JPS589697A - 試料中の尿酸測定用用具の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に臨床試験の公野に関する。さらに評しく
は、液体試料中の尿酸を測定するための測定用用具の製
造方法に関する。

哺乳動物の代射においては、摂取された核蛋白質がプリ
ンおよびピリミジンに内因的に一定に変化する。このプ
リンは異化作用過程によりさらに脱アミノ化および部分
酸化されて尿酸になり、これは通常人体では尿中に排泄
される。

従つて、どく少量の濃度の尿酸が人間の血液および尿中
に常に存在する。

プリンを含有する食物を摂取しても、濃度が上昇するよ
うな腎臓の機能低下の場合を除いて、血清中の尿酸含有
量に影響を与えない。プリンを含有する食物の摂取に関
係しないある他の病的状態、例えば尿毒症または痛風で
は、血清中の尿酸の量の異常な増加が見られる。また、
血清中の尿酸は白血病および肺炎等の白血球核の過剰な
破壊に関係する状態で上昇する。

血清中の尿酸の試験は前述の状態を診断し、いくつかの
場合には、非常に関係の深い異常な状態、例えば肺炎と
関節炎を区別する助けとして役に立つと認識されている
。肺炎は血清中の尿酸の異常な増加により特徴づけられ
るが、関節炎はそのような増加を示さない。それゆえ、
血清中の尿酸濃度を正確に特定して測定する簡単かつ経
済的な試験用用具を提供することが望まれる。

尿酸は正常時には、血清１００ｍｌ当り約０．７〜約６
．０ｍｇ（通常ｍｇ％として報告されている）の量で血
清中に見られる。上述した異常な状態では、血清中の尿
酸含量は１０Ｍ９％またはそれ以上の値にしばしば達す
る。

従来技術は血清中の尿酸を測定するための多くの方法を
開示している。より広範に用いられている方法のなかに
は血液のろ液を利用する発色法がある。これらの方法の
いくつかは血液のろ液からの尿酸の析出（例えば銀塩と
して）およびリンタングステン酸塩または砒タングステ
ン酸塩との反応による色原体付加物の生成に依存する。

血液ろ液を利用する他の方法は、尿酸一度の定量的評価
のための従来の技術を用いて測定される色を生じさせる
ためにシアン化尿素溶液の存在下、ろ液をタングステン
酸で直接処理することに依存する。

極く最近では、尿酸のアラントインと過酸化水素への触
媒酸化を包含する方法が提案されている。この酸化は大
気中の酸素の存在下で通常行なわれ、かつウリカーゼ活
性を有する物質を利用する。この反応はｐＨ９またはそ
の付近で起こる。このような方法では、尿酸がアラント
インと過酸化水素に転換する間に尿酸の特徴的スペクト
ルの消滅を測定するために、分光光度針を用いることが
できる。もう１つの方法は尿酸のこのような分解時に生
成した化学量論量の過酸化水素を測定するために比色手
段を利用しており、例えば、アルバウム（Ａｌｈａａｍ
）特許番号票３．３４９，００６号およびワヒテル（Ｗ
ａｃｈｔｅｒ）特許番号票３．３３５，０６９号（いず
れも本出願人に譲渡されている）に記載されている。

酵素転換試験において、生成する過酸化水素が血清中に
存在する尿酸の置に比例する場合、過酸化水素は、過階
化活性を有する物質の存在下で呈色する物質の酸化によ
り生じた色の変化によつて測定される。この反応は酸性
ｐＨで起る。

ナトリウムアジドまたはシアン化ナトリウム等のカタラ
ーゼ防止剤は過酸化物のカタラーゼ分解を防止すること
を通常要求されている。次いで得られた色を目で標準と
比較するかまたは、電気的に測定して試験する流体中に
存在する尿酸の定量的評価が得られる。

仏国特許７２／３１５５７号は基本的に異なる酵素触媒
反応を開示しており、そこではアルデヒドを含まないメ
タノールおよびカタラーゼをウリカーゼと共に試料（ｐ
Ｈ８に緩衝）に添加し、３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾン（ｐＨ３に緩衝）および塩酸に溶解し
た塩化第二鉄を添加すると青部に呈色することが開示さ
れている。

カーノー（Ｋａｎｏ）特許番号票３．８６２．８８５号
は、微生物起源ウリカーゼおよびカタラーゼ防止剤（ｐ
Ｈ５，５〜７、０に緩衝）により過酸化水素を発生させ
、陰イオン界面活性剤、色原体およびペルオキ−シダー
ゼ（ｐＨ４，０〜７．０）の存在下発生した過酸化物を
測定することによる尿酸の測定方法を開示している。

ゴツホマン（Ｇｏｃｈｍａｎ）とシユミツト（Ｓｃｈ−
ｍｌｔｘ）は、［クリニカル・ケミストリー」（Ｃｌ１
ｎ、Ｃｈｅｍ）第１１巻、１１５４ページ（１９７１）
において、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾン・塩酸塩をＮ、Ｎジメチルアニリンと共に用いてア
ゾ色素指示薬を形成させる尿酸の自動測定法を報告して
いる。

この分野においてこれまでの研究者の貢献にもかかわら
ず、これらの方法は、液相で通常行なう一連の別々の操
作を要するという欠点を持つていた。動物ウリカーゼお
よびペルオキシダーゼを同時に用いる組合せの反応は、
尿酸と色原体が競合するため、すなわち両者がペルオキ
シダーゼの存在下で過酸化水素により酸化されるためと
用いる２つの酵素の最適ｐＨが著るしく異なるために不
可能と考えられていた。両反応を同じｐＨまたは非常に
近いｐＨで行なう従来技術のシステムでは、最高の効率
特性を示す動物起源ウリカーゼ等の使用可能なある反応
成分は、この反応に要求されるｐＨ範囲内でペルオキシ
ダーゼ生成系の成分として機能しないためにここでは用
いることができないという欠点がある。

このように安定化された統一的な試薬試験には不可能で
あつた。

本発明の第１の目的は、多数の試料を試験するために特
に有用な型の尿拳測定用用具の製造方法を提供すること
である。

本発明の第２の目的は長時間に亘つて安定な単一作用尿
酸試験用用具の製造方法を提供することである。

本発明の第３の目的はｐＨ感受性の妨害物質を含有しな
い新規な精製された動物起源ウリカーゼ活性物質を包含
させることにより上述の利点が達成される尿酸測定のた
めの試験用用具の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的および充分な理解が以下の記載および
好ましい実施態様に向けられた特許請求の範囲を参照す
ることによつて選られるであろう。

本発明に従えば、精製されたウリカーゼをその中に用い
た試験用具の製造方法が提供される。

さらに詳しくは、動物起源ウリカーゼを浸透して６００
０未満の分子量の成分を除夫する工程、このように透析
したウリカーゼに、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノ
ンヒドラゾン、３−エチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾン、３一プロピル−２−ベンゾチアゾリノンヒド
ラゾンまたは３−ブチル−２−ベンゾチアゾリノンヒド
ラゾンと、プリマキン二リン階塩、クロモトロープ酸お
よび４．４′−メチレンビス（Ｎ。

Ｎ−ジメチルアニリン）からなる群より選ばれるカツプ
リング剤と、過酸化性活性物質とを組合わせたものを含
有する組成物を調製する工程、およびこのように調整し
た組成物を担体マトリツクスに包含させる工程よりなる
ことを特徴とする試料中の尿酸測定用用具の製造方法が
提供される。

上記製造工程において使用されるウリカーゼは、標準的
な動物起源ウリカーゼ製品を分別して低分子量の妨害物
質を除くことにより精製され、以前は達成されなかつた
ｐＨ範囲に亘つて安定であり、統一的な試験を可能にす
る。

上述の組成物の成分である精製された動物起源ウリカー
ゼ活性物質は、例えばインヂアナ４６５１４、エルクハ
ートのマイルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテツ
ドのマイルス・リサーチ・プロダクツ（ＭｉｌｅｓＲｅ
５ｅａｒｃｈＰｒｏ−ｄｕｃｔｓ、ＭｉｌｅｓＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、、Ｅｌｋｈａｒｔ。

Ｉｎｄｉａｎｓ４６５１４）より商業的に入手可能な動
物ウリカーゼ製品を分別精製することにより調整される
。ｐＨの変化に感受性があり、約６０００未満の比較的
定分子量の妨害物質が除去される。

驚くべきことに、この一見簡単な精製方法によつて生成
されたウリカーゼ活性物質は、約６．８〜約７．５のｐ
Ｈ範囲に亘つて安定であり、かくして、単一の反応のパ
ラメーターの下で機能する多くの反応系を有する統一さ
れた酸素触媒尿酸試験組成物の調整を可能にする。

動物ウリカーゼは鋼蛋白（複合金属蛋白）であり、Ｃｕ
”＋は酵素の触媒位置の一部であると信じられている。

活性位置の鋼を含す部分の構造は以下に図式的に示され
ている。すなわち、酵素の鋼蛋白の性質は、Ｃｕイオン
の瞬間的な還元とＣｕイオンの錯体形成を可能にする種
々の試薬によつて酵素が急速であるが可逆的に抑制され
るようにする。それゆえウリカーゼは低い金属結合定数
を有する緩衝液に対して透析することにより精製するこ
とが好ましい。

好ましい実施態様においては、トリス（ヒドロキシメチ
ル）−アミノメタン（ＴＲＩ８）、ピペラジン−Ｎ、Ｎ
’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥ８）、Ｎ
−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエ
タンスルホン酸（ＴＥ８）およびリン酸塩緩衝液等の低
い金属結合定数を有する緩衝液を含んでいる溶液に対し
て酵素を透析する。

尿酸をウリカーゼによつて約ｐＨ７でアラントインと過
酸化水素に酵素的に酸化する。緩衝液またはｐＨにかか
わらず、本来の酵素反応の化学量論は式〔■〕： により与えられる。すなわち尿酸塩のモノアニオンから
酸素への電子対の伝達により不安定な酸中間体（１−カ
ルボキシ−２，４，６，８−テトラアザビシクロ［３，
３，０］−オクタ−４−エン−３．７−ジオンおよび過
酸化水素が得られる。

この中間体生成物は尿酸より強い酸（より低いｐＫ）で
あり（尿酸塩のｐＫ＝ａ’ｙｓに対して尿酸ｐＫ−ｔｓ
、尿酸塩のＰＫｓ”１０．３に対して尿酸ｐＫ１ｍｌＬ
５）、鋼（Ｃｕ）およびコバルト（Ｃｅ２＋）と金属中
レートを形成させることにより安定化する仁とができる
。ｐＨ７，０で極度に精製された酵素の存在下では、ア
ラントイン、過酸化水素および二酸化炭素の化学量論量
が生成される。次いで過酸化水素がペルオキシダーゼの
存在下で色原体と反応して赤い錯体を与える。

この試験の全般的化学反応は以下のようである。

この系では、尿酸および色原体との間の競合の難点およ
び酵素の最適ｐＨの極度の相異の難点が強い還元剤、ヒ
ドラゾンおよび非常に感受性があり、さらにウリカーゼ
の活性物質として働くカツプリング剤を用いることによ
つてさらに克服される。例えば３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）およびプリマキン
二リン酸塩（ＦＤＰ）を用いる色原体反応が以下のよう
に図式Ａに図式的に表わされている。

特定のことばが明確にするために以下の記載に用いられ
ているが、これらのことばは代表的な説明のために選ば
れた本発明の特別の実施態様のみを言及しようとするも
のであり、本発明の範囲を限定あるいは制限しようとす
るものではない。

市販のウリカーゼ製品は、好ましい実施態様において、
そのウリカーゼ製品を分別して約６０００未満の分子量
を有する分子を除く仁とを特徴とする透析方法によつて
精製される。

ヒドラゾンはヒドラジンとアルデヒドまたはケトンとの
縮合生成物であり、Ｃ＝ＮＮＨ，基を含有する。多くの
ヒドラゾンはある芳香族アミンまたはヒドロキシナフタ
レンスルホン酸塩と酸化的にカツプリングして！Ｉｉ物
質を形成する。

このヒドラシンとしては、とりわけ、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、２−ヒドラジノベンゾ
チアゾール、Ｎ−メチル−ピリドン−４−ヒドラゾン、
Ｎ−メチル−ピリドン−２−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−
キノリノン−２−ヒドラゾン、メチル−キノリノン−４
−ヒドラゾン、Ｎ−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾン、Ｎ−メチルーチアゾリニノンー２−ヒドラゾ
ン、Ｎ−メチル−４−フエニルチアゾリノン−２−ヒド
ラゾン、Ｎ−メチルーオキサゾリノン−２−ヒドラゾン
、Ｎ−メチル−ベンズオキサゾリジン−２−ヒドラゾン
および１．３−ジメチルベンズイミダゾリノン−２−ヒ
ドラゾンが挙げられる。

組成物の好ましい実施態様では、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等の３−（Ｃ１
〜Ｃ４アルキル）−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
・色原体が色原体として用いられる。このようなヒドラ
ゾンは強い還元剤である。このヒドラゾンは約０．ｏｓ
ｗｇｓから約０．２ｍＦ−の濃度でベンゼン溶液中で用
いられる。

色原体ヒドラゾンと組合わせて用いることができるカツ
プリング剤の代表例は下記の通りである。

（式中、Ｘは炭素原子、窒素原子またはイオウ原子を表
わし、凡、は水素原子、水酸基、アミノ基、アルキレン
ジアミン基またはアミノアルカノール基を表わすかまた
はＲ１が水素原子の場合にＲと一緒になつてＮＨＣＨ，
ＣＨＯＨＣＨとなるものを表わし、ＲおよびＲは同一ま
たは異なつていてもよく、水素原子または亜硫酸基を表
わし、Ｒ４は水素原子、水酸基、ＮＨＣ’Ｈ（ＣＩ、）
ＣＨ。

ＣＨ，ＯＨ，ＮＨ，、または亜硫酸基を表わし、Ｒは水
素原子、亜硫酸基型たはアセドアミノ基を表わし、Ｒ６
は水素原子またはメトキシ基を表わし、Ｒ７は水素原子
、水酸基またはアミノ基を表わす。）を有する化合物お
よびそのリン酸塩等の酸付加塩 （２）一般式：Ｒ−ＯＨ，−Ｒ（式中、それぞれｏＲは
ジメチルアニリン、ヒドロキシフエニル、ベンゾチアゾ
ールまたはベンゾフエノンを表わす。）を有する化合物 （３）チアミンまたはその酸付加塩 （４）メチルフエニルプロパンジアミン（５）フエノチ
アジン 好ましいカツプリング剤としては、ブリマキン二リン酸
塩（ＦＤＰ）、クロモトロープ酸および４．４’−メチ
レンビス（Ｎ、Ｎ’−ジメチルアニリン）（ＭＢＤＭＡ
）が挙げられる。カツプリング剤は約１．０ｍｇ〜約５
．０ｍｇ％の水溶液で用いられる。

この組成物はさらに有利に選択された安定剤、カルボキ
シメチルセルロース（ＣＭＣ）および脂肪族アルコール
のポリオキシエチレンエーテル（ＢＲＩＪ：登録商標、
アイシーアイ・ユナイテツド・ステイツ・インコーポレ
ーテツド、ウイルミングトン、デラウエア１９８９７（
ＩＣＩＵｎｉｔｅｄ５ｔａｔｅｓＩｎｃ、、ＷＮｍｉｎ
ｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ１９８９７）社製〕を含む
ことができる。これらは総濃度約０．５■％〜約５．０
ｍｇ％で水溶液中に存在する。

本発明に従つた組成物を含んでいる溶液は、尿等の体液
試料に添加することｋよつて尿酸を検出するために用い
る仁とができる。結果として色の変化を伴なう発色錯体
が形成される。しかしながら、この組成物は溶液として
よりもむしろ固体製品の形で、また好ましくは使い易さ
と信頼性のために設計された用具でより有利に用いられ
る。

本発明の特徴として、不活性担体およびその不活性担体
に包含される上述の実施例で説明されるような本発明に
従つた組成物よりなる用具が作成される。この不活性担
体は吸収性または非吸収性の担体マトリツクスの形を採
ることができるかまたは錠剤または他の通常の形を採る
ことができる。

この担体マトリツクスということばは生理的液体または
他の液体と接触される場合、不溶性であり、その構造全
体を維持する吸収性または非吸収性のマトリツクスのこ
とをいう。

用いることができる好適な吸収性マトリツクスとしては
、紙、セルロース、木、合成樹脂フリース、ガラス繊維
、不織布および織布等が拳げられる。非吸収性マトリツ
クスとしてはポリプロピレンのような有機プラスチツク
材料が挙げられる。使い易くするために、そのマトリツ
クスをポリスチレン製の支持部材のような非溶解性支持
部材と組合わせることができる。

また、この不活性担体は崩壊剤、充填剤および潤滑剤の
ような通常の担体材料を含んでいる圧縮成形または型成
形した錠剤の形にすることができる。

本発明により得られる試験用具は実施例に示されている
ように高度な安定性を示す。この安定性は基質上にある
組成物の成分を分離し、最終製品を箔、乾燥剤を含んで
いる容器等に装填することによりさらに改良することが
できる。

印刷、１またはそれ以上の成分のカプセル包装、異なつ
た成分に対して別々のマトリツクスまたは基質の使用、
基質の両側へ共存できない成分の配置などによつて成分
を物理的に分離することができる。

さらに本発明の特徴として、不活性担体を本発明に係る
組成物で含浸、プリントまたは他の方法で接触すること
よりなる尿酸試験用具を調製する方法も提供される。担
体が液状の組成物で含浸される場合には、担体は次いで
乾燥工程を受ける。本発明により得られる尿酸測定用用
具と試料を接触させ、色のある変化を観察することによ
つてこの試料を試験することができる。

吸収性担体マトリツクスを有する型の用具を用いる場合
には、この試料をマトリツクスに入れてその上の色の変
化を観察する。視覚による比較に加えて、生じたある色
の変化を測定するために種々の器具を用いる方法によ知
行なうことができ、このようにして人間の目による主観
的な色の測定を不要にすることにより試験の精度を向上
させる。

酵素製品の活性は乾燥重量ｍｇ当りの活性単位数によつ
て測定される。国際生化学連合の酵素委員金（ＴｈｅＣ
ｏｎｎｒｉｓｓｉｏｎｏｎＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＩ
ａｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）は酵素活性の国際単位（Ｉ，Ｕ、）をｐ
Ｈおよび温度を制御した特定の条件下の毎分当りの利用
される１ｕｍｏｌの基質と定義した。

実施例に示された反射率（％Ｒ）と吸収種（尿酸）の濃
度との関係は、コルツミ、ジー・著「反射分光学」、ス
プリンゲルーフエアラーク・ニユーヨーク・インコーポ
レーデツト発行（１９８ｍ）（ＫｏｒｔＴｈｌｏ、、Ｒ
ｅｆｌｅｃｔａａｃｅ８ｐｅｃｔ−ｒｏｍｃｏｐｙ、８
ｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇＮｅｗＹｏｒｋＩｎｃ、。

１９６９、）で反射分光学の詳細な論議と共に与えられ
ているクペルカーモンクの式（Ｋｕｂｅｌｋａ−Ｍｏａ
ｋｅｑｕａｔｉｏｎ）によつて得られる。クペルカーモ
ンクの式によつて定義された関係においては−Ｂ値は検
出された尿酸の濃度が増加すると減少し、逆に減少する
と増加する。かくしてその式に従えば得られた表示は検
出される尿酸や濃度と反比例の関係にある。すべての表
示は他に指示がなければ５３０ａｍで得た。

反射率の表示はカリホルニア９２６３４、ヒユラートン
ベツクマン・インストルメンツ・インコーポレーテツド
製ペツクマンＤＫ−２スペクトロフオトメーター（Ｂｅ
ｃｋｍａｎＤＫ−２８ｐｅｃｔｒｏｐｈ−ｏｔｏｍｅｔ
ｅｒ、ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ
、、Ｆｕｌｌ−ｃｒｔｏｎ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ９２
６３４）またはイスラエル・エレクトロ−オプテイカル
・インダストリー・リミテツド製スペクトロカラリメー
ター８ＣＦ−１（米国においてブルマー・リサーチ・コ
ーポレーシヨン、ブレインウエル、ロングアイランド、
ニユーヨーク１１８０３より市販）（８ｐｅｃｔｒｏｃ
ｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ８ＣＦ−１、ｌ５ｒａｅｌＥｌｅ
ｃｔｒ。

−０ｐｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＬｔｄ、（ｄｉｓｔ
ｒｉｂｕｔｅｄ１ｎｔｈｅＵ、８．ｂｙＢｒｏｏｍｅｒ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

Ｐｌａｉｎｗｅｌｌ、Ｌｏｎｇｌ５ｌａｎｄ、Ｎ、Ｙ、
１１８０３））等の商業的に入手可能な分光光度針によ
り得ることができる。

示された実施例は単に例示であり、本発明を限定するた
めに構成されるものではない。当業者は、所望のように
成分およびパラメータを変化させ、置き換え、修正する
ことができるであろう。

実施例１ 本発明に係る精製された動物起源ウリカーゼ活性物質を
下記のように調製した。

活性度９１．Ｕ、／ｍｌの５ｍｌのウリカーゼ〔べ−リ
ンゲル・マンハイム・ＧｍｂＨ，マン八イム、西独（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ，Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ。

ＦｅｄｅｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＧｅｒｍａｎｙ）
’）を、分子量約６０００未満の分子を透過可能なスペ
クトレイパー膜ｃスペクＦラム・メディカル・インダス
トリーズ、ロサンジエルス、カリホルニア６０９１６（
８ｐｅｃｔｒｓｎｎＭｅｄｉｃａｌＩｎｄｕｉｔｒｉｅ
ｓ。

ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、Ｃａｌ目ｏｒｎｉａ６０９１６
））で形成゛された透析袋に入れた。このウリカーゼを
０．５ＭのＴＲｌ８に対して−ｚＯ１４Ｃで１８時間攪
拌下透析した。

この酵素を充分に透析するために要する緩衝液の最小容
量を測定するためにこの研究を始めた。ｌｍｌのウリカ
ーゼを２０ｍｌ５０ｍｌ、１００ｍｌおよび１０００ｍ
ｌの緩衝液に対して透析した。

透析したウリカーゼをすべて測定したところ、種々の容
量の緩衝液で活性度の重大な相異葉は見られなかつた。

結果を第１表に示す。

かくして、実質的に完全に精製したことにより、２０ｍ
ｌ程度の緩衝液を用いてさえ妨害物質を除去することが
できることが明らかである。

実施例２ 第２表に示された種々の緩衝液に対して透析したウリカ
ーゼを用いて２段階侵漬法で細片を調製した。

それぞれ示された。緩衝液に対して透析した０．５ｍｌ
のウリカーゼ（３．０Ｉ、Ｕ、／ｍｌ）、０．５ｍｌの
安定剤［１５ｍｇ％のＣＭＣｌおよび脂肪族アルコール
のポリオキシエチレンエーテル０．８１１％（ＢＲＩＪ
３５）］、０．０６−の西洋わさび４ペルオキシダーゼ
、および０．ｘｍ（λ７．５．、ＷＱ襲）のカツプリン
グ剤ＦＤＰをすべて蒸留水中で混合することによつて第
１の浸漬溶液を調製した。５，０ｍｇの色原体ＭＢＴＨ
をベンゼン１０ｍｌに溶解することにより第２の浸漬溶
液を調製した。

２．５４×１０．１６ｃｍの寸法のワツトマンＥＴ３１
ろ紙〔ワツトマン・インコーポレーテツド、クリフトン
、ニユージヤージー０７０１４（Ｗｈａｔ−ｍａｎＩｎ
ｃ、Ｃ１１ｆｔｏｎ、Ｎ、Ｊ、０７０１４））を、各第
１の浸漬溶液で飽和含浸し、５０Ｃで３０分間乾燥し、
次いで第２の浸漬溶液で飽和含浸した後、再度乾燥し、
＆ＩＸ１ａ２ｍに切断して本発明の用具を作成した。

次いで、このように調製した用具を３つのグループに分
けた。これらのグループの２つをそれぞれ６０Ｃで２４
時間および７２時間加温状態に置いた。第３のグループ
は加温はせず、対照とした。

次いで、これらの用具を、第２表に示された置の尿酸を
含む０．０３ｍｌに分別した血清試料をその上に置き、
生じた色の変化を観察することにより試験した。ＳＲの
表示を新しく調製した細片で１２０秒毎に測定した。

第２表の結果は、尿酸の濃度が増加すると≦Ｒが漸次減
少することを示し、この関係はクベルカーモンクの式に
よつて定義されている。これは、試験した各緩衝液が、
精製されたウリカーゼ活性物質を調製する際に有利に役
立つことを示す。

実施例３ 透析する緩衝液のｐＨの変化に対する感受性を試験した
。

第３表に示された種々のｐＨレベルに調整されたリン酸
塩緩衝液に対して透析されたウリカーゼで実施例２のよ
うに用具を調製した。ＳＲで示され、得られたデータを
第３表に示す。

この結果は尿酸濃度の増加につれて漸次減少する傾向を
示す。これは少なくとも約６．８〜少なくとも約７５の
ｐＨを有する緩衝液に対して透析されたウリカーゼが尿
酸の検出において高い感受性を与えたことを示す。

ＴＲｌＳ、ＰＩＰＥ８およびＴＥＳ緩衝液に対して透析
されたウリカーゼを用いて得られた結果は、同じｐＨ範
囲に亘つてウリカーゼが安定であることを示す。

実施例４ 第４表に示されたカツプリング剤をＰＤＰの代りに用い
た以下の方法に従つて用具を調製した。

ＭＢＴＨ０．２Ｆを５０ｍｌのメタノールと１０ｍｌの
Ｈ，Ｏの混合液に溶解させた。このＭＢＴＨ溶液６ｍｌ
に、ａ０２Ｆの選択されたカツプリング剤、０．５ｄの
２００８１％ペルオキシダーゼおよび０．１ｄの透析し
たウリカーゼ（５１，０，７Ｍ）。

を加えて本発明に係る組成物を含む溶液を調製した。

このように調整された反応溶液を、その０．２ｍｌと尿
酸０．０１ｍｌを混合することによつて試験した。５ｍ
ｇ％および１０ｍｇ％の濃度の尿酸で試験する場合、種
々のカツプリング剤と共に観察された反応を第４表に示
す。

このように第４表はクロモトロープ酸、ＭＢＤＭＡおよ
びプリマキン二リン酸塩が、本発明に係る組成物でカツ
プリング剤として用いられる場合効果的であり、ある他
の化合物、すなわち、パラーｄ−メチルアミノベンズア
ルデヒド、ビス（４−ヒドロキシフエニル）メタンおよ
びイミノジベンジルは効果的でないことを示す。

効果的なカツプリング剤である他の化合物としては、ナ
フチルエチレンジアミン、ナフチルアミノエタノール、
ヒドロキシテトラヒドロベンゾキノリン、フエノチアジ
ン、Ｈ−酸（８−アミノ−１−ナフトールー６−スルホ
ン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホン酸、１
−ヒドロキシ−３−ナフタレンスルホン酸、１−アミノ
−２−ナフタレンスルホン酸および６−アセトアミノ−
１−ヒドロキシナフタレンスルホン酸が挙げられる。

実施例５ 尿酸含有量未知の２０の清浄な血清試料を、下記のよう
に１段浸漬法で調製された用具を用いて分析した。この
結果を、キヤロル、その他着、「臨床化学」第１７巻、
１５８ページ（１９７１）（Ｃａｒｒｏｌｌｅｔａｌ、
、Ｃｌ１ｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ１７：１５８
（１９７１））に従つた標準のリンタングステン酸塩法
により行なわれた試験と比較した。

０．３８！１％の３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、０．１５ｍＩｇ％のペルオキ
シダーゼ、０．Ｏ７５Ｍｇ％のプリマキン二リン酸塩（
ＦＤＰ）およびＬＯＱ％のカルボキシメチルセルロース
を含む１０ｍの蒸留水を、本発明に係る＆Ｏ１，Ｕ、／
Ｍの活性度を有する精製した動物起源ウリカーゼ活性物
質を含むｐＨ７の０．５ＭのＴＲｌ８１０ｍｌと混合し
た。

２５４×１０１６ｃｍの寸法のワツトマンＦ紙を各上記
溶液１ｍｌで含浸し、５０Ｃで３０分間乾燥し、次いで
５．ｌ×１０、２ｍｍに切断して本発明に係る用具を調
製した。この用具を、使い易くするために拡大したポリ
スチレン支持部材に両面接着テープで固定した。

それぞれの用具の上にそれぞれ００５ｍｌの血清試料を
加え、１０秒後および５分後に再度呈色を観察すること
によつてこれらの用具を試験した。すぺでの表示は、黄
緑色のフイルター〔エドムンド・サイエンテイフイツク
・カンパニー、パリングトン。ニユージヤージー０８０
０７（Ｅｄｍｕｎｄ８ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ、、Ｂａ
ｒｒｉｍｇｔｏｎ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ０８００７））
を用いたエームス分光光度計（ムＲＭ）（工−ムス・カ
ンパニー、デイビジヨン・オブ・マイルス・ラボラトリ
ーズ・イン個ーポレーテツド、エルタハート、ベンジア
ナ４６Ｓ１４（ＡｍｅｎＣｏｍｐａｎｙ、Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎｏｆＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、
、Ｅｌｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ４６５１４））によ
り得た。標準のリンタングステン酸法によつて各試料を
試験した結果と比較する際に、手製の用具の応答変化を
最小にするために、５分と１０秒の表示の間のＡＲＭ単
位の差（Δ）を用いた。各試料の結果を第５表に示す。

ＡＲＭ単位の表示は存在する尿酸の濃度Ｍｇ１ｇと直線
間係で変化する。得られた結果は、記載された。試験が
文献の分析法に関係し、尿酸レベルの相異に非常に感受
性があることを示した。

この感受性は尿酸濃度がわすかに変化した試料間で表示
が明確に増加することより明らかである。

実施例６ 以下のように２段浸漬法の種々の組成に従つて、尿酸試
験廟具を調製した。

透析した０．５ｍｌのウリカーゼ活性物質（Ｌ３１、Ｕ
、／ｍｌ）、０１ｍｌのＰＤＰ（３．７５ｍｇ％）より
得られた水溶液、００６ｍｌのペルオキシダーゼ（１５
ａＦ％）および０．５ｍｌ（１．５ｍｇ５のＣＭＣと０
．８ｍｇ％のＢＲＩＪ）を混合して第ｌの侵漬溶液を調
製した。

ワツトマンろ紙を上記第１の浸漬溶液で飽和含浸し、６
０℃で１０分間乾燥した。このろ紙を０．０５ｍｇ％の
ＭＢＴＨを含む１０ｍｌのベンセン溶液で飽和含浸し、
６０Ｃで１０分間乾燥した後１５×１０．２ｍｓに切断
した本発明に係る用具を作成した。この用具に２．４．
６，８゜１０ｍｇ％の濃度の尿酸を含む試料Ｑ、９３ｍ
を加え、１２０秒後の反射率を観察することによりこの
用具を試験した。３９．３、３４．７、２９．４、２６
．９および２５８％Ｒの表示を得た。

これらの表示が以前述べたクペルカ−モンクの式により
定義された逆の関係であり、尿酸の濃度変化に対して良
好な感受性を示すことを確認する。

ＦＤＰ３７５Ｎｇ憾に代えて、ｔ、ｏ、２．、ｏおよび
１０Ｍ９％の濃度のＰＤＰを用いた以外は上述の方法に
従つて用具を調製した。このように調製された用具を上
記のように試験した。１２０秒毎に観察した％Ｒの表示
より、この用具に用いたカツプリング剤ＰＤＰの濃度が
相異する結果として観察した感受性の重大な変化はなか
つた。

同様に１．５ｍｇ５の安定剤ＣＭＣを０．５および２．
４ｍｇ％の濃度とした以外は上述のように用具を調製し
た。このように調製した用具を上述のように試験し、高
度な感受性査有する尿酸を検出するために観察した。

０．０５ｍｇ％の色原体ＭＢＴＨに代えて０．０１、０
．１０および０．２０ｍｇの濃度とした以外は上述のよ
うに、用具を作成した。このように作成した用具を上述
のように試験したところ尿酸濃度に対して一着な感受性
を同様に示した。

１．５ｍｇ％のペルオキシダーゼの濃度を０．５、１０
、５．０および２０ｍｇ％とした以外は上述のように用
具を作成した。この用具を上述のように試験したところ
１５１１Ｐ％の濃度のペルオキシダーゼを有する用具と
同じ感受性で尿酸濃度を識別した。１．３１．Ｕ、／ｍ
ｌの活性度を有するウリ力ーゼ活性物質に代えて０．８
および１．８１．Ｕ、／ｍｌのものを用いた以外は上記
のように用具を作成した。この用具を試験したところ、
種々の活性度のペルオキシダーゼを用いた結果として、
尿酸検出の感受性に重大な変化は認められなかつた。

本発明はある程度特定して記載されたが、この記載は実
施例によつてのみなされたものであり、本発明の精神お
よび範囲から逸脱することなく多くの変化がなされるこ
とは理解されよう。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）動物起源ウリカーゼを透析して６０００未満の分
   子量の成分を除去する工程、このように透析したウリカ
   ーゼに、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾ
   ン、３−エチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン、
   ３−プロピル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンまた
   は３−ブチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと、
   ブリマキン二リン酸塩、クロモトロープ酸および４．４
   ′−メチレンビス（Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン）からな
   る群より選ばれるカツプリング剤と、過酸化性活性物質
   とを組合わせたものを含有する組成物を調製する工程、
   およびこのように調整した組成物を担体マトリツクスに
   包含させる工程よりなることを特徴とする試料中の尿酸
   測定用用具の製造方法。
2. （２）組成物を担体マトリツクスに包含させる工程が、
   組成物溶液を担体マトリツクスに含浸させる工程および
   そのように含浸されたマトリツクスを乾燥させる工程よ
   りなるものである特許請求の範囲第１項記載の製造方法
   。