CN102757893B - 肌酸酐测定用干式试验片及肌酸酐测定法 - Google Patents

Abstract

本发明提供肌酸酐测定用干式试验片及肌酸酐测定法。肌酸酐测定用干式试验片1的特征在于，具备支持体2、设置在该支持体2上的试剂层4、设置在该试剂层4上的试剂保持层5及由使试剂层4与试剂保持层5胶粘的形成为斑点状的胶粘剂构成的连接层6，所述试剂层4含有肌酸酐酶及4-氨基安替比林，所述试剂保持层5含有肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶及N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，并且连接层6使滴加在所述试剂保持层5上的液态样品延迟到达试剂层4。

Description

肌酸酐测定用干式试验片及肌酸酐测定法

技术领域

本发明涉及肌酸酐测定用干式试验片及肌酸酐测定法。

背景技术

肌酸酐是肌酸通路的最终代谢物，肌酸具有脱水而成环的结构。在体内，大部分以肌酸或磷酸肌酸的形式存在于肌肉中。肌酸从ATP接受高能磷酸而形成磷酸肌酸，从而作为储能物质发挥作用。具体而言，磷酸肌酸在肌肉收缩等能量消耗时向ADP转移高能磷酸而变回肌酸，或者通过非酶反应而形成肌酸酐。然后，生成的肌酸酐通过肾脏排泄到尿中。

因此，肌酸酐的尿中排泄量即尿中浓度被用作肌肉疾病和肾功能障碍的指标。此外，在患肾功能障碍等情况下，血中的肌酸酐浓度可以作为疾病的指标。

在集体诊察的现场或筛选检查等初期诊断的情况下，为了迅速地进行肌酸酐的尿中、血清中或血浆中的浓度的测定，广泛使用将与肌酸酐发生反应而显色的试剂预先涂布或浸渗到支持体上并使其干燥而成的干式试验片。

现有的肌酸酐测定用干式试验片利用在强碱性条件下由肌酸酐与苦味酸的缩合物引起的显色反应(捷非氏反应)。作为这样的试验片之一，日本特开平09-061430号公报中公开了一种肌酸酐测定用试验片，其由支持体、负载在该支持体上的含有3，5-二硝基苯甲酸的试剂层和设置在该试剂层上的含有氢氧化锂等强碱性物质的展开层构成。

此外，作为用于测定肌酸酐的显色反应，还已知有酶法。日本专利第4243255号公开了对由肌酸酐与肌酐亚胺水解酶的反应生成的气态氨进行定量的干式分析元件。具体而言，在透明支持体上依次一体地层叠有：含有由于气态氨而产生可检测的变化的指示药的指示药层、使气态氨通过的液体阻断层、含有碱性缓冲剂且可以根据需要与基质发生反应而生成氨的试剂层、以及展开层。

此外，就现有的湿式肌酸酐测定试剂盒而言，利用作为酶法的一种的肌酸酶-肌氨酸氧化酶-过氧化物酶法。“CRE-L試薬カイノス添付文書，第4版，カイノス株式会社，2010”、“N-アツセイCRE-Lニツト一ボ一添付文書，第11版，日东纺织株式会社，2008”及“エクセライザCRE添付文書，第6版，积水医疗株式会社，2008”中公开了一种由第一反应试剂和第二反应试剂构成的湿式肌酸酐测定试剂盒。第一反应试剂利用肌酸酐酶预先将样品中的内源性肌酸分解。第二反应试剂添加到添加了第一反应试剂而反应后的样品中，利用肌酸酶使样品中的肌酸酐转变为肌酸，并利用肌酸酐酶使该肌酸分解为肌氨酸和尿素，使该肌氨酸与肌氨酸氧化酶反应而生成过氧化氢，在该过氧化氢及过氧化物酶存在下使供氢体化合物及4-氨基安替比林发生氧化缩合，由此生成醌色素。

但是，日本特开平09-061430号公报所示的现有的利用捷非氏反应的肌酸酐测定用干式试验片，在低浓度范围内测定肌酸酐时存在误差大的缺点。

日本专利第4243255号所公开的干式分析元件在低浓度范围内测定肌酸时的误差比利用捷非氏反应时小，但存在如下缺点：不能完全消除样品中的内源性氨的影响，此外，需要复杂的层结构来控制作为反应产物的氨气，从而使制造的成品率低。

此外，现有的干式试验片中，由于该试验片中所含的所有试剂都进入样品中来发生反应，因此，如果不借助日本专利第4243255号中记载的氨气等气体，则不能将由两阶段以上构成的反应体系应用于干式试验。因此，作为在反应过程中不产生气体的两阶段反应体系的“CRE-L試薬カイノス添付文書，第4版，カイノス株式会社，2010”、“N-アツセイCRE-Lニツト一ボ一添付文書，第11版，日东纺织株式会社，2008”及“エクセライザCRE添付文書，第6版，积水医疗株式会社，2008”中记载的肌酸酶-肌氨酸氧化酶-过氧化物酶法，到目前为止还不能用于干式试验片。

发明内容

本发明鉴于上述问题而完成，其目的在于，提供在低浓度范围内测定肌酸酐时的误差小且具有简单的结构的肌酸酐测定用干式试验片以及使用该试验片的肌酸酐测定法。

为了实现上述目的，本发明的第一观点的肌酸酐测定用干式试验片的特征在于，

具备：支持体、设置在该支持体上的试剂层、设置在该试剂层上的试剂保持层以及设置在上述试剂层与上述试剂保持层之间来连接上述试剂层与上述试剂保持层的连接层，

上述试剂层含有肌酸酐酶，

上述试剂保持层含有肌酸酶和肌氨酸氧化酶，

过氧化物酶、4-氨基安替比林以及供氢体化合物各自包含在上述试剂层和上述试剂保持层中的仅任意一者的层中或者包含在两者的层中，且

上述连接层使滴加在上述试剂保持层上的液态样品延迟到达上述试剂层。

优选上述连接层由以形成彼此分离的多个斑点的方式涂布的胶粘剂构成，并且上述斑点之间存在没有上述胶粘剂的部分。

优选上述供氢体为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺。

优选上述试剂保持层和/或上述试剂层还含有缓冲剂。

为了实现上述目的，本发明的第二观点的肌酸酐测定法是使用本发明的第一观点的肌酸酐测定用干式试验片的肌酸酐测定法，其特征在于，具备：

在上述试剂保持层上滴加液态样品的步骤；

在上述液态样品中的内源性肌酸被上述肌酸酶完全分解后，对上述肌酸酐测定用干式试验片的显色程度进行测定的第一测定步骤；

从上述第一测定步骤开始经过预定时间后，对上述肌酸酐测定用干式试验片的显色程度进行测定的第二测定步骤；

从上述第二测定步骤中测定的显色程度中减去上述第一测定步骤中测定的显色程度来获得从上述第一测定步骤开始至上述第二测定步骤为止的显色程度的变化量的步骤；及

通过求出与上述变化量相对应的标准曲线的值来确定上述液态样品中的肌酸酐浓度的步骤。

为了实现上述目的，本发明的第三观点的肌酸酐测定法是使用本发明的第一观点的肌酸酐测定用干式试验片的肌酸酐测定法，其特征在于，具备：

在上述试剂保持层上滴加液态样品的滴加步骤；

上述滴加步骤后，直到上述肌酸酐测定用干式试验片与液态样品反应而使显色达到稳态为止，对上述肌酸酐测定用干式试验片的显色程度进行经时记录的步骤；

在上述记录中获得从上述显色程度的变化率发生变化的时刻开始至显色达到稳态的时刻为止的上述显色程度的每单位时间的变化量的步骤；及

通过求出与上述变化量相对应的标准曲线的值来确定上述液态样品中的肌酸酐浓度的步骤。

附图说明

图1A是表示本发明的实施方式的肌酸酐测定用干式试验片的构成的立体图。

图1B是图1A的A-A纵剖面图。

图2A是表示使用实施例1的肌酸酐测定用试验片来测定高肌酸样品时的K/S值的经时变化的图。

图2B是表示测定高肌酸酐样品时的K/S值的经时变化的图。

图3是对使用实施例1的肌酸酐测定用试验片并利用反应时间差测定法测得的ΔK/S值与使用分析装置测得的肌酸酐浓度测定值进行作图而示出的图。

图4A是表示使用实施例1及2的肌酸酐测定用试验片来测定肌酸酐浓度低的样品时的K/S值的经时变化的图。

图4B是表示测定肌酸酐浓度高的样品时的K/S值的经时变化的图。

具体实施方式

以下，参考附图对本发明的实施方式详细地进行说明。

(实施方式)

如图1A及图2A所示，本发明的实施方式的肌酸酐测定用干式试验片1由支持体2和负载在支持体2上的试剂部3构成。试剂部3由形成于支持体2上的试剂层4、以覆盖该试剂层4的方式形成的试剂保持层5、以及在试剂层4与试剂保持层5之间形成的用于、连接试剂层4与试剂保持层5的连接层6构成。

支持体2优选不具有液体渗透性。由此，在使用本实施方式的肌酸酐测定用干式试验片1来测定肌酸酐时，滴加到试剂层4、试剂保持层5上的液态样品停留在试剂层4及试剂保持层5内，因此，能够高精度地进行测定。作为支持体2，可以使用纸片、塑料(合成树脂)片、金属片等。从批量生产率、低成本、保存性和耐水性等观点出发，优选使用合成树脂片。

此外，在滴加液态样品而使检测反应发生之后的光学分析中，使光从支持体侧照射时，需要支持体2具有透光性。与此相对，使光从试剂保持层5侧照射时，不要求透光性。

试剂层4含有肌酸酐酶。试剂层4以具有液体渗透性的材质为主体而构成。特别优选以水溶性材质为主体、并且其中分散有试剂。由此，在测定时，试剂层4中所含的试剂可进入到滴加在位于上层的试剂保持层5上的液态样品中。作为水溶性材质，可以使用以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为代表的水溶性高分子化合物等。此外，试剂层4也可以是在具有液体渗透性的纸、编织物或机织物等布帛材料中分散有试剂的构成。

试剂保持层5含有肌酸酶及肌氨酸氧化酶。试剂保持层5以具有液体渗透性的材质为主体而构成。特别优选以水溶性材质为主体、并且其中分散有试剂。由此，在测定时，滴加到试剂保持层5上的液态样品在试剂保持层5中迅速且均匀地扩散。作为水溶性材质，可以使用以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为代表的水溶性高分子化合物等。此外，试剂保持层5可以是在具有液体渗透性的纸、编织物或机织物等布帛材料中分散有试剂的构成。

连接层6通过以在试剂层4的表面形成彼此分离的多个斑点的方式涂布胶粘剂来胶粘试剂层4与试剂保持层5而形成。由多个斑点状的胶粘剂构成的连接层6以在试剂保持层5与试剂层4之间夹有少许空隙的方式将它们连接。在样品滴加到试剂保持层5上时，由于该空隙的存在，液态样品在从试剂保持层5向试剂层4移动的过程中产生延迟。因此，滴加到试剂保持层5上的液态样品，首先优先地在试剂保持层5中扩散，然后向试剂层4中移动。

本实施方式中，显色反应如下进行：在由肌氨酸氧化酶引起的肌氨酸的水解而产生的过氧化氢以及过氧化物酶的存在下，通过4-氨基安替比林及供氢体化合物的偶联反应而形成有色醌。因此，过氧化物酶、4-氨基安替比林及供氢体化合物包含在试剂层4或试剂保持层5中的至少一层中。

作为供氢体化合物，有：N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-磺丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(DAPS)、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺(HDAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺(MAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)及N-磺丙基苯胺(HALPS)等。

试剂层4和/或试剂保持层5可以含有用于提高它们所含的酶的反应或保存稳定性的缓冲剂。优选氢离子浓度指数(pH)在pH为6～9的范围内。作为缓冲剂，可以使用例如磷酸缓冲剂、N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-羟基-3-丙磺酸)二水合物(POPSO)等公知的缓冲剂。

在打算作为肌酸酐测定用干式试验片1的测定对象的液态样品为微量、例如约5μl的情况下，试剂层4及试剂保持层5只要是数毫米×数毫米左右的面积即可。而且，由于难以用手等来握住这些层，因此，优选将支持体2设置成宽度为约数毫米至约1厘米的细长片，以使其能够作为把手来使用。

此外，对于肌酸酐测定用干式试验片1中的各试剂的含量，对于肌酸酐酶而言，只要是至少足以与预定的测定上限量的肌酸酐发生反应的量即可。对于其他试剂而言，只要是至少足以与预定的测定上限量的肌酸酐以及液态样品中的内源性肌酸发生反应的量即可。

例如，测定对象为血清时，包括患者来源的血清在内的血清中的肌酸酐浓度为约0.3mg/dl～约20mg/dl，肌酸浓度为约0.2mg/dl～约0.6mg/dl。根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS，NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards)，在对对象物质进行测定时，关于给其测定带来影响的干扰物质，只要是以干扰物质的上限值的约3倍为基准即可。因此，将肌酸酐的测定上限设定为20mg/dl，将内源性肌酸浓度的基准值设定为1.8mg/dl，从而确定各试剂的浓度即可。此外，即使对健康人而言血中的肌酸浓度也可能由于补充物等的摄取而增加。因此，更优选在考虑到这种预计血中肌酸浓度的升高部分的情况下来确定内源性肌酸浓度的基准值。例如，在上述例的情况下，更优选将内源性肌酸浓度的基准值设定为5.0mg/dl。

滴加液态样品时形成的反应液中的各试剂的优选浓度如下。

肌酸酐酶：20-1000U/ml

肌酸酶：20-1000U/ml

肌氨酸氧化酶：20-300U/ml

过氧化物酶：50-3000U/ml

4-氨基安替比林：5-100mM

供氢体化合物：5-100mM

本发明的实施方式的肌酸酐测定用干式试验片1可以如下制作。

首先，将用于制作支持体2的具有预定材质和预定厚度的片材切割成预定尺寸的细长片。对细长片进行清洗并干燥，由此制作支持体2。

接着，制作试剂层4。首先，使肌酸酐酶以及根据需要的过氧化物酶、4-氨基安替比林、供氢体化合物及pH缓冲剂分散在具有液体渗透性的材质中。

在具有液体渗透性的材质为水溶性高分子化合物等水溶性材质的情况下，使其溶解于纯水中而制成水溶液，使上述各试剂溶解在水溶液中并搅拌，由此使上述各试剂分散。然后，涂布到支持体2的预定部位处并进行干燥，制成试剂层4。

在具有液体渗透性的材质为纸、编织物或机织物等布帛材料的情况下，使上述各试剂溶解在纯水中并搅拌而形成水溶液，并使该水溶液被预定尺寸的布帛材料吸收，由此使其分散。然后，进行干燥而除去水分，制成试剂层4。然后，将试剂层4层叠到支持体2上。作为该方法，在试剂层4为以水溶性材质为主体的试剂层的情况下，用纯水润湿底面并压接在支持体2的预定位置处。由此，底面的水溶性材质发生溶解而发挥出胶粘剂的作用。作为其他方法，也可以利用胶粘剂将试剂层4胶粘在支持体2上。

接着，制作试剂保持层5。首先，对于试剂保持层5而言，使肌酸酶及肌氨酸氧化酶以及根据需要的过氧化物酶、4-氨基安替比林、供氢体化合物及pH缓冲剂分散在具有液体渗透性的材质中。

在具有液体渗透性的材质为水溶性高分子化合物等水溶性材质的情况下，使其溶解于纯水中而制成水溶液，使上述各试剂溶解到该水溶液中，并通过搅拌使其分散。然后，涂布到平坦的基材上并进行干燥，之后从基材上剥离而制成试剂保持层5。

在具有液体渗透性的材质为纸、编织物或机织物等布帛材料的情况下，使上述各试剂溶解到纯水中并进行搅拌而形成水溶液，并使该水溶液被预定尺寸的布帛材料吸收，由此使其分散。然后，进行干燥而除去水分，制成试剂保持层5。

接着，将试剂保持层5层叠到试剂层4上，并利用胶粘剂进行胶粘。胶粘剂只要是不阻碍上述各酶的反应的胶粘剂即可。优选在试剂层上以形成彼此分离的多个斑点的方式来涂布胶粘剂，并且以在斑点之间形成没有胶粘剂的部分的方式进行胶粘。由此形成连接层6。

这样，可以制作本发明实施方式的肌酸酐测定用干式试验片1。

接着，对使用本实施方式的试验片来测定血清、血浆或尿等液态样品中的肌酸酐浓度的方法进行说明。

首先，将液态样品滴加到试剂保持层5上。滴加的液态样品在试剂保持层5中沿横向扩散，同时取入试剂保持层5中所含的各种试剂。此时，首先，通过取入的肌酸酶的作用，样品中所含的内源性肌酸分解成尿素和肌氨酸。然后，通过进入样品中的肌氨酸氧化酶的作用，经肌氨酸的水解而产生过氧化氢。

与以上反应同时进行的是，扩散到试剂保持层5中的样品接着到达试剂层4。样品的扩散这样阶段性地进行的原因在于，试剂保持层5与试剂层4由连接层6以具有若干空隙的方式连接。通过使样品的扩散阶段性地进行，在本实施方式的试验片中，利用肌酸酶及肌氨酸氧化酶的酶反应在试剂保持层5中进行到一定程度后，样品到达试剂层4。此时样品逐渐地取入试剂层4中的肌酸酐酶，通过肌酸酐酶的作用使样品中的肌酸酐转变成肌酸。然后，通过已进入到样品中的肌酸酶与肌氨酸氧化酶的作用，根据肌酸酐来源的肌酸量产生过氧化氢。由于试剂保持层5与试剂层4中含有过氧化物酶、4-氨基安替比林及供氢体化合物，因此，通过利用这些试剂的显色反应，在该阶段的样品中，形成与过氧化氢量相应的量的醌色素。

由上，根据来源于内源性肌酸的过氧化氢的产生量及来源于肌酸酐来源的肌酸的过氧化氢的产生量，形成醌色素。来源于内源性肌酸的过氧化氢的产生在来源于肌酸酐来源的肌酸的过氧化氢的产生之前开始，因此，即使在内源性肌酸耗尽而使来源于内源性肌酸的过氧化氢的产生结束后，来源于肌酸酐来源的肌酸的过氧化氢的产生也可以继续进行。根据内源性肌酸与肌酸酐来源的肌酸的反应的时间差，能够将内源性肌酸与肌酸酐来源的肌酸区分开。

具体而言，滴加样品后，采用光学测定方法对显色程度(K/S值)经时地进行测定。测定波长只要是接近所形成的有色醌的吸收峰的波长即可，优选400～700nm，特别优选580～640nm。显色反应达到稳态后，对经时的K/S值的变化进行分析。此时，可以作如下推定：在经时地作图而得到的K/S值的斜率发生变化之处，来源于内源性肌酸的过氧化氢的产生结束、而来源于肌酸酐来源的肌酸的过氧化氢的产生持续的状态开始。这是因为，肌酸酶及肌酸酐酶与各自的底物的反应速度不同，因此，来源于内源性肌酸的过氧化氢的产生速度与来源于肌酸酐来源的肌酸的过氧化氢的产生速度不同。通过读取仅来源于肌酸酐来源的肌酸的过氧化氢的产生所持续的时间范围内的K/S值的每单位时间的变化量，可以排除内源性肌酸的影响并且求出来源于样品中所含的肌酸酐的显色量。最后，通过将检测到的该K/S值的每单位时间的变化量与预先制作好的标准曲线比较等来确定样品中所含的肌酸酐浓度。

此外，可以不对K/S值经时地进行测定，取而代之，在滴加液态样品后经过预定的时间t1之后，进行第一次K/S值测定，然后，再经过预定的时间t2之后，进行第二次K/S值测定，从而得到第二次测定的K/S值与第一次测定的K/S值的差，由此，可以求出仅来源于肌酸酐来源的肌酸的过氧化氢的产生所持续的时间范围内的K/S值的每单位时间的变化量。预定的时间t1只要在使本试验片与样品反应时的来源于内源性肌酸的过氧化氢的产生结束的时间的上限以上即可。血清、血浆或尿等液态样品中所含的内源性肌酸的量包括在液态样品的每个来源大致恒定的范围内。因此，使本试验片与样品反应时来源于内源性肌酸的过氧化氢的产生结束的时间的上限可以由液态样品的来源和测定量来推定。预定的时间t2只要小于使本试验片与含有测定下限量的肌酸酐的液态样品反应时的过氧化氢的产生结束的时间即可。如果这样确定预定的时间t2，则在利用本试验片对打算测定的含有测定范围内的肌酸酐的液态样品进行测定时，预定的时间t2包括在其显色反应持续的时间范围内。在预定的时间t2偏离显色反应持续的时间范围的情况下，可能会损失标准曲线的线性而无法测定准确的肌酸酐浓度。

(变形例)

实施方式中，连接层6由形成为多个斑点状的胶粘剂形成，取而代之，也可以通过利用涂布在试剂层4的整个单面上的液体渗透性的胶粘剂对试剂层4与试剂保持层5进行胶粘来形成连接层6。此时，作为胶粘剂，优选使用液态样品在该胶粘剂中的渗透速度比液态样品在试剂保持层5中的扩散速度慢的胶粘剂。连接层6由这种胶粘剂构成时，与连接层6相比，滴加在试剂保持层5上的液态样品会优先地扩散到试剂保持层5中。因此，液态样品在试剂保持层5中进行某种程度的扩散之后，经过渗透过连接层6的时间差后到达试剂层4。即，样品从试剂保持层5向试剂层4的传输仅延迟渗透过连接层6的时间。

除了上述变形例之外，如果连接层6是使液态样品从试剂保持层5至试剂层4的传输时间比不借助连接层6而使试剂保持层5与试剂层4密接时的传输时间延迟的结构，则可以是任意的。例如，在实施方式中，为了在试剂保持层5与试剂层4之间设置空隙而使用由设置成多个斑点状的胶粘剂构成的连接层6，取而代之，也可以使用由浸渗有胶粘剂的具有液体渗透性的网状布帛材料构成的连接层6。此外，也可以通过在与试剂层4相对的试剂保持层5的一面上浸渗使液体渗透性降低的非水溶性聚合物来作为连接层6。在制造该连接层6时，试剂保持层5与试剂层4的连接可以不使用胶粘剂而是通过将湿润状态的连接层6压接到试剂层4后使其干燥来进行。此外，通过用纯水将试剂保持层5的底面润湿后层叠到试剂层4上并使其干燥来对试剂保持层5与试剂层4进行胶粘时，试剂保持层5的底面也可以作为连接层6发挥作用。

(实施例1)

以下，示出实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定在以下的实施例的范围内。需要说明的是，在没有特别说明的情况下，纯水使用去离子水。

首先，从厚度为0.2mm的白色聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)片上切下尺寸为长度70mm×宽度5mm的细长片，制成支持体。

接着，在22ml磷酸缓冲液(pH7.5)中溶解300U肌酸酐酶(キツコ一マン株式会社制造)、81mg 4-氨基安替比林(キシダ化学株式会社制造)、435mg海藻酸钠(ナカライテスク株式会社制造)。将该水溶液充分搅拌后，脱气。将全部溶液以形成长度7mm×宽度5mm×厚度0.1mm的尺寸的方式涂布到支持体的一端上。然后，在40℃下干燥20分钟，使水分完全蒸发，制成膜状试剂层。

在该试剂层上层叠以布帛材料为主体而构成的试剂保持层。作为布帛材料，使用KBセ一レン株式会社的ザヴイ一ナ(注册商标)。在12mL磷酸缓冲液(pH7.5)中溶解49mg N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺钠盐(DAOS)(同仁化学研究所株式会社制造)、10KU肌酸酶(キツコ一マン株式会社制造)、600U肌氨酸氧化酶(キツコ一マン株式会社制造)、10KU过氧化物酶(东洋纺株式会社制造)。将该水溶液充分搅拌后，脱气。使全部溶液渗入到长度7mm×宽度5mm×厚度0.2mm的ザヴイ一ナ中。然后，在40℃下干燥20分钟，使水分蒸发。

使用胶粘剂将该试剂保持层胶粘而层叠到试剂层上。使用丙烯酸类胶粘剂作为胶粘剂，以在试剂层上涂布成点状并且在点之间形成没有胶粘剂的部分的方式进行胶粘。

(实施例2)

与实施例1同样地制作支持体、试剂层、试剂保持层。但是，并不使用胶粘剂将试剂保持层胶粘在试剂层上，取而代之，用纯水将试剂保持层的底面润湿后层叠到试剂层上，并使其干燥，由此进行胶粘。

(肌酸与肌酸酐的反应时程)

为了研究能否将由内源性肌酸引起的显色反应与由肌酸酐来源的肌酸引起的显色反应辨别开，对使肌酸多的样品A(肌酸酐浓度0.79mg/dL，肌酸浓度5.47mg/dL)及肌酸酐多的样品B(肌酸浓度5.08mg/dL，肌酸酐浓度0.49mg/dL)与实施例1的肌酸酐测定用试验片反应时的显色程度(K/S值)的经时变化进行了比较。作为测定装置，使用爱科来株式会社的桌上型反射率测定装置スポツトケム(注册商标)EZ。将试验片放置在桌台上，自上方滴加5.0μl的样品。然后，对波长610nm处的反射率(R)经时地进行测定。将反射率(R)利用库伯卡-芒克(Kubelka-Munk)式(K/S＝(1-R)²/2R)换算为K/S值。对每个样品进行六次测定。图2A是表示样品A的显色反应的经时变化的图，图2B是表示样品B的显色反应的经时变化的图。在各图中，样品A及B的K/S值是对六次测定的平均值进行作图。由图2A可知，来源于内源性肌酸的显色反应在滴加样品后180秒达到稳态。另一方面，由图2B可知，由样品中的肌酸酐来源的肌酸引起的显色反应持续到滴加样品后300秒。因此可知，可以通过计算出滴加样品后180～300秒之间的吸光变化量来确定由肌酸酐来源的肌酸引起的显色反应量即样品中的肌酸量。

(测定操作)

基于上述发现，在本实施例中，如下所述，使用肌酸酐测定用试验片来测定肌酸酐浓度。作为测定装置，使用爱科来株式会社的桌上型反射率测定装置スポツトケム(注册商标)EZ。将肌酸酐测定用试验片放置在桌台上，自上方滴加5.0μl的样品。然后，对波长610nm处的反射率(R)经时地进行测定。将反射率(R)利用库伯卡-芒克(Kubelka-Munk)式(K/S＝(1-R)²/2R)换算为K/S值。预先通过对已知浓度样品进行测定，制作测定后180秒至300秒之间的K/S值的变化量(ΔK/S值)与肌酸酐浓度的标准曲线。以测定后180秒至300秒之间的K/S值的变化量和该标准曲线为基础，计算出样品中的肌酸酐浓度。需要说明的是，以下，将该K/S值的测定法称为反应时间差测定法。

(内源性肌酸浓度的影响)

为了验证实施例1的肌酸酐测定用试验片中的内源性肌酸的影响的有无，利用实施例1的肌酸酐测定用试验片对肌酸酐浓度相同(0.54mg/dL)、但肌酸浓度不同的样品C(肌酸浓度0.42mg/dL)及样品D(肌酸浓度5.59mg/dL)的肌酸浓度进行了六次测定。结果，利用实施例1的肌酸酐测定用试验片测定得到的样品C的平均肌酸浓度为0.52mg/dL，样品D的平均肌酸浓度为0.52mg/dL。将实施例1的肌酸酐测定用试验片与反应时间差测定法组合来测定肌酸浓度时，未观察到内源性肌酸的影响。

(相关性试验)

为了比较实施例1的肌酸酐测定用试验片的准确性，对预先利用肌酸酐分析装置(荣研化学株式会社制造)测定了肌酸酐浓度的85个人的血清样品中的肌酸酐浓度进行了测定。图3是对使用分析装置进行测定而得到的肌酸酐浓度测定值(0.54～16.33mg/dL)与使用实施例1的肌酸酐测定用试验片并利用反应时间差测定法进行测定而得到的ΔK/S值进行作图而示出的图。使用分析装置时的测定值、与使用实施例1的肌酸酐测定用试验片并利用反应时间差测定法进行测定而得到的ΔK/S值显示出0.99的强相关性。此外，由本试验的结果可知，利用实施例1的肌酸酐测定用试验片的肌酸酐浓度测定可以在0.54～16.33mg/dL这样宽的浓度范围内得到线性良好的测定结果。

(同时测定试验)

为了研究实施例1的肌酸酐测定用试验片的同时重现性和准确性，分别对肌酸酐浓度不同的两个样品即样品E(肌酸酐浓度0.75mg/dL)及样品F(肌酸酐浓度9.14mg/dL)的肌酸酐浓度各同时测定24次。结果，利用实施例1的肌酸酐测定用试验片测定得到的样品E的平均肌酸浓度为0.78mg/dL，样品F的平均肌酸浓度为9.17mg/dL。此外，利用实施例1的肌酸酐测定用试验片测定得到的各样品的变异系数均在3％以内，显示出非常良好的同时重现性。

表1

	样品E	样品F
			测定值(mg/dL)	0.79	9.14
1	0.77	9.07
			2	0.79	9.31
3	0.78	8.67
			4	0.78	9.15
5	0.78	9.22
			6	0.76	9.36
7	0.73	8.70
			8	0.79	9.29
9	0.77	8.96
			10	0.79	9.21
11	0.78	9.18
			12	0.79	9.58
13	0.76	9.12
			14	0.78	9.37
15	0.78	9.42
			16	0.80	9.47
17	0.75	8.97
			18	0.83	9.10
19	0.79	8.98
			20	0.77	9.32
21	0.74	8.97
			22	0.78	9.50
23	0.74	8.99
			24	0.80	9.18
平均值(mg/dL)	0.78	9.17
			标准偏差	0.022	0.233
变异系数(％)	2.8	2.5

(连接层的影响的比较)

为了调查连接层的性质给反应时间差测定法带来的影响，使用连接层不同的实施例1及实施例2的肌酸酐测定用试验片对样品G(肌酸酐浓度0.89mg/dL，肌酸浓度6.1mg/dl)及样品H(肌酸酐浓度22.30mg/dL，肌酸浓度5.8mg/dl)的K/S值经时地进行测定。图4A表示测定肌酸酐浓度低的样品时的K/S值的经时变化，图4B表示测定肌酸酐浓度高的样品时的K/S值的经时变化。此外，将利用各肌酸酐测定用试验片的肌酸酐浓度的测定值示于表2中。由图4A及图4B所示的反应时程可知，对于任一样品而言，实施例2的肌酸酐测定用试验片均显示出比实施例1的肌酸酐测定用试验片高的K/S值。认为这是因为，对于实施例2的肌酸酐测定用试验片而言，与实施例1的肌酸酐测定用试验片相比，样品迅速地从试剂保持层移动到试剂层，因而内源性肌酸在试剂保持层中未发生显色而使反应的时间缩短，结果，更多的内源性肌酸来源的过氧化氢发生显色反应。此外，如表2所示，使用实施例2的肌酸酐测定用试验片时的测定结果与使用实施例1的肌酸酐测定用试验片时的测定结果相比，显示出较低的值。认为这是因为，对于实施例2的肌酸酐测定用试验片而言，与实施例1的肌酸酐测定用试验片相比，样品迅速地从试剂保持层移动到试剂层，因而肌酸酐的显色反应也从更早的时刻开始发生，结果，在180～300秒的测定时间范围内，样品中的大部分肌酸酐已被消耗。进而，对肌酸酐浓度不同的样品G及H进行比较时，在使用实施例1的肌酸酐测定用试验片的情况下，实际的肌酸酐浓度与测定值之间的偏离在两个样品中是同等程度的。另一方面，在使用实施例2的肌酸酐测定用试验片的情况下，实际的肌酸酐浓度与测定值之间的偏离在肌酸酐浓度高的样品H中比样品G中大。基于上述情况，可以认为像实施例2的肌酸酐测定用试验片那样，在样品迅速地从试剂保持层移动到试剂层的情况下，对高浓度的肌酸酐进行测定时，容易受到内源性肌酸的影响。

表2

本申请基于2011年4月28日提出的日本专利申请2011-102426号提出。本说明书中，将日本专利申请2011-102426号的说明书、权利要求书和附图全部以参照的形式引入。

Claims (5)

1.一种肌酸酐测定用干式试验片，其特征在于，

具备：支持体、设置在该支持体上的试剂层、设置在该试剂层上的试剂保持层以及设置在所述试剂层与所述试剂保持层之间来连接所述试剂层与所述试剂保持层的连接层，

所述试剂层含有肌酸酐酶，

所述试剂保持层含有肌酸酶和肌氨酸氧化酶，

过氧化物酶、4-氨基安替比林以及供氢体化合物包含在所述试剂层和所述试剂保持层中的仅任意一者的层中或者包含在两者的层中，且

所述连接层由以形成彼此分离的多个斑点的方式涂布的胶粘剂构成，并且所述斑点之间存在没有所述胶粘剂的部分，使滴加在所述试剂保持层上的液态样品延迟到达所述试剂层。

2.如权利要求1所述的肌酸酐测定用干式试验片，其特征在于，所述供氢体为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺。

3.如权利要求1所述的肌酸酐测定用干式试验片，其特征在于，所述试剂保持层和/或所述试剂层还含有缓冲剂。

4.一种肌酸酐测定法，是使用权利要求1所述的肌酸酐测定用干式试验片的肌酸酐测定法，其特征在于，具备：

在所述试剂保持层上滴加液态样品的步骤；

在所述液态样品中的内源性肌酸被所述肌酸酶完全分解后，对所述肌酸酐测定用干式试验片的显色程度进行测定的第一测定步骤；

从所述第一测定步骤开始经过预定时间后，对所述肌酸酐测定用干式试验片的显色程度进行测定的第二测定步骤；

从所述第二测定步骤中测定的显色程度中减去所述第一测定步骤中测定的显色程度来获得从所述第一测定步骤开始至所述第二测定步骤为止的显色程度的变化量的步骤；及

通过求出与所述变化量相对应的标准曲线的值来确定所述液态样品中的肌酸酐浓度的步骤。

5.一种肌酸酐测定法，是使用权利要求1所述的肌酸酐测定用干式试验片的肌酸酐测定法，其特征在于，具备：

在所述试剂保持层上滴加液态样品的滴加步骤；

所述滴加步骤后，直到所述肌酸酐测定用干式试验片与液态样品反应而使显色达到稳态为止，对所述肌酸酐测定用干式试验片的显色程度进行经时记录的步骤；

在所述记录中获得从所述显色程度的变化率发生变化的时刻开始至显色达到稳态的时刻为止的所述显色程度的每单位时间的变化量的步骤；及

通过求出与所述变化量相对应的标准曲线的值来确定所述液态样品中的肌酸酐浓度的步骤。