CN115201134B - 一种抗白皮杉醇干扰的肌酐检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗白皮杉醇干扰的肌酐检测试剂盒及其应用,属于医药生物技术领域,所述试剂盒包括独立包装的R1试剂和R2试剂,R1试剂含有2,2,6,6‑四甲基哌啶1‑氧自由基、肌氨酸氧化酶、肌酸脒基水解酶、过氧化氢酶和N‑乙基‑N‑(3‑磺丙基)‑3‑甲氧基苯胺,R2试剂含有肌酐酰胺水解酶、过氧化物酶、偶联剂。使用本发明的试剂盒测量人血清中肌酐含量,无需对样品进行预处理,使肌酐的测定可不受白皮杉醇影响。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,具体涉及一种抗白皮杉醇干扰的肌酐检测试剂盒及其应用。
背景技术
肌酐(creatinine,Cre)是肌肉在人体内代谢的产物,主要由肾小球滤过排出体外。血中的肌酐来源包括外源性和内源性两部分,血肌酐几乎全部经肾小球滤过进入原尿,并且不被肾小管重吸收;内源性肌酐每日生成量几乎保持恒定,严格控制外源性肌酐的摄入时,血肌酐浓度为稳定值,因此,在临床上,测定血肌酐浓度可以反映肾脏肾小球的滤过功能及肾脏损害情况。
肌酐的检测方法:测定血清肌酐的方法主要有两种:一种是碱性苦味酸法,一种是肌氨酸氧化酶法。目前市场使用较多的为肌氨酸氧化酶法。
在临床工作中,偶尔出现住院患者在检测肌酐时,发生肌酐检测值低于给药前肌酐检测值,这给临床医疗带来了很大困惑。面对这一现象,进行了多方面的讨论,并结合有关文献报道,考虑到可能由于所用药物,在体内与血液共存,在采血进行肌酐检测时,该药物干扰了肌酐检测系统的化学反应,进而出现了负干扰现象。
例如,中国授权专利CN108627654B公开了一种用于消除羟苯磺酸钙药物对肌酐酶法检测干扰的组合物,包括:R1试剂、R2试剂以及高分子氧化剂;所述高分子氧化剂为高分子过氧酸、高分子硒氧化物、高分子氯代硫醚、N-代酰亚胺、水溶性四氮唑、戴斯马丁氧化剂中的一种或多种。本发明所公开的组合物中的高分子氧化剂可与待测样品中的羟苯磺酸钙发生作用,使得羟苯磺酸钙失去干扰酶法肌酐检测的作用,提升肌氨酸氧化酶法检测的准确性,从而解决了病人服用羟苯磺酸钙药物期间,病人血液中高浓度羟苯磺酸钙对酶法肌酐项目检测结果的严重负干扰问题。
再例如,中国授权专利CN104459164B公开了一种血清肌酐检测试剂,在试剂R1中通过加入γ-Fe2O3纳米粒子增强了过氧化物酶的活性以及对底物的专一性,减少了抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽及胆红素等还原性物质的干扰,同时γ-Fe2O3纳米粒子还作为反应的催化剂,与过氧化物酶共同作用有效地除去了内源性肌酸的干扰。此外,该专利采用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)为色原,试剂更加稳定,分析灵敏度高。试剂R1中还加入了脂肪酶和脂蛋白脂酶等物质,可有效去除脂浊的影响,因而本发明试剂具有更强的抗干扰能力和稳定性。
然而,对于肌酐检测系统产生干扰的药物并不限于上述文献报道。因此,如何发现更多干扰肌酐检测系统的药物并且针对该药物提供抗干扰的肌酐检测试剂盒,是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
基于上述原因,本发明提出一种抗干扰的肌酐检测试剂盒及其应用。
本申请的发明人在日常工作中发现白皮杉醇( piceatannol,PIC)是能够引起氧化酶比色法检测肌酐发生负干扰的物质之一。白皮杉醇(PIC)主要存在于葡萄、大黄与甘蔗等植物中,是一种多羟基酚化合物。已被证实具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗炎、抗白血病、抗细胞増殖、提高免疫调节力、防癌、抗癌及抗衰老等生物活性。由于PIC对肌酐检测产生的负干扰作用,这给医生对患者肾脏疾患的诊断及鉴别诊断带来了一定的困难。为了解决PIC对肌酐检测产生的负干扰作用,本申请发明人进行了大量的研究及实验工作。在研究工作中出人意料的的发现,2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基可以减低PIC对肌酐检测产生负干扰的现象。在这一发现的引导下,本发明人通过研究与实验,发明了使用2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基抑制PIC对肌酐检测产生负干扰的方法。
本发明拟采用如下的技术方案:
本发明一方面涉及一种抗白皮杉醇干扰的肌酐检测试剂盒,所述试剂盒包括独立包装的R1试剂和R2试剂,R1试剂含有2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基、肌氨酸氧化酶、肌酸脒基水解酶、过氧化氢酶和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺,R2试剂含有肌酐酰胺水解酶、过氧化物酶、偶联剂。
在本发明的一个优选实施方式中,所述2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基在R1试剂中的浓度为0.01-10μM。酶法测定肌酐试剂中2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基(TEMPO)含量在0.01-10μM范围对肌酐检测的干扰小于3%,符合肌酐试剂盒的技术要求。
在本发明的一个优选实施方式中,所述R1试剂和/或R2试剂中含有缓冲液成分,所述缓冲液成分独立地选自Tris缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、碳酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液。
在本发明的一个优选实施方式中,所述R1试剂和/或R2试剂中含有酶稳定剂,所述酶稳定剂独立地选自白蛋白、糖醇、甘露醇、甲醇、蔗糖、海藻糖、环糊精、葡萄糖酸盐或氨基酸中的一种或者多种的组合。
在本发明的一个优选实施方式中,所述R1试剂和/或R2试剂中含有抑菌剂,所述抑菌剂独立地选自抗生素例如、庆大霉素、卡那霉素、氯霉素或proclin-300一种或者多种的组合。
在本发明的一个优选实施方式中,所述R2试剂中含有显色剂,所述显色剂选自苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺或萘胺衍生物。
在本发明的一个优选实施方式中,所述R2试剂中还包括显色剂稳定剂,所述显色剂稳定剂选自乙二胺四乙酸或其盐、环糊精中的一种或者多种的组合。
在本发明的一个优选实施方式中,所述R1试剂和/或R2试剂中含有消除内源性干扰的酶,所述酶选自过氧化氢酶和/或抗坏血酸氧化酶。已知本发明的试剂盒容易受到血清等样品中共存的干扰物质的影响,例如抗坏血酸和胆红素等体内还原性物质,对于这些干扰物质,可以通过上述酶消除系统或公知的方法给与克服。
在本发明的一个优选实施方式中,所述偶联剂包括但不限于4-氨基安替比林(4-AA)、氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBT)等。
在本发明的一个优选实施方式中,所述R1试剂中包含:
抗坏血酸氧化酶 1-3KU/L
肌氨酸氧化酶 SAO(东洋纺株式会社制SAO-351) 5-15KU/L
肌酸脒基水解酶CRH(东洋纺株式会社制CRH-221) 60-100 KU/L
过氧化氢酶CAO(东洋纺株式会社制CAO-519) 100-200 KU/L
N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺 (ADPS) 0.2-0.8mM
2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基 3-8mM
所述R2试剂中包含:
肌酐酰胺水解酶 200-400KU/L
过氧化物酶 10-30 KU/L
4-氨基安替比林 2-8mM。
需要说明的是,KU/L是酶活浓度单位,其表示每升试剂中所含有的酶的活性,mM为化学物质量的浓度单位,其中M在化学中是代表摩尔浓度,单位是mol/L。
本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备定量检测血清样本中肌酐含量的试剂盒中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中,所述血清样本源自服用或注射了白皮杉醇的患者。
有益效果
根据本发明,使用本发明的试剂盒测量人血清中肌酐含量,无需对样品进行预处理,使肌酐的测定可不受白皮杉醇影响。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明,本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品,均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1:
【试剂的组成】
(一)含有抗白皮杉醇干扰的肌酐检测试剂及抗干扰剂。
(二)试剂由试剂R1与R2组成,其成分如下:
R1试剂中包含
Good's缓冲液pH 7.5 50 mM
抗坏血酸氧化酶ASO(东洋纺株式会社制ASO-311) 2KU/L
肌氨酸氧化酶 SAO(东洋纺株式会社制SAO-351) 11KU/L
肌酸脒基水解酶CRH(东洋纺株式会社制CRH-221) 80 KU/L
过氧化氢酶CAO(东洋纺株式会社制CAO-519) 150 KU/L
N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺 (ADPS) 0.4 mM(显色剂)
2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基 5mM
白蛋白 0.2%(稳定剂)
蔗糖 3%(稳定剂)
甘露醇 5%(稳定剂)
庆大霉素(抑菌剂) 0.02%(抑菌剂)
Proclin300 0.03%(防腐剂)
曲拉通X-100 0.1%
R2试剂中包
Good's缓冲液pH 7.7 50 mM
肌酐酰胺水解酶CNH (东洋纺株式会社制CNH-211) 330KU/L
过氧化物酶 (东洋纺株式会社制PEO-301) 20 KU/L
4-氨基安替比林 4.9 mM
叠氮钠 6.14mM (防腐剂)
需要说明的是,KU/L是酶活浓度单位,其表示每升试剂中所含有的酶的活性;mM为化学物质量的浓度单位,其中M在化学中是代表摩尔浓度,单位是mol/L;百分比为质量百分比。
标准测定操作方法:
仪器: 日立-7600-010型分析仪:
分析方法:2点终点法;
测定点:16-34
标准操作方法仅作为参考举例,由于自动分析仪的种类不同,操作方法及参数不仅限于此。
使用日立7600-010型自动分析仪。 将150 μL R1试剂加入6 μL样品中,37°C孵育5分钟,进行第一反应。 然后加入50 μL R2试剂,孵育5分钟,进行第二反应。
在546nm处的吸光度通过2点终点法测量,并获取第一反应与第二反应吸光度之间的差值。由仪器电脑自动计算出样本中肌酐的含量。(试剂空白、检测定标、结果的算出均由仪器自动进行。肌酐标准液浓度为:179μmol/l)
(1)检测PIC对酶法测定肌酐的干扰
配制含有不同浓度PIC的检测样本,使用未加2,2,6,6-四甲基哌啶 1-氧自由基(TEMPO)抗干扰剂的肌酐(CRE)检测试剂进行测试。
将PIC分别按下列浓度,溶于混合血清中。作为检测样本。
取未加入PIC的混合血清作为对照样本,PIC含量为0。
使用未加TEMPO的肌酐试剂进行肌酐测定。
分别将前述样本上机进行测定,其上机参数同前。计算出干扰度:干扰度%= [(测定值-对照值)/对照值]×100 %。其测定数据如表一。
表一 PIC对酶法测定肌酐的干扰
结论:本实验中得出结论,血清中PIC含量在10μg/ml时,对肌酐检测产生的负干扰可达到-3.09%,随着PIC浓度的增加,其负干扰明显增强,最高可达-56.1%。
在含量达到100μg/ml时其负干扰可达到-56.1%。所以,样本中含有PIC时,可对酶法测定肌酐产生明显的负干扰。
(2)测定氮氧自由基(TEMPO)对肌酐检测试剂的影响。
方法:
检测样本:BIO质控血清
抗干扰试剂的配制:在肌酐检测试剂的R1试剂中,加入TEMPO,配制成表中的浓度。
对照试剂:R1中不加入TEMPO。
测定:将含有不同浓度TEMPO的肌酐检测试剂,设置在日立-7600全自动生化分析仪中,其测定参数同前(1)。
将BIO质控血清作为样本,上机进行测定。其结果如下表(二)。
表二 氮氧自由基(TEMPO)对肌酐检测试剂的影响(n=3)
实验结论:通过上述实验得出结论,酶法测定肌酐试剂中TEMPO含量在0.01-10μM范围对肌酐检测的干扰小于3%,符合肌酐试剂盒的技术要求。
(3)TEMPO对PIC的抗干扰作用
方法:
1、抗PIC干扰的肌酐检测试剂的配制:在肌酐检测试剂的R1中加入不同浓度的TEMPO,其浓度分别为:0.1 、0.5、 0.8、 1.0、2.0、5.0、10mM.
2、对照试剂的配制:除R1试剂中不添加TEMPO外,其余同前述试剂相同,其中,0浓度管为对照组。
3、含有不同浓度PIC的混合血清的配制:配制含有PIC为10 、20、 30、 40、 60、80、 100μg/ml浓度的混合血清。
4、对照血清:除不含PIC外,余同前述混合血清相同。0浓度管为对照管。
5、依次检测各不同浓度的实验组,其结果与对照组比较,
计算出影响度(ER%=[(测定值-对照值)/对照值] ×100%)。
测定:
将上述试剂及样本,设置在日立7600-110型分析仪上进行测定,其测定结果如下表三。
表三
实验结果表明,在所有实施例中(TEMPO的添加量在0.1 mmol/L-10 mmol/L范围内)与对照例相比,白皮杉醇(PIC)对肌酐检测产生的负干扰均有减低。
(4)实施例1的试剂在35℃环境下保存2周,检测试剂的试剂空白、灵敏度及其对PIC抗干扰的情况
测定试剂的制备:实施例1记载的肌酐试剂的第一试剂中加入TEMPO使其终浓度为5mmol/l,用作测定试剂。
对照试剂:除不添加TEMPO外,余同前测定试剂。
1、配制后立即测定、
2、35°C保存7天、
3、35°C保存14天后,在以下测定条件下测定试剂。
4、试剂空白的测定:用精制水作为样本测定吸光度(仪器自动测定)。
5、灵敏度测定:用179μmol/L的肌酐标准液作为样本,测定的吸光度。在减去精制水测定的吸光度。
6、影响度的测定:用与实施例1相同的血清样本中,加入PIC,使其浓度达到30μg/ml 。
分别使用测定用试剂及对照试剂对样本进行测定,计算出影响度,结果如表四所示。
表四
结果如表四所示,其中ABS表示吸光度,在添加TEMPO的情况下,PIC对检测肌酐的负干扰,可以避免或减轻。同时,试剂在35℃条件下,经过7天及14天的保存,测定其试剂空白值及灵敏度,结果良好。
(5)本发明试剂与市售试剂的抗干扰比较:
方法:
1、 样本的制备:
1.1、检测血清样本:配制含有不同PIC浓度的混合血清,配制含有PIC为10 、20、30、 40、 60、 80、 100μg/ml浓度的混合血清。
1.2、对照样本:除不含PIC外,余同前1.1检测血清样本。
2、本发明试剂与市售试剂的抗干扰比对。本发明试剂为实施例1配制试剂,所用比对市售试剂为
2.1、 A厂家试剂
2.2、 B厂家试剂
测定:仪器:日立-7600-110型全自动生化分析仪
参数同前实施例1,所测结果如下表五。
表5:抗干扰比较结果
结论:本发明试剂,样本中PIC含量在(10-100mg/L)范围内,可以避免或减轻对肌酐检测的负干扰。市售试剂,样本中PIC含量在(10-100mg/L)范围内,发生明显的对肌酐检测产生负干扰。
以上描述了本发明优选实施方式,然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (9)
1.一种抗白皮杉醇干扰的肌酐检测试剂盒,所述试剂盒包括独立包装的R1试剂和R2试剂,其特征在于,所述R1试剂含有2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、肌氨酸氧化酶、肌酸脒基水解酶、过氧化氢酶和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺,所述R2试剂含有肌酐酰胺水解酶、过氧化物酶、偶联剂;所述R2试剂中还含有显色剂,所述显色剂选自苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺或萘胺衍生物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基在R1试剂中的浓度为0.01-10μM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R1试剂和/或R2试剂中含有缓冲液成分,所述缓冲液成分独立地选自Tris缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、碳酸缓冲溶液、Good’s缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R1试剂和/或R2试剂中含有酶稳定剂,所述酶稳定剂独立地选自白蛋白、糖醇、甘露醇、甲醇、蔗糖、海藻糖、环糊精、葡萄糖酸盐或氨基酸中的一种或者多种的组合。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中还包括显色剂稳定剂,所述显色剂稳定剂选自乙二胺四乙酸或其盐、环糊精中的一种或者多种的组合。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R1试剂和/或R2试剂中含有消除内源性干扰的酶,所述酶选自过氧化氢酶和/或抗坏血酸氧化酶。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述偶联剂选自4-氨基安替比林、氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙中的一种或者多种的组合。
8.权利要求1-7任意一项所述试剂盒在制备定量检测血清样本中肌酐含量的试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述血清样本源自服用了或注射了白皮杉醇物质的患者。
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