DE69121456T2

DE69121456T2 - Stabilisiertes Harnsäurereagens

Info

Publication number: DE69121456T2
Application number: DE1991621456
Authority: DE
Inventors: James Denton; Richard Allen Kaufman
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1990-05-09
Filing date: 1991-04-30
Publication date: 1996-12-19
Anticipated expiration: 2011-05-01
Also published as: CA2041896A1; EP0456088B1; JPH0670798A; JP2854995B2; CA2041896C; DE69121456D1; EP0456088A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der in vitro- Diagnostika und insbesondere Reagenzien zur Bestimmung von Harnsäure in Proben von Körperflüssigkeiten. Derartige Verfahren bedienen sich typischerweise eines Uricase, Peroxidase und einen Indikator enthaltenden Mehrfachreagenssystems.
Harnsäure ist das Hauptendprodukt des Purinmetabolismus beim Menschen und eine der Komponenten der Nichteiweißstickstofffraktion im Plasma. Die Serumharnsäurespiegel sind charakteristischerweise bei Gicht, einer erblichen Störung, die entweder die Harnsäuresynthese oder die Harnsäureausscheidung umfaßt, erhöht. Hyperurikämie ist auch mit einer Nierenfehlfunktion, Ketoacidose und dem Lesch-Nyhan-Syndrom verbunden. Erkrankungen, die die Kernproteinbildung und den Kernproteinmetabolismus beeinträchtigen, wie Leukämie, Lymphom, Polycythämie und verschiedene verstreute Neoplasmen, führen zu Hyperurikämie. Es besteht folglich ein Interesse daran, genaue ökonomische und angenehme Verfahren zur Bestimmung der Harnsäurekonzentrationen in Körperflüssigkeiten zu haben.
Zur Bestimmung von Harnsäure im Blut wurden die verschiedensten Verfahren verwendet. Die meisten der frühen Verfahren waren kolorimetrische Verfahren. Folin und Denis beschrieben ein Verfahren einer Umsetzung von Phosphowolframsäure mit Harnsäure in alkalischer Lösung unter Bildung eines blauen Chromophors (Journal of Biological Chemistry 3: 469 (1972)). Obwohl es zahlreiche Anwendungen für das Phosphowolframsäurereduktionsverfahren gab, war die Trübe häufig ein Problem (R. J. Henry, Clinical Chemistry Principles and Technics (1979)). Kalckar verbesserte das Verfahren durch Verwendung von Uricase zur Oxidation von Harnsäure zu Allantom. Die Harnsäurekonzentration wurde durch Messen der Absorption vor und nach Behandlung mit Uricase bestimmt (Journal of Biological Chemistry 167:429 (1947)). Haeckel beschrieb einen Ansatz einer Kupplung mit Enzymen unter Verwendung von Katalase und Aldehyddehydrogenase zur Messung des durch die Uricasereaktion gebildeten Wasserstoffperoxids. Die Reduktion von NAD wurde verwendet, um die Harnsäurekonzentration zu bestimmen (Journal of Clinical Chemistry and Biochemistry 14:3 (1976)).
Fossati et al. bedienten sich in einer Modifizierung der Barham-Trinder-Reaktion der Peroxidase zum Nachweis des durch die Uricasereaktion gebildeten Wasserstoffperoxids (Clinical Chemistry 26:227 (1980)). Die Peroxidase beim Verfahren von Fossati et al. katalysierte die oxidative Kupplung von 4-Aminoantipyrin an 3, 5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat durch Reaktion mit Wasserstoffperoxid. Durch Zugabe von Kaliumferrocyanid wurde die Störung durch Bilirubin minimiert.
Zum Kuppeln mit 4-Aminoantipyrin unter Bildung von Chromogenen mit verschiedenen Nachweiswellenlängen können andere Verbindungen verwendet werden. Von Trinder und Webster wurde eine andere Phenolverbindung, nämlich 3-Hydroxy-2, 4, 6-tribrombenzoesäure, beschrieben (Annals of Clinical Biochemistry 21:430 (1984)). Ferner wurden Anilinderivate, einschließlich N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS), synthetisiert (Chemical Pharmaceutical Bulletin 30:2492 (1982)).
Die Lagerfähigkeit eines Harnsäurereagenses ist aufgrund der Stabilität der Enzyme begrenzt. Das Uricase/Peroxidase-Reagens erfordert einen zwischen dem Optimum von 6,5 für Peroxidase und dem Optimum von 8,5 für Uricase liegenden Zwischen-pH-Wert. Der Zwischen-pH-wert verringert die Stabilität beider Enzyme in der Lösung. Ferner wurden höhere Enzymkonzentrationen verwendet, um die Lagerfähigkeit der Reagenzien in Lösung zu erhöhen. Dies führte jedoch zu dem Nachteil höherer Reagenzienkosten. Die Abtrennung einiger der destabilisierenden Reagenzien in eine zweite Reagenslösung kann ferner die Lagerfähigkeit erhöhen. Die destabilisierenden Reagenzien sind beispielsweise die phenolischen Indikatoren und das Ferrocyanid. Eine zweite Reagenslösung verringert die bequeme Handhabbarkeit des Verfahrens und stellt eine potentielle Quelle für Fehler und Abfall dar.
Die Stabilität von aus einer Komponente bestehenden Reagenzien für Harnsäure schwankt bei den verschiedenen im Handel erhältlichen Rezepturen zwischen einem Tag und drei Monaten. Fossati et al. (a.a.O.) berichten über eine Stabilitätszeit von einem Arbeitstag für ein aus einer Komponente bestehendes Reagens, das auf der Basis der Uricase/Peroxidase-Reaktion arbeitet. Das flüssige stabile Harnsäurereagensset von Medical Analysis Systems Inc. weist zwei flüssige Reagenzien auf, die nicht spezifizierte Konservierungsmittel und Stabilisatoren enthalten. Das vereinigte Reagens weist - Berichten zufolge - eine Stabilität von drei Monaten bei 2 bis 8ºC auf. Das Problem der geringeren Stabilität bei einem einzelnen Reagens erforderte Mehrfachreagenslösungen oder lyophilisierte Reagenzien. Ein einzelnes gebrauchsfertiges Reagens wäre schneller (durch Einsparen von Zeit für die Reagenszubereitung) und genauer (durch Beseitigen von Volumenirrtümern beim Wiederzubereiten und Vermischen) und genau so ökonomisch oder noch ökonomischer (durch Minimieren des Abfalls, der bei einem verfallenen, kombinierten Reagens gebildet wird)
Der Verlust der Reagensstabilität kann die Folge des Abbaus der Enzyme oder der Indikatoren sein. Die Verwendung von organischen Polyhydroxyverbindungen zur Stabilisierung eines Cholesterinreagenses (US-A-4 378 429) und eines α-Amylasereagenses (internationale Patentveröffentlichung WO 89/00600) wurde von Modrovich beschrieben. Die offenbarten Polyhydroxyverbindungen waren beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Sorbit und Propylenglykol.
Eine verbesserte Stabilisierung einer E. coli Dihydroorotase wurde unter Verwendung eines mit Natriumborhydrid behandelten Ethylenglykols demonstriert (Analytical Biochemistry 134, S. 144-152 (1983)).
Uricase in Lösung wird häufig in Kombination mit Glycerin im Handel vertrieben (z.B. wissenschaftlicher Sigma-Katalog Nr. U1377 (50% Glycerin)). Der Glyceringehalt in einem erhaltenen kombinierten Reagens für Harnsäure ist jedoch nicht hoch genug, um wirksam als Stabilisator zu fungieren (vgl. beispielsweise Methods of Enzymatic Analysis, Band 4, S. 1951 (1974); der Glyceringehalt des beschriebenen Endreagenses betrug weniger als 0,6% (1974)).
Uricase wurde im lyophilisierten Zustand mit nichtionischen grenzflächenaktiven Mitteln, Serumalbumin und/oder basischen Aminosäuren stabilisiert (japanisches Patent Nr. 60 224 499). Das Uricase/Peroxidase-Reagens für Harnsäure wurde von Marymont und London mit EDTA stabilisiert (vgl. The American Journal of Clinical Pathalogy 42:630 (1964)). Das Reagens enthielt Uricase, Peroxidase, O-Dianisidinhydrochlorid, 1 mmol EDTA und 0,03% Rinderalbumin in Trispuffer bei einem pH-Wert von 7,5. Die Stabilität des eingefrorenen Reagenses betrug mehrere Wochen.
Die Stabilität eines Harnsäurereagenses wurde durch Ersetzen von Peroxidase durch Mikroperoxidase und Erhöhen des pH- Werts auf 8,2 erhöht (EP-A-195 320). Mikroperoxidase, ein Peptid aus der Proteaseverdauung von Cytochrom C, ist bei alkalischem pH-Wert stabiler als Meerrettichperoxidase. Die Uricase wird ferner mit einem einen höheren pH-Wert aufweisenden Puffer, nämlich 0,1 M Borat eines pH-Werts von 8,2, stabilisiert. Der Glyceringehalt im Reagens beträgt 2,5%. Das Reagens ist 40 h bei 45ºC stabil (Clinical Chemistry 31:969 (1985))
Die vorliegende Erfindung liefert ein Reagens, das in Form einer einzelnen Lösung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Messung de Harnsäurekonzentration in einer Probe einer Körperflüssigkeit einer erhöhte Stabilität aufweist. Insbesondere umfaßt das erfindungsgemäße stabilisierte Reagens eine Uricase, eine Peroxidase, einen Indikator und als Stabilisator einen nichtaromatischen Polyhydroxyalkohol mit mindestens drei Kohlenstoffatomen und mindestens drei Hydroxylgruppen. Besonders bevorzugt als der nichtaromatische Polyhydroxyalkohol sind die mehrwertigen Alkohole Glycerin, Sorbit, Mannit. Das erfindungsgemäße Reagens umfaßt gegebenenfalls des weiteren ein inertes Protein und EDTA.
Es wurde festgestellt, daß nichtaromatische Polyhydroxyverbindungen mit mindestens drei Kohlenstoffatomen und drei Hydroxylgruppen, wie Sorbit, Glycerin und Mannit, die Lagerzeit eines Reagenses auf Uricasebasis merklich erhöhen. Die Lagerzeit wurde des weiteren durch Zugabe von EDTA und eines inerten Proteins, wie Rinder-γ-globulin, verlängert. Die erhöhte thermische Stabilität des Reagenses reichte aus, um die Enzymaktivität bei Lagerung bei hohen Temperaturen von 45ºC während einer Woche im wesentlichen beizubehalten.
Es wurde festgestellt, daß die nichtaromatische Hydroxylverbindung eine hohe Reinheit aufweisen muß und keine destabilisierenden Verunreinigungen, einschließlich Metallionen, reduzierenden Substanzen und proteindenaturierenden Substanzen, enthalten darf, um eine derartige erhöhte Stabilität selbst bei erhöhter Temperatur zu erreichen. Einige Verbindungen, einschließlich Glycerin, können zur Verbesserung der Reinheit mehrfach destilliert werden. Verunreinigungen können ferner in wirksamer Weise aus Hydroxylverbindungen durch Behandlung mit Natriumborhydrid entfernt werden. Die bevorzugte Behandlung erfolgt bei alkalischem pH-Wert mehrere Stunden bei Raumtemperatur. Es wurde festgestellt, daß sich mit der Borhydridbehandlung der nichtaromatischen Polyhydroxyverbindungen der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Reagensstabilität einstellt.
Es wurde ferner festgestellt, daß Hydroxylverbindungen, wie Ethylenglykol und Propylenglykol, die Stabilität der Reagenzien nicht ausreichend erhöhen. Die bevorzugten Hydroxylverbindungen sind mehrwertige Alkohole mit mindestens drei Kohlenstoffatomen und mindestens drei Hydroxylgruppen.
Die bevorzugten Hydroxyverbindungen besitzen keine Absorption zwischen 400 und 700 nm, eine niedrige Viskosität und eine hohe Löslichkeit. Die Volumenmessung und das Einmischen in Lösungen sind effizienter bei Hydroxyverbindungen mit einer geringen Lösungsviskosität und hoher Löslichkeit. Eine hohe Löslichkeit ist ferner wichtig, um eine Kristallisation oder Ausfällung während einer Lagerung insbesondere bei 2 bis 8ºC zu verhindern. Die bevorzugte Hydroxyverbindung ist aufgrund der niedrigen Viskosität, hohen Löslichkeit und des niedrigen Preises Sorbit.
Das Polyol kann in geeigneter Weise erfindungsgemäß über einen breiten Konzentrationsbereich von 10% bis zu einer Maximalkonzentration, die ihre Grenze in dem Wert besitzt, der die Enzyme in schädigender Weise hemmen würde, verwendet werden. Der bevorzugte Konzentrationsbereich liegt zwischen 25 und 50% (g/v).
EDTA kann in vorteilhafter Weise zugesetzt werden, um eine Erhöhung der Leerabsorption, die von der nicht spezifischen Oxidation der Indikatoren herrühren kann, zu verhindern. Die Oxidation tritt in Gegenwart von Sauerstoff und Katalysatoren, wie Metallionen, auf. Die bevorzugte EDTA-Konzentration beträgt 0,04 bis 2,0 mmol, sie kann jedoch beachtlich von mindestens 0,01 mmol bis zu einer maximalen EDTA- Konzentration, die einen Wert aufweist, der die Aktivität der Enzyme hemmen würde, verändert werden.
Ein Indikator für den Nachweis von Wasserstoffperoxid aus der Oxidation von Harnsäure, ist eine weitere Komponente des Reagenses. Der bevorzugte Indikator ist in Lösung stabil und weist eine geringe Bilirubinstörung auf.
Indikatoren für Peroxidase umfassen Benzidine, Leucofarbstoffe, 4-Aminoantipyrin, Phenole, Naphthole und Anilinderivate. Der bevorzugte Indikator ist 4-Aminoantipyrin und N- Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS). Die bevorzugte Konzentration liegt in einem Bereich von 0,05 bis 10 mmol 4-Aminoantipyrin und 0,05 bis 10 mmol TOOS.
Ferrocyanid kann dem Reagens zur Minimierung der Störung durch Bilirubin zugesetzt werden. Die Anwesenheit von Metallionen, wie Ferrocyanid, kann jedoch den Indikator und die Enzyme destabilisieren. Die Stabilität des Reagenses mit dem erfindungsgemäßen Hydroxylstabilisator ist hoch genug, um eine Zugabe von Ferrocyanid zulassen zu können. Der bevorzugte Konzentrationsbereich von Ferrocyanid liegt zwischen 1 und 400 µmol, wobei die Maximalkonzentration die Konzentration ist, die die Aktivität der Enzyme hemmt.
Ein nichtreaktives Protein kann zur weiteren Erhöhung der Stabilität zugesetzt werden. Nichtreaktive Proteine umfassen Serumalbumine, Globuline und Faserproteine. Das bevorzugte Protein ist Rinder-γ-globulin in einer bevorzugten Konzentration von 0,05 bis 0,3% (g/v). Geringere Konzentrationen können geeignet sein. Das bevorzugte nichtreaktive Protein weist keine Proteaseverunreinigung, die einen Enzymabbau bedingen würde, auf.
Die Enzyme im Reagens müssen eine hohe Reinheit und Lösungsstabilität aufweisen. Mikrobielle Uricase weist eine bessere Stabilität und eine höhere Aktivität bei einem niedrigeren pH-Wertbereich als tierische Uricase auf. Die bevorzugte Uricase ist aufgrund des geringen Preises und der hohen Stabilität Bacillus fastidiosus oder Candida utilis. Die Enzymkonzentration muß hoch genug sein, daß am Ende der Lagerungszeit eine schnelle und quantitative Reaktion mit der Harnsäure stattfindet. Der bevorzugte Konzentrationsbereich von Bacillus fastidiosus-Uricase liegt zwischen 100 und 800 Einheiten/l.
Meerrettichperoxidase ist bevorzugt, da sie im Handel in hoher Reinheit und preisgünstig erhältlich ist. Die Enzymkonzentration sollte für eine schnelle, vollständige Reaktion hoch genug sein. Vorzugsweise liegt die Enzymkonzentration in einem Bereich von 1000 bis 10.000 Einheiten/l.
Jeder beliebige Puffer mit einer ausreichenden Pufferkapazität in einem pH-Wertbereich von 6,5 bis 8,5 ist geeignet. Puffer in diesem pH-Wertbereich sind beispielsweise Phosphat, Tris, Bis/Tris-propan, N-Tris (hydroxymethyl)methyl-2- aminoethansulfonsäure (TES) und 3-(N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure (TAPSO). Der bevorzugte Puffer ist aufgrund seines geringen Preises und der hohen Stabilität Phosphat. Der bevorzugte Konzentrationsbereich liegt zwischen 25 und 200 mmol Phosphat und bei einem pH- Wert von 7,5.
Die Bestimmung der Harnsäurekonzentration erfolgt mit einem speziellen Volumen und einer speziellen Probe einer Körperflüssigkeit und mit einem speziellen Reagensvolumen. Das Ablesen der Absorption zur Bestimmung einer Blindprobe kann sobald wie möglich nach Vermischen und vor Auftreten einer merklichen Absorptionsänderung aufgrund des Harnsäuremetabolismus erfolgen. Ein erstes Ablesen der Absorption nach 0,5 s ist geeignet. Ein zweites Bestimmen der Absorption erfolgt, nachdem die Absorption einen konstanten Wert erreicht hat. Dies ist typischerweise bei 37ºC bei einer Harnsäurekonzentration von 20 mg/dl nach 3,3 min der Fall. Typischerweise wird das Reagens mit einer wäßrigen oder Serumlösung mit einer bekannten Harnsäurekonzentration kalibriert.
Die Volumina zur Untersuchung an automatischen Geräten, wie COBAS BIO , COBAS FARA oder COBAS MIRA (Roche Diagnostic Systems Inc.) betragen 15 µl für die Probe, 50 µl für das Verdünnungsmittel und 200 µl für das Reagens. Die Volumina von Probe und Reagens hängen von den Reaktionsbedingungen, dem Spektrophotometer oder einem anderen Gerät sowie anderen Variablen ab. Eine Optimierung der Proben- und Reagensvolumina für die Bestimmungsbedingungen liegen im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns auf dem einschlägigen Fachgebiet. Die Harnsäurekonzentration wird aus der Differenz zwischen dem ersten Ablesen der Absorption und dem letzten Ablesen der Absorption bestimmt.
Der in den folgenden Beispielen genannte "Faktor" für die Kalibrierung ist die Harnsäurekonzentration der Kalibrierlösung, geteilt durch die Absorptionsdifferenz. Die Empfindlichkeit ist der Reziprokwert des Faktors. Nach einer Lagerung des Reagenses bei 37ºC oder 45ºC nimmt die Empfindlichkeit ab und der Faktor zu.

Beispiel 1

Herstellung des Reagenses

300 g D-Sorbit werden in 300 ml destilliertes Wasser eingetragen. Anschließend werden 1,4 g Kaliumhydroxid und danach 0,95 g Natriumborhydrid in die Lösung eingetragen und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur verrührt. Es werden 2 mol Phosphorsäure zur Verringerung des pH-Werts auf 6,3 zugegeben. Nachdem das Natriumborhydrid zerstört ist, wird Wasser zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 900 ml zu bringen. Anschließend werden 21,4 g eines wasserfreien, zweibasigen Kaliumphosphats zugegeben. Nach Eintragen von 1,0 g Methyl-4-hydroxybenzoat (Methylparaben), 0,20 g Propyl-4- hydroxybenzoat (Propylparaben), 0,37 g EDTA, 45 mg Kaliumferrocyanid, 134 mg 4-Aminoantipyrin, 0,58 g TOOS und 2,0 g Rinder-γ-globulin in die behandelte Sorbitlösung wird der pH-Wert auf 7,5 ± 0,1 eingestellt. Anschließend werden 650 Einheiten Uricase und 7100 Einheiten Peroxidase zugegeben. Das Lösungsvolumen wird mit Wasser auf 1 1 erhöht. Nach Filtrieren durch ein 22 µm-Filter werden 0,5 g Foamaster FLD (Henkel Corporation) zugegeben.

Beispiel 2

Harnsäurebestimmung an einer COBAS BIO-Vorrichtung, einer COBAS FARA-Vorrichtung oder einer COBAS-MIRA-Vorrichtung

200 µl des in Beispiel 1 hergestellten Reagenses werden mit 15 µl Probe und 50 µl Wasser als Verdünnungsmittel versetzt und vermischt. Das Ablesen der Absorption bei 550 nm erfolgt nach 0,5 s und 200 s nach dem Vermischen der Probe, des Verdünnungsmittels und des Reagenses. Die Absorptionsdifferenz wird mit der Kalibrierung aus einer Kalibrierungslösung mit bekannter Harnsäurekonzentration in die Harnsäurekonzentration umgewandelt.
Mit der COBAS MIRA-Vorrichtung wurden mit normalen, mit Harnsäure versetzten Humanseren die folgenden Ergebnisse erhalten. Die Referenzharnsäurewerte wurden mit einer COBAS MIRA-Vorrichtung mit dem ROCHE-Reagens für Harnsäure (Roche Diagnostic System Inc.), einem Uricase/Katalase/Aldehyddehydrogenase-Verfahren, bei 340 nm bestimmt. Harnsäurekonzentration (mg/dl) Referenzverfahren Reagens von Beispiel 1

Beispiel 3

Reagensstabilität und Sorbitkonzentration

Das folgende Reagens wurde mit 20%, 30% oder 40% Sorbit hergestellt.
Die Borhydridbehandlung von Sorbit erfolgte bei neutralem pH-Wert.
20 oder 30 oder 40 g D-Sorbit
95 mg Natriumborhydrid
100 mg Methylparaben
20 mg Propylparaben
25 37 mg EDTA
100 mg Rinder-γ-globulin
4,3 mg Kaliumferrocyanid
12,7 mg 4-Aminoantipyrin
51 mg TOOS
510 Einheiten Peroxidase
60 Einheiten Uricase
100 ml eines 0,063 molaren Phosphatpuffers eines pH-Werts von 7,5
Das Reagens wurde mit Serumproben an einer COBAS MIRA-Vorrichtung nach 12 Tagen Lagerung bei 45ºC getestet. Der Faktor wurde aus der Kalibrierlösung bestimmt und zur Umwandlung der Absorption in die Harnsäurekonzentration verwendet. Ein hoher Faktor ist charakteristisch für eine geringe Empfindlichkeit für die Harnsäurekonzentration. Referenz Sorbit Harnsäurekonzentration Faktor
Die Harnsäurekonzentration und der Faktor in der ersten Spalte sind für alle bei 4%C gelagerten Reagenzien repräsentativ. Die Sorbitkonzentration ist in % g/v angegeben.

Beispiel 4

Die Wirkung von EDTA oder Rinder-γ-globulin auf die Reagensstabilität

Das folgende Reagens wurde ohne EDTA oder ohne Rinder-γ-globulin hergestellt. Die Borhydridbehandlung von Sorbit erfolgte bei neutralem pH-Wert.
25 g D-Sorbit
79 mg Natriumborhydrid
100 mg Methylparaben
20 mg Propylparaben
4,2 mg Kaliumferrocyanid
12,7 mg 4-Aminoantipyrin
55 mg TOOS
37 mg EDTA
100 mg Rinder-γ-globulin
650 Einheiten Peroxidase
60 Einheiten Uricase
100 ml eines 0,063 molaren Phosphatpuffers eines pH-Werts von 7,5
Das Reagens wurde mit Serumproben an einer KOBAS MIRA-Vorrichtung nach 7tägiger Lagerung bei 45ºC getestet. Der Faktor wurde aus der Kalibrierlösung bestimmt und zur Umwandlung der Absorption in die Harnsäurekonzentration verwendet. Referenz ohne EDTA ohne Rinder-γ-globulin mit EDTA und Rinder-γ-globulin Harnsäurekonzentration (mg/dl) Faktor
Die Harnsäurekonzentration und der Faktor in der Referenzspalte sind für alle Reagenzien nach einer Lagerung bei 4ºC repräsentativ.
Die höchste Empfindlichkeit (den niedrigsten Faktor) nach einer einwöchigen Lagerung bei 45ºC wies das Reagens mit so wohl EDTA als auch Rinder-γ-globulin auf.

Beispiel 5

Wirkung einer Borhydridbehandlung von Sorbit

Ein Vergleich der Reagensstabilität erfolgte mit keinem Sorbit und keinem Glycerin, 30% redestilliertem Glycerin, 30% Sorbit ohne Borhydridbehandlung und 30% Sorbit mit Borhydridbehandlung bei hohem pH-Wert.
0 g Glycerin oder 30 g redestilliertes Glycerin oder 30 g Sorbit oder 30 g Sorbit mit Borhydridbehandlung (95 mg) bei hohem pH-Wert
100 mg Methylparaben
20 mg Propylparaben
4,4 mg Kaliumferrocyanid
37 mg EDTA
100 mg Rinder-γ-globulin
13,5 mg 4-Aminoantipyrin
58 mg TOOS
Einheiten Peroxidase
54 Einheiten Uricase
100 ml eines 0,063 molaren Phosphatpuffers eines pH-Werts von 7,5
100 mg Foamaster FLD
Die Reagenzien wurden mit Serumproben nach einer Lagerung bei 4ºC und 45ºC getestet. Referenz 0% Glycerin 0% Sorbit 3 Tage bei 45ºC 30 % Sorbit mit Borhydridbehandlung bei hohem pH-Wert 3 Tage bei 45ºC Harnsäurekonzentration (mg/dl) Faktor
Die Zahlen in der ersten Spalte sind für beide Reagenzien bei 4ºC repräsentativ. Einwöchige Lagerung Lagerung bei 45ºC kein Glycerin, kein Sorbit 30% Glycerin 30% Sorbit, keine Borhydridbehandlg. 30% Sorbit, Borhydridbehandlg. bei hohem pH-Wert Referenz Harnsäurekonzentration (mg/dl) Faktor
Die Zahlen in der ersten Spalte sind für alle Reagenzien bei 4ºC repräsentativ. Das stabilste Reagens wies 30% Sorbit mit einer Borhydridbehandlung bei hohem pH-Wert auf.

Beispiel 6

Reagensstabilität mit Borat und Sorbit

Ein Vergleich der Reagensstabilität erfolgte mit keinem Sorbit und keinem Borat, keinem Sorbit und Borat, 30% Sorbit und Borat und 30% Sorbit mit Borhydridbehandlung bei hohem pH-Wert.
0 mg oder 238 mg Natriumborhydrid
100 mg Methylparaben
20 mg Propylparaben
4,4 mg Kaliumferrocyanid
37 mg EDTA
100 mg Rinder-γ-globulin
15 13,5 mg 4-Aminoantipyrin
58 mg TOOS
710 Einheiten Peroxidase
48 Einheiten Uricase
100 ml eines 0,063 molaren Phosphatpuffers eines pH-Werts von 7,5
100 mg Foamaster FLD
Diese Reagenzien wurden mit Serumproben nach einer Lagerung bei 4ºC und 45ºC getestet. Dreitägige Lagerung Lagerung bei 45ºC Referenz kein Borat 30% Sorbit Borat, 30% Sorbit 30% Sorbit mit Borhydrid-behandlg. bei hohem pH-Wert Harnsäurekonzentration (mg/dl) Faktor
Die Zahlen in der ersten Spalte sind für alle Reagenzien bei 4ºC repräsentativ. Das Reagens ohne Borat und ohne Sorbit und das Reagens mit Borat und ohne Sorbit versagten nach 3 Tagen bei 45ºC vollständig. Siebentägige Lagerung Lagerung bei 4ºC Lagerung bei 45ºC Referenz kein Borat 30% Sorbit Borat, 30% Sorbit 30% Sorbit mit Borhydrid-behandlg. bei hohem pH-Wert Harnsäurekonzentration (mg/dl) Faktor
Die Zahlen in der ersten Spalte sind für alle Reagenzien bei 4ºC repräsentativ. Das stabilste Reagens wies 30% Sorbit mit einer Borhydridbehandlung bei hohem pH-Wert auf.

Claims

1. Wäßrige Reagenszusammensetzung zur Bestimmung von Harn säure in einer Probe einer Körperflüssigkeit, die wirksame Mengen von Uricase, Peroxidase, eines Peroxidaseindikators und eines mehrwertigen nichtaromatischen Alkohols mit mindestens drei Kohlenstoffatomen und mindestens drei Hydroxylgruppen in einer zur Stabilisierung des Reagenses wirksamen Menge umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der mehrwertige Alkohol Glycerin, Sorbit oder Mannit ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der mehrwertige Alkohol in einer Konzentration von 10 bis 50% (g/v), vorzugsweise 25 bis 50% (g/v) vorhanden ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der mehrwertige Alkohol zur Entfernung von destabilisierenden Verunreinigungen behandelt ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der mehrwertige Alkohol zur Entfernung von destabilisierenden Verunreinigungen mit einem Borhydrid umgesetzt worden ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die des weiteren EDTA und ein inertes Protein in zur weiteren Stabilisierung der Zusammensetzung wirksamen Mengen umfaßt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der mehrwertige Alkohol Sorbit in einer Konzentration von 25 bis 50% (g/v) ist und das inerte Protein Rinder-γ-globulin in einer Konzentration von 0,05 bis 0,3% (g/v) ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die des weiteren ein Ferrocyanid in einer zur Hemmung der durch Bilirubin in der Probe einer Körperflüssigkeit hervorgerufenen Störung der Harnsäurebestimmung wirksamen Konzentration umfaßt.