JPS585190A - 試料中の尿酸測定に用いる精製された動物起源ウリカ−ゼ活性物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に臨床試験の分野に関する。さらに詳しく
は、液体試料中の尿酸測定に用いる精製された動物起源
ウリカーゼ活性物質の製造方法に関する。

哺乳動物Ｏ代射においては、摂取されえ核蛋白質がｌリ
ンおよびビリミシンに内因的に一定に変化する。ζ０７
”ｌＪンは異化作用過＠によ〕さらに脱アミノ化および
部分酸化畜れて尿酸にな〕、これは通常人体では尿中に
排１１１される。従って、ごく少量の濃度の尿酸が人間
の血液および尿中に當に存在する。

プリンを含有する食物を摂取して一％ａｔが上昇するよ
う表腎臓の機能低下Ｏ場合を除いて、血清中の尿酸含有
量に影響を与えない、プリン管含有する食物の摂取に関
係しないある他の病的状態、例えば尿毒症または痛風で
は、血清中の尿酸の量の異常な増加が覚られる。壕九、
血清中Ｏ尿酸は白血病および肺炎等の白血球核の過剰な
破壊に関係する状態で上昇する。

血清中の尿酸の試験は前述の状態を診断し、いくつかの
場合には、非常Ｋｌｌ係の深い異常な状態、例えば肺炎
と関節炎を区別する助けとして役に立つとｕｗ＆されて
いる。肺炎は血清中の尿酸の異常な増加により特徴づけ
られるが、関節炎はそのような増加を示さない。それゆ
え、血清中の尿酸濃度を正確に４Ｇ定して測定する簡単
かつ経済的な試験手段を提供することが望まれる。

尿酸は正常時には、血清１ＱＱｓ！当シ約０．７〜約ｓ
、ｏｉｗ（通常■−として報告されている）の量で血清
中に見られる。上述した異常な状態で杜、血清中Ｏ尿酸
含量は１０１１ｆ慢を九はそれ以上の値にしばしば達す
る。

従来技術は血清中の尿酸を測定するための多くの方法を
開示している。よシ広範に用いられている方法のなかに
は血液のＦ液を利用する発色法がある。これらの方法の
いくつかは血液ＯＦ液からの尿酸の析出（例えば銀塩と
して）およびリンタングステン酸塩または砒タングステ
ン酸塩との反応による色原体付加物の生成に依存する。

血液Ｐ液を利用する他の方法は、尿酸濃度の定量的評価
の丸めの従来の技術を用いて測定される色を生じさせる
丸めにシアン化尿素溶液の存在下％ｒ液をタングステン
酸で直接処理することに依存する。

極く最近では、尿酸の７ラントインと過酸化水素への触
媒酸化を包含する方法が提案されている。

この酸化は大気中の酸素の存在下で通常行なわれ、かつ
ウリカーゼ活性を有する物質を利用する。この反応はｐ
Ｈ９ま九はその付近で起ζる。このような方法では、尿
酸がアラントインと過酸化水素に転換する間に尿酸の特
徴的スペクトルＯ消滅を測定するために、分光光度針を
用いることができる。

もう１つの方法は尿酸のこのような分解時に生成した化
学量論量の過酸化水素を測定すゐえめに比色手段を利用
してお９、例えばアルパウム（Ａｌｂａｗｍ　）特許番
号第３．３４９．００６号およびワヒテｋ　（Ｗａｅｈ
ｔ＠ｒ）特許番号！３，３３５．０６９号（いずれ４本
出願人に鎗渡されている）に記載されている。

酵素転換試験において、生成する過酸化水素が血清中に
存在する尿酸の量に比例する場合、過酸化水素は、過酸
化活性を有する物質の存在下で呈色する物質の酸化によ
〕生じ比色の変化によって測定される。この反応祉酸性
ｐＨで起る。ナトリクムアジＦまたはシアン化ナトリウ
ム等Ｏカタツーゼ防止剤は過酸化物のカフラーゼ分解を
防止することを通常要求されている０次いで得られた色
を目で標準と比較するかｔ九は、電気的に測定して試験
する流体中に存在する尿酸の定景的評−が得られる。

私印特許７２／３１５５７号は基本的に興なる酵素触媒
反応を開示しておシ、そこではアルデヒドを含まないメ
タノールおよびカタラーゼをウリカーゼと共に試料（ｐ
Ｈ８に緩衝）Ｋ添加し、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン（ｐＨ３に緩ＩＩ）および塩酸に溶解
した塩化第二鉄を添加すると青色に呈色することが開示
されている。

カーノー（Ｋａｎｏ）％許番号第３．８６２，８８５号
は、微生物起源クリカーぜおよびカタラーゼ防止剤（ｐ
Ｈ５，５〜７．ＯＫ緩衝）によシ過酸化水素を発生させ
、蔭イオン界面活性剤、色原体およびペルオ命シダー−
ｋ”（ｐＨ４，０〜７．０）の存在下発生した過酸化物
を測定することによる尿酸の測定方法を開示している。

プツホマン（Ｇｏｃｈｎａｎ　　）とシｘｉット（８ｃ
ｈｎｉｔｚ　）は、「クリニカル番ケンストリーＪ　（
Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｇｎ）第１７巻、ｌ　ｌ　５４−ｅ−Ｎ
（１９７ｊ）Ｋオイテ、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン・塩酸塩をＮ、Ｎ−ジメチルアニリン
と共に用いてアゾ色素指示薬を形成させる尿酸の自動１
測定法を報告している。

この分野においてこれまでの研究者の貢献にもかかわら
ず、これらの方法は、液相で通常行なう一連の別々の操
作を要するという欠点を持っていた。動物ウリカーゼお
よび（ルオ中シ〆−ゼを同時に用いる組合せの反応は、
尿酸と色原体が競合するため、すなわち両者がベルオキ
シダーゼの存在下で過酸化水素によシ酸化されゐ九めと
用いる２つの酵素の最適ＰＨが著るしく異なるために不
可能と考えられていた。両反応を同じｐＨ１７ｔは非常
に近いｐＨで行なう従来技術Ｏシステムでは、最高の効
率特性を示す動物起源ウリカー−ｖｌ等の使用可能なあ
る反応成分は、この反応に要求されるｐＨ範囲内でペル
オキシダーゼ生成系や成分として機能しないためＫこと
では用いることができないという欠点がある。

このように安定化された統一的な試薬試験において、尿
酸測定用手段を包含することは以前は不可能であつ九。

本発明の第１の目的はｐＨ感受性の妨害物質を含有しな
い新規な精製された動物起源ウリカーゼ活性物質の製造
方法を提供することである。

本発明の第２の目的は体液中の尿酸測定用組成物資たけ
用具等に適用して有用な精製された動物起源ウリカーゼ
活性物質の製造方法を提供することでああ。

本発明の他の目的および充分な理解が以下の記載および
好ましい実施態様に向けられ九特許請求の範囲を参照す
ることＫよって得られるであろう。

本発明の動物起源ウリカーゼ活性物質の製造方法は、約
５ｏｏｏ未溝の分子量を有する成分を分別によって動物
起源ウリカーゼから除去することを特徴とするものであ
る。本発明の製造方法は、前記分別操作が透析によ〕達
成されることが好ましく、更に、前記透析操作が低金属
結合定数を有する緩衝液に対して行ｄわれることが好ま
しい。

更に体発ｆ１４に従えば、精製され九ウリカーゼをその
中に用いた組成物または用具等の統一的な試験手段、試
験用具の製造方法およびそれを用いる尿酸の測定方法が
提供される。Ｉｌ］ち、ウリカーゼ活性物質、少なくと
４ｂ１つの色原体および過酸化活性物質からなる尿酸の
検出用試験手段において、ウリカーゼ活性物質が約６０
００未満の分子量を有するｐＨ感受性妨害物質を含有し
ていない動物起源ウリカーゼであることを特徴とする試
験手段が提供される。この試験手段は少なくとも１つの
カップリング剤および少なくと４１つの安定剤をさらに
包含することができる組成物Ｏ形を採ることができる。

この組成物を錠剤またはマトリックス等の担体に任意に
包含して試験用＾を得ることができる０本発明の製造方
法によシ得られる動物起。

源ウリカーゼ活性物質を使用するととＫより、以前は達
成されなかったｐＨ範囲に亘って安定であシ。

且つ、統一的な試験が可能となる。

上述の組成物の成分である精製された動物起源ウリカー
ゼ活性物質轄、例えばインヂアナ４６５１もエルクハー
トのｉイルス・ラゲットリーズ・インニー−レーテッド
の一、マイルス・リサーチ・プロダクツ（Ｍｉｌ＠ｓ　
Ｒ＠ｕａｒｃｈＰｒｏｄｕｅｔｓ、Ｍｌｌａｍ　Ｌａｂ
ｅｙａｔｏｒｉｅｓｌｎｅ、、　Ｅｌｋｈａｒｔ、　Ｉ
ｎｄｉａｎａ　４６５１４　）よ）商業的に入手可能な
動物ウリカーゼ製品を分別精製することＫよ）調製され
る。ｐＨＣ）ｆｆｉ化に感受性があ如、約６−０００未
満の比較的低分子量の妨害物質が除去される。驚くべき
ことに、この−見簡単な精製方法によって生成され九ウ
リカーゼ活性物質は、約６．Ｓ〜約７．５のｐＨ範囲に
亘って安定であり、かくして、単一の反応のノ４ツメ−
ターの下で機能する多くの反応系を有する統一された酵
素触媒尿酸試験組成物の調製を可能にする。

動物クリカーゼは銅蛋白（複合金属蛋白）であり、ｃｌ
’は酵素の触媒位置の一部であると信じられている。活
性位置の銅を含む部分の構造は以下に図式的に示されて
いる。すなわち、 酵素の銅蛋白の性質はｓ　０ｗｌ＋イオンの瞬間的な還
元とＣｕ＋イオンの錯体形成を可能にする種ｋＯ試薬に
よって酵素が急速であ為が可逆的に抑制されるようにす
る。それゆえクリカーゼは低い金属結合定数を有する緩
衝液に対して透析するととＫよシ精製することが好まし
い。

好ましい実施態様においては、トリス（ヒドロキシメチ
ル）−アミノメタン（丁ＲＩ８）、ピペラソンーＮ、Ｎ
’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥ８　）、
Ｎ−）リス−（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノ
エタンスルホン酸（ＴＥ８）およびリン酸塩緩衝液゛等
の低い金属結合定数を有する緩衝液を含んでいる溶液に
対して酵素を透析する。

尿酸をウリカーゼによって約ｐＨ７でアラントインと過
酸化水素に＃素的に酸化する。緩衝液またはｐＨにかか
わらず、本来の酵素反応の化学量論は式〔Ｉ〕： ＣｓＮ４０ｓＨ＠−＋０１＋Ｈ１０４（４Ｎｍ０４％−
＋＆Ｏｍ　　ＩＩＪによシ与えられる。すなわち尿酸塩
のモノアニオンから酸素への電子対の伝達によシネ安定
な酸中量体（１−カルｌキシ−２，４，６，８−テトラ
アゾビシクロ（３，３，０３−オクタ−４−エン−３，
７−ノオン）および過酸化水素が得られる。

この中間体生成物は尿酸より強い酸（よシ低いｐＫ）で
あシ（尿酸塩のｐＫｍ５．７５　　に対して尿酸ｐＫ＝
４．５．尿酸塩のｐＫｍ　＝　Ｉ　Ｏ，３Ｋ対して尿酸
ｐＫ。

−１１，ｓ　）、銅（Ｃｕ２＋）およびコバルト（Ｃｏ
　２　＋　）と金属キレートを形成させゐことによプ安
定化することができる。ｐＨ７，０で極度に精製された
酵素の存在下では、アランＦイン、過酸化水素および二
酸化脚嵩の化学量論量が生成される。次いで過酸化水嵩
がベルオキシダーゼの存在下で色原体と反応して赤い錯
体を与える。この試験の全般的化学反応は以下のようで
ある。

叫 Ｈａへ＋３−アんキル−２−ペンゾチアプリノ／ヒドラ
ゾン十カプリン梢拭桑この系では、尿酸および色原体と
の間の競合の難点および酵素の最適ｐＨＯ極度の相異の
難点が強い還元剤、ヒドラゾンおよび非常に感受性があ
参、さらにウリカーゼの活性物質として働くカップリン
グ剤を用いることによってさらに克服される。

例えば３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
（ＭＢＴＨ）およびプリマキンニリン酸塩（ＦＤＰ　）
を用いる色原体反応が以下のように図式Ａに図式的に表
わされている。

図式Ａ Ｈａ 赤い錯体 特定のことばが明確にする丸めに以下の配ｌ！に用いら
れているが、これらのことばは代表的な説明のために選
ばれた本発明の特別の実施態様のみを言及しようとする
ものであ）、本発明の範囲を限定あるいは制限しようと
するものではない。

市販のウリカーゼ製品は、好ましい実施態様において、
そのウリカーゼ製品を分別して約６０００未満の分子量
を有する一分子を除くことを特徴とする透析方法によっ
てｎ＄１される。

ヒドラゾンはヒドラジンとアルデヒＶま九はケトンとの
縮合生成物であ）、Ｃ＝　ＮＮＨ，基を含有する。多く
のヒドラゾンはある芳香族アミンまたはヒドロキシナフ
タレンスルホン酸塩と酸化的にカップリングして呈色物
質を形成する。仁のヒドラゾンとしては、と９わけ、３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、２−ヒ
ドラジノベンゾチアゾール、Ｎ−メチル−ピリドン−４
−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−ピリドン−２−ヒドラジノ
、Ｎ−メチル−キノリノン−２−ヒドラゾン、メゾルー
キノリノン−４−ヒドラゾン、Ｎ−メチルー２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン、Ｎ−メチル−チアゾリノン−
２−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−４−フェニルチアゾリノ
ン−２−ヒドラゾ／、Ｎ−メチル−オキサシリノン−２
−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−ベンズオキサシリノン−２
−ヒドラゾンおよび１．３−ツメチルベンズイミダゾリ
ノン−２−ヒドラゾンが挙げられる。

組成物の好ましい実施態様では、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のａ−（Ｃ＋
〜Ｃ４アルキル）−２−ベンゾチアゾリノン上１２フフ
０色原体が色原体として用いられる。このようなヒト２
シンは強い還元剤である。

このヒドラゾンは約０．０５＋ｖ％から約０．２　ｑ９
Ｇの１１＆でベンゼン溶液中で用いられる。

色原体ヒドラゾンと組合わせて用いることができるカッ
プリング剤の代表例は下記の通シである。

（１）　　一般式： （式中、Ｘは炭素原子、窒素原子★九はイオウ原子を表
わし、ＥｔＩは水素原子、水酸基、ア建）基、アルキレ
ンジアミン基またはア建ノアルカノール基を表わすかま
たはＲ２が水素原子の場合ＫＬと一緒になってＮＨＣＨ
，ＣＨＯＨＣＨＪなるものを表わし、Ｒ８およびＲ８は
同一または異なっていてもよく、水素原子または亜硫酸
基を表わし、Ｒ４は水素原子、水酸基、ＮＨＣＨ（ＣＨ
ａ）Ｃ馬Ｃ山Ｃ山皿、または亜硫酸基を表わし、鳥は水
素原子、亜硫酸基またはア七ドア建ノ基を表わし、鳥は
水素原子壕九はメトキシ基を表わし、馬は水素原子、水
酸基壇九はアミノ基を表わす、）を有する化合物および
そのリン酸塩等の酸付加塩 （２）一般式：　Ｒ−ＣＨｒ　Ｒ（式中、それぞれＯＲ
はジメチルアニリン、ヒト四キシフェニル、ベンゾチア
ゾールまたはベンゾフェノンを表わす。）を有する化合
物 （３）テアずンを九はその酸付加塩 （４））？ルフェニルプロパンジアミン（５）フェノチ
アジン 好ましいカップリング剤としては、ｌリマ午ンニリン酸
塩（ＦＤＰ）、クロモトロープ酸および４゜４′−メチ
レンビス（Ｎ、Ｎ’−ジメチルアニリン）（ＭＢＤＭＡ
）が挙げられる。カップリング剤は約１．０ＩＩｌＦ−
〜約５．０ｑｌＧの水溶液で用いられる。

この組成物はさらに有利に選択され九安定剤、カルＩキ
シメチルセルロース（ＣＭＣ）および脂肪族フル：１−
ルのＩリオキシエチレンエーテル〔ＢＲＩＪ：登録商標
、アイシーアイ・ユナイテッド・スティク・インコーー
レーテツＰ１ウイルンングトン、プラウエア１９８９７
　（ＩＣＩ　Ｕｎ１ｔ＠ｄ８ｔａｔ＠ｓ　Ｉｎｃ、　、
Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄａｌａｗａｒ＠１９８９７　
）社製〕を含む仁と・ができる、これらは総濃度約０．
５ｍｙ−〜約５・０＊％で水溶液中に存在する。

本発明に従つ良組酸物を含んでいる溶液は、尿等の体液
試料に添加することＫよって尿酸を検出するために用い
ることができる。結果として色の変化を伴なう発色錯体
が形成される。しかしながら、この組成物は溶液として
よ）もむしろ固体製品の形で、また好ましくは使い具さ
と信頼性の丸めに設計され走用具でよ）有利に用いられ
る。

本発明の特徴として、不活性担体およびその不活性担体
に包含される上述の実施例で説明されるような本発明に
従った組成物よ）なる用具が作成される。この不活性担
体は吸収性を九は非吸収性の担体マトリックスの形を採
ることができるかまたは錠剤を九は他の通常の形を採る
ことができる。

この担体マ）ＩＪラックスいうことばは生、通約液体ま
たは他の液体と接触される場合、不溶性であシ、その構
造全体を維持する吸収性を九゛は非吸収性のマトリック
スのことをいう。

用いることができる好適なａ収性！トリックスとしては
、紙、セルロース、木１合成樹脂７リース、ガラス繊維
、不織布および織布等が挙げられる、非吸収性マトリッ
クスとしては４９プ四ピレンのような有機プラスチック
材料が挙げられる。

使い異くするために１そのマトリックスを一すスチレン
製の支持部材のような非溶解性支持１部材と組合わせる
仁とができる。

壕九、この不活性担体は崩壊剤、充填剤および潤滑剤の
ような通常の担体材料を含んでいる圧縮成形または型成
形した錠剤の形にすることができる。

本発明に係る試験用具は実施例に示されているように高
度な安定性を示す、この安定性は基質上にある組成物の
成分を分離し、最終製品を箔、乾燥剤を含んでいる容器
等に装填することによりさらに改良する仁とができる。

印刷、Ｉｔたはそれ以上の成分のカブ令ル包装、異なつ
九成分に対して別々のマ）　ＩＪラックス九は基質の使
用、基質の両側へ共存できない成分の配置などによって
成分を物理的に分離することができる。

さらに本発明の特徴として、不活性担体を本発＃ＩＫ係
る組成物で含浸、プリントまたは他の方法で接触するこ
とによりなる尿酸試験用具を調製する方法も提供される
。担体が液状の組成物で含浸される場合には、担体は次
いで乾燥工程を受ける。

・ さらに本発明によれば、上記処理によシ得られる組成物
ｉ九は用具と試料を接触させ１色のある変化を観察する
ことによってこの試料を試験することができる。吸収性
担体マトリックスを有する盤の用具を用いる場合には、
この試料をマトリックスに入れてその上の色の変化を観
察する。視覚による比較に加えて、生じたある色の変化
を測定するために稙々の器＾を用いる方法によシ行なう
ことができ、″このようにして人間の目による主観的な
色の測定を不要にすることにより試験の精度を向上させ
る。

酵素製品の活性は乾燥重量ｑｍＦ）の活性単位数によっ
て測定される０国際生化学連合の酵素委員会　（Ｔｈｅ
　　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　　　ｏｎ　　Ｅｎｘｙｍｓ
ｓｅｆ　　を麺ｅ　　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎ
ｉａｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｅｈａｏｄａｔｒｙ　）は酵素活
性の国際単位（１，Ｕ、）をｐＨおよび温度を制御し九
特定０＠件下Ｏ毎分蟲夛の利用される１μｍｏｚ　　の
基質と定義し友。

実施例に示され九反射率（ＩＩＲ）と吸収種（尿酸）の
一度との関係は、コルラミ、ジー・著「反射分光学」、
スプリングルーフエアラーク・ニューｌ−夕・インコー
Ｉレーテッド発行（１９６９）（Ｋｅｒｔｍｍｉ　Ｇ、
　ｅＲ＠ｆｌ＠ａｔａｎｃｅ　８ｐｅｅｔｒｏａｅｏｐ
ｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖ＠ｒ１ｍｇＮ＠ｗＹｏｒｋ
　Ｉｎｎ、、　　１９６９　）で反射分光学の詳細な論
議と共に与えられているクペルカーモンタの式（Ｋｕｂ
＠ｌｋｍ−Ｍｏｎｋ　＠ｑｕａｔｉｏｎ　）によって得
られる。タペルカーモンクの式によって定義され九関係
においては−Ｒ値は検出され九尿酸の濃度が増加すると
減少し、逆に減少すると増加する。

かくしてその弐に従えば得られ九表示は検出される尿酸
の濃度と反比例の関係にある。すべての表示は他に指示
がなければ５３０　ｎｍで得良。

反射率の表示はカリホルニア９２ｇ３４　、ヒエラート
ンペツクマン・インストルメンツ・インコーＩレーテツ
Ｖ製ペックマンＤＫ−２スペクトロフオトメーター（Ｂ
＠ｃｋｍａｎ　ＤＫ−２８ｐｅｃｔｒ＠ｐｈｏｔｏｒｎ
ｅｌ＠ｃ　。

Ｂ＊ｅｌａｎａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　　、ＩＩ
Ｒ（１，、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ　、Ｃａｌｌｆｏｒｎｉ
ｍ９１１１４　）１九はイスラエル・エレクト四−オｌ
ティカル拳インダストリー・リオテツド製スペクト四カ
ラリメーター８ＣＦ−１（米国においてプル！−・リサ
ーチ嗜コー４し一シ冒ン、！レインウェル、ロングアイ
ラン）″、ニエーＷ−／１１８０３より市販）　（８ｐ
＠ｃｔｒｏｅｏｌｏｒｉｍｔ＠ｒ　８ＣＦ−１ｅＩｓｒ
ａ＠ＩＥｌｅｃｔｒｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｙ　Ｌｔｄ、（ｄｉｓｔｒｌｂｕｔ＠ｄｉｎ　ｔｈ＠
Ｕ、８．ｂｙ　Ｂｒｏｏｍｅｒ　Ｒｅ＠ｅａｒｃｈ　Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　。

Ｐｌａｉｎｗ＠ｌｌ、Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ、Ｎ、Ｙ
、１１８０３　）　］等の商業的に入手可能な分光光度
針により得ることができる。

示された実施例は単に例示であシ、本発明を限定するた
めに構成されるものではない。癲業者は。

所望のように成分およびパラメータを変化させ。

置き換え、修正することができるであろう。

実施例１ 本発明に係る精製され九動物起源ウリカーゼ活性物質を
下記のように調製した。

活性度９Ｉ・Ｕ・／−の５−のクリカーゼ〔ペーリンｒ
ル・マンハイム・ＧｒｎｂＨ，ｗンハイム、西独（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ＠ｉｍ　ＧｍｂＨ，Ｍａ
ｎｎｈ＠１ｍ、Ｆ＠ｄ＠ｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ
　Ｇ＠ｒｍａｎｙ　）　）を、分子量約６０００未満の
分子を透過可能なスペクトレイパー膜〔ス（クトラム・
メディカル・イン〆ストリーズ、ロナンゾエルス、カリ
ホルニア６０９１６　（Ｓｐ＠ｃｔｒｕｍｌｖｌ＊ｄｌ
ｅａｌ　１ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌｏｇ　Ａｎｇａｌｓ
ｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎ１ｍ６０９１６　））で形成され
た透析袋に入れ友。このウリ力−セを０．５ＭｏＴＲＩ
８に対ｔ、てｐａ７．ｏ、４℃で１８時間攪拌下透析し
九。

この酵素を充分に透析する丸めに要する緩衝液の最小容
量を測定する丸めにこの研究を始めた。

ｌ−のクリカーゼを２Ｏ−１５０ｄ、１００−および１
００Ｇ−の緩衝液に対して透析した。透析し九ウリカー
ゼをすべて測定したところ、種々の容量の緩衝液で活性
度の重大な相異は見られなかつ九。結果を第１表に示す
。

第　　ｌ　　表 異なった容量の緩衝液で透析したウリカーゼの活性度か
くして、実質的に完全く精製したことによ）、２〇−程
度の緩衝液を用いてさえ妨害物質を除去することができ
ることが明らかである。

実施例２ 第２表に示された種々の緩衝液に対して透析したウリカ
ーゼを用いて２段浸漬法で細片を調製し友。

それぞれ示された緩衝液に対して透析した０、５−のウ
リカーゼ（３，ＯＩ・Ｕ・／ｓｇ）、０．５−の安定剤
（１，５ｗｉ−のＣＭＣおよび脂肪族ア羨コールの４リ
オキシエチレンエーテル０．ｓｗｅ−（ＢＲＩＪ３！Ｓ
））、０．０６−の西洋わさびペルオキシダーゼ、およ
びｏ、ｔ−（３，７ｓキー）のカッ！リング剤ＦＤＰを
すべて蒸留水中で混合することによって第１の浸漬溶液
を調製した。５．０１９の色原体ＭＢＴＨをペンゼア１
０ｘｌＫ溶解することによシ第２の浸漬溶液を調製しえ
。

２．５４　Ｘ　ｌ　Ｏ，１６国の寸法のワットｆｆ／ｉ
！１Ｔ３１Ｆｆｉ（ワットオン・インツー４レーテツド
、クリフトン、ニューシャーシー０７０１４　（Ｗｈａ
ｔｍａｎＩｎｅ、Ｃｌ１ｆｔｏｎ、Ｎ、Ｊ、０７０１４
　））を各第１の浸漬溶液で飽和含浸し、５０℃で３０
分間乾燥し、次いで第２の浸漬溶液で飽和含浸した後、
再度乾燥し、！＄、Ｉ　Ｘ　１０．２■に切断して本発
明に係る用具を作成した。

次いで、このように調製した用具を３つのグループに分
けた。これらのグループの２っｔそれぞれ６０℃で２４
時間および７２時間加温状態に置い九、第３のグループ
は加温はせず、対照とした。

次いで、これらの用具を、８２表に示された量の尿酸を
含む０．０３−に分別した血清試料をその上に置き、生
じ比色の変化を観察することＫよシ試験した。−Ｒの表
示管新しく調製し九細片で１２０秒毎に測定した。

第　　２　　表 第２表の結果は、尿酸の濃度が増加するとＳＲが漸次減
少することを示し、この関係はクペルカーモンクの弐に
よって定義されている。これは、試験した各緩衝液が、
精製され九ウリカーゼ活性物質を調製する際に有利に役
立つことを示す。

実施例３ 透析すゐ緩衝液のｐＨの変化に対する感受性を試験し良
。

第３１Ｒに示され九種々のｐＨレベルに調整、されたリ
ン酸塩緩衝液に対して透析されたウリカーゼで実施例２
のように用具を調製した。ＳＲで示され、得られたデー
タを第３表に示す。

第　　３　　表 この結果は尿駿濃変の増加につれて漸次減少する傾向を
示す、これは少なくとも約６．８〜少なくとも約７．５
のｐＨを有する緩衛液に対して透析されたウリカーゼが
尿酸の検出において高い感受性を与え九ことを示す。

ＴＲｌ８．ＰＩＰＥ８お！　びＴＥｓｍｉｌｌｉ液に対
して透析されたクリカーゼを用いて得られ九結果は、同
じｐＨ範囲に亘ってウリカーゼが安定であることを示す
。

実施例４ 第４表に示され九カップリング剤をＰＤＰの代）に用い
た以下の方法に従って用具を調製した。

ＭＢＴＨｏ、２Ｆを５０−のメタノールとｌＯ−の市０
の混合液に溶解させた。このＭＢ’ｆ’Ｈ溶液６ｍに、
０．０２　Ｆの選択されたカッグリ／ダ剤、０．５ゴの
２００Ｉｌｖ−イルオキシダーゼおよび０．１−の透析
ｔ、７’ｃウリカーゼ（６１，Ｕ、／ｓＪ）を加えて本
発明に係る組成物を含む溶液を調製し九。

このように調製された反応溶液を、そ（Ｄ　Ｏ，２ｍと
尿酸ｏ、ｏ　ｉ　ｓｇを混合すること（よって試験し九
。

５ｑチおよび１０１０１ｌ１の議変の尿酸で試験する場
合、種々のカップリング剤とＸＫＩ！察された反応を第
４表に示す。

第４表 このように第４表はクロモトロープ酸、ＭＢＤＭＡおよ
びプリマキンニリン酸塩が、本発明に係る組成物でカッ
プリング剤として用いられる場合効果的であシ、ある他
の化合物、すなわち、〕臂？−ｄ−メチルアセノベンズ
アルデヒド、ビス（４−ヒドロキシフェニル）メタンお
よびイ建ノジペンジルは効果的でないことを示す。

効果的なカップリング剤である他の化合物としては、ナ
フチルエチレンジアミン、す７チルアｉノエタノール、
ヒｙロキシテトラヒＶロペンゾキノリン、フェノチアゾ
ン、Ｈ−酸（８−アミノ−１−す７トールー６−スルホ
ン酸）、ｌ−ヒドロキシ−２−す７タレンスルホン酸、
ｌ−ヒドロキシ−３−す７タレンスルホン酸、ｌ−ア之
ノー２−ナフタレンスルホン酸および６−アセトアミノ
−１−ヒドロキシナフタレンスルホン酸が挙ケラれる。

実施例５ 尿酸含有量未知の２０の清浄な血清試料を、下記のよう
Ｔｌｃ１段浸漬法で調製さ・れた用具を用いて分析した
。この結果を、キャ胃ル、その軸着、「臨床化学」第１
７巻、１５８ページ（１９７１）ＣＣａｒｒｏｌｌ　ｅ
ｔ　ｍｌ、、Ｃｌ１ｎ１ｅａｌ　Ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　
１７：１５Ｂ（１９７１））に従った標準Ｏリンタング
ステン酸塩法によ）行なわれた試験と比較した。

ｏ、ａ　ｑ　慢の３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン（Ｍ　Ｂ　Ｔ　Ｈ）、０．１５１１Ｆ優のペ
ルオキシダーゼ、０．０７５ｆｍのプリマキンニリン酸
塩（ＦＤＰ）および１．０４１ｇのカル？キシメチルセ
ルｐ−スを含むｌＯ−の蒸留水を、本発明の製造方法に
よシ得た３、０１．Ｕ、／−の活性度を有する精製し九
動物起源クリカーゼ活性物質を含むｐＨ７の０．５Ｍの
ＴｉＬＩ８１０ｗＩｔと混合した。

２．５４　Ｘ　ｌ　Ｏ，１６ｃｘｉの寸法のワットマン
Ｆ紙を各上記溶液ｌ−で含浸し、５０℃で３０分間乾燥
し、次いで５゜Ｉ　Ｘ　１０．２■に切断して本発明に
係る用具を調製し友。この用具を、使い易くするために
拡大し友ポリスチレン支持部材に両面接着テープで固定
し九。

それぞれの用具の上にそれぞれ０．０５ｍｇの血清試料
を加え、１０秒後および５分後に再度呈色を観察するこ
とによってこれらの用具を試験した。

すべての表示は、黄緑色のフィルター〔工Ｆムンド・ナ
イエンテイフイツク・カンパニー、）臂リングトン、ニ
ューシャーシー０８００７　（ＥｄｍｕｎｄＳｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　、Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｎｅｗ
　Ｊ＠ｒｓｓｙ　０８００７）　）を用いたエームス分
光光度計（ムＲＭ）（工−ムス・カンノ臂ニー、デイビ
ジョンーオ！・マイルス・ラーラトリーズーインコーー
レーテツド、エルクハート、ベンゾアナ４６５１４　（
、＾ａｓｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ　。

Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ　Ｉｎｅ、、Ｅｌｋｈａｒｔ。

Ｉｎｄｉａｎａ　４６５１４））によ）得た。標準のリ
ンタングステン酸法によって各試料を試験し九結果と比
較する際に、手製の用具の応答変化を最小にするために
、５分と１０秒の表示の間ＯＡＲＭ単位の差（Δ）を用
い騰、各試料の結果を第５表に示す。

第　　　５　　　表 ＡＲＭ単位の表示は存在する尿酸の濃度ＩＩｆ−と直線
関係で変化する。得られた結果は、記載され九試験が文
献の分析法に関係し、尿酸レベルの相異に非常に感受性
があることを示した。この感受性は尿酸濃度がわずかに
変化し九試料間で表示が明確に増加することによシ明ら
かである。

実施例６ 以下のように２段浸漬法の種々の組成に従って、尿酸試
験用具を調製した。

透析した０、５−のウリカーゼ活性物質（１，３１，Ｕ
。

／ｖｔ）、０．１−のＰＤＰ（３，７５Ｗ　ＩＧ　’）
よ）得られた水溶液、０．０６−のベルオキシダーゼ（
１，５岬チ）および０．５＋４（１，５１１ｆ９６のＣ
ＭＣとｏ、ｓ　＋ｗ優０ＢＲＩＪ）を混合してｆｓｌの
浸漬溶液を調製した。

ワットマンｐ紙を上記第１の浸漬溶液で飽和含浸し、６
０℃で１０分間乾燥した。このｐ紙を０．０５η係のＭ
ＢＴＩ（を含む１０−のベンゼン溶液で飽和含浸し、６
０℃で１０１分間乾燥した後５．ｌ×１０．２簡に切断
して本発明に係る用具を作成した。この用具に２．４，
６，８．ｌＯ＋＋ｗ−の濃度の尿酸を含む試料０．０３
−を加え、１２０秒後の反射率を観察することＫよ）こ
の用具を試験した。　３９．３　。

３４．７　、２９．４　、２６．９オＪ：び２５．８１
ＧＲＯ表示を得え。

これらの表示が以前述べたクペルヵーモンクの弐により
定義された逆の関係であり、尿酸の濃度変化に対して良
好な感受性を示すことを確認する。

ＰＤＰ３．７５ＷＩＫ代えて、１．０　、２．０および
５．０ｑ％の濃度のＰＤＰを用いた以外は上述の方法に
従って用具を調製し九。このように調製された用具を上
記のように試験した。１２０秒毎に観察し九憾Ｂの表示
よ）、この用具に用いたカップリング剤ＰＤＰの濃度が
相異する結果として観察した感受性の重大な変化はなか
った。

同様にり、６１１２１Ｇ　Ｏ安定剤ＣＭＣｔ−０，５オ
よび２．４ｑｌＤＩＩｆ：とし九以外祉上述のように用
具を調製し九、このように調製した用具を上述のように
試験し、高度な感受性を有する尿酸を検出するためＫｍ
察した。

０．０５ｑ−の色原体ＭＢＴＨＫ代えて０．０１　。

０．１０および０．２０　ｍｙ　９Ｇの濃度とした以外
は上述のように用具を作成した。このように作成し九用
具を上述のように試験したとζろ尿酸濃度に対して顕著
な感受性を同様に示した。

１．５〜憾のベルオキシダーゼのＩｆ度ｔ−０，５゜１
．０　、５．０および２０ｓｖｌとした以外は上述のよ
うに用具を作成した。この用具を上述のように試験した
ところ１．５１１１Ｆ　ｍの濃度の（ルオキシ〆−ゼを
有する用具と同じ感受性で尿酸濃度を識別した。

１．３１．Ｕ、／’−の活性度を有するウリカーゼ活性
物質に代えて０．８および１．８１．Ｕ、／−の４のを
用いた以外は上記のように用具を作成した。この用具を
試験したところ、種々の活性度のペルオキシダーゼを用
いた結果として、尿酸検出の感受性に重大な変化は認め
られなかった。

本発明はある程度特定して記載され九が、この記載は実
施例によってのみなされたものであ）、本発明の精神お
よび範囲から逸脱することなく多くの変化がなされるこ
とは理解されよう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１約６０００未満の分子量を有する成分を分別によ
   って動物起源ウリカーゼから除去することを特徴とする
   試料中の尿酸測定に用いる約６０００未満の分子量を有
   するｐＨ感受性の妨害物質を含まない精製された動物起
   源ウリカーゼ活性物質の製造方法。 （２）　　前記分別操作が透析により達成される９％許
   請求の範囲第１項記載の製造方法。 （３）前記透析操作が低金属結合定数を有する緩ｗｍに
   対して行なわれる特許請求の範囲第２項記載４りＩＩ造
   方法。