CN114774256A - 一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用，肌酐测试卡由上下卡壳、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，过滤反应层设置有肌酐酶及肌酸水解酶，分离反应层上设置有肌氨酸氧化酶及抗干扰酶液，显色反应层上设置色原底物和过氧化氢酶，利用扩散层，过滤反应层、分离反应层处理分离得到血清的同时，使肌酐酶法分步反应在不同层分别进行，酶液分层设置，底物浓度及酶液浓度有利于各步反应更加充分，各步反应副产物不会对其他反应步骤的酶液及反应进程造成影响，减少干扰，最大程度的将肌酐及肌酸反应转化，快速准确定量检测血肌酐含量，检测结果精确度和稳定性得到极大的提升，使用简单，无需专业人士操作。

Description

一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及血肌酐定量检测领域，特别涉及一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用。
背景技术
肌酐(creatinine，CR)是一种人体内代谢产生的低分子质量的含氮化合物。人体肌酐可分为血肌酐和尿肌酐。血肌酐分为外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。一般内源性肌酐每日生成量几乎保持恒定，因此，在摄入总量稳定的情况下，血肌酐浓度主要取决于肾小球的滤过功能，因此血肌酐对肾功能的检测更有意义，能较准确的反应肾实质受损的情况，在临床上具有重要意义。
目前临床上检测肾功能指标采用的方法都为湿化学法，使用试剂盒与大型生化仪检测，时间久，操作复杂，且需要专业人员维护操作，不便于用户和病人使用。此外，肌酐多采用肌酐酶法检测，测定结果容易受到内源性肌酸以及血液中其他物质(如铁氰化钾、胆红素、维生素C、甲基多巴、左旋多巴等)的干扰。
现有技术中的肌酐酶法反应原理如下：
Figure BDA0003596781110000011
Figure BDA0003596781110000012
Figure BDA0003596781110000013
Figure BDA0003596781110000014
肌酐在肌酸酶作用下，生成肌酸。肌酸再经肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶的处理，最终生成H2O2，H2O2将4-氨基安替比林和色原底物凝聚成有色物质，通过检测该有色物质的反射吸光度即可推算出肌酐的浓度。
但是现有技术中虽然也采用光学信号差分方法将内源性肌酸的影响消除，但是现有技术中的肌酐酶法存在较大的问题，现有技术中，检测卡中的试条均在扩散膜扩散血样后，通过滤血膜滤除血细胞，然后通过抗干扰膜对血样中的干扰物质进行滤除，将处理过后的血清在反应膜上进行显色反应，但是目前现有技术中，肌酐酶法涉及到的4步反应中的4种酶液及色原底物等均负载在反应膜上，反应膜上均匀负载所有的酶液，因此，肌酐酶法涉及到的4步反应均在一张反应膜上完成，那么，带来的问题是，肌酐酶法涉及到的4步反应的尿素，甘氨酸，甲醛等副产物会影响各步反应的酶液活性，比如甲醛和尿素等会影响肌酐酶和肌酸水解酶的活性，使其失效，从而不能将肌酐和肌酸完全转化肌氨酸，导致测试结果不够准确，其他步骤的副产物存在也会影响正常反应的反应进程，使得正常所需反应进程受到影响，导致肌酐和肌酸不能完全转化，酶液全部均匀设置在反应膜的缺陷还有，由于每步反应的酶液均是均匀的负载在反应膜上，导致该步反应的底物接触到的酶液浓度不够高，从而使得某些位置的底物不能完全和酶液发生反应，反应效率和速度均较低，不能将前步骤底物全部转化为后续反应步骤的底物，最终结果是不能将全部的肌酐和肌酸全部转化为显色反应的前体物质过氧化氢，从而导致了肌酐的定量测试出现误差，与血样中的肌酐实际含量存在偏差，测试结果不准确，且在反应膜上单层均匀负载不同酶液，每次浸渍法或者点样法得到的酶液分布不一致，导致每次测试结果重复性不好，结果偏移偏差过大，这是目前现有技术中光学信号差分法存在的典型问题。
本发明公开一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用，肌酐测试卡由上下卡壳、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，过滤反应层设置有肌酐酶及肌酸水解酶，分离反应层上设置有肌氨酸氧化酶及抗干扰酶液，显色反应层上设置色原底物和过氧化氢酶，利用扩散层，过滤反应层、分离反应层处理分离得到血清的同时，使肌酐酶法分步反应在不同层分别进行，酶液分层设置，底物浓度及酶液浓度有利于各步反应更加充分，各步反应副产物不会对其他反应步骤的酶液及反应进程造成影响，比如分离反应层肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下生成的甲醛及甘氨酸副产物，由于其设置在肌酸与肌酐反应(过滤反应层)的下层，因此，副产物甲醛及甘氨酸不会对肌酐酶和肌酸水解酶造成影响，也不会对肌酐和肌酸的反应进程造成干扰，可以使得肌酐和肌酸在酶液浓度及底物浓度最合适的条件下进行反应，充分进行转化后再到下一层完成肌氨酸的反应，由于甲醛等副产物在分离反应层反应，过氧化氢酶设置在显色反应层，由于分层设置的拦截作用，甲醛等副产物对于过氧化氢酶的影响也比现有技术小很多，即使副产物随着血清向下层运移，由于过氧化氢酶只设置在显色反应层，过氧化氢酶浓度较高，分离反应层产生的过氧化氢浓度较高，副产物对显色反应的反应进程影响较小，从而也降低了副产物对后续反应的干扰和破坏，酶液按照分步反应进行分层设置，有利于减少干扰，为了使得各步充分反应，酶液设置在每层的负载液中均加入水溶性增稠剂，水溶性增稠剂一方面使得酶液成膜，均匀分布在每层，使反应更加高效，第二方面，水溶性增稠剂延缓血清向下扩散的速度，使其在每层充分完成各自的反应后扩散至下层反应，由于其水溶性，也不影响最终的产物运移，通过上述手段的协同，最大程度的将肌酐及肌酸反应转化，快速准确定量检测血肌酐含量，检测结果精确度和稳定性得到极大的提升，使用简单，无需专业人士操作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，公开了一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用，肌酐测试卡由上下卡壳、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，过滤反应层设置有肌酐酶及肌酸水解酶，分离反应层上设置有肌氨酸氧化酶及抗干扰酶液，显色反应层上设置色原底物和过氧化氢酶，利用扩散层，过滤反应层、分离反应层处理分离得到血清的同时，使肌酐酶法分步反应在不同层分别进行，酶液分层设置，底物浓度及酶液浓度有利于各步反应更加充分，各步反应副产物不会对其他反应步骤的酶液及反应进程造成影响，减少干扰，最大程度的将肌酐及肌酸反应转化，快速准确定量检测血肌酐含量，检测结果精确度和稳定性得到极大的提升，使用简单，无需专业人士操作。
为实现上述目的，本申请采用的技术方案为：
一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡，血肌酐测试卡由上下卡壳、打孔底板、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，上卡壳上设置有加样孔，下卡壳设置有与显色反应层对应的2个测试孔，2个测试孔分别为肌酸测试孔、肌酐+肌酸测试孔，打孔底板上的2个孔位置与显色反应层对应的下卡壳2个测试孔的位置相对应，打孔底板固定在下卡壳上，打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，然后各个层位固定制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。
进一步的，所述扩散层为网纱，具有亲水性或经过网纱处理液处理后具亲水性；主要使得加样孔中的血液快速均匀的扩散；网纱处理液为表面活性剂溶液，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、曲拉通X-100或OP-10中的一种或者多种；所述处理扩散层的表面活性剂溶液的质量含量为1～10％。
进一步的，所述过滤反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维，第一作用为去除血样中的血细胞，所述肌酐+肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酐酶和肌酸水解酶，所述肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酸水解酶，所述处理过滤反应层的肌酸水解酶浓度为5～20KU/ml，肌酐酶浓度为10～30KU/ml；第二作用是将血清中的肌酐和肌酸在过滤反应膜中进行反应；所述过滤反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2～8％，保护剂、缓冲液，所述处理过滤反应层的保护剂质量浓度0.1～5％；所述保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；所述缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种。
进一步的，所述分离反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维；所述分离反应层经过抗干扰溶液处理，用于去除血液中的干扰物质；所述抗干扰溶液包括胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶；所述处理分离反应层的胆红素氧化酶浓度为1～12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为1～28KU/ml；所述分离反应层还负载有肌氨酸氧化酶，所述处理分离反应层的肌氨酸氧化酶浓度为10KU/ml～30KU/ml；所述分离反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2～8％，保护剂、缓冲液，所述处理分离反应层的保护剂质量浓度0.1～5％；所述保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；所述缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种。
进一步的，所述显色反应层为尼龙膜，所述尼龙膜上负载有过氧化氢酶，过氧化物酶浓度为10～30KU/ml，4-氨基安替比林和色原底物，所述色原底物为DAOS,HDAOS中的一种，所述处理显色反应层的色原底物质量浓度为0.1～1％，所述4-氨基安替比林质量浓度为2-5％，所述显色反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2～8％，保护剂、缓冲液，所述处理显色反应层的保护剂质量浓度0.1～5％；所述保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；所述缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种。
一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1：制备扩散层：扩散层为网纱，具有亲水性或经过网纱处理液处理后具亲水性；配制表面活性剂溶液作为网纱处理液，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、曲拉通X-100或OP-10中的一种或者多种；所述处理扩散层的表面活性剂溶液的质量含量为1～10％；
用网纱处理液浸泡网纱2～10分钟，放置于50℃干燥20分钟后使用；
步骤S2：制备过滤反应层：过滤反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维；
1)制备肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为5～20KU/ml，肌酐酶浓度为10～30KU/ml，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种，质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层；
2)制备肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为5～20KU/ml，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种；质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酸测试孔对应过滤反应层；
步骤S3：制备分离反应层：分离反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维；
配制分离反应层负载液，分离反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中胆红素氧化酶的浓度为1～12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为1～28KU/ml，肌氨酸氧化酶的浓度为10KU/ml～30KU/ml，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种；质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到分离反应层负载液；
将分离反应层材料用配制的分离反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到分离反应层；
步骤S4：制备显色反应层：显色反应层为尼龙膜；
配制显色反应层负载液，显色反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液、4-氨基安替比林和色原底物，其中过氧化物酶浓度为10～30KU/ml，质量浓度为0.1～1％的色原底物溶液，色原底物为DAOS,HDAOS中的一种，4-氨基安替比林，所述4-氨基安替比林质量浓度为2-5％，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种；质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到显色反应层负载液；
将显色反应层材料用配制的显色反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到显色反应层；
步骤S5：组装
首先将下卡壳的2个测试孔与打孔底板上的2个孔位置对齐后固定在下卡壳上，然后在打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。
进一步的，所述步骤S5中将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条的方法为胶粘固定或者超声波焊接器进行焊接固定。
进一步的，所述制备方法中所有步骤中的膜条处理制作过程以及检测卡的组装过程在湿度30％以下的洁净空间完成，测试卡避光干燥保存。
一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的应用，所述血肌酐检测卡在血肌酐浓度测试中的应用。
一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的应用，所述应用方法为：
首先，滴入已知肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，由于肌酐浓度和反射率成比例关系，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线；
然后，滴入待测肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，通过建立的肌酐浓度和差分反射率的线性曲线计算待测血样中肌酐浓度值。
所述的光学差分肌酐信号处理方法为分别测试肌酐+内源性肌酸和内源性肌酸两个孔的两分钟终点反射率，然后对应的将对应的反射率做差分，得到血肌酐的两分钟终点反射率，通过建立的肌酐浓度-反射率差分曲线即可计算得到血肌酐的检测浓度。
本发明的有益效果为：
本发明提出了一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用，与现有方法相比，优点在于：
1、提供一种快速简便的肌酐检测的测试卡，解决医院测试时间长，操作复杂的问题，可推动POCT行业的发展；
2、利用光学差分信号处理可最大程度地排除内源性肌酸和血液中胆红素、抗坏血酸等其他物质的的干扰，解决肌酐试条测试准确度不高问题；
3、本发明过滤反应层设置有肌酐酶及肌酸水解酶，分离反应层上设置有肌氨酸氧化酶及抗干扰酶液，显色反应层上设置色原底物和过氧化氢酶，利用扩散层，过滤反应层、分离反应层处理分离得到血清的同时，使肌酐酶法分步反应在不同层分别进行，酶液分层设置，底物浓度及酶液浓度有利于各步反应更加充分，各步反应副产物不会对其他反应步骤的酶液及反应进程造成影响，比如分离反应层肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下生成的甲醛及甘氨酸副产物，由于其设置在肌酸与肌酐反应(过滤反应层)的下层，因此，副产物甲醛及甘氨酸不会对肌酐酶和肌酸水解酶造成影响，也不会对肌酐和肌酸的反应进程造成干扰，可以使得肌酐和肌酸在酶液浓度及底物浓度最合适的条件下进行反应，充分进行转化后再到下一层完成肌氨酸的反应，由于甲醛等副产物在分离反应层反应，过氧化氢酶设置在显色反应层，由于分层设置的拦截作用，甲醛等副产物对于过氧化氢酶的影响也比现有技术小很多，即使副产物随着血清向下层运移，由于过氧化氢酶只设置在显色反应层，过氧化氢酶浓度较高，分离反应层产生的过氧化氢浓度较高，副产物对显色反应的反应进程影响较小，从而也降低了副产物对后续反应的干扰和破坏，酶液按照分步反应进行分层设置，有利于减少干扰，为了使得各步充分反应，酶液设置在每层的负载液中均加入水溶性增稠剂，水溶性增稠剂一方面使得酶液成膜，均匀分布在每层，使反应更加高效，第二方面，水溶性增稠剂延缓血清向下扩散的速度，使其在每层充分完成各自的反应后扩散至下层反应，由于其水溶性，也不影响最终的产物运移，通过上述手段的协同，最大程度的将肌酐及肌酸反应转化，快速准确定量检测血肌酐含量，检测结果精确度和稳定性得到极大的提升，使用简单，无需专业人士操作。
附图说明
图1为本申请实施例中肌酐测试卡的剖面结构图；
其中，1为加样口，2为肌酐+肌酸测试孔，3为肌酸测试孔，4为上卡壳，5为下卡壳，6为打孔底板，7为扩散膜，8为肌酸测试孔对应的过滤反应层，9为肌酸测试孔对应的分离反应层，10为肌酸测试孔对应的显色反应层，11为肌酐+肌酸测试孔对应的过滤反应层，12为肌酐+肌酸测试孔对应的分离反应层，13为肌酐+肌酸测试孔对应的显色反应层；
图2为本申请实施例中肌酐测试卡的俯视结构图；
其中，1为加样口，4为上卡壳，5为下卡壳；
图3为本申请实施例中肌酐测试卡的仰视结构图；
其中，2为肌酐+肌酸测试孔，3为肌酸测试孔，5为下卡壳；
图4为本申请实施例1中肌酐测试差分信号值与肌酐浓度的拟合曲线图；
图5为本申请实施例2中肌酐测试差分信号值与肌酐浓度的拟合曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
通过以下公式计算测得肌酐浓度值的平均值
Figure BDA0003596781110000071
标准差(SD)和变异系数(CV)：
Figure BDA0003596781110000072
其中，Xi为第i次测得肌酐浓度值，n为测试次数,
Figure BDA0003596781110000073
为肌酐浓度平均值。
实施例1：
如图1-3所示，本发明的肌酐测试卡剖面结构图如图1所示，图2为本申请实施例中肌酐测试卡的俯视结构图；图3为本申请实施例中肌酐测试卡的仰视结构图；
所述血肌酐测试卡由上下卡壳、打孔底板、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，上卡壳上设置有加样孔，下卡壳设置有与显色反应层对应的2个测试孔，2个测试孔分别为肌酸测试孔、肌酐+肌酸测试孔，打孔底板上的2个孔位置与显色反应层对应的下卡壳2个测试孔的位置相对应，打孔底板固定在下卡壳上，打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，然后各个层位固定制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条的方法为超声波焊接器进行焊接固定。
扩散层为网纱，具有亲水性或经过网纱处理液处理后具亲水性；主要使得加样孔中的血液快速均匀的扩散；网纱处理液为表面活性剂溶液，所述表面活性剂为OP-10；质量含量为10％。
过滤反应层为纤维滤纸，第一作用为去除血样中的血细胞，所述肌酐+肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酐酶和肌酸水解酶，所述肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酸水解酶，所述处理过滤反应层的肌酸水解酶浓度为20KU/ml，肌酐酶浓度为30KU/ml；第二作用是将血清中的肌酐和肌酸在过滤反应膜中进行反应；所述过滤反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为8％，保护剂、缓冲液，所述处理过滤反应层的保护剂质量浓度5％；保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度4％,牛血清蛋白质量浓度1％；所述缓冲液为pH 8.0的Tris缓冲液，所述增稠剂为聚丙烯酸钠。
分离反应层为聚酯纤维；所述分离反应层经过抗干扰溶液处理，用于去除血液中的干扰物质；所述抗干扰溶液包括胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶；所述处理分离反应层的胆红素氧化酶浓度为12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为28KU/ml；所述分离反应层还负载有肌氨酸氧化酶，所述处理分离反应层的肌氨酸氧化酶浓度为30KU/ml；所述分离反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为6％，保护剂、缓冲液，所述处理分离反应层的保护剂质量浓度2％；保护剂为蔗糖和牛血清蛋白，其中，蔗糖质量浓度1.6％,牛血清蛋白质量浓度0.4％；；所述缓冲液为pH 6.0盐酸缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP。
显色反应层为尼龙膜，所述尼龙膜上负载有过氧化氢酶，过氧化物酶浓度为30KU/ml，4-氨基安替比林和色原底物，色原底物为DAOS，所述处理显色反应层的色原底物质量浓度为1％，所述4-氨基安替比林质量浓度为3％，所述显色反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2％，保护剂、缓冲液，所述处理显色反应层的保护剂质量浓度0.1％；保护剂为海藻糖和牛血清蛋白，其中，海藻糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；所述缓冲液为pH 7.4的磷酸缓冲液，所述增稠剂为聚氧乙烯。
上述血肌酐检测卡的制备方法：
步骤S1：制备扩散层：扩散层为网纱，经过网纱处理液处理后具亲水性；配制表面活性剂溶液作为网纱处理液，所述表面活性剂为OP-10；质量含量为1～10％；
用网纱处理液浸泡网纱10分钟，放置于50℃干燥20分钟后使用；
步骤S2：制备过滤反应层：过滤反应层为纤维滤纸；
1)制备肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为20KU/ml，肌酐酶浓度为30KU/ml，加入质量浓度为8％的增稠剂，增稠剂为聚丙烯酸钠，质量浓度为5％的保护剂；缓冲液为pH 8.0Tris缓冲液，保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度4％,牛血清蛋白质量浓度1％；即得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层；
2)制备肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为20KU/ml，加入质量浓度为8％的增稠剂，增稠剂为聚丙烯酸钠；质量浓度为5％的保护剂；缓冲液为pH 8.0的Tris缓冲液，保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度4％,牛血清蛋白质量浓度1％；即得到肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酸测试孔对应过滤反应层；
步骤S3：制备分离反应层：分离反应层为纤维滤纸；
配制分离反应层负载液，分离反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中胆红素氧化酶的浓度为12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为28KU/ml，肌氨酸氧化酶的浓度为30KU/ml，加入质量浓度为6％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP；质量浓度为2％的保护剂；缓冲液为pH 6.0盐酸缓冲液，保护剂为蔗糖和牛血清蛋白，其中，蔗糖质量浓度1.6％,牛血清蛋白质量浓度0.4％；即得到分离反应层负载液；
将分离反应层材料用配制的分离反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到分离反应层；
步骤S4：制备显色反应层：显色反应层为尼龙膜；
配制显色反应层负载液，显色反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液、4-氨基安替比林和色原底物，过氧化物酶浓度为30KU/ml，质量浓度为1％的色原底物溶液，色原底物为DAOS，4-氨基安替比林，4-氨基安替比林质量浓度为3％，加入质量浓度为2％的增稠剂，增稠剂为聚氧乙烯；质量浓度为0.1％的保护剂，保护剂为海藻糖和牛血清蛋白，其中，海藻糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；缓冲液为pH 7.4的磷酸缓冲液；即得到显色反应层负载液；
将显色反应层材料用配制的显色反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到显色反应层；
步骤S5：组装
首先将下卡壳的2个测试孔与打孔底板上的2个孔位置对齐后固定在下卡壳上，然后在打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。
将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条的方法为超声波焊接器进行焊接固定。
制备方法中所有步骤中的膜条处理制作过程以及检测卡的组装过程在23℃下，湿度30％的洁净空间完成，测试卡避光干燥保存。
一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的测试应用：
血肌酐检测卡在非疾病诊断或治疗为目的的血肌酐浓度测试中的应用。
血肌酐检测卡的测试应用方法为：
首先，滴入已知肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，由于肌酐浓度和反射率成比例关系，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线；
然后，滴入待测肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，通过建立的肌酐浓度和差分反射率的线性曲线计算待测血样中肌酐浓度值。
所述的光学差分肌酐信号处理方法为分别测试肌酐+内源性肌酸和内源性肌酸两个孔的两分钟终点反射率，然后对应的将对应的反射率做差分，得到血肌酐的两分钟终点反射率，通过建立的肌酐浓度-反射率差分曲线即可计算得到血肌酐的检测浓度。
分别配置6个不同浓度的肌酐全血样本(43μM，155μM，353μM，609μM，876μM，1204μM)，每个样本使用日立3110生化分析仪进行肌酐测试，然后再使用本实施例中的检测卡和自制干式生化分析仪YX-G01进行测试(发射波长550nm)，每个样本重复测10次，分别记录下光电信号值。表1为6个不同浓度的肌酐全血样本肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号值。
表1肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号值
Figure BDA0003596781110000111
将6个不同浓度的肌酐全血样本10次测试的肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号平均值作为横坐标，将6个不同浓度的肌酐全血样本已知肌酐浓度作为纵坐标，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线，如图4所示，从上表1中的测试数据来看，信号值与肌酐浓度成正比，通过线性拟合所得的标准曲线如图4，线性R2＞0.999,线性极好。
得到肌酐浓度和差分反射率的线性曲线后，按照10次测试的实际差分反射率计算每次测试的真实肌酐含量值，如表2所示，表2为6个不同浓度的肌酐全血样本肌酐测试值及偏差值。
表2 6个不同浓度的肌酐全血样本肌酐测试值及偏差值
Figure BDA0003596781110000112
Figure BDA0003596781110000121
由表2可知，本发明提供的肌酐测试卡的不同浓度下的测试结果中标准差SD值较小，变异系数CV较低，测试结果比较稳定，与生化实际值偏差较小，测试重复性一致性极好。
实施例2：
肌酐测试卡的结构组装如实施例中所示：
所述血肌酐测试卡由上下卡壳、打孔底板、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，上卡壳上设置有加样孔，下卡壳设置有与显色反应层对应的2个测试孔，2个测试孔分别为肌酸测试孔、肌酐+肌酸测试孔，打孔底板上的2个孔位置与显色反应层对应的下卡壳2个测试孔的位置相对应，打孔底板固定在下卡壳上，打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，然后各个层位固定制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条的方法为超声波焊接器进行焊接固定。
扩散层为网纱，具有亲水性或经过网纱处理液处理后具亲水性；主要使得加样孔中的血液快速均匀的扩散；网纱处理液为表面活性剂溶液，所述表面活性剂为吐温40；质量含量为1％。
过滤反应层为玻纤，第一作用为去除血样中的血细胞，所述肌酐+肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酐酶和肌酸水解酶，所述肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酸水解酶，所述处理过滤反应层的肌酸水解酶浓度为5KU/ml，肌酐酶浓度为10KU/ml；第二作用是将血清中的肌酐和肌酸在过滤反应膜中进行反应；所述过滤反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2％，保护剂、缓冲液，所述处理过滤反应层的保护剂质量浓度0.1％；保护剂为蔗糖和牛血清蛋白，其中，蔗糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；所述缓冲液为pH 6.0盐酸缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP。
分离反应层为玻纤；所述分离反应层经过抗干扰溶液处理，用于去除血液中的干扰物质；所述抗干扰溶液包括胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶；所述处理分离反应层的胆红素氧化酶浓度为1KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为1KU/ml；所述分离反应层还负载有肌氨酸氧化酶，所述处理分离反应层的肌氨酸氧化酶浓度为10KU/ml；所述分离反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2％，保护剂、缓冲液，所述处理分离反应层的保护剂质量浓度0.1％；保护剂为海藻糖和牛血清蛋白，其中，海藻糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；所述缓冲液为pH 7.4的磷酸缓冲液，所述增稠剂为聚氧乙烯。
显色反应层为尼龙膜，所述尼龙膜上负载有过氧化氢酶，过氧化物酶浓度为10KU/ml，4-氨基安替比林和色原底物，色原底物为HDAOS，所述处理显色反应层的色原底物质量浓度为0.1％，所述4-氨基安替比林质量浓度为2％，所述显色反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2％，保护剂、缓冲液，所述处理显色反应层的保护剂质量浓度0.1％；保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；所述缓冲液为pH 8.0的Tris缓冲液，所述增稠剂为聚丙烯酸钠。
上述血肌酐检测卡的制备方法：
步骤S1：制备扩散层：扩散层为网纱，经过网纱处理液处理后具亲水性；配制表面活性剂溶液作为网纱处理液，所述表面活性剂为吐温40；质量含量为1％；
用网纱处理液浸泡网纱10分钟，放置于50℃干燥20分钟后使用；
步骤S2：制备过滤反应层：过滤反应层为纤维滤纸；
1)制备肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为5KU/ml，肌酐酶浓度为10KU/ml，加入质量浓度为2％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP，质量浓度为0.1％的保护剂；缓冲液为pH 6.0盐酸缓冲液，保护剂为蔗糖和牛血清蛋白，其中，蔗糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；即得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层；
2)制备肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为5KU/ml，加入质量浓度为2％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP；质量浓度为0.1％的保护剂；缓冲液为pH 6.0盐酸缓冲液，保护剂为蔗糖和牛血清蛋白，其中，蔗糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；即得到肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酸测试孔对应过滤反应层；
步骤S3：制备分离反应层：分离反应层为纤维滤纸；
配制分离反应层负载液，分离反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中胆红素氧化酶的浓度为1KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为1KU/ml，肌氨酸氧化酶的浓度为10KU/ml，加入质量浓度为2％的增稠剂，增稠剂为聚氧乙烯；质量浓度为0.1％的保护剂；缓冲液为pH 7.4的磷酸缓冲液，保护剂为海藻糖和牛血清蛋白，其中，海藻糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；即得到分离反应层负载液；
将分离反应层材料用配制的分离反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到分离反应层；
步骤S4：制备显色反应层：显色反应层为尼龙膜；
配制显色反应层负载液，显色反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液、4-氨基安替比林和色原底物，过氧化物酶浓度为10KU/ml，质量浓度为0.1％的色原底物溶液，色原底物为HDAOS，4-氨基安替比林，4-氨基安替比林质量浓度为2％，加入质量浓度为2％的增稠剂，增稠剂为聚丙烯酸钠；质量浓度为0.1％的保护剂，保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度0.08％,牛血清蛋白质量浓度0.02％；缓冲液为pH 8.0的Tris缓冲液；即得到显色反应层负载液；
将显色反应层材料用配制的显色反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到显色反应层；
步骤S5：组装
首先将下卡壳的2个测试孔与打孔底板上的2个孔位置对齐后固定在下卡壳上，然后在打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。
将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条的方法为超声波焊接器进行焊接固定。
制备方法中所有步骤中的膜条处理制作过程以及检测卡的组装过程在23℃下，湿度30％的洁净空间完成，测试卡避光干燥保存。
一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的测试应用：
血肌酐检测卡在非疾病诊断或治疗为目的的血肌酐浓度测试中的应用。
血肌酐检测卡的测试应用方法为：
首先，滴入已知肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，由于肌酐浓度和反射率成比例关系，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线；
然后，滴入待测肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，通过建立的肌酐浓度和差分反射率的线性曲线计算待测血样中肌酐浓度值。
所述的光学差分肌酐信号处理方法为分别测试肌酐+内源性肌酸和内源性肌酸两个孔的两分钟终点反射率，然后对应的将对应的反射率做差分，得到血肌酐的两分钟终点反射率，通过建立的肌酐浓度-反射率差分曲线即可计算得到血肌酐的检测浓度。
分别配置6个不同浓度的肌酐全血样本(43μM，155μM，353μM，609μM，876μM，1204μM)，每个样本使用日立3110生化分析仪进行肌酐测试，然后再使用本实施例中的检测卡和自制干式生化分析仪YX-G01进行测试(发射波长550nm)，每个样本重复测10次，分别记录下光电信号值。表3为6个不同浓度的肌酐全血样本肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号值。
表3 6个不同浓度的肌酐全血样本肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号值
Figure BDA0003596781110000151
将6个不同浓度的肌酐全血样本10次测试的肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号平均值作为横坐标，将6个不同浓度的肌酐全血样本已知肌酐浓度作为纵坐标，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线，如图5所示，从上表3中的测试数据来看，信号值与肌酐浓度成正比，通过线性拟合所得的标准曲线如图5，线性R2＞0.999,线性极好。
得到肌酐浓度和差分反射率的线性曲线后，按照10次测试的实际差分反射率计算每次测试的真实肌酐含量值，如表4所示，表4为6个不同浓度的肌酐全血样本肌酐测试值及偏差值。
表4 6个不同浓度的肌酐全血样本肌酐测试值及偏差值
Figure BDA0003596781110000161
由表4可知，本发明提供的肌酐测试卡的不同浓度下的测试结果中标准差SD值较小，变异系数CV较低，测试结果比较稳定，与生化实际值偏差较小，重复性一致性极好。
对比例：
对比例的对比基准为实施例1，在实施例1的基础上，按照现有技术将所有反应的酶液均设置在反应膜上；
即对比例中血肌酐测试卡由上下卡壳、打孔底板、扩散层、过滤层、分离层、反应层组成，上卡壳上设置有加样孔，下卡壳设置有与显色反应层对应的2个测试孔，2个测试孔分别为肌酸测试孔、肌酐+肌酸测试孔，打孔底板上的2个孔位置与显色反应层对应的下卡壳2个测试孔的位置相对应，打孔底板固定在下卡壳上，打孔基板上从下至上依次放置反应层、分离层、过滤层和扩散层，然后各个层位固定制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。将反应层、分离层、过滤层和扩散层固定后制成测试条的方法为超声波焊接器进行焊接固定。
扩散层为网纱，具有亲水性或经过网纱处理液处理后具亲水性；主要使得加样孔中的血液快速均匀的扩散；网纱处理液为表面活性剂溶液，所述表面活性剂为OP-10；质量含量为10％。
过滤层为纤维滤纸，作用为去除血样中的血细胞。
分离层为聚酯纤维；所述分离反应层经过抗干扰溶液处理，用于去除血液中的干扰物质；所述抗干扰溶液包括胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶；所述处理分离反应层的胆红素氧化酶浓度为12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为28KU/ml，所述分离层还负载有保护剂、缓冲液，所述处理分离层的保护剂质量浓度2％；保护剂为蔗糖和牛血清蛋白，其中，蔗糖质量浓度1.6％,牛血清蛋白质量浓度0.4％；所述缓冲液为pH 6.0盐酸缓冲液。
反应层为尼龙膜，所述肌酐+肌酸测试孔对应的尼龙膜上负载有肌酐酶和肌酸水解酶，所述肌酸测试孔对应的尼龙膜上负载有肌酸水解酶，所述处理尼龙膜的肌酸水解酶浓度为20KU/ml，肌酐酶浓度为30KU/ml；所述尼龙膜上还负载有肌氨酸氧化酶，所述处理尼龙膜的肌氨酸氧化酶浓度为30KU/ml；所述尼龙膜上还负载有过氧化氢酶，过氧化物酶浓度为30KU/ml，4-氨基安替比林和色原底物，色原底物为DAOS，所述处理反应层的色原底物质量浓度为1％，所述4-氨基安替比林质量浓度为3％，所述尼龙膜还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为8％，保护剂、缓冲液，所述处理尼龙膜的保护剂质量浓度5％；保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度4％,牛血清蛋白质量浓度1％；所述缓冲液为pH 8.0的Tris缓冲液，所述增稠剂为聚丙烯酸钠。
上述血肌酐检测卡的制备方法：
步骤S1：制备扩散层：扩散层为网纱，经过网纱处理液处理后具亲水性；配制表面活性剂溶液作为网纱处理液，所述表面活性剂为OP-10；质量含量为1～10％；
用网纱处理液浸泡网纱10分钟，放置于50℃干燥20分钟后使用；
步骤S2：制备过滤层：过滤反应层为纤维滤纸；
1)制备肌酐+肌酸测试孔对应过滤层
肌酐+肌酸测试孔对应过滤层为纤维滤纸，直接使用；
2)制备肌酸测试孔对应过滤反应层
肌酸测试孔对应过滤层为纤维滤纸，直接使用；
步骤S3：制备分离层：分离反应层为纤维滤纸；
配制分离层负载液，分离层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中胆红素氧化酶的浓度为12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为28KU/ml，质量浓度为2％的保护剂；缓冲液为pH 6.0盐酸缓冲液，保护剂为蔗糖和牛血清蛋白，其中，蔗糖质量浓度1.6％,牛血清蛋白质量浓度0.4％；即得到分离层负载液；
将分离层材料用配制的分离层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到分离层；
步骤S4：制备反应层：反应层为尼龙膜；
1)制备肌酐+肌酸测试孔对应的尼龙膜
配制负载液，反应层为尼龙膜，反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液；所述肌酐+肌酸测试孔对应的尼龙膜上负载有肌酐酶和肌酸水解酶，其中，肌酸水解酶浓度为20KU/ml，肌酐酶浓度为30KU/ml；肌氨酸氧化酶浓度为30KU/ml；过氧化物酶浓度为30KU/ml，4-氨基安替比林和色原底物，色原底物为DAOS，所述处理反应层的色原底物质量浓度为1％，所述4-氨基安替比林质量浓度为3％，所述尼龙膜还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为8％，保护剂、缓冲液，所述处理尼龙膜的保护剂质量浓度5％；保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度4％,牛血清蛋白质量浓度1％；所述缓冲液为pH 8.0的Tris缓冲液，所述增稠剂为聚丙烯酸钠，即得到肌酐+肌酸测试孔对应的尼龙膜负载液。
将尼龙膜用配制的肌酐+肌酸测试孔对应的尼龙膜负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酐+肌酸测试孔对应的尼龙膜反应层；
1)制备肌酸测试孔对应的尼龙膜
配制负载液，反应层为尼龙膜，反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液；所述肌酸测试孔对应的尼龙膜上负载有肌酸水解酶，其中，肌酸水解酶浓度为20KU/ml肌氨酸氧化酶浓度为30KU/ml；过氧化物酶浓度为30KU/ml，4-氨基安替比林和色原底物，色原底物为DAOS，所述处理反应层的色原底物质量浓度为1％，所述4-氨基安替比林质量浓度为3％，所述尼龙膜还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为8％，保护剂、缓冲液，所述处理尼龙膜的保护剂质量浓度5％；保护剂为牛血清蛋白及蔗糖，其中，蔗糖质量浓度4％,牛血清蛋白质量浓度1％；所述缓冲液为pH 8.0的Tris缓冲液，所述增稠剂为聚丙烯酸钠，即得到肌酸测试孔对应的尼龙膜负载液。
将尼龙膜用配制的肌酸测试孔对应的尼龙膜负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酸测试孔对应的尼龙膜反应层；
步骤S5：组装
首先将下卡壳的2个测试孔与打孔底板上的2个孔位置对齐后固定在下卡壳上，然后在打孔基板上从下至上依次放置反应层、分离层、过滤层和扩散层，将反应层、分离层、过滤层和扩散层固定后制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。
将反应层、分离层、过滤层和扩散层固定后制成测试条的方法为超声波焊接器进行焊接固定。
制备方法中所有步骤中的膜条处理制作过程以及检测卡的组装过程在23℃下，湿度30％的洁净空间完成，测试卡避光干燥保存。
一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的测试应用：
血肌酐检测卡在非疾病诊断或治疗为目的的血肌酐浓度测试中的应用。
血肌酐检测卡的测试应用方法为：
首先，滴入已知肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，由于肌酐浓度和反射率成比例关系，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线；
然后，滴入待测肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，通过建立的肌酐浓度和差分反射率的线性曲线计算待测血样中肌酐浓度值。
所述的光学差分肌酐信号处理方法为分别测试肌酐+内源性肌酸和内源性肌酸两个孔的两分钟终点反射率，然后对应的将对应的反射率做差分，得到血肌酐的两分钟终点反射率，通过建立的肌酐浓度-反射率差分曲线即可计算得到血肌酐的检测浓度。
分别配置6个不同浓度的肌酐全血样本(43μM，155μM，353μM，609μM，876μM，1204μM)，每个样本使用日立3110生化分析仪进行肌酐测试，然后再使用本实施例中的检测卡和自制干式生化分析仪YX-G01进行测试(发射波长550nm)，每个样本重复测10次，分别记录下光电信号值。表5为6个不同浓度的肌酐全血样本肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号值。
表5 6个不同浓度的肌酐全血样本肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号值
Figure BDA0003596781110000201
将6个不同浓度的肌酐全血样本10次测试的肌酸+肌酐和肌酸测试的反射率差分信号平均值作为横坐标，将6个不同浓度的肌酐全血样本已知肌酐浓度作为纵坐标，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线，从上表5中的测试数据来看，信号值与肌酐浓度成正比，通过线性拟合所得的标准曲线。
得到肌酐浓度和差分反射率的线性曲线后，按照10次测试的实际差分反射率计算每次测试的真实肌酐含量值，如表6所示，表6为6个不同浓度的肌酐全血样本肌酐测试值及偏差值。
表6 6个不同浓度的肌酐全血样本肌酐测试值及偏差值
Figure BDA0003596781110000202
Figure BDA0003596781110000211
由表6可知，本发明提供的肌酐测试卡的不同浓度下的测试结果中变异系数CV相对于实施例1和2中明显偏大，重复测试结果不太稳定，与生化实际值偏差较大，重复性一致性较本发明的肌酐测试条差。
综上所述，本发明公开一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡、制备方法及应用，肌酐测试卡由上下卡壳、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，过滤反应层设置有肌酐酶及肌酸水解酶，分离反应层上设置有肌氨酸氧化酶及抗干扰酶液，显色反应层上设置色原底物和过氧化氢酶，利用扩散层，过滤反应层、分离反应层处理分离得到血清的同时，使肌酐酶法分步反应在不同层分别进行，酶液分层设置，底物浓度及酶液浓度有利于各步反应更加充分，各步反应副产物不会对其他反应步骤的酶液及反应进程造成影响，比如分离反应层肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下生成的甲醛及甘氨酸副产物，由于其设置在肌酸与肌酐反应(过滤反应层)的下层，因此，副产物甲醛及甘氨酸不会对肌酐酶和肌酸水解酶造成影响，也不会对肌酐和肌酸的反应进程造成干扰，可以使得肌酐和肌酸在酶液浓度及底物浓度最合适的条件下进行反应，充分进行转化后再到下一层完成肌氨酸的反应，由于甲醛等副产物在分离反应层反应，过氧化氢酶设置在显色反应层，由于分层设置的拦截作用，甲醛等副产物对于过氧化氢酶的影响也比现有技术小很多，即使副产物随着血清向下层运移，由于过氧化氢酶只设置在显色反应层，过氧化氢酶浓度较高，分离反应层产生的过氧化氢浓度较高，副产物对显色反应的反应进程影响较小，从而也降低了副产物对后续反应的干扰和破坏，酶液按照分步反应进行分层设置，有利于减少干扰，为了使得各步充分反应，酶液设置在每层的负载液中均加入水溶性增稠剂，水溶性增稠剂一方面使得酶液成膜，均匀分布在每层，使反应更加高效，第二方面，水溶性增稠剂延缓血清向下扩散的速度，使其在每层充分完成各自的反应后扩散至下层反应，由于其水溶性，也不影响最终的产物运移，通过上述手段的协同，最大程度的将肌酐及肌酸反应转化，快速准确定量检测血肌酐含量，检测结果精确度和稳定性得到极大的提升，使用简单，无需专业人士操作。
至此，本领域技术人员认识到，虽然本文已详尽展示和描述了本发明的实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导符合本发明原理的许多其他变形或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变形或修改。

Claims (10)

1.一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡，其特征在于，所述血肌酐测试卡由上下卡壳、打孔底板、扩散层、过滤反应层、分离反应层、显色反应层组成，上卡壳上设置有加样孔，下卡壳设置有与显色反应层对应的2个测试孔，2个测试孔分别为肌酸测试孔、肌酐+肌酸测试孔，打孔底板上的2个孔位置与显色反应层对应的下卡壳2个测试孔的位置相对应，打孔底板固定在下卡壳上，打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，然后各个层位固定制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。
2.如权利要求1中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡，其特征在于，所述扩散层为网纱，具有亲水性或经过网纱处理液处理后具亲水性；主要使得加样孔中的血液快速均匀的扩散；网纱处理液为表面活性剂溶液，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、曲拉通X-100或OP-10中的一种或者多种；所述处理扩散层的表面活性剂溶液的质量含量为1～10％。
3.如权利要求1中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡，其特征在于，所述过滤反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维，第一作用为去除血样中的血细胞，所述肌酐+肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酐酶和肌酸水解酶，所述肌酸测试孔对应的过滤反应层上负载有肌酸水解酶，所述处理过滤反应层的肌酸水解酶浓度为5～20KU/ml，肌酐酶浓度为10～30KU/ml；第二作用是将血清中的肌酐和肌酸在过滤反应膜中进行反应；所述过滤反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2～8％，保护剂、缓冲液，所述处理过滤反应层的保护剂质量浓度0.1～5％；所述保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；所述缓冲液为pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种。
4.如权利要求1中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡，其特征在于，所述分离反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维；所述分离反应层经过抗干扰溶液处理，用于去除血液中的干扰物质；所述抗干扰溶液包括胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶；所述处理分离反应层的胆红素氧化酶浓度为1～12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为1～28KU/ml；所述分离反应层还负载有肌氨酸氧化酶，所述处理分离反应层的肌氨酸氧化酶浓度为10KU/ml～30KU/ml；所述分离反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2～8％，保护剂、缓冲液，所述处理分离反应层的保护剂质量浓度0.1～5％；所述保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；所述缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种。
5.如权利要求1中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡，其特征在于，所述显色反应层为尼龙膜，所述尼龙膜上负载有过氧化氢酶，过氧化物酶浓度为10～30KU/ml，4-氨基安替比林和色原底物，所述色原底物为DAOS,HDAOS中的一种，所述处理显色反应层的色原底物质量浓度为0.1～1％，所述4-氨基安替比林质量浓度为2-5％，所述显色反应层还负载有增稠剂，增稠剂质量浓度为2～8％，保护剂、缓冲液，所述处理显色反应层的保护剂质量浓度0.1～5％；所述保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；所述缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，所述增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种。
6.一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤S1：制备扩散层：扩散层为网纱，具有亲水性或经过网纱处理液处理后具亲水性；配制表面活性剂溶液作为网纱处理液，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、曲拉通X-100或OP-10中的一种或者多种；所述处理扩散层的表面活性剂溶液的质量含量为1～10％；
用网纱处理液浸泡网纱2～10分钟，放置于50℃干燥20分钟后使用；
步骤S2：制备过滤反应层：过滤反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维；
1)制备肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为5～20KU/ml，肌酐酶浓度为10～30KU/ml，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种，质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酐+肌酸测试孔对应过滤反应层；
2)制备肌酸测试孔对应过滤反应层
配制肌酸测试孔对应过滤反应层负载液，肌酸测试孔对应过滤反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中肌酸水解酶浓度为5～20KU/ml，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种；质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到肌酸测试孔对应过滤反应层负载液；
将肌酸测试孔对应过滤反应层材料用配制的肌酸测试孔对应过滤反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到肌酸测试孔对应过滤反应层；
步骤S3：制备分离反应层：分离反应层为玻纤、纤维滤纸或聚酯纤维；
配制分离反应层负载液，分离反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液，其中胆红素氧化酶的浓度为1～12KU/ml，抗坏血酸氧化酶的浓度为1～28KU/ml，肌氨酸氧化酶的浓度为10KU/ml～30KU/ml，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种；质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到分离反应层负载液；
将分离反应层材料用配制的分离反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到分离反应层；
步骤S4：制备显色反应层：显色反应层为尼龙膜；
配制显色反应层负载液，显色反应层负载液使用缓冲液做溶剂配置酶液、4-氨基安替比林和色原底物，过氧化物酶浓度为10～30KU/ml，质量浓度为0.1～1％的色原底物溶液，色原底物为DAOS,HDAOS中的一种，4-氨基安替比林，所述4-氨基安替比林质量浓度为2-5％，加入质量浓度为2～8％的增稠剂，增稠剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸钠、聚氧乙烯中的一种或者多种；质量浓度为0.1～5％的保护剂；缓冲液为pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或盐酸缓冲液或Tris缓冲液，保护剂为蔗糖、海藻糖、牛血清蛋白；即得到显色反应层负载液；
将显色反应层材料用配制的显色反应层负载液浸泡3分钟，取出后37℃干燥25分钟得到显色反应层；
步骤S5：组装
首先将下卡壳的2个测试孔与打孔底板上的2个孔位置对齐后固定在下卡壳上，然后在打孔基板上从下至上依次放置显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层，将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条，将测试条、上下卡壳配合组装成检测卡。
7.如权利要求6中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中将显色反应层、分离反应层、过滤反应层和扩散层固定后制成测试条的方法为胶粘固定或者超声波焊接器进行焊接固定。
8.如权利要求6中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的制备方法，其特征在于，所述制备方法中所有步骤中的膜条处理制作过程以及检测卡的组装过程在湿度30％以下的洁净空间完成，测试卡避光干燥保存。
9.如权利要求1-5中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的应用，其特征在于，所述血肌酐检测卡在血肌酐浓度测试中的应用。
10.如权利要求9中所述的一种光学差分信号处理的血肌酐检测卡的应用，其特征在于，所述应用方法为：
首先，滴入已知肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，由于肌酐浓度和反射率成比例关系，建立肌酐浓度和差分反射率的线性曲线；
然后，滴入待测肌酐浓度的血样，通过干式生化分析仪发射特定波长的光照射肌酐+肌酸测试孔及肌酸测试孔，然后通过光电二极管检测测试孔的反射光强度，分别计算反射率，将肌酐+肌酸测试孔反射率与肌酸测试孔反射率做差分得到差分反射率，通过建立的肌酐浓度和差分反射率的线性曲线计算待测血样中肌酐浓度值。
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