CN116953213A - 一种肾功能三联检测试剂卡及其应用 - Google Patents

一种肾功能三联检测试剂卡及其应用 Download PDF

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CN116953213A CN202310937786.9A CN202310937786A CN116953213A CN 116953213 A CN116953213 A CN 116953213A CN 202310937786 A CN202310937786 A CN 202310937786A CN 116953213 A CN116953213 A CN 116953213A
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宋雪薇
曾野
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Abstract

本发明提供了一种肾功能三联检测试剂卡及其应用，所述检测试剂卡包括试纸条，所述试纸条包括依次层叠的第一结构层、第二结构层和第三结构层；所述第一结构层为血样扩散层；所述第二结构层为反应层；所述反应层包括尿酸反应层、肌酐反应层和尿素反应层；所述尿酸反应层、肌酐反应层和尿素反应层依次并列张贴于第三结构层上；所述第三结构层为支撑层；所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液。本发明通过使用高分子材料进行物理隔离，阻止血细胞通过，每项检测需要液量5μL，仅需要15μL即可准确快速的完成三项联检。

Description

一种肾功能三联检测试剂卡及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种肾功能三联检测试剂卡及其应用。
背景技术
肾功能三项指血肌酐、尿素氮和尿酸的检查，这三种检查主要通过抽血化验检测。是最基础的可以初步判定肾功能的检查。血肌酐是指血液中肌酐的浓度，肌酐由肌肉代谢产生，经过肾脏排泄，可反映肾功能；尿素氮是蛋白质分解的最终产物，同样通过肾脏排泄；尿酸通常指血尿酸水平由嘌呤分解产生，通过肾脏排泄。三项指标均可初步反映肾功能是否正常，是否有肾功能不全或高尿酸血症。肾功能通常采用大型生化仪进行测试，试剂盒需要2-8℃保存，液相血清检测，需要从全血分离出血清进行检测，耗时长，且需要专业的检验人员进行操作。
干式化学又称为固相化学，采用多层薄膜的固相试剂技术。干式化学的生化测定具有快速、简便、用血量少等特点。只要把液体样品直接加到已固化于特殊结构的试剂载体，即干式化学的试剂中，以样品中的水为溶剂，将固化在载体上的试剂溶解后，再与样品中的待测成分进行化学反应，从而进行分析测定，得出待测物体浓度或者活度。每一个干片由3-5层滤纸或胶膜构成，每一层都有不同的功能。当标本通过每一层时，可分别应用物理和化学的方法将各种干扰因素(如脂肪微粒、蛋白纤维、微小凝块以及高血脂标本、溶血标本、高胆红素标本等)排除掉，标本的测定在最后一层进行，并应用反射光分析仪进行测定。
常规的光化学检测需要多层膜处理，每层膜都有一定的液体载量，这样需要样本量大。专利CN109856131B中的检测试剂条能同时检测三个项目，所述试剂条需要扩散层、全血分离层、辅助层以及反应层至少4层结构，至少35μL左右的加样量才能实现准确检测；同时因为多层膜材料检测时间延长，需要3-5分钟。因此提供一种新型微量、快速检测试剂卡对于肾功能检测具有重要应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种肾功能三联检测试剂卡及其应用。发明通过使用高分子材料进行物理隔离，阻止血细胞通过，每项检测需要液量5μL，仅需要15μL即可完成三项联检。本发明所述检测试剂卡可以制成肾功能干化学检测试剂盒，配合干式生化分析仪进行检测，属于即时诊断POCT产品，可以急诊、诊所现场直接用全血进行检测，也可以居家进行测试。具有简便、快速、灵活以及无需专业人员操作等优点。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种肾功能三联检测试剂卡，所述检测试剂卡包括试纸条，所述试纸条包括依次层叠的第一结构层、第二结构层和第三结构层；
所述第一结构层为血样扩散层；
所述第二结构层为反应层；所述反应层包括尿酸反应层、肌酐反应层和尿素反应层；所述尿酸反应层、肌酐反应层和尿素反应层依次并列张贴于第三结构层上；
所述第三结构层为支撑层；
所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述尿酸反应液包括：尿酸氧化酶、过氧化物酶、成膜剂、辅助剂、全血分离剂、色原和缓冲液；
所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述肌酐反应液包括：肌酐酶、肌氨酸氧化酶、肌酸水解酶、过氧化物酶、成膜剂、辅助剂、全血分离剂、色原和缓冲液；
所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液，所述尿素反应液包括：脲酶、成膜剂、辅助剂、全血分离剂、色原和缓冲液。
常规的光化学检测需要多层膜处理，每层膜都有一定的液体载量，这样需要样本量大，三个项目同时检测，需要至少35μL左右，本发明根据全血当中的有形成分的粒径大小，通过高分子材料物理隔离的方式阻止血细胞通过，血浆在反应层显色反应。三联检液量仅需要15μL即可，结果的准确性得到保证，膜层由原来的3-5层缩减到仅需要2层。
优选地，所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述尿酸反应液按浓度计包括：
本发明中所述尿酸氧化酶的浓度为1-20KU/L，例如可以是1KU/L、5KU/L、10KU/L、15KU/L或20KU/L等；过氧化物酶的浓度为1-50KU/L，例如可以是1KU/L、10KU/L、20KU/L、30KU/L、40KU/L或50KU/L等；成膜剂的浓度为0.1-20g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、5g/L、10g/L、15g/L或20g/L等；辅助剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、4g/L、5g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；全血分离剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、4g/L、5g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；色原的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、4g/L、5g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；缓冲液的浓度为0.1-1M，例如可以是0.1M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M或1M等。
本发明中，所述尿酸反应层一方面用于检测尿酸含量，另一方面用于分离血细胞，本发明将两种功能膜层集中到一层，将本来的两层膜减少至1层，减少膜层后不仅降低了成本，还可以减少测试样本的使用量。本发明中所述尿酸反应液中不仅含有检测尿酸的试剂，还含有全血分离剂。其中全血分离剂为高分子聚合物，检测尿酸的试剂中的主要成分是具有生物学活性的酶，只有将全血分离剂使用量控制在合适范围内，才能同时实现分离血细胞，又不影响尿酸氧化酶、过氧化物酶与尿酸的反应。本发明中所述全血分离剂在尿酸反应液中的浓度为0.1-10g/L时检测结果更准确，当全血分离剂的浓度大于10g/L，检测的准确度降低。
优选地，所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述肌酐反应液按浓度计包括：
本发明中所述肌酐酶的浓度为2-50KU/L，例如可以是2KU/L、10KU/L、30KU/L、40KU/L或50KU/L等；肌氨酸氧化酶的浓度为5-100KU/L，例如可以是5KU/L、10KU/L、20KU/L、40KU/L、60KU/L、80KU/L或100KU/L等；肌酸水解酶的浓度为5-100KU/L，例如可以是5KU/L、10KU/L、20KU/L、40KU/L、60KU/L、80KU/L或100KU/L等；过氧化物酶的浓度为1-20KU/L，例如可以是1KU/L、5KU/L、10KU/L、15KU/L或20KU/L等；成膜剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；辅助剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；全血分离剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；色原的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；缓冲液的浓度为0.1-1M，例如可以是0.1M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M或1M等。
本发明中，所述肌酐反应层一方面用于检测肌酐含量，另一方用于分离血细胞，本发明将两种功能膜层集中到一层，将本来的两层膜减少至1层，减少膜层后不仅降低了成本，还可以减少测试样本的使用量。本发明中所述肌酐反应液中不仅含有检测肌酐的试剂，还含有全血分离剂。其中全血分离剂为高分子聚合物，检测肌酐的试剂中的主要成分是具有生物学活性的酶，只有将全血分离剂使用量控制在合适范围内，才能同时实现分离血细胞，又不影响肌酐酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶与肌酐的反应。本发明中所述全血分离剂在肌酐反应液中的浓度为0.1-10g/L时检测结果更准确，当全血分离剂的浓度大于10g/L，检测的准确度降低。
优选地，所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液，所述尿素反应液按浓度计包括：
本发明中所述脲酶的浓度为5-100KU/L，例如可以是5KU/L、20KU/L、40KU/L、60KU/L、80KU/L或100KU/L等；成膜剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；辅助剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；全血分离剂的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；色原的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L或10g/L等；缓冲液的浓度为0.1-1M，例如可以是0.1M、0.2M、0.4M、0.6M、0.8M或1M等。
本发明中，所述尿素反应层一方面用于检测尿素含量，另一方用于分离血细胞，本发明将两种功能膜层集中到一层，将本来的两层膜减少至1层，减少膜层后不仅降低了成本，还可以减少测试样本的使用量。本发明中所述尿素反应液中不仅含有检测尿素的试剂，还含有全血分离剂。其中全血分离剂为高分子聚合物，检测尿素的试剂中的主要成分是具有生物学活性的酶，只有将全血分离剂使用量控制在合适范围内，才能同时实现分离血细胞，又不影响脲酶与尿素的反应。本发明中所述全血分离剂在尿素反应液中的浓度为0.1-10g/L时检测结果更准确，当全血分离剂的浓度大于10g/L，检测的准确度降低。
优选地，所述成膜剂选自羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯醇、明胶或黄原胶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述辅助剂选自EDTA钠盐、EDTA钾盐、氯化镁、氯化钾、吐温-20、枸橼酸钠、氯化钠、聚乙二醇200、聚乙二醇300、山梨糖醇酐单月桂酸酯、Triton X-100、海藻糖、牛血清白蛋白或Triton X-450中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述全血分离剂选自聚苯乙烯微球、聚二氧化硅微球、壳聚糖、聚乳酸微球或聚丙烯酸微球中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述色原选自4-氨基安替比林、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠、3,5-二氯羟基苯磺酸钠、酚酞、百里溴酚蓝或甲基红中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲液选自Tris缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液、MOPS缓冲液或磷酸盐缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述反应层的膜材料选自尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜或聚醋酸纤维素膜中的任意一种。
优选地，所述检测试剂卡还包括卡壳上盖和卡壳下盖，所述试纸条在卡壳上盖和卡壳下盖之间。
本发明中，所述试纸条上还包括标识条，所述标识条张贴于第三结构层上。
优选地，所述卡壳上盖设置有尿酸加样孔、肌酐加样孔和尿素加样孔。
优选地，所述卡壳下盖设置有尿酸检测孔、肌酐检测孔和尿素检测孔。
优选地，所述尿酸加样孔与尿酸检测孔对应位置的试纸条上为尿酸反应层。
优选地，所述肌酐加样孔与肌酐检测孔对应位置的试纸条上为肌酐反应层。
优选地，所述尿素加样孔与尿素检测孔对应位置的试纸条上为尿素反应层。
第二方面，本发明提供第一方面所述的肾功能三联检测试剂卡的制备方法，所述制备方法包括：
将各反应层的反应液喷涂在膜材料上，干燥；将反应层张贴于支撑层上，再将扩散层覆盖于反应层上得到试纸条，依次将卡壳上盖、试纸条和卡壳下盖组装。
优选地，所述尿酸反应层上尿酸反应液的喷涂量为15-45μL/cm2(例如可以是15μL/cm2、20μL/cm2、25μL/cm2、30μL/cm2、35μL/cm2、40μL/cm2或45μL/cm2等)，优选为20-25μL/cm2。
优选地，所述肌酐反应层上肌酐反应液的喷涂量为15-45μL/cm2(例如可以是15μL/cm2、20μL/cm2、25μL/cm2、30μL/cm2、35μL/cm2、40μL/cm2或45μL/cm2等)，优选为20-25μL/cm2。
优选地，所述尿素反应层上尿素反应液的喷涂量为15-45μL/cm2(例如可以是15μL/cm2、20μL/cm2、25μL/cm2、30μL/cm2、35μL/cm2、40μL/cm2或45μL/cm2等)，优选为20-25μL/cm2。
作为本发明的优选技术方案，所述试剂卡的制备方法包括如下步骤：
(1)将各反应层的反应液均匀喷涂在反应膜上，干燥；
(2)将标识条、裁切成4-4.5mm宽的反应层张贴于支撑层上；
(3)将扩散层覆盖于反应层上；
(4)根据试剂条卡壳宽度进行组装好的试剂条大板裁切；
(5)装入卡壳下盖，盖上卡壳上盖，压紧；
(6)试剂条组装完成。
第三方面，本发明提供第一种肾功能三联检测试剂盒，所述试剂盒中包含第一方面所述的肾功能三联检测试剂卡。
第四方面，本发明提供第一方面所述的肾功能三联检测试剂卡和/或第三方面所述的肾功能三联检测试剂盒在血液检测中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过使用高分子材料作为全血分离剂进行物理隔离，阻止血细胞通过，检测的液量仅需要15μL即可，克服了末梢采血困难的问题。
(2)本发明将所述的试剂卡制成肾功能干化学检测试剂盒配合干式生化分析仪进行检测，属于即时诊断POCT产品，可以急诊、诊所现场直接用全血进行检测，也可以居家进行测试。具有简便、快速、灵活以及无需专业人员操作等优点。
(3)本发明的检测结果的准确性得到保证，膜层由原来的3-5层缩减到2层，仅一层扩散层和一层反应层，无需膜层消耗的死体积，加样量减少，便于进行自测取样。
附图说明
图1是试剂卡中的试纸条的各层示意图，图中，10为血样扩散层，21为尿酸反应层，22为肌酐反应层，23为尿素反应层，30为支撑底板，31为标识条。
图2是试剂卡中的卡壳下盖的各孔示意图，图中，41为尿酸检测孔，42为肌酐检测孔，43为尿素检测孔。
图3是试剂卡中的卡壳上盖的各孔示意图，图中，51尿酸加样孔，52为肌酐加样孔，53为尿素加样孔。
图4是试剂卡组装后的示意图，图中，61为试剂卡的卡壳下盖，62为试剂条卡壳上盖，63为试纸条。
图5是实施例1的试剂卡的尿酸结果比对图。
图6是实施例1的试剂卡的肌酐结果比对图。
图7是实施例1的试剂卡的尿素结果比对图。
图8是实施例2的试剂卡的尿酸结果比对图。
图9是实施例2的试剂卡的肌酐结果比对图。
图10是实施例2的试剂卡的尿素结果比对图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下试剂的来源如下：
羟甲基纤维素：厂家：ALFA，货号：L04584701；
D-海藻糖：厂家：麦克林，货号：D807342；
聚苯乙烯微球：厂家：麦克林，货号：L815937；
二氧化硅微球：厂家：沃凯，货号：XW606768601；
壳聚糖：厂家：麦克林，货号：C850348；
聚乳酸微球：厂家：麦克林，货号：P875107。
实施例1
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，所述检测试剂卡包括卡壳上盖、试纸条和卡壳下盖，所述试纸条包括血样扩散层、支撑层，和依次并列张贴于支撑层上的标识条、尿酸反应层、肌酐反应层、尿素反应层，所述血样扩散层覆盖在反应层上。
所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述尿酸反应液按浓度计包括：2KU尿酸氧化酶、5KU过氧化物酶、8g羟甲基纤维素、6g D-海藻糖、2g牛血清白蛋白、0.8g EDTA二钠、80mL质量分数10％的粒径200nm聚苯乙烯微球、2g 4-氨基安替比林、0.8g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠和0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)配制成1L乳浊液备用。
所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述肌酐反应液按浓度计包括：4KU肌酐酶、40KU肌氨酸氧化酶、12KU肌酸水解酶、12KU过氧化物酶、8g羟甲基纤维素、2g牛血清白蛋白、0.8g EDTA二钠、80mL质量分数10％的粒径200nm聚苯乙烯微球、0.8g 4-氨基安替比林、0.8g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠和0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)配制成1L乳浊液备用。
所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液，所述尿素反应液按浓度计包括：8KU脲酶、4g明胶、2g牛血清白蛋白、1.6g EDTA二钾、2g吐温-20、0.8g海藻糖、80mL质量分数10％的粒径200nm聚苯乙烯微球、0.2g百里溴酚蓝和0.2M Tris缓冲液(pH 8.0)配制成1L乳浊液备用。
将各反应层的反应液均匀喷涂在底膜上，喷涂量为25μL/cm2，干燥；将标识条、裁切成4.5mm宽的反应层张贴于支持层上；将扩散层覆盖于反应层上；根据试剂条卡壳宽度进行组装好的试剂条大板裁切；装入卡壳下盖，盖上卡壳上盖，压紧；完成试剂条组装备用。
图1是试剂卡中的试纸条的各层示意图，图中，10为支撑层，21为尿酸反应层，22为肌酐反应层，23为尿素反应层，30为支撑底板，31为标识条。
图2是试剂卡中的卡壳下盖的各孔示意图，图中，41为尿酸检测孔，42为肌酐检测孔，43为尿素检测孔。
图3是试剂卡中的卡壳上盖的各孔示意图，图中，51尿酸加样孔，52为肌酐加样孔，53为尿素加样孔。
图4是试剂卡组装后的示意图，图中，61为试剂卡的卡壳下盖，62为试剂条卡壳上盖，63为试纸条。
实施例2
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，所述检测试剂卡包括卡壳上盖、试纸条和卡壳下盖，所述试纸条包括血样扩散层、支撑层，和依次并列张贴于支撑层上的标识条、尿酸反应层、肌酐反应层、尿素反应层，所述血样扩散层覆盖在反应层上。
所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述尿酸反应液按浓度计包括：2KU尿酸氧化酶、5KU过氧化物酶、8g羟甲基纤维素、4g D-海藻糖、2g牛血清白蛋白、0.8g EDTA二钠、1.2g聚乙二醇200、80mL质量分数10％的粒径约1μm聚二氧化硅微球、0.8g 4-氨基安替比林、0.8g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠和0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)配制成1L乳浊液备用。
所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述肌酐反应液按浓度计包括：4KU肌酐酶、40KU肌氨酸氧化酶、12KU肌酸水解酶、40KU过氧化物酶、8g羟甲基纤维素、2g牛血清白蛋白、0.8g EDTA二钠、1.2g聚乙二醇200、80mL质量分数10％的粒径约1μm聚二氧化硅微球，0.8g 4-氨基安替比林，0.8g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠，0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)配制成1mL乳浊液备用。
所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液，所述尿素反应液按浓度计包括：8KU脲酶、10g聚乙烯吡咯烷酮K30、2g牛血清白蛋白、0.8g EDTA二钠、1.2g聚乙二醇200、4g蔗糖、80mL质量分数10％的粒径约1μm聚二氧化硅微球、0.2g甲基红和0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制成1L乳浊液备用。
将各反应层的反应液均匀喷涂在底膜上，喷涂量为25μL/cm2，干燥；将标识条、裁切成4.5mm宽的反应层张贴于支撑层上；将扩散层覆盖于反应层上；根据试剂条卡壳宽度进行组装好的试剂条大板裁切；装入下卡壳，盖上上盖，压紧；完成试剂条组装备用。
实施例3
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，所述检测试剂卡包括卡壳上盖、试纸条和卡壳下盖，所述试纸条包括血样扩散层、支撑层，和依次并列张贴于支撑层上的标识条、尿酸反应层、肌酐反应层、尿素反应层，所述血样扩散层覆盖在反应层上。
所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述尿酸反应液按浓度计包括：20KU尿酸氧化酶、50KU过氧化物酶、20g羟甲基纤维素、7.2g D-海藻糖、2g牛血清白蛋白、0.8g EDTA二钠、80mL质量分数10％的粒径200nm聚苯乙烯微球、2g 4-氨基安替比林、0.8g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠和0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)配制成1L乳浊液备用。
所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述肌酐反应液按浓度计包括：50KU肌酐酶、80KU肌氨酸氧化酶、80KU肌酸水解酶、20KU过氧化物酶、10g羟甲基纤维素、8g牛血清白蛋白、0.8g EDTA二钠、80mL质量分数10％的粒径200nm聚苯乙烯微球、0.8g 4-氨基安替比林、0.8g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠和0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)配制成1L乳浊液备用。
所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液，所述尿素反应液按浓度计包括：50KU脲酶、10g明胶、6g牛血清白蛋白、1.6g EDTA二钾、2g吐温-20、80mL质量分数10％的粒径200nm聚苯乙烯微球、0.2g百里溴酚蓝、0.8g海藻糖和0.2M Tris缓冲液(pH 8.0)配制成1L乳浊液备用。
将各反应层的反应液均匀喷涂在底膜上，喷涂量为25μL/cm2，干燥；将标识条、裁切成4.5mm宽的反应层张贴于支撑层上；将扩散层覆盖于反应层上；根据试剂条卡壳宽度进行组装好的试剂条大板裁切；装入下卡壳，盖上上盖，压紧；完成试剂条组装备用。
实施例4
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于：
所述尿酸反应液中成膜剂为羟甲基纤维素，所述羟甲基纤维素的浓度为30g/L，所述辅助剂为EDTA二钠、海藻糖和牛血清白蛋白的组合，所述EDTA二钠、海藻糖和牛血清白蛋白质量比为2:15:5；所述辅助剂的浓度为20g/L。
所述肌酐反应液中的成膜剂为羟甲基纤维素，所述羟甲基纤维素的浓度为20g/L；所述辅助剂为牛血清白蛋白、EDTA二钠和聚乙二醇200，所述牛血清白蛋白、EDTA二钠和聚乙二醇200质量比为5:2:3；所述辅助剂的浓度为20g/L。
所述尿素反应液中的成膜剂为聚乙烯吡咯烷酮K30，所述聚乙烯吡咯烷酮K30的浓度为20g/L。所述辅助剂为牛血清白蛋白、EDTA二钠和聚乙二醇200，所述牛血清白蛋白、EDTA二钠和聚乙二醇200质量比为5:2:3；所述辅助剂的浓度为20g/L。
实施例5
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中全血分离剂为聚苯乙烯微球，所述全血分离剂的浓度为0.1g/L。
实施例6
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中全血分离剂为聚苯乙烯微球，所述全血分离剂的浓度为10g/L。
实施例7
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中全血分离剂为聚苯乙烯微球，所述全血分离剂的浓度为15g/L。
实施例8
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中全血分离剂为壳聚糖。
实施例9
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中全血分离剂为聚乳酸微球。
实施例10
本实施例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中全血分离剂为聚丙烯酸微球。
对比例1
本对比例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，本实施例与实施例1的区别仅在于，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中不含全血分离剂。
对比例2
本对比例提供一种用于同时检测样本中尿酸、肌酐、尿素三合一的检测试剂卡，组装试剂条增加市场上常用的滤血膜为滤血层；组装试剂条增加市场上常用的玻纤膜作为光反射辅助层；组装试剂条选用对比例1中处理的不添加血细胞分离剂的反应层。
将各反应层的反应液均匀喷涂在底膜上，干燥；将标识条、裁切成4.5mm宽的反应层张贴于支持层上；将反应层上覆盖光反射辅助层，滤血膜，将扩散层覆盖于滤血膜上；根据试剂条卡壳宽度进行组装好的试剂条大板裁切；装入下卡壳，盖上上盖，压紧；完成试剂条组装备用。
测试例1
将实施例1-10和对比例1制备的成品试剂卡，配套光景生物公司的干式生化分析仪LP-100对1例全血样本(3组平行实验)进行检测，同步采用大型生化仪同源血清样本的结果(尿酸218.87μmol/L、肌酐193.88μmol/L、尿素12.29mmol/L)进行对照实验，检测结果如表1所示。
表1-3为尿酸、肌酐和尿素与生化仪检测同源血清样本的结果
表1为尿酸比对结果。
表1
表2为肌酐比对结果：
表2
表3为尿素比对结果：
表3
/>
从表1-3可知，实施例1-3中制备的试剂卡的检测结果与大型生化仪的检测结果接近，准确度更高。
通过实施例1与实施例4的对比可知，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中的成膜剂和辅助剂的含量范围影响检测结果的准确度，在尿酸反应液中当成膜剂的浓度高于20g/L，辅助剂的浓度高于10g/L时，成膜剂和辅助剂会干扰尿酸氧化酶与过氧化物酶的反应，从而降低检测的准确度。上述三种反应液中成分类型多，只有将各组分控制在合适的范围才能实现良好的检测效果。
通过实施例1与实施例5-7的对比可知，所述尿酸反应液、肌酐反应液和尿素反应液中的全血分离剂的浓度在0.1-10g/L时，试剂卡与大型生化仪的结果一致性更高，当全血分离剂的浓度大于10g/L，检测的准确度降低。
通过实施例1与实施例8-10的对比可知，所述全血分离剂选自聚苯乙烯微球、聚二氧化硅微球、壳聚糖、聚乳酸微球、聚丙烯酸微球中的任何一种均能阻隔血细胞到反应膜上，实现良好的检测效果。
通过实施例1与对比例1的对比可知，添加血细胞分离剂，能够阻隔血细胞到反应膜上，能够正常的进行检测，检测结果有很好的相关性。
通过实施例1与对比例2的对比可知，常规的光化学检测需要多层膜处理，每层膜都有一定的液体载量，这样需要样本量大，三个项目同时检测，需要更大量的检测样品。将膜层由原来的3-5层缩减到2层后仅用少量的液量就可以实现准确的检测。
测试例2
将实施例1制备的检测试剂卡，配套光景生物公司的干式生化分析仪LP-100对30例全血样本进行检测，同步采用同源血清在大型生化仪上进行对照实验，比对结果如表4所示。
表4
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从表4中可知，用实施例1做的成品试剂卡与干式生化分析仪LP-100配合检测全血样本与同源血清大型生化测试的结果进行比对，比对结果如图5-7，图中R平方值都在0.95以上，结果表明与生化仪检测结果具有很好的线性相关性。
尿酸结果比对图如图5所示，图5中线性方程为y＝0.9736x+8.2033；R2＝0.9594。
肌酐结果比对图如图6所示，图6中线性方程为y＝0.9836x+3.0719；R2＝0.9894。
尿素结果比对图如图7所示，图7中线性方程为y＝0.984x+0.2006；R2＝0.991。
测试例3
将实施例2制备的检测试剂卡，配套光景生物公司的干式生化分析仪LP-100对30例全血样本进行检测，同步采用同源血清在大型生化仪上进行对照实验，比对结果如表5所示。
表5
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从表5中可知，用实施例2制备的成品试剂卡与干式生化分析仪LP-100配合检测全血样本与同源血清大型生化测试的结果进行比对。R平方值都在0.85以上，结果表明与生化仪检测结果具有良好的线性相关性。
尿酸结果比对图如图8所示，图8中线性方程为y＝1.0322x+22.881；R2＝0.8765。
肌酐结果比对图如图9所示，图9中线性方程为y＝1.08x+4.0083；R2＝0.9788。
尿素结果比对图如图10所示，图10中线性方程为y＝1.1085x-0.0562；R2＝0.9814。
测试例4
将对比例1中制备的检测试剂卡，配套光景生物公司的干式生化分析仪LP-100对30例全血样本进行检测，同步采用同源血清在大型生化仪上进行对照实验，比对结果如表6所示。
表6
从表6中可知，用对比例1制备的成品与干式生化分析仪LP-100配合检测全血样本，与同源血清大型生化测试的结果进行比对。因为渗血严重，所以对比例1中检出结果整体异常，结果之间没有相关性。结果表明，添加血细胞分离剂，能够阻隔血细胞到反应膜上，能够正常的进行检测，有很好的相关性。
测试例5
将对比例2中制备的检测试剂卡，配套光景生物公司的干式生化分析仪LP-100对30例全血样本进行检测，同步采用同源血清在大型生化仪上进行对照实验，比对结果如表7所示。
表7
用对比例2制备的成品试剂卡与干式生化分析仪LP-100配合检测全血样本，与同源血清大型生化测试的结果进行比对。因为增加了滤血膜和光反射辅助层，膜层增厚，相应的各层膜消耗的血容量也增加。导致到反应层的血浆容量不足，所以对比例2的检出结果整体偏低，部分因为红细胞压积超过45％，直接结果低于最低检出限。结果表明，添加血细胞分离剂的，避免使用常规的滤血膜和光反射辅助层，能够减少加液量，便于进行自测血样本，进行正常的检测。
综上，本发明提供了一种肾功能三联检测试剂卡，所述试剂卡与湿法大型生化仪检测结果比较，有很好的相关性；所述试剂卡仅含有一层扩散层和一层反应层，无需膜层消耗的死体积，相对于常规工艺来说，加样量仅需要15μL，加样量减少，便于进行自测取样。所述肾功能三联检测试剂卡配合干式生化分析仪进行检测，属于即时诊断POCT产品，可以急诊、诊所现场直接用全血进行检测，也可以居家进行测试。具有简便、快速、灵活以及无需专业人员操作等优点。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种肾功能三联检测试剂卡，其特征在于，所述检测试剂卡包括试纸条，所述试纸条包括依次层叠的第一结构层、第二结构层和第三结构层；
所述第一结构层为血样扩散层；
所述第二结构层为反应层；所述反应层包括尿酸反应层、肌酐反应层和尿素反应层；所述尿酸反应层、肌酐反应层和尿素反应层依次并列张贴于第三结构层上；
所述第三结构层为支撑层；
所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述尿酸反应液包括：尿酸氧化酶、过氧化物酶、成膜剂、辅助剂、全血分离剂、色原和缓冲液；
所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述肌酐反应液包括：肌酐酶、肌氨酸氧化酶、肌酸水解酶、过氧化物酶、成膜剂、辅助剂、全血分离剂、色原和缓冲液；
所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液，所述尿素反应液包括：脲酶、成膜剂、辅助剂、全血分离剂、色原和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的肾功能三联检测试剂卡，其特征在于，所述尿酸反应层上喷涂有尿酸反应液，所述尿酸反应液按浓度计包括：
3.根据权利要求1或2所述的肾功能三联检测试剂卡，其特征在于，所述肌酐反应层上喷涂有肌酐反应液，所述肌酐反应液按浓度计包括：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的肾功能三联检测试剂卡，其特征在于，所述尿素反应层上喷涂有尿素反应液，所述尿素反应液按浓度计包括：
5.根据权利要求1-4中任一项所述的肾功能三联检测试剂卡，其特征在于，所述成膜剂选自羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯醇、明胶或黄原胶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述辅助剂选自EDTA钠盐、EDTA钾盐、氯化镁、氯化钾、吐温-20、枸橼酸钠、氯化钠、聚乙二醇200、聚乙二醇300、山梨糖醇酐单月桂酸酯、Triton X-100、海藻糖、牛血清白蛋白或Triton X-450中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的肾功能三联检测试剂卡，其特征在于，所述全血分离剂选自聚苯乙烯微球、聚二氧化硅微球、壳聚糖、聚乳酸微球或聚丙烯酸微球中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述色原选自4-氨基安替比林、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠、3,5-二氯羟基苯磺酸钠、酚酞、百里溴酚蓝或甲基红中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲液选自Tris缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液、MOPS缓冲液或磷酸盐缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述反应层的膜材料选自尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚醚砜膜、聚偏氟乙烯膜或聚醋酸纤维素膜中的任意一种。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的肾功能三联检测试剂卡，其特征在于，所述检测试剂卡还包括卡壳上盖和卡壳下盖，所述试纸条在卡壳上盖和卡壳下盖之间；
优选地，所述卡壳上盖设置有尿酸加样孔、肌酐加样孔和尿素加样孔；
优选地，所述卡壳下盖设置有尿酸检测孔、肌酐检测孔和尿素检测孔；
优选地，所述尿酸加样孔与尿酸检测孔对应位置的试纸条上为尿酸反应层；
优选地，所述肌酐加样孔与肌酐检测孔对应位置的试纸条上为肌酐反应层；
优选地，所述尿素加样孔与尿素检测孔对应位置的试纸条上为尿素反应层。
8.权利要求1-7中任一项所述的肾功能三联检测试剂卡的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将各反应层的反应液喷涂在膜材料上，干燥；将反应层张贴于支撑层上，再将扩散层覆盖于反应层上得到试纸条，依次将卡壳上盖、试纸条和卡壳下盖组装；
优选地，所述尿酸反应层上尿酸反应液的喷涂量为15-45μL/cm2；
优选地，所述肌酐反应层上肌酐反应液的喷涂量为15-45μL/cm2；
优选地，所述尿素反应层上尿素反应液的喷涂量为15-45μL/cm2。
9.一种肾功能三联检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求1-7中任一项所述的肾功能三联检测试剂卡。
10.权利要求1-7中任一项所述的肾功能三联检测试剂卡和/或权利要求9中所述的肾功能三联检测试剂盒在血液检测中的应用。
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