DE2855433C2

DE2855433C2 - Testmittel zum Nachweis von Harnsäure

Info

Publication number: DE2855433C2
Application number: DE2855433A
Authority: DE
Inventors: Eppie S. Elkhart Ind. Chang
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-02-13
Filing date: 1978-12-21
Publication date: 1986-06-26
Also published as: IT7947953A0; GB2014155A; JPS589697A; FR2417105A1; IT1114497B; JPS585190A; AU4415479A; JPS5841835B2; DE2855433A1; CA1093440A; AU514609B2; GB2014155B; JPS6180B2; JPS54121199A; FR2417105B1; US4230798A; JPS584916B2

Description

worin X ein C-, N- oder S-Atom darstellt, R, Wasserstoff, OH, Amino, Alkylendiamin oder Aminoalkanol bedeutet, oder mit R₂ unter Bildung von NHCh₂CHOHCH₂ verbunden ist, wobei R₂ Wasserstoff ist; R₁ und R₃, die gleich oder verschieden sein können, H oder SO₃H bedeuten; R₄ Wasserstoff, Oll, NHCH-(CH₃)CH₂Ch₂CH₂NH₂ oder SO₃H darstellt; R₅ Wasserstoff, SO₃H oder Acelamino bedeutet; R,, Wasserstoff oder OCH, darstellt und R₇ Wasserstoff, OH oder NH₂ bedeutet, sowie deren Säureaddilionssalze, insbesondere die Phosphate; Verbindungen mit der allgemeinen Formel R-CH₂-R, worin

jedes R Dimethylanilin, Hydroxyphenyä, Benzothiazol oder Benzophenon bedeutet,
Thiamin oder dessen Säureadditionssalze,
Methylphenylpropandiamin und
Phenothiazin darstellt.

7. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem mindestens ein Stabilisierungsmittel enthält. iä

8. Testmittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Stabilisierungsmittel Carboxy- *·'' methylzellulose und/oder einen Polyoxyäthylenäther eines Fettalkohols darstellt.

Die Erfindung betrifft ein Testmittel zum Nachweis von Harnsäure in einer flüssigen Probe und stellt somit einen in der Diagnostik anwendbaren Test dar.

Im Metabolismus des Primaten findet eine konstante endogene Umwandlung von aufgenommenen Nukleoproteinen zu Purinen und Pyrimidinen statt. Die Purine erfahren dann durch einen katabolischen Prozeß eine weitere Deaminierung und feiloxidation zu Harnsäure, die beim Menschen in der Regel im Urin abgeschieden

wird. Auf diese Weise liegt im menschlichen Blut und Urin immer eine nominale Konzentration an I larnsäure vor.

Im allgemeinen hat die Aufnahme von purinhaltiger Nahrung auf den Gehalt an Harnsäure im Blutserum keinen tfTekt, mit Ausnahme bei einer unzureichenden Leistung derNiere, z. B. bei Nierenvcrsagen, wobei in diesem Falle die Konzentration erhöht ist. Bei bestimmten anderen pathologischen Zuständen, die nicht mit der Nahrungsaufname von purinhaltiger Nahrung in Verbindung stehen, z. B. bei Urämie und Gicht, liegt eine

abnormale Zunahme der im Blutserum vorhandenen Harnsäuremenge vor. Außerdem wird die Konzentration der Harnsäure im Serum bei solchen Zuständen erhöht, die mit einer exzessiven Zerstörung von Lcukozylenkernen in Verbindung stehen, wie z. B. bei Leukämie und Lungenentzündung.

Ein Serumharnsäuretest wird deshalb als geeignetes Hilfsmittel bei der Diagnose der voranstehend genannten

AO Zustünde angesehen und dient in einigen Fällen zur Unterscheidung zwischen nahe verwandten abnormen Zustünden, z. B. bei Gicht und Arthritis. Die Gicht ist durch eine abnormale Zunahme der Harnsäure im Blutserum gekennzeichnet, während sich im Falle von Arthritis keine Zunahme ergibt. F.s ist deshalb wünschenswert, einen einfachen und ökonomischen Test zur Verfügung zu stellen, der eine genaue und spezifische Bestimmung der im Blutserum enthaltenen Harnsäurekonzentration erlaubt.

Harnsäure liegt im allgemeinen im Blutserum in Mengen von etwa 0.7 bis etwa 6,0 mg/100 ml Blutserum vor und wird im allgemeinen als Milligrammprozent (mg%) angegeben. Bei den vorstehend aufgezählten ahnormalen Zuständen erreicht der Harnsäuregehalt im Blutserum oft Werte von 10 mg% und darüber.
Hs ist eine Reihe von Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure im Blutserum bekannt. Unter den hiiiilig

angewandten bekannten Methoden sind die colorimetrischen Verfahren unter Verwendung von Blutfiltration zu nennen, Einige dieser Verfahren nutzen die Ausfallung von Harnsäure im Blutfiltrat, z. B. als Silbersalz, und die Bildung eines chromogenen Adduktes durch Reaktion mit einem Phosphorwolframat oder einem Arsenowolframat. Bei anderen Methoden, die vom Blutfiltrat ausgehen, erfolgt eine direkte Behandlung des Filtrats mit Wolfram.säure in Gegenwart einer Cyanid-Harnstoff-Lösung unter Entwicklung einer Farbe, die dann mittels üblicher Methoden gemessen wird, um die Harnsäurekonzentration quantitativ zu bestimmen.

In letzter Zeit wurden Verfahren vorgeschlagen, die eine katalysierte Oxidation der Harnsäure zu Allantoin und Wasserstoffperoxid umfassen. Diese Oxidation wird im allgemeinen in Gegenwart von atmosphärisches ι Sauerstoff durchgeführt, wobei ein Material mit UricaseaKtivität verwendet wird, und die Reaktion bei oder nahe pH 9 erfolgt. Bei diesen Verfahren kann ein Spektrofotometer verwendet werden, um das Verschwinden des charakteristischen Harnsäurespektrums während der Umwandlung zu Allantoin und Wasserstoffperoxid zu bestimmen. Nach einer anderen Methode wird das in stöchiometrischen Mengen während des Abbaus der I lamsäurc gebildete Wasserstoffperoxid colorimetrisch bestimmt. Hierzu wird beispielsweise auf die US-PS 33 49 006 und 33 35 069 der Anmelderin hingewiesen.

Beim en/ymatischen Umwandlungstest, bei welchem die gebildete Menge an Wasserstoffperoxid direkt proportional der im Blutserum vorliegenden Harnsäuremenge ist, wird das Wasserstoffperoxid mittels eines Farbumschlages nachgewiesen, der durch Oxidation einer farbbildenden Substanz in Gegenwart einer peroxidali ν wirkenden Substanz erfolgt. Diese Reaktion erfolgt bei saurem pH. Ein Catalaseinhibitor, wie Natriumazid oder Nalriumcya^id, war in der Regel erforderlich, um eine Zerstörung des Peroxids durch Catalase zu verhindern. Die erhaliene Farbe wird dann visuell mit Standardproben verglichen oder elektronisch gemessen, um eine quantitative Bestimmung der in der Testlösung vorliegenden Harnsäure zu erlauben.

Die französische Anmeldung 72/31 557 offenbart eine völlig unterschiedliche enzymkatalysierte Reaktion, bei der Calalase und aldehydfreies Methanol zusammen mit Uricase zu der Probe (die auf pH 8 gepuffert ist) zugegeben werden, worauf 3-Methy!-2-bcnzothiazc!irion-hydrazor! (gepuffert auf pH 3} und FeCI₅ in HC! unter Blaufärbung zugegeben werden.

US-PS 38 62 885 (Kano) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung von Harnsikire, wobei die Bildung von Wasserstoffperoxid mit einer Uricase aus Mikroben zusammen mit einem Catalaseinhibitor (auf pH 5,5 bis 7,0 gepudert) erfolgt und das gebildete Peroxid in Gegenwart eines anionischen oberflächenaktiven Mittels, eines Chromogcns und Peroxidase (pH 4,0 bis 7,0) bestimmt wird.

Von Gochmann und Schmitz wurde in CHn. Chem. 17 (1971), Seite 1154, die Verwendung von 3-Methyl-2-ben/.othiazolinon-hydrazon-Hydrochlorid mit N,N-Dimethylanilin unter Bildung eines Azofarbstoffindikators bei der automatisierten Bestimmung von Harnsäure berichtet.

Trotz dieser Beiträge auf diesem Gebiet hatten die genannten Verfahren den Nachteil, daß eine Reihe von separaten Schritten erforderlich war, Jie im allgemeinen in flüssiger Phase durchgeführt wurden. Es wurde als nicht möglich angesehen, gekoppelte Reaktionen unter gleichzeitiger Verwendung von tierischer Uricase und Peroxidase durchzuführen, und zwar aufgrund der !Competition zwischen Harnsäure und dem Chromogen, die beide durch I I₂O> in Gegenwart von Peroxidase oxidiert werden, sowie aufgrund des drastischen Unterschiedes im pH-Optimum der beiden verwendeten Enzyme.

Aus diesem Grunde war es bisher nicht möglich, die Testmittel zur Bestimmung von Harnsäure in einen stabilisierten, vereinheitlichten Reagenztest einzubauen. -to

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Testmittel zur Bestimmung von Harnsäure in Körperfiüssigkeilcn mit ausreichender Stabilität zur Verfügung zu stellen.

Außerdem ist es Aufgabe der Erfindung, einen Anzeiger zur Verfügung zu stellen, mit dem in einem Operalionsschrill der Harnsäuretest durchgeführt werden kann, wobei dieser Anzeiger über längere Zeit hin stabil ist.

Fine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Test zum Nachweis von Harnsäure zu schaffen.

I· rllndungsgcmäß gelöst werden die Aufgaben durch die Bereitstellung eines Testmittels zum Nachweis von I lamsäurc, enthaltend eine Substanz mit Uricaseaktivität, mindestens ein Chromogen und Peroxidase, in dem die Substanz mit Uricaseaktivität tierischen Ursprungs ist und von Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von unter 6000 durch Dialyse gegen einen Puffer mit niedriger Metallbindungskonstante und einem pH-Wert im Bereich von 6,8 bis 7,5 befreit worden ist, wobei das Testmittel in einem inerten Träger inkorporiert ist.

Gemäß der Erfindung wird ein Testmittel zum Nachweis von Harnsäure zur Verfügung gestellt. Insbesondere wird die vorstehende Aufgabe dadurch gelöst, daß in Testmitteln zum Nachweis von Harnsäure unter Verwendung einer Substanz mit Uricaseaktivität, mindestens einem Chromogen und einer Peroxidase, zur Verbesserung derselben eine Uricase-aktive Substanz tierischen Ursprungs, die frei an Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von unter 6000, verwendet wird. Die Testmittel enthalten eine Zusammensetzung, die auch mindestens ein Kopplungsreagenz und mindestens ein Stabilisierungsreagenz umfassen kann. Die Zusammensetzungen sind in einen Träger, wie eine Tablette oder Matrix, inkorporiert. Die Substanz mit Uricaseaktivität wird durch Fraktionierung von tierischen Standard-Uricasepräparationen gereinigt, um niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen; diese gereinigte Uricase ist über einen pH-Bereich stabil, der bis zu diesem Zeitpunkt unerreichbar war, was wiederum einen vereinheitlichten Test gewährleistet.

Die gereinigte Uricase-aktive Substanz tierischen Ursprungs, die in der oben beschriebenen Zusammensetzung eine kritische Komponente darstellt, wird durch Fraktionierungsreinigung von im Handel erhältlichen tierischen Uricascpräparationen, wie sie z.B. von Miles Research Products, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana,46 514, erhalten werden können, gewonnen. Verunreinigungen, die ein verhältnismäßig niederes Molekulargewicht aufweisen (unterhalb etwa 6000) werden entfernt. In überraschender Weise wird durch diesen einlach erscheinenden Rcinigungsprozeli eine Uricase-aktive Substanz gewonnen, die über einen pH-Bereich von (>,H his 7,5 stabilisiert ist, wodurch die vereinheitlichte, enzymkatalysiertc Harnsäure-Testzusammensetzung, die über eine Vielzahl von Reaktionssystemen verfugt, welche innerhalb eines einzigen Satzes von Reaktionspara-

metern ihre Funktion ausüben, ermöglicht wird.

Tierische Uricase stellt ein Cuproprotein (ein konjugiertes Metallprotein) dar. Es wird angenommen, daß Cu*⁺ einen Teil des katalytischen Zentrums des Enzyms darstellt. Die Strukturder kupferhaltigen Komponente des aktiven Zentrums kann schematisch wie folgt dargestellt werden:

Enzvm—Cu"¹

OH

O₂H

Aufgrund der Cuproproteinnatur des Enzyms wird dieses schnell, jedoch reversibel, durch eine Vielzahl von Agentien, die gleichzeitig eine Reduktion von Cu⁺* und eine Komplexierung der CuMonen bewirken, inhibiert. Aus diesem Grunde wird die Uricase durch Dialyse gegen einen Puffer mit einer niederen Metallbindungskonstante gereinigt.

Insbesondere wird das Enzym gegen Lösungen dialysiert, die Puffer mit niederen Metallbindungskonstantcn sind, wie Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan(TRIS), Piperazin-N,N'-bis-(2-äthansulfonsäure) (PIPES), N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoäthansulfonsäure (TES) und Phosphatpuffer.

Harnsäure wird enzymatisch durch Uricase zu Allantoin und Wasserstoffperoxid bei eLwa r>U 7 oxidiert. Die Stöchiornetrie der Enzyrnreaktion wird, ungeachtet von Puffer oder pH-Wert, in Gleichung (ί-; angegeben, d. h. es erfolgt ein Transfer eines Elektronenp2;.res vom Urat-Monoanion auf Sauerstoff, wodurch sich eine instabile saure Zwischenverbindung (l-Carboxy-2,4,6,8-tetraazabicyl-[3,3,0]-octa-4-en-3,7-dion) und Wasserstoffperoxid ergibt.

C5N4O3H3- + O₂ + H₂O = C₅N₄O₄H₃- + H₂O₂

(D

Das intermediäre Produkt ist eine stärkere Säure (niedrigerer pK) als Harnsäure (pK = 4,5, im Vergleich /u pK = 5,75 für Urat: pK, = 11,5 im Vergleich zu pK₂ = 10,3 Tür Urat) und läßt sich unter Bildung von MeUiII-chelaten mit Kupfer (Cu* ^r) und Kobalt (Co⁺⁺) stabilisieren. In Gegenwart von hochgereiniglem En/ym werden bei pH 7,0 stöchiometrische Mengen an Allantoin, Wasserstoffperoxid und CO₂ gebildet. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit den Chromogenen in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines roten Komplexes umgesetzt. Die chemischen Gesamtreaktionen des Testes sind folgende:

35 pH-stabile Uricase

Harnsäure+ O₃ + H₂O > Allantoin+ CO₂ + H₂O (2)

pH 7,0

Peroxidase

H₂O₂ + S-AlkyW-benzothiazolinon-hydrazon + Kopplungsreagenz > Farbkomplex + H₂U (3)

pH 7,0

In dem vorliegenden System werden die Schwierigkeiten der Kompelition zwischen Harnsäure und dem Chromogen sowie des drastischen Unterschiedes im pH-Optimum der Enzyme im weiteren dadurch gelöst, daß ein starkes Reduktionsmittel, ein Hydrazon und ein extrem empfindliches Kopplungsmittel, das darüber hinaus als ein Uricaseaktivator dient, verwendet werden. Die chromogenen Reaktionen unter Verwendung von ;·■.. B. 3-Methyi-2-benzothiazolinon-hydi£zon (MBTH) und Primachindiphosphat (PDP) werden schematisch im nachfolgenden Diagramm A dargestellt:

= N-NH₂ + H₂O₂

CH,

MBTII

CH₃CH(CH₂)JNH

CH

CH₃O

CHjCH(CH₂J₃NH₂ NH

PDP

CH₃O

\ ii

>=N —N

S ^V

CHj

roter Komplex

Der Klarheit willen werden in der folgenden Beschreibung spezifische Definitionen verwendet, doch sollen sich diese Definitionen lediglich auf besondere Ausfuhrungsformen der Erfindung, die diese mitteis Beispielen erläutern, beziehen, ohne den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Die im Handel erhältliche Uricasepräparation wird durch Dialyse gereinigt, welche die Fraktionierung der Uricasepräparation unter Entfernung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von unterhalb 6000 umfaßt.

Die I lydrazone stellen Kondensationsprodukte eines Hvdrazins mit einem Aldehvd oder Keton dar und enthalten die Gruppierung C=NNH₂. Viele Hydrazone sind in der Lage, eine oxidative Kopplung mit bestimmter aromatischen Aminen oder Hydroxynaphthalinsulfonaten unter Bildung einer gefärbten Verbindung bzw. eines gcliirbten Komplexes durchzuführen. Unter diesen Hydrazonen sind zu nennen J-Methyl^-benzothiazolinonh) drazon, N-Methyl-pyridon-4-hydrazon, N-MethyI-pyridon-2-hydrazon, N-Methyl-chinolinon-2-hydrazon, .Methyl-chinolinon-4-hydrazon, N-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon, N-Methyl-thiazolinon-2-hydrazon. N-VKthyl-4-phenylthi;i7olinon-2-hydrazon, N-Methyl-oxazolinon-2-hydrazon, N-Methyl-benzoxazolinon-2-h>dra/on, !,B-Dimethylbenzimidazolinon^-hydrazon und 2-Hydrazinobenzothiazol.

In einer bevorzugten Zusammensetzung wird ein 3-(C|-C₄-Alkyl)-2-benzothiazolinon-hydrazon-Chromogen. wie 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH) als Chromogen verwendet. Diese Hydrazone sind starke Reduktionsmittel. Das Hydrazon wiro in benzolischer Lösung bei Konzentrationen von etwa 0.05 mg% bis etwa 0,2 mg"/» verwendet.

Beispiele für geeignete Kopplungsreagenzien, die in Kombination mit dem chromogenen Hydrazon verwende! werden können, sind folecnde:

(I) Verbindungen tier allgemeinen Formel:
R₁

R₆ I I R₂

κι worin X ein Kohlenstoffatom, Stickstoffatom oder Schwefelatom darstellt; R| Wasserstoff, OH, Amino,

Alkylendiamin oder Aminoalkano! bedeutet oder sich mit R, unter Bildung von NlICH,ClK)I IClI.. verbindet, wobei R- Wasserstoff ist; Rj und Ri, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffoder.SO. 11 bedeuten; R₄ Wasserstoff, OH, NHCH(CH₅)CH,CH,CH₂NH, oder SO₁H darstellt; R, Wasserstoff, SO Il oder Acetamino bedeutet; R₁, WasserstolToder OCHi darstellt und R- Wasserstoff, OH oder NI I. bedeutet, sowie deren Säureadditionssalze, wie z. B. die Phosphate.

(2) Verbindungen der allgemeinen Formel R-CH₂R, worin jeweils R Dimethylanilin, Hydroxyphenyl, Hen/othiazol oder Benzophenon bedeutet.

(3) Thiamin oder dessen Säureadditionssalz.
■ (4) Methylphenylpropandiamin; und

,₀ (5) Phenothiazin.

Bevorzugte Kopplungsreagenzien umfassen Primachindiphosphat (PDP), Chromotropsiiurc und 4,4'-Methylen-bis-(N,N'-dimethylanilin) (MBDMA). Das Kopplungsreagenz wird in wäßrigen Lösungen von etwa 1,0 mg% bis etwa 5,0 mg% verwendet.

Die Zusammensetzung kann darüber hinaus stabilisierende Agentien enthalten, wobei Carboxymeihylzellulose (CMC) und Polyoxyäthylenäther von Fettalkoholen (BRIJ, hergestellt von ICl United States INC. Wilminton, Delaware, 19897) besonders geeignet sind. Diese liegen in wäßrigen Lösungen in einer gesamten Konzentration von etwa 0.5 mg% bis etwa 5,0 mg% vor.

Eine Lösung, die die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Testmittels enthält, kann zum Nachweis von Harnsäure verwendet werden, indem diese Lösung zu einer Probe einer Körperflüssigkeit, wie z. B. Urin, /uge- f "ben wird. Es bildet sich der chromophore Komplex mit der sich ergebenden Farbveränderung. Das erllndungsgemäße Testmittcl wird jedoch in vorteilhafterer Weise in Form einer festen Präparation und vorzugsweise in Anzeigern, die speziell unter Berücksichtigung einer leichten Handhabung und hoher Zuverlässigkeil konstruiert sind, verwendet.

Gemäß der Erfindung wird ein Anzeiger hergestellt, der einen inerten Träger und in diesem inkorporiert eine 3S Zusammensetzung, wie sie oben beschrieben und in den Beispielen angegeben wird, umfaßt. Der inerte Träger kann in Form einer saugfähigen oder nicht-saugfahigen Trägermatrix oder in Tablettenform oder einer anderen üblichen Form vorliegen.

Die Bezeichnung Trägermatrix bezieht sich auf saugfähige und nicht-saugfähige Matrizes, die in physiologischen oder anderen Flüssigkeiten unlöslich sind und ihre strukturelle Einheit in denselben beibehalten, (ieeignete saugfähige Matrizes umfassen Papier, Zellulose, Holz, synthetische Harzvliesc, Glaslasern, vliesariige Stoffe oder Gewebe und dergleichen. Nicht-saugfähige Matrizes umfassen organoplastische Materialien, wie Polypropylen. Zur leichteren Handhabung kann die Matrix mit einem unlöslichen Trägerelemenl, das /.. Ii. aus Polystyrol bestehen kann, verbunden sein.

In alternativer Weise kann der inerte Träger die Form einer gepreßten oder gegossenen Tablette, welche die üblichen Trägermaterialien, wie Disintegrationsstoffe, Füllmaterialien und Schmiermittel, enthält, annehmen.

Der erfindungsgemäße Anzeiger weist, wie dies in den Beispielen gezeigt wird, einen hohen Grad an Stabilität auf. Diese Stabilität kann noch weiter verbessert werden, indem Komponenten der Zusammensetzung auf einem Substrat getrennt werden oder indem das Endprodukt in geeigneter Weise in einer Folie, einem Behälter, der ein Wasserabsorptionsmittel enthält, oder dergleichen abgepackt wird. Die physikalische Trennung der Komponenten kann durch Drucken, durch Einkapselung einer oder mehrerer Komponenten, durch Verwendung einer separaten Matrix oder eines separaten Substrat ;s für verschiedene Komponenten, durch Anordnung inkompatibler Komponenten auf einander gegenüberliegenden Seiten des Substrates und dergleichen erreicht werden. Die Herstellung eines Harnsäure-Testanzeigers erfolgt durch Imprägnierung, Bedrucken oder ein beliebiges anderes Inkontaktbringen des inerten Trägers mit den weiteren Bestandteilen des erfindungsgemäßen Testmittels. Wenn der Träger in flüssiger Form imprägniert wird, so wird dieser daraufhin einem Trocknungsschritt unterworfen.

Das erfindungsgemäße Testmittel wird zur Bestimmung von Harnsäure in einer flüssigen Probe eingesetzt. Die Probe wird getestet, indem das Testmittel mit der Probe in Kontakt gebracht wird und eine etwaige Farbveränderung beobachtet bzw. ausgewertet wird. Bei Verwendung eines Anzeigers, welcher über eine saugllihigc ho Trägermatrix verfügt, tritt die Probe in die Matrix ein und die Farbveränderung kann auf derselben beobachtet werden. Zusätzlich zum visuellen Vergleich können verschiedene instrumenteile Methoden angewandt werden, um eine etwaige Farbveränderung zu bestimmen, wodurch die Genauigkeit des Testes erhöht wird, indem einer subjektiven Farbbestimmung durch das menschliche Auge vorgebeugt wird.

Die Aktivität der Enzympräparation wird als Anzahl der Aktivitätseinheiten pro Milligramm des Trockengewichtes bestimmt. Die Enzymkommission der internationai Union of Biochemistry' hat eine internationale VAn-

heit (I.E.) der Enzymaktivität als 1 Mikromol (μίτιοί) Substrat definiert, das pro Minute unter spezifischen %

Bedingungen des pH-Wertes und unter Temperaturkontrolle umgesetzt wird. |

Die Beziehung zwischen % Reflexionsvermögen (% R), wie sie in den Beispielen angegeben wird, und der Kon-

/c nl πι tion des absorbierenden Stoffes (Harnsäure) wird durch die Kubelka-Munk-Gleichung gegeben, welche : zusammen mit einer detaillierten Diskussion über Reflexionsspektrofotometrie von G. Kortüm in »Reflectance

Spectroscopy, Springer-Verlag New York Inc., 1969, angegeben wird. In der durch die Kübelka-Munk-Gleichung dellnierten Beziehung nimmt der %-R-Wert mit zunehmender Harnsäurekonzentration ab und umgekehrt. ; Daher korrelieren die Ablesungen, en (sprechend der Gleichung, invers mit den nachgewiesenen Harnsäure kon-

Λ /eiilrationen. Sämtliche Ablesungen wurden, wenn dies nicht anders angegeben ist, bei 530 Nanometer vorgenommen.

J₁ Kellcxionsmoisungen können durch die im Handel erhältlichen Spektrofotometer, wie z. B. Beckman DK-2

Γ, Spektrofolomctcr, Beckman Instruments Inc., Fullerton, Calif. 92 634, oder Spektrocolorimeter SCF-I, Israel

Klectro-Optical Industry Ltd. (in den USA durch Broomer Research Corporation, Plainwell, Long Island, N. Y. I I X03 vertrieben), erhalten werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung und sollen keine Einschränkung des Erfindungsumfanges darstellen. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein, Variationen, Substitutionen oder Änderungen in den Bestandteilen und Parametern, sofern dies wünschenswert ist, vorzunehmen.

B e i s ρ i e I I

Ls wurden Streifen in einem zweimaligen Tauchprozeß hergestellt, wobei Uricase verwendet wurde, die gegen '· verschiedene Puller, wie sie in Tabelle I angegeben sind, diaiysien wurde.

Durchgeführt wurden die Dialysen 18 Stunden lang bei 4°C in einem Dialysierschlauch ausSpektrapor-Membran (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, Calif. 60916), die für Moleküle mit einem Molekulargewicht von unter 6000 durchlässig ist.

Die erste Tauchlösung wurde durch Vereinigung von 0,5 ml Uricase (3,0 I.E./ml), die gegen den jeweils ange-'; gebenen Puller dialysiert wurde, 0,5 ml stabilisierendem Agens (1,5 mg% CMC und 0,8 mg% Polyoxyäthylen-

"■ äther von aliphatischen! Alkohol (BRIJ 35), 0,06 ml Meerrettichperoxidase und 0,1 ml (3,75 mg"A) des

Kopplungsreagcns PDP, jeweils in destilliertem Wasser bereitet. Die zweite Tauchlösung wurde hergestellt durch Auflösung von 5,0 mg des Chromogens MBTH in 10 ml Benzol.

Streifen aus Whatman ET 3 1 Filterpapier (Whatman Inc., Clifton, N.J. 07 014) von der Größe 2,54 cm x 10.16

"f cm, wurden jeweils mit der ersten Tauchlösung bis zur Sättigung imprägniert, 30 Minuten lang bei 5O⁰C ge-

ί trocknet, dann mit der zweiten Tauchlösung gesättigt, wiederum getrocknet und auf eine Größe von 5,1 mm x

Ί 10,2 mm zur Herstellung der erfindungsgemäßen Testmittel bzw. Teststreifen zugeschnitten.

^; Die auf diese Weise hergestellten Teststreifen wurden dann in drei Gruppen aufgeteilt. Zwei dieser Gruppen

, wurden jeweils 24 bzw. 72 Stunden lang einer Wärmeeinwirkung bei 6O⁰C ausgesetzt. Auf die dritte Gruppe

l· erfolgte überhaupt keine Wärmeeinwirkung (0); diese Gruppe diente als Kontrolle.

Die genannten Teststreifen wurden daraufhin untersucht, indem 0,03 ml aliquote Teile von Serumproben, die die in Tabelle II aufgeführten Mengen an Harnsäure enthielten, aufgetragen und die sich ergebende Farbveränderung beobachtet wurde. Ablesungen in %R wurden nach !20 Sekunden an den frisch hergestellten Streifen vorgenommen.

Üi Tabelle I -40

/eil Harnsäure (mg%)

(Stunden) 2 4 6 8 10

TRIS

I Il iio \j j^,u ^j,/ ^»,i i-u,-· *.«,_■ _-

ti:s

Die Ergebnisse in Tabelle I zeigen bei zunehmender Harnsäurekonzentration eine inkrementale Abnahme der prozentualen Reflexionsstärke (%R); diese Beziehung wird in der Kubelka-Munk-Gleichung definiert. Dies wiederum zeigt an, daß jeder der untersuchten Puffer gut dazu geeignet ist, die gereinigte Uricase-aktive Substanz herzustellen.

Beispiel II

Ls wurde der Effekt der endgültigen Testempfmdlichkeil bei pH-Variation des Dialysepuffers untersucht. Dazu wurden Teststreifen wie in Beispiel I hergestellt, wobei die Uricase gegen Phosphatpuffer, der auf die

verschiedenen in Tabelle II angegebenen pH-Werte eingestellt war, dialysiert worden war. Die erhaltenen Ergehnisse, ausgedrückt in %R, sind in Tabelle II wiedergegeben.

0	38,6	30,7	28,9	23,0	25,0
24	44,8	35,6	30,0	30,0	26.3
72	43,4	40,1	34,7	32,3	27,9
0	39,0	33,7	31,1	28,5	26,5
24	38,1	34,5	30,3	27.2	24,4
72	35,4	35,6	31,0	29,2	28,8
0	33,8	31,2	29,1	25,7	25,6
24	34,3	31,0	28,5	27,1	24,2
72	33,2	35,0	29,!	26,6	26,3

Tabelle II

pH Harnsäure (mg"'")

2.0 4,0 6,0 8.0 10,0

6,8	19,4	13,8	12,4	10,7	9,3
7,0	19,5	14,3	11,5	10,2	9,2
7,5	19,0	13,5	8,1	10,3	9,2

Die Ergebnisse zeigen bei zunehmender Harnsäurekonzentration eine wachsende Abnahme. Dies indi/ierl, daß Uricase, die gegen einen Puffer mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,5 dialysiert wurde, eine hohe Empfindlichkeit im Nachweis von Harnsäure aufweist.

Ergebnisse, die mit Uricase erhalten wurden, welche gegen TRIS-, PIPES- und TES-Pul'fer dialysiert worden war, weisen eine pH-Stabilität der Uricase im selben Bereich auf.

Beispiel III

Es wurden Teststreifen bzw. Testmittel nach dem nachfolgend beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei die in Tabellt III aufgeführten Kopplungsreagenzien anstelle von PDP verwendet wurden.

0,2 g MBTH wurden in einem Gemisch aus 50 ml Methanol und 10 ml H₂O gelöst. Zu 6 ml dieser MBTII-Lösung wurden 0,02 g des jeweiligen Kopplungsreagenz, 0,5 ml 200 mg% Peroxidase und 0,1 ml dialysierte Uricase (6 I.E./ml) unter Bildung einer Lösung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zugegeben.

Die auf diese Weise hergestellte Reaktionslösung wurde durch Vereinigung von 0,2 ml derselben mit 0,01 ml Harnsäure getestet. Die mit den verschiedenen Kopplungsreagenzien beobachteten Reaktionen bei 5 mg%- und 10 mg%-Konzentration Harnsäure sind in Tabelle III wiedergegeben.

Tabelle III

	Kopplungsreagenz	Harnsäure	beobachtete Reaktion
		(mg%)
ι S	Chromotropsüure	5 10	purpur purpur
	p-d-Methylaminobenzaldehyd	5 10	keine Reaktion keine Reaktion
40	MBDMA	5 10	blaßblau blaßblau
	Bis-(4-hydiOxyphenyl (-methan	5 10	keine Reaktion keine Reaktion
45	Primachindiphosphat	5 10	helle Rotfärbung helle Rotfärbung
	Iminodibenzyl	5 10	keine Reaktion keine Reaktion

Wie aus Tabelle III hervorgeht, sind Chromotropsäure, MBDMA und Primachindiphosphat als Kopplungsreagenzien in der Zusammensetzung gemäß der Erfindung wirksam, wohingegen andere Verbindungen, nämlich para-d-Methylamino-benzaldehyd, Bis-(4-hydroxyphenyl)-methan und Iminodibenzyl nicht geeignet sind. Weitere geeignete Kopplungsverbindungen umfassen Naphthyläthylendiamin, Naphthylaminoälhanol, Hydroxytetrahydrobenzoehinolin, Phenothiazin, Η-Säure (S-Amino-l-naphtol-6-sulfonsäure), I-Hydroxy-2-naphthalin-sulfonsäure, l-Hydroxy-3-naphthaiin-sulfonsäure, l-Amino-2-naphthalin-sulfonsäure und 6-Acciamino-1-hydroxy-naphthalin-sulfonsäure.

Beispiel IV

Es wurden 20 klare Serumprobe η mit unbekanntem Harnsäuregehalt bestimmt, wobei Teststreifen verwendet wurden, die mit dem nachfolgenden Einmal-Tauchverfahren hergestellt worden waren. Die Ergebnisse wurden mit Testen verglichen, die mit dem Standard-Phosphowolframat-Verfahren nach Carroll et al, Clinical Chemistry 17, 158 (1971) durchgeführt wurden.

&5 10 ml destilliertes Wasser, das 0,3 mg% B-MethyW-benzothiazolinon-hydrazon (MBTH), 0,15 mg% Pcro.xidase, 0,075 mg% Primachin-diphosphat (PDP) und 1,0 mg% Carboxymethylzellulose enthielt, wurden mit 10 ml 0.5 molarem (M) TRIS von pH 7,0, welches die gereinigte Uricase-aktive Substanz tierischen Ursprungs gemäß der Erfindung mit einer Aktivität von 3,0 I.E./ml enthielt, vereinigt.

Streuen aus Whatman Filterpapier von der Größe 2,54 cm x 10,16 cm wurden mit jeweils 1 ml dieser Lö- |i

sung imprägniert, bei 50⁰C 30 Minuten lang getrocknet und zu Testanzeigern bzw. Teststreifen von der Größe j_;

5,1 mm x 10,2 mm zugeschnitten. Diese Anzeiger wurden mittels einem doppelseitigen Klebeband aufläng- |;

liehe Polystyrol-Trägerelemente zur leichteren Handhabung aufgebracht. j^!;

Die Teststreifen wurden untersucht, indem je 0,05 ml einer Serumprobe auf den jeweiligen Teststreifen auf- 5 \

gebracht wurden und die sich entwickelnde Farbe nach 10 Sekunden und daraufhin nochmals nach 5 Minuten abgelesen wurde. Sämtliche Ablesungen erfolgen aufeinem Arnes Reflexionsmeter (ARM) (Arnes Company, Division of Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana 46514) mit einem gelbgrünen Filter (Edmund Scientific Company, Barrington, NJ. 08007). Der Unterschied (Δ) in ARM-Einheiten zwischen den Ablesungen nach 5 Minuten und 10 Sekunden wurde genutzt, um die Anzeigeschwankungen der von Hand hergestellten Teststreifen zum Vergleich mit den Untersuchungsergebnissen jeder Probe durch das Standard-Phosphorwolframat-Verfahren auf ein Minimum zu reduzieren, wobei die jeweiligen Ergebnisse der entsprechenden Probe in Tabelle IV wiedergegeben werden.

Tabelle IV

Probe Referenzwert ARM-Einheiten Δ

(mg'l'i Harnsäure)

1	2,5	37
2	3,4	41
■> j	3,5	48
4	3,9	44
5	4,2	49
6	4,3	56
7	4,5	50
8	4,7	57
9	4,8	50
10	5,5	60
11	5,6	59
12	5.6	50
13	5,8	54
14	6,0	70
15	7,0	71
io	8,3	IV
17	8,6	91
18	9,0	88
19	9,5	80
20	10,0	86

30

Die Ablesungen in ARM-Einheiten variieren nach einer linearen Beziehung in Abhängigkeit von der vorliegenden Konzentration in mg% Harnsäure. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die beschriebenen Untersuchungen mit der Referenzbestimmungsmethode korrelieren und gegenüber Unterschieden im Harnsäurespie- -15 gel sehr empfindlich sind. Diese Empfindlichkeit geht besonders bei der deutlichen Zunahme der Ablesungen /wischen Beispielen hervor, die sich nur leicht in ihrer Harnsäurekonzentration unterscheiden.

Beispiel V

50

Nach verschiedenen Formulierungen wurden in einem Zweimal-Tauchverfahren. das nachfolgend beschrieber! wird, Testmittel zum Harnsäurenachweis hergestellt.

Die erste Tauchlösung wurde durch Vereinigung von 0,5 ml dialysierter Uricase-aktiver Substanz (1,3 I.E./ml) mit einer wäßrigen Lösung aus 0,1 ml (3,75 mg%) PDP, 0,06 ml (1,5 mg%) Peroxidase und 0,5 ml (1,5 mg%) CMC und 0,8 mg% BRIJ hergestellt.

hin Bogen Whatman Filterpapier w urde bis zu dessen Sättigung mit der obigen Tauchlösung imprägniert und bei 60⁰C IO Minuten lang getrocknet. Der Bogen wurde dann bis zur Sättigung mit 10 ml 0,05 mg"/» MBTH in Bcn/ol imprägniert, bei 60⁰C 10 Minuten lang getrocknet und zu den erfindungsgemäßen Teststreifen von der Größe 5,1 mm x 10,2 mm zugeschnitten.

Diese Teststreifen wurden untersucht, indem 0,03 ml der Probe, welche Harnsäurekonzentrationen von 2,4,6, X und 10 mg% enthielten, aufgetragen und nach 120 Sekunden die Reflexionsstärke beobachtet wurde, Dabei wurden Ablesungen von 39,3,34,7, 29,4, 26,9 und 25,8 %R erhalten. Diese Ablesungen bestätigen die reciproke Beziehung, wie sie durch die Kubelka-Munk-Gleichung definiert wird, auf die auch schon im vorhergehenden hingewiesen wurde, und zeigen die gute Empfindlichkeit gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen an Harnsäure. f>5

Daraufhin wurden Teststreifen nach dem vorangehend beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei jedoch I'DI'-Konzentrationen von 1,0, 2,0 und 5,0 mg%, anstelle von 3,75 mg%, verwendet wurden. Die auf diese Weise hergestellten Teststreifen b/w. Testanzeiger wurden wie oben untersucht. Bei den %R-Ablesungen nach 120

Sekunden ergibt sich keine signifikante Veränderung der beobachteten Empfindlichkeit in Abhängigkeit der unterschiedlichen Konzentrationen des Kopplungsreagenz PDP, das in den Streifen verwendet wurde.

Außerdem wurden Teststreifen wie oben angegeben hergestellt, wobei jedoch das Stabiiisierungsagens CMC in einer Konzentration von 0,5 und 2,4 mg% anstatt von 1,5 mg%, verwendet wurde. Die auf diese Weise hergestellten Streifen bzw. Anzeiger wurden wie oben untersucht und es konnte festgestellt werden, daß auch diese Harnsäure mit großer Empfindlichkeit nachweisen.

Außerdem wurden Streifen wie oben angegeben hergestellt, wobei jedoch das Chromogen MBTH in Konzentrationen von 0,01,0,10 und 0,20 mg%, anstelle von 0,05 mg%, verwendet wurde. Die auf diese Weise hergestellten Testanzeiger wurden wie oben untersucht und zeigten ebenfalls eine ausgezeichnete Empfindlichkeit gegenüber Harnsäurekonzentrationen.

Außerdem wurden Anzeiger hergestellt, wobei Peroxidase in Konzentrationen von 0,5, 1,0,5,0 und 20 mg%, anstelle von 1,5 mg%, verwendet wurde. Wenn diese wie oben angegeben getestet wurden, so konnte jeder Anzeiger, der auf diese Weise hergestellt worden war, mit dergleichen Empfindlichkeit wie in dem Testanzeiger mit 1,5 mg% Peroxidasekonzentration, zwischen den Harnsäurekonzentrationen unterscheiden. Zudem wurden Teststreifen wie oben angegeben hergestellt, wobei Uricase-aktive Substanzen mit einer Aktivität von 0,8 und 1,8 I.E./ml, im Gegensatz zu 1,3 I.E./ml, verwendet wurden. Nach der oben angegebenen Untersuchung konnte keine Veränderung der Sensitivität beim Nachweis von Harnsäure als Ergebnis der Verwendung von Peroxidase mit unterschiedlicher Aktivität festgestellt werden.

20 Beispiel VI

Nach dem in Beispiel i angegebenen Verfahren wurden in einem zweimaligen Tauchprozeß Teststreifen hergestellt, die Uricase (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim Bundesrepublik Deutschland), mit einer Aktivität von 9 IE/ml und die anderen in Beispiel I angegebenen Reagentien (Carboxymethylcellulose, Peroxidase, MBTH, PDP und oberflächenaktives Mittel) enthielten. In drei parallelen Versuchsreihen wuroe dabei die handelsübliche Uricase ohne weitere Nachbehandlung, sowie nach Dialyse gegen Wasser bzw. 0,5molaren TRIS-PulTer mit einem pH-Wert von 7,0 (18 Stunden bei 4°C) eingesetzt.

Die so hergestellten Teststreifen wurden in eine Harnsäure enthaltende Lösung getaucht und die l-arbbildung

in einem Arnes Reflectance Meter untersucht. Die nachstehende Tabelle gibt jeweils den Mittelwert aus zwei Parallelversuchen an. Die numerischen Werte beziehen sich auf die Reflexions-Änderung nach 10 Sekunden

bzw. 5 Minuten. fä

Die Temperaturbehandlung bei 60⁰C simuliert die Verhältnisse bei längerer Lagerung unter Umgebungsbc- ||

dingungen: m

24 Stunden bei 60⁰C entsprechen etwa einem Jahr Lagerung bei Raumtemperatur. si

Tabelle Vl |

L'ricasc Temperaturbehandlung jjjj

⁴⁽¹ 0 24^h/60^cC 4X¹VM)⁰C fj

nicht dialysiert 30 26 ~ P]

dialysiert gegen Wasser 49 53 48 |]

dialysiert gegen Puffer 66 71 67 u

In einem weiteren Versuch wurde eine Uricase mikrowellen Ursprungs (aus Bacillus Lastidiolus) mit einer φ

so Aktivität von 2,8 ΙΕ/mg in der erfindungsgemäßen Weise gegen Pufferlösung dialysiert. Die Uricisc war jedoch |j

nicht solubilisierbar und konnte nicht in das Testmittel überführt werden. Die Uricase ist (möglicherweise auf- f_t\

grund von noch vorhandenen Verunreinigungen) nur bei alks'ischen pH-Werten solubilisierbar, die für die erlln- ξ]

dungsgemäße Testzusammensetzung ungeeignet sind. |i

Eine weitere mikrobielle Uricase der Firma Novo wurde (ohne erfindungsgemäßen Dialyseschritt) in der in ij

g ebracht. Diese wiesen nach 24stündiger Lagerung bei 6()°C |j

praktisch keine enzymatische Aktivität mehr auf.

Beispiel I angegebenen Weise auf Teststreifen aufgebracht. Diese wiesen nach 24stündiger Lagerung bei 6()°C |

10

Claims

Patentansprüche:

1. Testmittel zum Nachweis von Harnsäure, enthaltend eine Substanz mit Uricaseaktivität, mindestens ein Chromogen und Peroxidase, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mit Uricaseaktivität ticri-

sehen Ursprungs ist und von Verunreinigungen mit einem Molekulargewicht von unter 6000 durch Dialyse

gegen einen Puffer mit niedriger Metallbindungskonstante und einem pH-Wert im Bereich von 6,8 bis 7,5 befreit worden ist, wobei das Testmittel in einem inerten Träger inkorporiert ist.

2. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen ein Hydrazon darstellt.

3. Testmittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrazon ein 3-(C, -Ct-Alkyl)-2-ben/o- !0 thiazolinon-hydrazon ist.

4. Testmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das 3-(C,-C₄-Alkyl)-2-benzoihiazolinonhydrazon die Verbindung 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon darstellt.

5. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem mindestens ein Kopplungsreagenz enthält.

6. Testmittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Kopplungsreagenz eine Verbindung der allgemeinen Formel