CN112029817A - 一种肌酐检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肌酐检测试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括R1试剂和R2试剂,所述R1试剂包括:肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、2,4,6‑三溴‑3‑羟基苯甲酸和3,5‑二氯‑2‑羟基苯磺酸;所述R2试剂包括:肌酐酶、过氧化物酶、亚铁氰化钾和4‑氨基安替吡啉。采用本发明提供的肌酐检测试剂盒能够抵抗待测样品中300mg/L(最高血药浓度)以下的酚磺乙胺的干扰,线性范围较宽(0‑6000μmol/L),适用于高肌酐含量样品的检测,并且能够对手术患者的肾功能进行正确评估。
Description
技术领域
本发明涉及肌酐检测技术领域,具体涉及一种肌酐检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
肌酐(creatinine,Cre)是一种低分子量含氮化合物,是肌肉在人体内的代谢产物。血清肌酐通常用于晚期肾脏疾病的临床检测。测定肌酐的方法主要有化学法和酶法,化学法主要是苦味酸法,特异性较差;酶法主要有三种:肌酐氨基水解酶法、肌氨酸氧化酶法、肌酐亚氨基水解酶法。酶法特异性较好,可消除内源性肌酐的干扰。
目前,临床上广泛使用的肌酐检测试剂盒一般采用酶偶联法,以Trinder反应为基础,其原理为肌酐通过酶作用产生的过氧化氢(H2O2)在4-氨基安替吡啉(4-AAP)、色原、过氧化物酶(POD)的存在下,生成红色醌亚胺化合物,从而通过吸光度的变化确定出待测样品中的肌酐浓度。由于待测样品中的还原性物质能够竞争性地与H2O2发生反应,消耗部分由肌酐产生的H2O2,会对肌酐含量的检测造成负干扰。
酚磺乙胺,又称止血敏、羟苯磺乙胺、止血定、氢醌磺乙胺,能降低毛细血管通透性,增强血小板的功能及粘合力,促进血小板释放凝血活性物质,缩短凝血时间而止血,用于防治手术前后和各种血管因素出血。由于酚磺乙胺分子中的氢醌环消耗H2O2,对肌酐检测结果造成负干扰,使手术患者服药后的肌酐检测结果不准确,因此在临床给药后,如需测定患者血清肌酐浓度,至少要在给药后10.5h抽血测定,否则容易导致无法正确评估手术患者肾功能从而影响患者预后的问题。针对上述问题,中国专利文献(CN106124779A)提供了一种用于测定肌酐的试剂盒,可以抵抗250mg/L以下的酚磺乙胺的干扰,但是肌酐含量的线性检测范围仅在2000μmol以下,对于高肌酐含量的样品则无法进行准确测定,存在一定局限性。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的抗酚磺乙胺干扰的肌酐检测试剂盒线性检测范围小,对于高肌酐含量的样品无法进行准确测定的缺陷,从而提供一种具有较宽线性范围的抗酚磺乙胺干扰的肌酐检测试剂盒。
第一方面,本发明提供一种肌酐检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,
所述R1试剂包括:肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸;
所述R2试剂包括:肌酐酶、过氧化物酶、亚铁氰化钾和4-氨基安替吡啉。
进一步地,在所述R1试剂中,2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸的量为4.0-6.0mmol/L,3,5-二氯-2-羟基苯磺酸的量为1.0-3.0mmol/L;在所述R2试剂中,4-氨基安替吡啉的量为1-3mmol/L。
进一步地,在所述R1试剂中,肌酸酶的量为1.5-2.0KU/L,肌氨酸氧化酶的量为0.6-0.9KU/L,过氧化物酶20-30KU/L,抗坏血酸氧化酶的量为1-3KU/L。
进一步地,在所述R2试剂中,肌酐酶的量为30-50KU/L,过氧化物酶的量为0.8-1.2KU/L,亚铁氰化钾的量为150-170μmol/L。
进一步地,所述R1试剂还包括:TAPS缓冲液30-40mmol/L,pH值为7.8-8.2;所述R2试剂还包括:TAPS缓冲液30-40mmol/L,pH值为7.8-8.2。
进一步地,所述R1试剂还包括:表面活性剂、稳定剂、防腐剂中的至少一种;所述R2试剂还包括:表面活性剂、稳定剂、防腐剂中的至少一种。
进一步地,在所述R1试剂中,表面活性剂的量为1-3g/L,稳定剂的量为5-20g/L,防腐剂的量为0.1-0.3g/L;在所述R2试剂中,表面活性剂的量为0.1-1g/L,稳定剂的量为3-10g/L,防腐剂的量为0.1-0.3g/L。
进一步地,所述表面活性剂包括吐温-20、吐温-80中的至少一种;所述稳定剂包括蔗糖、果糖、甘油、牛血清白蛋白中的至少一种;所述防腐剂包括ProClin系列防腐剂。
第二方面,本发明提供所述的肌酐检测试剂盒的使用方法,包括:
将所述R1试剂与待测样品混合,得到第一混合液,将所述第一混合液于37℃孵育5min后读取其吸光度A1;
将所述第一混合液与R2试剂混合,得到第二混合液,将所述第二混合液于37℃孵育5min后读取其吸光度A2;
计算待测样品的吸光度变化△A=A2-A1;
根据肌酐标准品的肌酐浓度与吸光度变化关系曲线和待测样品的吸光度变化△A,得出待测样品中的肌酐浓度。
进一步地,R1试剂、R2试剂与待测样品的体积比为45:15:1,检测波长为546nm。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供的肌酐检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,R1试剂包括:肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHB)和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸(DCHBS);R2试剂包括:肌酐酶、过氧化物酶、亚铁氰化钾和4-氨基安替吡啉,该试剂盒的原理为:待测样品中的肌酐在肌酐酶的催化下水解生成肌酸;在肌酸酶的催化下肌酸水解产生肌氨酸和尿素;肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化成甘氨酸、甲醛和H2O2;H2O2在4-氨基安替吡啉(4-AAP)、TBHB、DCHBS、过氧化物酶(POD)的存在下,生成红色醌亚胺化合物,比色法测定,反应产物的吸光度与肌酐的浓度成正比。抗坏血酸氧化酶用于消除待测样品中维生素C的干扰,亚铁氰化钾用于消除胆红素的干扰,肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶可以分别用于消除待测样品中存在的内源性肌酸、肌氨酸、过氧化物酶的干扰。采用本发明提供的肌酐检测试剂盒能够抵抗待测样品中300mg/L(最高血药浓度)以下的酚磺乙胺的干扰,线性范围较宽(0-6000μmol/L),适用于高肌酐含量样品的检测,并且能够对手术患者的肾功能进行正确评估。
2.本发明提供的肌酐检测试剂盒,检测结果准确度高、精密度好,而且该试剂盒质量稳定,保存时间长,便于推广使用。
3.本发明提供的肌酐检测试剂盒的使用方法,将待测样品依次与R1试剂和R2试剂混合,计算待测样品的吸光度变化△A,根据肌酐标准品的肌酐浓度与吸光度变化关系曲线和待测样品的吸光度变化△A,得出待测样品中的肌酐浓度,使用方法简便,能够满足临床实际检测需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中肌酐检测试剂盒在0-6000μmol/L浓度范围内线性范围图;
图2是本发明实施例1中肌酐检测试剂盒在0-100μmol/L浓度范围内线性范围图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用原料或仪器,均为可以通过市购获得的常规产品,包括但不限于本申请实施例中采用的原料或仪器。
实施例1
一种肌酐检测试剂盒,组成如下:
R1试剂:
实施例2
一种肌酐检测试剂盒,组成如下:
R1试剂:
R2试剂:
实施例3
一种肌酐检测试剂盒,组成如下:
R1试剂:
R2试剂:
实施例4
一种肌酐检测试剂盒,组成如下:
R1试剂:
R2试剂:
实施例5
一种肌酐检测试剂盒,组成如下:
R1试剂:
R2试剂:
对比例1
一种肌酐检测试剂盒,组成如下:
R1试剂:
R2试剂:
对比例2
一种肌酐检测试剂盒,组成如下:
R1试剂:
R2试剂:
实施例1-5和对比例1-2中提供的肌酐检测试剂盒的制备方法如下:
(1)配制TAPS缓冲液:根据欲配制的浓度称取相应质量的三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS),溶于纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH至8.0±0.2,于0.105MPa/cm2条件下高压灭菌30分钟(以配制30mmol/L的TAPS缓冲液为例,称取7.2984g的TAPS溶于1L纯化水中,搅拌至完全溶解后调pH,高压灭菌);
(2)配制R1试剂:根据欲配制的浓度称取R1试剂中除TAPS缓冲液以外的其他组分,加入配制好的TAPS缓冲液中,混匀;
(3)配制R2试剂:根据欲配制的浓度称取R2试剂中除TAPS缓冲液以外的其他组分,加入配制好的TAPS缓冲液中,混匀;
(4)依次进行半成品检验、分装、组装(贴签、装盒、装说明书、贴盒封口签)、成品检验、入库。
实施例1-5和对比例1-2中提供的肌酐检测试剂盒的使用方法如下:
使用日立7170生化分析仪进行检测,其操作方法如表1所示,具体为:将4μL待测样品与180μL R1试剂混合,于37℃孵育5min后读取吸光度A1,加入60μL R2试剂混合,于37℃孵育5min后读取吸光度A2,计算待测样品的吸光度变化△A=A2-A1,检测波长为546nm,检测过程中用空白管调零;
根据上述检测方法,采用两点线性校准制作出肌酐标准品的肌酐浓度与吸光度变化关系曲线,由测得的待测样品的吸光度变化△A在上述曲线中读出待测样品的肌酐浓度,每个待测样品重复检测3次,取均值作为检测结果。
表1肌酐检测试剂盒的使用方法
实验例1酚磺乙胺抗干扰实验
收集健康体检人员的新鲜混合血清,配制浓度为3000mg/L的酚磺乙胺水溶液,稀释后分别得到浓度2500mg/L、1500mg/L、500mg/L的酚磺乙胺水溶液,分别取0.9mL混合血清和0.1mL酚磺乙胺水溶液(3000mg/L、2500mg/L、1500mg/L、500mg/L),混合均匀,得到药物浓度为300mg/L、250mg/L、150mg/L、50mg/L的酚磺乙胺干扰样品,作为对照,取0.9mL混合血清和0.1mL生理盐水,混合均匀,得到药物浓度为0mg/L的对照样品。
采用实施例1-5、对比例1-2提供的肌酐检测试剂盒,按照表1中提供的使用方法分别检测不同药物浓度酚磺乙胺干扰样品和对照样品中的肌酐浓度,检测结果如表2所示。
表2抗干扰实验肌酐浓度检测结果
由表2可以看出,本发明实施例1-5提供的肌酐检测试剂盒能够抵抗血清样品中300mg/L以下的酚磺乙胺干扰,相对于对照样品的偏差基本控制在10%以内,实施例1和对比例1-2的对照结果可以看出,选择2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸(TBHB)和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸(DCHBS)配合,使肌酐检测试剂盒对酚磺乙胺的抗干扰能力显著增强。
实验例2线性范围考察实验
利用肌酐标准品分别配制浓度为1000μmol/L、2000μmoL、3000μmol/L、4000μmol/L、6000μmol/L和7000μmol/L肌酐标准品溶液,采用实施例1-5提供的肌酐检测试剂盒,按照表1中提供的使用方法分别检测不同浓度肌酐标准品溶液中的肌酐浓度,检测结果如表3所示。
表3线性范围考察实验检测结果
由表3可以看出,在0-6000μmol/L浓度范围内,实施例1-5提供的肌酐检测试剂盒的检测值与理论值的相关性好,在7000μmol/L浓度下检测值与理论值相差较大,实施例1提供的肌酐检测试剂盒在0-6000μmol/L浓度范围内的线性范围图如图1所示。因此,本发明提供的肌酐检测试剂盒线性范围较宽(0-6000μmol/L),适用于高肌酐含量样品的检测。
参照上述方法使用实施例1提供的肌酐检测试剂盒对较低肌酐浓度(0-100μmol/L)的肌酐标准品溶液进行检测,得到0-100μmol/L浓度范围内的线性范围图如图2所示。由此可见,本发明提供的肌酐检测试剂盒在较低浓度下的检测值与理论值相关性好。
实验例3准确度考察实验
使用本发明实施例1提供的肌酐检测试剂盒按照表1中提供的使用方法分别对罗氏多项生化质控高、低值血清标准品各测定3次,计算平均值与标准品靶值的相对偏差,检测结果如表4所示。
表4准确度考察实验检测结果
检测结果 | 低值血清标准品 | 高值血清标准品 |
第1次检测值 | 86.33 | 352.17 |
第2次检测值 | 86.47 | 353.78 |
第3次检测值 | 86.46 | 351.66 |
3次检测平均值 | 86.42 | 352.54 |
靶值 | 86.20 | 351.00 |
相对偏差(%) | 0.26 | 0.44 |
由表4可以看出,实施例1制备的肌酐检测试剂盒检测结果平均值与低值血清标准品和高值血清标准品靶值的相对偏差分别为0.26%和0.44%,证明本发明提供的肌酐检测试剂盒准确度高。按照此方法对实施例2-5制备的肌酐检测试剂盒进行稳定性检测,检测结果平均值与低值血清标准品相对偏差分别为0.28%、0.35%、0.37%、0.30%;检测结果平均值与高值血清标准品相对偏差分别为0.51%、0.53%、0.61%、0.58%,证明本发明实施例2-5提供的肌酐检测试剂盒准确度均较高。
实验例4精密度考察实验
以健康体检人员的新鲜血清为待测样品,使用本发明实施例1提供的肌酐检测试剂盒按照表1中提供的使用方法测定10次,计算平均值与标准偏差,得出该肌酐检测试剂盒的变异系数CV%,检测结果如表5所示。
表5精密度考察实验检测结果
测定次数 | 肌酐浓度检测值(μmol/L) |
1 | 102.33 |
2 | 101.59 |
3 | 100.91 |
4 | 100.83 |
5 | 102.67 |
6 | 101.88 |
7 | 99.98 |
8 | 102.31 |
9 | 101.42 |
10 | 101.45 |
平均值 | 101.54 |
标准偏差SD | 0.81 |
变异系数CV% | 0.80% |
按照此方法对实施例2-5制备的肌酐检测试剂盒进行精密度考察检测,得到各肌酐检测试剂盒的变异系数分别为0.83%、0.91%、0.89%、0.93%,证明本发明实施例2-5提供的肌酐检测试剂盒的精密度均较高。
实验例5稳定性考察实验
对实施例1制备的肌酐检测试剂盒的稳定性进行考察,将肌酐检测试剂盒在2-8℃温度下放置,分别于放置后的第2个月、第6个月、第12个月、第14个月取出,按照表1中提供的使用方法分别检测质控品(浓度为124.0μmol/L的肌酐标准品溶液)中的肌酐浓度,并与第0个月的检测结果进行比较,检测结果如表6所示。
表6稳定性考察实验检测结果
肌酐浓度(μmol/L) | 结果偏差(%) | |
第0个月 | 124.0 | 0 |
第2个月 | 123.6 | 0.32 |
第6个月 | 123.0 | 0.81 |
第12个月 | 122.5 | 1.21 |
第14个月 | 122.3 | 1.37 |
由表6可以看出,实施例1制备的肌酐检测试剂盒在2-8℃温度下放置14个月内检测结果基本保持稳定,证明本发明实施例1制备的肌酐检测试剂盒稳定性良好,按照此方法对实施例2-5制备的肌酐检测试剂盒进行稳定性检测,结果偏差均在2%以下。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种肌酐检测试剂盒,其特征在于,包括R1试剂和R2试剂,
所述R1试剂包括:肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸;
所述R2试剂包括:肌酐酶、过氧化物酶、亚铁氰化钾和4-氨基安替吡啉。
2.根据权利要求1所述的肌酐检测试剂盒,其特征在于,在所述R1试剂中,2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸的量为4.0-6.0mmol/L,3,5-二氯-2-羟基苯磺酸的量为1.0-3.0mmol/L;在所述R2试剂中,4-氨基安替吡啉的量为1-3mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的肌酐检测试剂盒,其特征在于,在所述R1试剂中,肌酸酶的量为1.5-2.0KU/L,肌氨酸氧化酶的量为0.6-0.9KU/L,过氧化物酶20-30KU/L,抗坏血酸氧化酶的量为1-3KU/L。
4.根据权利要求1-3任一所述的肌酐检测试剂盒,其特征在于,在所述R2试剂中,肌酐酶的量为30-50KU/L,过氧化物酶的量为0.8-1.2KU/L,亚铁氰化钾的量为150-170μmol/L。
5.根据权利要求1-4任一所述的肌酐检测试剂盒,其特征在于,所述R1试剂还包括:TAPS缓冲液30-40mmol/L,pH值为7.8-8.2;所述R2试剂还包括:TAPS缓冲液30-40mmol/L,pH值为7.8-8.2。
6.根据权利要求1-5任一所述的肌酐检测试剂盒,其特征在于,所述R1试剂还包括:表面活性剂、稳定剂、防腐剂中的至少一种;所述R2试剂还包括:表面活性剂、稳定剂、防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的肌酐检测试剂盒,其特征在于,在所述R1试剂中,表面活性剂的量为1-3g/L,稳定剂的量为5-20g/L,防腐剂的量为0.1-0.3g/L;在所述R2试剂中,表面活性剂的量为0.1-1g/L,稳定剂的量为3-10g/L,防腐剂的量为0.1-0.3g/L。
8.根据权利要求6或7所述的肌酐检测试剂盒,其特征在于,所述表面活性剂包括吐温-20、吐温-80中的至少一种;所述稳定剂包括蔗糖、果糖、甘油、牛血清白蛋白中的至少一种;所述防腐剂包括ProClin系列防腐剂。
9.权利要求1-8任一所述的肌酐检测试剂盒的使用方法,其特征在于,包括:
将所述R1试剂与待测样品混合,得到第一混合液,将所述第一混合液于37℃孵育5min后读取其吸光度A1;
将所述第一混合液与R2试剂混合,得到第二混合液,将所述第二混合液于37℃孵育5min后读取其吸光度A2;
计算待测样品的吸光度变化△A=A2-A1;
根据肌酐标准品的肌酐浓度与吸光度变化关系曲线和待测样品的吸光度变化△A,得出待测样品中的肌酐浓度。
10.根据权利要求9所述的肌酐检测试剂盒的使用方法,其特征在于,R1试剂、R2试剂与待测样品的体积比为45:15:1,检测波长为546nm。
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