 506 115).
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Alle diese Farbreaktionen werden durch reduzierende Verbin-
dungen
und vor allem durch Bilirubin beeinflußt, in dessen Gegenwart Bestimmungsungenauigkeiten
von 10 bis 50 % auftreten, so daß die quantitativen Bestimmungen zu ungenau werden.
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Zur Ausschaltung der Störung des chromogenen Systems durch Bilirubin
wird in den DE-OSen 2 744 812 und 2 925 365 der Zusatz von Ferrocyanidionen-und
gemäß der DE-OS 3 021 259 der Zusatz von Amidopyrin vorgeschlagen. Der Zusatz von
Amidopyrin beseitigt den störenden Einfluß von Bilirubin nur ungenügend, und der
Zusatz von Ferrocyanid ergibt einen sehr hohen Leerwertanstieg, insbesondere beim
Stehen der Reagenzlösungen, das bei der Verwendung in klinischen Laboratorien nicht
zu vermeiden ist. Hohe Leerwerte, d.h. Farbintensitäten in der unbenutzten Reagenzlösung,
führen ihrerseits wieder zu Bestimmungsungenauigkeiten, da bei hohen Farbintensitäten
in der Ausgangslösung Differenzwerte weniger genau ermittelbar sind.
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Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein
Verfahren und Reagenz zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid zu bekommen,
das einerseits nicht störanfällig gegenüber Bilirubin ist und andererseits eine
möglichst gute Leerwertstabilität des Reagenz in Lösung ergibt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid
in einer Flüssigkeitsprobe durch peroxidasekatalysierte Umsetzung mit einem chromogenen
System aus einer Komponente (A), bestehend aus wenigstens einer aromatischen Verbindung
mit wenigstens einem Hydroxyl- und/ oder Aminosubstituenten, und einer Komponente
(B), bestehend aus wenigstens einem Pyrazolinon, Oxazolinon oder Hydrazon, und Bestimmung
der Konzentration-der bei der Umsetzung gebildeten Farbstoffe, ist dadurch gekennzeichnet,
daß man die Umsetzung in Gegenwart eines Metallocens durchführt.
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Bei diesen Verfahren bekommt man einen ausgezeichneten
Schutz
gegen Bilirubininterferenzen und gleichzeitig eine gute Leerwertstabilität in Lösung,
d.h. eine erheblich längere Haltbarkeit der Reagenzlösungen und einen universelleren
Einsatz. Die Erhöhung der Leerwertstabilität bekommt man insbesondere auch gegenüber
den Reagenzlösungen, die Ferrocyanid enthalten.
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Metallocene sind Bis-( cyclopentadienyl)-metallkomplexe (siehe Römpps
Chemie-Lexikon, 7. Auflage, Seite 2129), für die eine sogenannte Sandwich-Struktur
charakteristisch ist.
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Der Begriff " "Metallocene", wie er in der vorliegenden Beschreibung
und den Ansprüchen verwendet wird, bedeutet auch kern-und seitenkettensubstituierte
Metallocenderivate In Betracht kommen beispielsweise Metallocene von Eisen, Nickel,
Kobalt, Ruthenium, Osmium und Mangan. Zweckmäßig werden erfindungsgemäß Metallocene
der Gruppe VIII des Periodensystems der Elemente, besonders Metallocene von Eisen,
Kobalt und Nickel, inbesondere Ferrocene, d.h. Ferrocen selber und dessen kern-
und seitenkettensubstituierte Derivate, verwendet.
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Die erfindungsgemaß bevorzugt verwendeten Metallocenderivate lassen
sich durch die allgemeine Formel
wiedergeben, worin R1, R2, R 3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoffatome, Alkylreste,
Arylreste, Aralkylreste, Halogenatome, Carboxylgruppen oder Sulfonsäuregruppen bedeuten.
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Die Alkyl-, Aryl- sowie Aralkylreste können ihrerseits durch Halogenatome,
Carboxylgruppen oder Sulfonsäuregruppen substituiert sein. Die Alkylgruppen, auch
jene in den Aralkylresten, enthalten vorzugsweise 1 bis 6, besonders 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
Die Arylreste enthalten, soweit sie substituiert sind, vorzugsweise ein oder zwei
Substituenten.
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Die Halogenatome sind vorzugsweise Chlor oder Brom.
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Nach der Erfindung besonders bevorzugt verwendetes Ferrocen ist Ferrocenmonocarbonsäure.
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Die Metallocene können den erfindungsgemäßen Mitteln zur quantitativen
Bestimmung von Wasserstoffperoxid in unterschiedlichen Mengen zugesetzt werden,
wobei die Menge des Metallocens normalerweise bei 20 bis 10.000 EMol je Millimol
der Komponente B enthalten ist. Vorzugsweise liegt die Menge bei 80 bis 2.000, besonders
bei 150 bis 1.000 pMol je Millimol der Komponente B.
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Als Komponente A kommen zahlreiche Phenolderivate oder Naphtholderivate
in Betracht, wie sie auf den Seiten 7 bis 13 der DE-OS 2 544 812 beschrieben sind.
Diese Phenolderivate und Naphtholderivate könnnen in den nicht von wenigstens einer
Hydroxylgruppe eingenommenen Stellungen der aromatischen Ringe durch niedermolekulare
Alkylgruppen, vorzugsweise solche mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenylreste, Cyclohexylreste,
Halogenatome, insbesondere Chloratome oder Bromatome, Alkoxygruppen, insbesondere
solche mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Sulfonsäuregruppen, Carbonsäuregruppen, Carbonsäureestergruppen
(insbesondere solche mit Phenyl) oder Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
oder Aminogruppen substituiert sein. Andere mögliche Substituenten und spezielle
Derivate finden sich in den Tabellen auf den Seiten 7/8 und 10 der DE-OS 2 744 812.
Eine bekanntermaßen zweckmäßig verwendbare Verbindung ist 2,4-Dichlorphenolsulfonat.
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Andere als Komponente A verwendbare Verbindungen sind Barbitursäure
und deren Derivate, Pyrazolone, Diketohydrinden und 2, 4-Diamino-6-hydroxypyrimidin.
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Aminosubstituenten enthaltende Komponenten A sind bei spielsweise
die nicht gleichzeitig in ortho- und para-Stellung substituierten aromatischen Amine
oder Säureadditionssalze derselben, die in der DE-OS 2 506 115 beschrieben sind.
Dies
sind sowohl kernunsubstituierte als auch kernsubstituierte
aromatische Amine, die primär, sekundär oder tertiär sein können. Bevorzugt sind
dabei Anilinderivate, Naphthylamine oder Naphthylaminderivate. Ein besonders bevorzugtes
aromatisches Amin ist dabei N,N-Dimethylanilin.
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Im Fall der kernsubstituierten aromatischen Amine kommen als Substituenten
niedermolekulare Alkylgruppen, niedermolekulare Alkoxygruppen, Hydroxylreste, Halogenatome,
Alkylthiogruppen, Mercaptogruppen, Aminogruppen, Mono- oder Diniederalkylaminogrupen
in Betracht. Niedermolekulare Alkylgruppen sind in allen diesen Substituenten jeweils
geradkettige oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit bis zu 6, vorzugsweise mit bis
zu 4 Kohlenstoffatomen. Halogensubstituenten sind vorzugsweise Brom oder Chlor.
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Geeignete kernsubstituierte aromatische Amine sind beispielsweise
m-Phenylendiamin, o-Chloranilin, Naphthyl-(l)-amin, o-Toluidin, p-Aminophenol oder
Naphthal-(2)-amin. Von diesen können auch die Säureadditionssalze, wie Halogenide
oder Sulfate, verwendet werden.
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Brauchbar sind auch die in der DE-OS 3 003 490 beschriebenen aminoaromatischen
Säuren der Formel
worin'X einen Mono- oder Dialkylaminorest und ZH eine Carboxylgruppe oder Sulfonsäuregruppe
bedeutet. Die Alkylgruppen sind dabei wiederum bevorzugt niedermolekulare Alkylgruppen
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, besonders mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Diese Säure
können zusätzlich noch am Benzolkern substituiert sein, wie beispielsweise durch
Halogenatome, wie Chloratome oder Bromatome, oder niedermolekulare Alkylgruppen.
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Die Komponente B ist ein Pyrazolinon, Oxazolinon oder Hydrazon. Beispiele
von Pyrazolinonen und Oxazolinonen sind 4-Dimethylamino-2, 3-dimethyl-l-phenyl-3-pyrazolin-5-on,
Natriumsalz von 2, 3-Dimethyl-l-phenyl-5-pyrazolon-4-aminomethansulfonsäure, Natriumsalz
von l-Phenyl-2,3-dimethyl-5-pyrazolon-4-yl-isobutylaminomethansul-fonat , 4-Isopropyl-2,
3-,dimethyl-l-phenyl-3-pyrazolin-3-on, 2-Dimethylamino-5-phenyl-2-oxazolin-4-on
und Na-l-phenyl-2,3-dimethyl-5-pyrazolon-4-methylaminomethansulfonat. Bevorzugt
ist 4-Aminophenazon, das auch als 4-Aminoantipyrin bekannt ist.
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Beispiele der verwendbaren Hydrazone sind solche, die mit der Komponente
A unter Bildung eines Farbstoffes oxidativ kuppeln können, wie N-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon,
N-Methylpyridon-4-hydrazon, N-Methylpyridon-2-hydrazon, N-Met-hylchinolinon-2-hydrazon,
N-Methylchinolinon-4-hydrazon, N-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon, N-Methylthiazolinon-2-hydrazon,
N-Methyl-4-phenylthiazolinon-2-hydrazon, N-Methyloxazolinon-2-hydrazon, N-Methylbenzoxazolinon-2-hydrazon,
1,3-Dimethylbenzimidazolinon-2-hydrazon und deren Säureadditionssalze. Besonders
bevorzugt ist dabei N-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid.
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Die Komponenten A und B sind auf die angegebenen Beispiele nicht beschränkt,
sondern vielmehr ist der Erfindungsgedanke auf alle Trinder-Systeme und abgewandelten
Trinder-Systeme anwendbar.
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Die erfindungsgemäßen Mittel zur Durchführung des Verfahrens enthalten
notwendigerweise 1. Peroxidase, 2. die Komponente (A), 3. die Komponente (B) und
4. ein Metallocen einschließlich der substituierten Derivate eines Metallocens.
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Außerdem ist in diesen Mitteln gewöhnlich ein Puffer enthalten. Geeignete
Puffer sind Phosphat-, Pyrophosphat-, Borat-
oder andere bekannte
Puffer, wie Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, .N,N,N-Tris- (2-hydroxyäthyl) -methyl-2-aminomethansulfonsäure,
N-(2-Hydroxyäthyl)-piperazin-N'-2-äthansulfonsäure, N,N-Bis-(2-hydroxyäthyl)-glycin,
N,N,N-Tris-(2-hydroxyäthyl)-methylglycin, Piperazin-N,N-bis-(2-äthansulfonsäure)
und N,N-Bis- (2-hydroxyäthyl)-2-aminoäthansulfonsäure. Andere bekannte Puffersysteme
kommen hierfür ebenfalls in Betracht.
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Zur Lagerung in trockenem Zustand sind die Komponenten des Mittels
gewöhnlich auf verschiedene Gemische verteilt, die beim Ansetzen der Reagenzlösung
miteinander vermengt werden.
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Je nachdem, für welche spezielle Bestimmung der Test eingesetzt werden
soll, enthält das erfindungsgemäße Mittel im Regelfall noch ein weiteres Enzym,
wie Uricase im Falle der Harnsäurebestimmung oder Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase
im Falle der Cholesterinbestimmung. Die im Einzelfall zuzusetzenden Enzyme sind
aus der Literatur bekannt.
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Die nachfolgenden Tabellen I bis III zeigen den überraschenden technischen
Fortschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens und Mittels gegenüber dem Stand der'Technik.
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Ein erfindungsgemäßes Reagenz A nach Beispiel 1 wurde mit einem Reagenz
B nach dem Stand der Technik, das gemäß Vergleichsbeispiel hergestellt wurde und
Kaliumferrocyanid enthielt, hinsichtlich der Stabilität der Reagenzienleerwerte
und hinsichtlich des Bilirubineinflusses untersucht. In letzterem Vergleichsversuch
wurde auch ein Reagenz C einbezogen, das gemäß dem Beispiel 1 unter Weglassung der
Ferrocenmonocarbonsäure zusammengesetzt war.
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Die nachfolgende Tabelle I zeigt den Reagenzienleerwert (RLW) für
die beiden Reagenzien A und B und in der letzten Spalte den Unterschied des Reagenz
B nach dem Stand der Technik gegenüber dem erfindungsgemäßen Reagenz A. Die Werte
zeigen, daß frisch aufgelöstes Reagenz A und B annähernd den gleichen Reagenzienleerwert
besaß. Eine Lagerung des
Lyophilisates, d.h. der Trockensubstanzen
während 7 Tagen bei 370 C ergab nach Rekonstitution ebenfalls keinen nennenswerten
Unterschied zwischen den Reagenzien A und B. Bei Lagerung in Lösung bei Raumtemperatur
während 5 Tagen dagegen zeigte sich ein erheblicher Stabilitätsverlust bei dem Reagenz
nach dem Stand der Technik. Ein noch größerer prozentualer Unterschied ergab sich
bei der Lagerung der beiden Reagenzien während drei Wochen bei 40 C. Dieser Vergleichsversuch
zeigt daher die überraschende Überlegenheit der erfindungsgemäßen Reagenzien bezüglich
der Leerwertstabilität gegenüber den einzigen gegenüber Bilirubin nicht störanfälligen
Reagenzien mit Ferrocyanidionen.
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In Tabelle II ist für die beiden Reagenzien A und B die prozentuale
Veränderung gegenüber dem frisch aufgelösten Zustand gezeigt. Wiederum ist ersichtlich,
daß der Anstieg des.Reagenzienleerwertes bei dem Reagenz B nach dem Stand der Technik
während der Lagerung in Lösung viel größer als bei dem erfindungsgemäßen Reagenz
A war. Auch diese Tabelle zeigt somit wieder die gegenüber dem Stand der Technik
erheblich bessere Leerwertstabilität des Anmeldungsgegenstandes.
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In Tabelle III sind die Ergebnisse einer Harnsäurebestimmung für die
Reagenzien A, B und C mit und ohne Bilirubineinfluß aufge-führt. Bei dem erfindungsgemäßen
Reagenz A führt die Harnsäurebestimmung zu einer quantitativen Wiederfindung ohne
Bilirubineinfluß. Bei-Bilirubinzusatz resultiert eine minimale Störung, die noch
fast in der Fehlergrenze der Bestimmungsmethode liegt.
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Etwa die gleichen Ergebnisse findet man bei dem bekannten Reagenz
B.. Bei dem Reagenz C ohne Ferrocyanid und ohne Metallocen dagegen findet man bei
Anwesenheit von Bilirubin nur knapp 60 % der Harnsäure wieder, so daß dieses Reagenz
für die quantitative Bestimmung in der klinischen Chemie ungeeignet ist.
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Zusammengenommen zeigen die Vergleichsversuche also, daß die erfindungsgemäßen
Reagenzien bezüglich der Widerstandsfähigkeit gegen Bilirubinstörung mit den in
dieser Beziehung besten Reagenzien nach dem Stand der Technik, nämlich solchen,
die Ferrocyanidionen enthalten, vergleichbar sind, daß aber gegenüber diesen Reagenzien
die erfindungsgemäßen hinsichtlich der Stabilität des Reagenzienleerwertes weit
überlegen sind.
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Tabelle I Vergleich der Reagenzienleerwerte (RIW) eines erfindungsgemäßen
Harnsäure-Reagenzes (A) gegenüber den Leerwerten eines Standard-Reagenze (B) unter
verschiedenen Stabilitätsbedingungen/Belastungen A B Harnsäure-Reagenz mit Ferrocenmonocarbonsäu-
Anstieg des RLE (B) re nach der Erfindung Stand der Technik gegenüber (A) E gegen
Wasser E gegen Wasser % von (A) Reagenz frisch aufgelöst 0,023 # 0,006 0,021 # 0,005
Lagerung des Reagenzes in Lösung bei Raumtemperatur; 5 Tage 0,054 # 0,021 0,154
# 0,060 + 285 % Belastung des Lyophilisates bei 37° C; 7 Tage 0,017 # 0,002 0,018
# 0,008 + 5,9 % Lagerung des Reagenzes in Lösung bei 4° C; 3 wochen 0,033 # 0,006
0,102 # 0,031 + 309 %
Tabelle II Anstieg der Reagenzienleerwerte
(RIW) eines erfindungsgemäßen Harnsäure-Reagenzes (A) unter verschiedenen Belastungsbedingungen,
jeweils bezogen auf das unbelastete, frisch gelöste Reagenz Als Vergleich sind die
entsprechenden Daten eines Standard-Reagenzes (B) gegnübergestellt
| Reagenz A (n = 7) Reagenz B (n = 8) |
| Unbelastetes |
| Reagenz; frisch |
| aufgelöst 0 % 0 % |
| aufgelöst; 5 Tage |
| bei 20 bis 25° C |
| gelagert + 135 % + 633 % |
| Belastung des Lyo- |
| philsates; 7 Tage |
| 37° C; Frischwerte - 26 % - 14 % |
| aufgelöst; 3 Wochen |
| bei 4° C gelagert + 43 % + 386 % |
Tabelle III Wiederfindung von Harnsäure im Kontrollserum Monitrol
IE (Sollwert 5,20 mg/dl = 100 % gesetzt) I: Kontrollserum ohne Bilirubin - Zusatz
( 1,4 mg/dl) II: Kontrollserum mit Bilirubin - Zusatz (+ 20,0 mg/dl) A I II Reagenz
mit Metallocen-Zusatz (Ferrocenmonocarbonsäure) nach der Erfindung 100 # 1,7 % 96,7
# 1,4 % (n = 7) B Reagenz mit Zusatz von Kaliumferrocyanid nach dem Stand der Technik
99 # 2,9 % 95,6 # 2,6 % (n = 7) C Reagenz A ohne Metallocen-Zusatz 99 # 3,3 % 57,7
# 7,9 % (n = 6)
Beispiel 1 Erfindungsgemäßes Reagenz zur enzymatischen
Bestimmung von Harnsäure der folgenden Zusammensetzung: 300 U Uricase (Candida utilis)
1000 U Peroxidase (Meerrettich) 0,3 mMol 4-Aminophenazon 6 mMol 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure
200 . UMol Ferrocenmonocarbonsäure 50 mMol Puffer; pH-Wert 7,0 jeweils bezogen auf
1000 ml einer gebrauchsfertigen Reagenzlösung.
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Beispiel 2 Erfindungsgemäßes Reagenz zur enzymatischen Bestimmung
von Cholesterin der folgenden Zusammensetzung: 200 U Cholesterinesterase 200 U Cholesterinoxidase
5000 U Peroxidase 0,25 mMol 4-Aminophenazon 30,00 mMol Phenol 200 pMol Ferrocenmonocarbonsäure
30 mMol Puffer; pH-Wert 6,5 jeweils bezogen auf 1000 ml einer gebrauchsfertigen
Reagenzlösung.
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Beispiel 3 Erfindungsgemäßes Reagenz zur enzymatischen Bestimmung
von Triglyceriden der folgenden Zusammensetzung: 0,5 mMol 4-Aminophenazon 5,5 mMol
4-Chlorphenol
1,0 mMol ATP 5,1 mMol Magnesiumionen 100 pMol Ferrocenmonocarbonsäure
225 000 U Lipoproteinlipase LPL 500 U Glycerokinase GK 1 900 U Glycerin-3-phosphatoxidase
GPO 850 U Peroxidase POD 40 mMol PIPES - Puffer; pH-Wert 7,5 jeweils bezogen auf
1000 ml einer gebrauchsfertigen Reagenzlösung.
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Vergleichsbeispiel Zusammensetzung des Standard-Reagenzes B (Vergleichsreagenz)
in den Tabellen I, II und III: 50 mMol Phosphat-Puffer; pH 7,0 4 mMol 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure
0,3 mMol 4-Aminophenazon 200 U Uricase (Candida utilis) 1000 U Peroxidase (Meerrettich)
20 pMol Kaliumhexacyanoferrat (II) jeweils bezogen auf 1000 ml einer gebrauchsfertigen
Reagenzlösung.