JPS61500152A

JPS61500152A - 流動体迅速定量分析用装置

Info

Publication number: JPS61500152A
Application number: JP50395184A
Authority: JP
Inventors: ホフ，クレイグ・アール; ポーラク，ロバート・ビー; セラミ，アンソニイ
Original assignee: イノメデイクス・インコ−ポレイテツド
Priority date: 1983-10-17
Filing date: 1984-10-17
Publication date: 1986-01-30
Also published as: AU3552284A; EP0159355A1; WO1985001747A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】流動体迅速定量分析用装置本願は、１９８３年１０月１７日出願の米国特許出願第５４ノ２．６０１号の一部継続出願であり、その内容は参照により本願に包含されるものである。

本発明は、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の迅速且つ視覚的なアッセイを可能ならしめる流動体定過分析用装置に関する。本装置は生物学的流動体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄｌ中の酵素及び酵素基質のアッセイ及び特に酵素結合試薬を使用する特異的結合アッセイにおいて有用である。

［発明の背景］産業及び医療分野の研究室において、流動体の定量分析が必要とされることが多い。例えば疾病の診断は体液中の特異的な成分の化学的定量分析の結果に依ることがある。今日、例えば血液や尿のような体液の分析方法は数多（知られている。それ等は一般に、非常に鋭敏で正確な器具を使用し、疾病を示し得る微小量の物質を検出するのに有用である。しかしながら、これ等の器具は高価で較正を必要とするため、臨床研究室外での使用には適していない。

従って、より簡単な体液用分析装置の開発のための研究が行なわれてきた。流動体と接触することによって観察可能な変色を起すようにした試験片が工夫されてきた。例えば、色原体紙片により尿中のグルコースが検知され得る（米国特許第２，９８１．６０６号明細書）。タンパク質、ケトン体及びその他の置換基が同様に、適当な色原体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）を含浸させた紙片あるいは他の不活性表面によりアッセイされ得る。その他に、試料の取扱い性及び分析改良のために多層成分を有するものが開発されてきた（米国特許第３，９１７，４３０号明細書及び第３．９９２．１５８号明細書）。

これ等の装置は通常、反応後に較正されたコントロールと比較づ−ることにより半定量的なものになっている。

しかしながら、これ等の測定は判別が困難な微少な変色を観察し比較しなければならないため、この測定の精度には限界がある。その上このような測定の再現性は、周囲条件、試料の取り扱い及び応用の変化を受けやすく、疑わしいものである。

（ワルター・ビー［Ｗａｌｔｅｒ　Ｂ、］　（也、アナリテイ力ル　ケミストリー［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］５５：４９８（１９８３））　。そのような装置で正確な結果を得るためには、試験物質の取り扱い上の細心の注意及び適切な技術、良好な採光、秀れた睨力が重要である（アジズーＩス［Ａｚｉｚ　Ｓ、］他、ダイアベーラ　ケア［ＤｉａｂｅｔｅｓＣａｒｅｌ　６　（６）：５２９−５３２（１９８３））。

エイチ・チー・ホッフシュトラッセ−（１■、　ｔｌＯ＋Ｊ１ｓｔｒａｓｓｅｒ、）による１つの研究（米国特許第３，９６４，８７１号明細書く１９７６）及び４，０５９．４０７号明細書（１９７７））は流動体中のグルコース及び他の物質のアッセイ用の試験片を開示している。この試験片は複数の試薬ゾーンを含んでおり、それぞれが分析物と反応する化学試薬を含んでおり、反応の結果指示薬が酸化され着色するものである。各ゾーンはまた、色糸形成に必要な反応物の１つを消費する物質を含んでいる。各ゾーンは漸増する異なった量の物質を含有しているため試験片は流動体中に存在する分析物の淵度範凹を定量できる。しかしながら、ホッフシュトラッセーは、ヘモグロビンのような物質による干渉を防止する手段を開示していない。従ってこのような装置は全血液の直接の正確なアッセイには使用できない。さ・らにホッフシュトラッセーは、被験流動体の温度変化あるいは、試験片と流動体の接触時間の変化に対する試験片の標準化のための内部手段を何も開示していない。

それ故、装置が流動体に接触しすぎると非常に多くの為陽性結果を起し得る。さらに長い間流動体を接触させると定量する物質を消費してしまい定量が完全にできなくなってしまう。

同様に、他の内部調節あるいは補償手段を持たない他の試験片において、試験片の流動体に対する接触が不足あるいは過度の場合に得られる結果に重大な誤差があることが報告されている。マーシャル・ニス・エム（Ｈａｒｓｈａ　ｌ　、　Ｓ、　Ｈ，）他、ダイアベート最近では、モノクローナル抗体の出現により中細な定量装置に対する関心が高まっている。モノクローナル抗体によるイムノアッセイは非常に鋭敏なものであるが、非臨床の分野においては通常わずかの変色によって観察される。このわずかの変色を標準と正確に比較することは難しい。

従って本発明の目的は、流動体、特に体液の改良分析用の新しい装置及び方法を提供することである。

［発明の要旨］本発明は流動体（ｆｌｕｉｄ）中の分析物（ａｎａ＋ｙｔｅ）の存在を測定する簡便で迅速な方法及びそのような方法を実施するための装置（ｄｅｖｉｃｅ）に係る。

一実施態様において該装置は、検出可能な生成物を生成するための、例えば酵素のような第１触媒と第１触媒を所定の速度で阻害する補償手段（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒ　ｍｅａｎｓ）を含浸させた支持部材（ｓｕｐｐｏｒｔ　ｍｅｍｂｅｒ）を含む。

もう１つの装置は、第１試薬を含有する流動体において、該第１試薬と酵素基質の反応により検出可能な反応生成物を生成する反応の酵素の存在の測定に有用である。この装置は該酵素の基質と酵素を所定速度で阻害する補償手段を含浸（ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅ）させた支持部材を含む。

もう１つの実施態様は、第１試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）を含有する分析物の存在を測定する装置を提供するものであって、第２試薬は第１試薬と反応し得るものであり、また検出可能な反応生成物を生成する反応のための第１触媒の基質であって、第１触媒は分析物に結合している。該装置は分析物と結合し得る生化学的試薬と第１触媒を所定の速度で阻害する補償手段を含浸した支持部材を含む。本装置はイムノアッセイのような特異的結合アッセイあるいはＤＮＡプローブとして有用である。

例えば検出可能な反応生成物である第１反応生成物の生成のために本発明の種々の装置を作製した。この生成物は可視光線を吸収してもよいがする必要はない。

本発明の装置はまた、可視光線を吸収する化合物を生成する、第１反応生成物と指示試薬との反応のための、例えば酵素のような、第二の触媒を含んでいてもよい。指示試薬は他の試薬のように、装置に含浸されていてもよく、あるいは被験流動体に添加されてもよい。

本発明の補償手段は、第１触媒即ち装置の酵素、あるいは可視光線を吸収する化合物の生成のための指示試薬の反応の触媒を阻害する。該補償手段は第２触媒から成り、第２触媒の基質及び第２試薬を含む流動体に好適な触媒で、第２試薬と第２触媒の基質との反応は阻害剤を生成する。また一方、第２触媒の基質が装置に含浸されており、第２触媒が流動体中に存在していてもよく、あるいは第２触媒及びその基質の両者が装置に含浸されていてもよい。

また一方、該補償手段は第１触媒即ち酵素の阻害剤あるいは可視光線を吸収する化合物を生成する指示試薬の反応の触媒の阻害剤であり、該阻害剤は装置が流動体と接触した後に所定の速度で阻害剤を放出し得る適当な材料中にカプセル化されている。

本発明の補償手段は、触媒的なものあるいはカプセル化されたちのいずれにせよ、所定の速度で関連する触媒を阻害するものである。

本発明の装置はまた、検出可能な反応生成物あるいは可視光線を吸収する化合物と反応する定量化試薬の既知の吊を含み得る。該装置は支持部材上の少なくとも２つの分離したゾーン内に前記の成分を含有する。少なくとも２つのゾーン内の定著化試薬の既知の吊が異なっている場合、２つのゾーンは異なった濃度の分析物の存在を示すので該装置は定量アッセイに有用である。

種々の分析物及び酵素のアッセイ、ヘテロジーナス（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）及びホモジーナス（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）な特異的結合アッセイ及びサンドウィッヂアッゼイ（ｓａｎｄｗｉｃｈ　ａｓｓａｙ）並びに核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける本発明装置の様々な使用方法もまたここに開示する。

［図面の簡単な説明１第１Ａ図及び第１Ｂ図は複数の試薬ゾーンを有する装置を示し、各ゾーンは指示試薬とゾーン毎に異なるＹの定量化手段を含んでいる。

第１Ａ図は流動体に接触させる以前の装置を示す。

第１Ｂ図は流動体に接触させた後の装置を示す。

６つのゾーンのうちの３つが指示試薬の変化を示しており、流動体中の分析物の存在が、変化した３つのゾーンのそれぞれの定量化剤の量に対応する最小濃度以上であることを示す。

［発明の詳細な説明］本発明は、分析物と反応し検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含む流動体中の該分析物の存在を測定するための簡便で迅速な方法及びこの方法を実施するための装置に係わる。

一実施態様に於いては、該装置は検出可能な生成物を生成するための例えば酵素のような第１触媒と所定速度で第１触媒を阻害するための補償手段で含浸（ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅ）させられた支持部分を含んでいる。適当な酵素としては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。

本発明の上記実施態様及び他の実施態様に於ける該装置の支持部材としては、様々な成分及び試薬がそれに含浸され得るどのような適当な物質も含まれ得る。例えばセルロース製品、アクリル製品、ポリエステル又はセラミックの不溶性高分子が適当である。成分は該支持物質によって形成されたマトリックスの中に含浸させられてもよいし、慣用方法によって適当な結合剤によりその支持部材上に不動化させられていてもよい。

好ましくは第１触媒は、例えば生成物が可視光を吸収するような化合物であり直接に検出し得るか、又は本明細書中で開示されるように指示試薬によって間接的に検出し得るような、検出可能な反応生成物の生成の触媒になる酵素である。そうでなければ一方、分析物が酵素の場合には、支持部材には該酵素の適切な基質が適当に含浸させられる。該酵素としては適当には酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼであり得る。好ましい一実施態様に於いて、該酸化還元酵素は、適当な条件下で例えばグルコース又はコレステロールといった適切な基質と適当な第１試薬、例えば酸素の存在下でそれぞれ反応する、過酸化水素の生成を触媒することができる、例えばそれぞれグルコースオキシダーゼ又はコレステロールオキシダーゼというような酵素である。この実施態様又は他の実施態様に於ける使用に適した他の数々の酵素−基質対は、例えば１９７４年の米国特許第３．８１７．８３７号明細書及び１９７７年の第４．ｏ５９，４０７号明細書にあるように酵素を種々の物質に含浸又は不動化させるための方法として当業者には公知のものである。この実施態様又は他の実施態様に於いて酵素が使用され又は検出される場合には、酵素反応が進行するように適当な緩衝液やイオン塩類を該装置又は流動体に添加する。

補償手段は温度依存性であり得る所定の速度で第１触媒を阻害することによって、検出可能な生成物の触媒による生成が進行する度合を調節するための内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ　５ｔａｎｄａｒｄ）として働く。

この実施態様及び他の実施態様の装置に於ける補償手段としては、流動体が第２触媒に対する基質及び第２試薬を含んでいる場合には第２触媒が適当であり、該基質と第２試薬との第２触媒による反応で第１触媒の阻害剤が生成される。

そうでなければ一方、流動体が第２触媒及び第２試薬を含む場合には、補償手段は第２触媒に対する基質を適当に含み、該基質と第２試薬との第２触媒による反応は上記と同様に第１触媒の阻害剤を生成する。

他の実施態様に於いては、補償手段は第２触媒とそれに対する基質を適当に含み、流動体は第２試薬を含み、上記のように該基質と第２試薬との第２触媒による反応によって第１触媒に対する阻害剤が生成される。

上記の補償手段の各実施態様に於いて、その触媒反応は第１試薬及び分析物の反応と同時に独立に進行する。第１触媒による反応と第２触媒による反応とは同時に進行するが、検出可能な反応生成物が検出可能な母だけ生成されるまで時間が経過してしまうまでは、本発明の補償手段は第１触媒をほぼ完全に阻害するに充分の阻害剤を生成しない。補償手段として用いられる適当な物質の量を選択することによって検出可能な反応生成物が触媒によって生成されるに許される時間を予め決めることが可能である。こうして、例えばある量の阻害剤が第１触媒をほぼ完全に阻害するのに要求されるとしたならば、この量の阻害剤を生成するのに必要な帝の第２触媒とその基質が採用され得る。この量の阻害剤が生成されるに要する時間は単純な速度反応論研究によって予め決めることができる。従って、適当量の物質を選ぶことによって、第１触媒が機能することのできる時間を内部的に標準化し得る。この時間の内部補償によって、時間によって引き起こされる変量を除去し、これによって試験操作が簡便になり様々なアッセイの比較が信頼し得るものになもし補償生成物の生成速度が温度に関して予測可能な様式で変化するならば、補償手段は温度に関する内部標準にもなり得る。第１触媒の触媒活性と同じ様式で温度に対して阻害剤の生成に関して変化する補償手段を選択することによって、温度変数によって引き起こされる変量をも除去し得る。このように、この補償手段によって外部的な温度調節又は標準化の必要をなくすことが可能である。

例えばシアン化物によって阻害される′Ｍ素を第１触媒として含む実施態様に於いては、第２触媒はマンゾロニトリルリアーゼが適当でありその第２触媒に対する基質はマンゾロニトリルである。そして第２試薬は水であり、この第２試薬及びマンゾロニトリルの反応で生成される第１触媒に対する阻害剤はシアン化物イオンである。

また一方、第２触媒としてβ−グルコシダーゼが適当であり、その第２触媒に対する基質はアミグダリン、第２試薬は水であり、第２試薬の反応によって生成される第１触媒に対する阻害剤はシアン化物イオンである。

検出可能な生成物の生成を触媒しジオン化物によっては阻害されないような他の数多くの種類の酵素は当該分野で公知であり、本発明の第１触媒として使用され得る。このような場合、例えば硫化物、特殊アミノ酸又は他の基質のような適切な阻害剤の生成を触媒する適当な酵素は当業者によって容易に選択可能であり、補償手段のための第２触媒として用いられる。

もう１つの実施態様に於いて補償手段は装置が流動体と接触した後、所定速度で阻害剤を放出し得るような適当な物質のカプセルに包まれた第１触媒に対する阻害剤である。

適当な物質としては多孔性物質及び徐々に又は所定時間内に分解される物質が含まれ、どちらの場合にも所定速度で、含有されている阻害剤を放出し得る。カプセル化に適当な物質及びその方法は公知である。米国特許第３．０９２，４６３号明細書（１９６３年）、第３，２５２．７６４号明細書（１９６６年）、第３，２４０．１１７号明細書（１９６６年）及び第３゜３４１．４６６号明細書（１９６７年）を参照のこと。数々の酵素に対する適当な阻害剤も公知である。例えば、酵素（ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ）、　３版、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　、　ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　１９７１年、酵素ハンドブック第１及び■巻、パルマン・チー・イー（Ｂａｒｍａｎ、　Ｔ、　Ｅ、　）版、スプリンガーフェアラーグ・ニューヨークイン］（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＩｎｃ、）を参照のこと。

いくつかの実１Ｍ態様に於いては、検出可能な反応生成物の触媒による生成は多段階プロセスであり、各段階に於いて、異なる触媒によって触媒反応が行なわれ得、様々な異なる試薬の添加を要求し得る。このような場合、本発明の第１触媒として働く触媒、即ち補償手段によって阻害される触媒はその触媒を阻害する上での勘弁を基に選択され得る。

−実ｍ態様に於ける検出可能な生成物は可視光を吸収する化合物である。もう１つの実施態様に於いては、装置は可視光を吸収する化合物を生成する為に指示試薬と検出可能な反応生成物との反応に対する第二の触媒をも含浸している。該装置は適当量の指示試薬も含浸し得る。そうでなければ一方１、指示試薬は流動体に添加されてもよい。適当な指示試薬として酸化還元、ｐＨ又はキロメトリック（ＣｈｅｌｏＩＩｌｅｔｒｉｃ）指示試薬が含まれる。

指示試薬として好ましくは、触媒反応によって変色する色原体である。そうでなければ一方、指示試薬は密度（ｄｅｎｓｉｔｙ）又は他の視覚的に観察され得る物理的変化を受けるものであり得る。この装置が研究室又は診療所で使用されるような場合には、指示試薬の触媒生成物及び検出可能な反応生成物は機械方法によって観察され得る。

こうして例えば、血中又は尿中の成分例えばグルコース又はトリグリセリドを適当な条件下で、それぞれグルコースオキシダーゼ又はリパーゼ、グリセロールキナーゼ及びＧＰオキシダーゼ（そうでなければ又は、リパーゼ及びグリセロールデヒドロゲナーゼ）と接触し過酸化水素を形成し得る。この過酸化水素は本明細書中で述べる装置と方法で測定され得る。現在の好ましい実施態様の１つに於いて、指示試薬は酸化還元試薬フェニレンジアミンである。ｍ−アミノサリチル酸及び、例えば０−ジアニシジン、ｐ−トルイジン、０−トルイジン、ｐ−ジフェニルアミンスルホン酸及びＮ−Ｎ’　ジフェニルインドアニリンを含む当該分野で公知の他の指示試薬も適当である。米国特許第４，０５９，４０７号明細書（１９７７年）及び第４．３９１．９０６号明細書（１９８３年）を参照のこと。

本発明の装置はまた、検出可能な反応生成物と反応しその生成物を消費する既治量の定量化試薬で含浸され得る。検出可能な反応生成物が還元され易い場合には、その定量化試薬は例えばアスコルビン酸又はその塩が適当であり得る。検出可能な反応生成物がｐＨ−感受性の場合には、定量化試薬は緩衝液が適又は高濃度の為に指示試薬よりも速く生成物と反応し得る。例上記式中、Ｓは分析物又は第１触媒に対する他の基質：［は装置に含浸させられているか又は装置上で不動化させられている第１触媒（好ましくは酵素）又は測定すべき物質；Ｐは検出可能な反応生成物：Ｑは未反応の定量化試薬：Ｐ′　はＰから導かれる無色の生成物＝Ｑ′　は消費された定量化試薬である。■は可視光を吸収する化合物である■ ′を生成する指示試薬である。

ビもまたＱと反応し■を生成し得る。

本発明の装置に於いて、第１触媒、補償手段及び定量化試薬はそれぞれ支持部材上の少なくとも２つの離れたゾーン内に在り、少なくとも２つのゾーンに在る定量化試薬の缶は異なっている。このような装置は分析物の異なる濃度の存在を示すのに用いることができる。もう１つの実施態様に於いて、少なくとも２つのゾーンは異なる成分を含み得、少なくとも２つの異なった分析物の存在を示すことができる。

装置はアッセイ分野に於いて公知の様々な物質形態のうちのどれによっても構成され得る。例えば隔離された地域に位置しているゾーンをもつ試験片の形態であり得る。そうでなければ一方、その装置は各試薬ゾーンが隔離されたプレート穴に設置されている試験プレートであり得る。装置がこのどちらの形態をとろうとも、少なくとも１つのゾーンは半透性のバリア一手段、例えば積層に（ｌａｍｉｎａｔｅｄ）被覆するとか、又は半透過性膜物質をしっかりと貼ることによって流動体と直接に接触することから構成される装置の操作を妨害し得る物質を排除することができる。このようなバリア一手段はヘモグロビン又は赤血球のような物質を排除し得る薄層（ｌａｙｅｒ）を含み、本発明の装置が全血液中に於ける直接アッセイに使用し得るようになる。このような薄層に適した物質はポリビニル酢酸のようなポリマーである。

本発明の好適な実施例を第１図に示す。この中で定量化試薬、指示試薬及び触媒は支持部材上の隔離されたゾーンに置かれている。他の実施態様は指示試薬及び定量化試薬が取り付けられているエリアの形や配置が幾何学的に違っているものを含み得る。いくつかの又は全てのエリアは隣接していてもよい。一方、エリアは付加された分離表面に取り付けられていてもよい。

本装置は例えば酵素のような触媒に対する基質である分析物の濃度の定量測定に用いられる。この操作に於いて、未知量の分析物を含んでいる溶液は、緩衝液及びイオン塩と一緒に装置の支持部材に含浸されている第１触媒と接触させられるか、又はこれら緩衝液及びイオン化塩は分析中に試料中に別個に添加され得る。

分析物は検出可能な反応生成物を生成し、必要ならば指示試薬と反応し得、第二の触媒によって触媒される反応に於いて可視光を吸収する化合物を生成する。どちらの型の生成物も完全にもしくは部分的に定量化手段によって消費され得る。

全反応は補償手段によって決められた時間内で生起しなければならない。すなわち、第１触媒が実質的に完全に阻害される前にである。反応ゾーンの検出可能な変化すなわち可視光を吸収する化合物又は検出可能な生成物の存在を監視する。

そして変化したゾーンの数と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は流動体中に存在する分析物の量と相関している。

この操作は適当な化学的又は酵素的な触媒との接触によって過酸化水素を生成するか、又はそのようにして過酸化水素を生成する他の化学反応システムにカップルされ得るグルコース、トリグリセリド又は他の体液成分の測定に特に有用される。このようにして生成された過酸化水素は一般的にはペルオキシダーゼ酵素の存在下に於ける適当な指示試薬との反応によって観察される。本発明の方法に於いて過酸化水素量は、定量化試薬が例えばケトエノール互変異性体、アスコルビン酸、指示試薬が例えばフェニレンジアミンのような色原体及び補償手段が例えば、マンゾロニトリル、マンゾロニトリルリアーゼとマンゾロニトリルとの組み合せでシアン化物イオンを生成するような装置と接触させることによって定量的に測定され得る。

第二の触媒と指示試薬を含むこの実施態様及びその他の実施態様に於いて、補償手段は第二の触媒を阻害することによって適当に機能し得る。分析物と反応し検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含む流動体中の分析物の存在を測定する為のこのような装置は、検出可能な生成物を生成するための第１触媒、検出可能な反応生成物が指示試薬と反応して可視光を吸収する化合物を生成する為の第二の触媒、及び所定速度で第二の触媒を阻害する補償手段を含浸させた支持部材を含む。このような装置は指示試薬をも含浸し得るか、又はこのような試薬は別個に流動体に添加され得る。補償手段は、この実施態様に於いてこのように生成される阻害剤は指示試薬との反応に対する第二の触媒の阻害剤であるということが違うたりて前に記載されたどの補償手段も包含することに注意を払う必要がある。

従って、定量化反応並びに時間及び温度補償反応から構成される反応システムの例は以下の式で記述され得る。

定量化反応：アメ３ルピン酸塩＋Ｈ〇　二デヒド［１アス］ルピン酸塩ビ＋アスコルビン酸塩 −−→Ｉ＋デヒドロアスコルビン酸塩鼠量土段反多士ＣＮ”　十ＨＲＰ　ＨＲＰ　（不活性）上記式中 β＝β−グルコシダーゼビニ可視光吸収化合物 ■　＝指示試！１ｉ（無色）ＨＲＰ＝セイヨウワサビ　ペルオキシダーゼＣＮ−＝シアン化物イオンアミグダリンとグルコシダーゼを用いる補償手段はマンゾロニトリルとマンゾロニトリルリアーゼを用いてＣＮ−を生成する方法に置き換えることができる。

この手法を用い、存在する過酸化物の槍を装置から読取り、試料中の過酸化物生成分析物の量と相関させることができる。

この方法と装置により、過酸化物を生成する他の多くの診断的に重要な成分もまた迅速に月つ簡便にそして確実に定量、的に分析し得る。

本発明装置では、上述のシステム以外に他の定量化試薬や他の補償手段用物質を有効に使用することができる。指示試薬が可視光吸収化合物を生成する可逆反応に関与している限りは、レドックス指示試薬、０日指示試薬、キロメトリック（ＣｈｅｌｏｍｅｔｒｉＣ）指示試薬を用いた場合も同様に本発明を完成し得る。

例えば、Ｉ）Ｈ指示試薬ベースのシステムでは、定量化試薬は緩衝物質であってよく、補償手段は第１ｐ）−１変化触媒すなわち酵素を阻害しうる。

この装置は種々の代謝物（尿素、クレアチニン等）及び生物学的流動体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ）に見られる伯の物質（グルコース、エタノール等）の測定にも有用である。例えば米国特許第４．０５９．４０７号明細書（１９７７）を参照せよ。

本発明装置は、第１試薬含有流動体中で検出可能な反応生成物を生成する基質と第１試薬との反応に関与する酵素の存在を検出するのにも有用である。装置は該酵素の基質と所定の速度で酵素を阻害する補償手段を含浸した支持部材を含むのが好適である。検出可能な反応生成物と反応して可視光吸収化合物を生成しうる指示試薬と、指示ぶ薬と検出可能な反応生成物との反応の触媒とをこのような装：置、に含浸させてもよい。また一方指示試薬は流動体に別個に添加してもよい。本発明の酵素アッセイ装置は適当な定量化試薬を含浸させられてもよく、前述の分析物アッセイ装置と同様な方法で異なるレベルの酵素活性を検出するための複数のゾーンから構成されてもよい。このような酵素アッセイ装置は半透過性膜物質で被覆してもよく、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、リパーゼ、アミラーゼ、アスパルテート−アミノトランスフェラーゼ又はグルタメート− オキサルアセテートトランスフェラーゼ、アラニン−アミントランスフェラーゼ又はグルタメート−ピルベートトランスフェラーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ及びタレアチンキナーゼ又はクレアチンホスホキナーゼのアッセイを含め臨床的に重要な多くのアッセイに有用である。

本発明装置は、適当にラベルした試薬例えば酵素でラベルした試薬を含有する、例えばイムノアッセイ又はヌクレオチドプローブのような特異的結合アッセイに使用するにも適している。

モノクローナル又は血清抗体、抗原、ハブテン及びヌクレオチド配列を含めた種々の試薬に酵素を結合させる方法、及び多数の異なる分析物の種々のアッセイにお（プるこのような酵素結合試薬の使用法は当業者にば公知であり・（例えばレンツ、エム。

（Ｒｅｎｚ、　Ｈ，）ら、アシツズ、リス（Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　）１２：３４３５−３４４４（１９８４）及び米国特許第３，８１７．８３７号明細書（１９７４）及び第４．３１８．９８０号明細書（１９，８２）参照）、一般に本発明方法及び装置に適用できる。例えばベーリンガー　マンハイム　バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎａｅｒ　ＨａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）インジアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ　ｉｓ）、インジアナ（Ｉｎｄｔａｎａ）及び他の会社から多数のこのような酵素結合成分が市販されている。

当業者には理解されるように、アッセイ中に酵素が間接的にとはいえ反応ゾーンとも結合し、検出可能な生成物の生成によりこの活性を測定するという点でこのようなアッセイは本発明の例えばグルコースについての直接アッセイと類似している３゜種々の従来のイムノアッセイ、例えば競合的結合法、ホモジーナス（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）及びサンドイツチ法の構成（ｃｏｒ＋ｒｒｇｕｒａｔ；ｏｎ）も使用しうる。これらのアッセイでは、補償手段と１つ以上の基質と指示試薬と定量化試薬とからなる装置に酵素ラベルを有する抗原−抗体対成分を接触さける。該装置は支持部材トに複数の離れたゾーンを有していてよく、アッセイ中に反応を検出するゾーンの数と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）によって酵素の量、ひいてはアッセイすべき分析物を測定できる。標準又は対照との比較の必要がなく、反応時間、温度及び色の測定の主観性による変化は排除される。このようにして確実で簡便なイムノアッセイが得られる。

一つの実施態様は、流動体中の分析物の存在を測定するための結合アッセイ（ｂｉｒｏｊｉｎｇ　ａｓｓａｙ）装置であり、上記流動体は第１試薬と、第１試薬と反応して検出可能な反応生成物を生成する第２試薬とを含有しており、第２試薬は第１触媒の基質であり、第１触媒は分析物と結合している、この装置は、分析物と結合しうる生化学的試薬と所定の速度で第１触媒を阻害しうる補償手段を含浸した支持部材を含んでいる。

この実施態様では、ザンドイッヂアッゼイで使用するためには、分析物に対する抗体のような第２生化学的試薬により触媒が分析物と結合すると好適である。一方、ホモジーナス又はヘテロジーナス（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）競合的結合アッセイに使用するためには、触媒は既知量の分析物、即ち、測定すべき物質の分子と直接的に結合していると好適である。

一実施態様においては、分析物は抗原であり、生化学的試薬はト記抗原に対する抗体である。ここでは、抗原なる用語はハプテンをも含む意味に用いている。抗原はウィルス、細菌類、真菌類、酵母、癌細胞又は他の疾患の起因物質、治療薬剤、乱用の薬剤（ｄｒｕｇ　ｏｆ　ａｂｕｓｅ）　、ホルモン又は他の蛋白質であるか、それらから誘導されたものが適している。

他の実施態様において、分析物はリガンドであり、生化学的試薬はリガンドと結合しうる受容体である。更にもう１つの実施態様では、分析物は核酸配列であり、生化学的試薬は相補配列である。

このような装置の補償手段は第２触媒の基質からなると好適であり、この場合、流動体は第２触媒と第２試薬とを含有しており、第２触媒の基質と第２試薬との反応により第１触媒の阻害剤が生成される。一方、補償手段が第２触媒と第２触媒の基質とからなってもよく、この場合には流動体は第２試薬を含有する。補償手段は又、第２触媒からなってもよく、この場合、流動体は第２触媒の基質と第２試薬とを含有づる。それ故、前述の如く第２触媒と基質は各々マンゾロニトリルリアーゼとマンゾロニトリル及び各々アミグダリンとベータグルコシダーゼを包含し、ここで第１触媒はシアン化物イオンで阻害される。

一方、第１触媒がシアン化物以外の物質例えば硫化物、特異的アミノ酸又は他の物質で阻害される場合には、好適な第２触媒、好ましくは酵素及び基質、従ってこれらの物質を触媒的に生成しうる第２試薬は当業者に公知のものから選択し得る。

前述の如く、補償手段は更に第１触媒の阻害剤を含有してもよく、該装置が流動体と接触した後に所定の速度で阻害剤を放出しうる物質中にこの阻害剤はカプセル化されている。

検出可能な反応生成物は可視光吸収化合物であってよい。又一方、前述の実施態様におけると同様に可視光吸収化合物を生成する指示試薬と検出可能な反応生成物との反応の第二の触媒を装置に含浸させてもよい。好適量の指示試薬を装置に含浸させてもよく、又指示試薬を流動体に添加してもよい。

更に前記実施態様におけると同様に、検出可能な反応生成物と反応する定量化試薬の既知量を装置に含浸させてもよい。

一つの実施態様では、生化学的試薬、補償手段及び定量化試薬の各々は支持部材上の少なくとも２つの分かれたゾーン内にあり、少なくとも２つのゾーン内の定量化試薬の量は異なっている。それ故、このような装置は定量的アッセイに有用である。

これらの装置は種々の形態、例えば試験片又は試験プレートとして構成されてもよい。含浸支持部材を半透過性膜物質で被覆又は積層してもよい。支持部材の成分が流動体中の阻害物質例えば赤血球又はヘモグロビンと接触するのを防ぐようにこれらの物質は選択できる。

この実施態様では、分析物に結合した第１触媒は続いて適当な基質及び試薬と接触することにより検出可能な反応生成物の生成を触媒する。第１触媒は酵素例えば酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼ酵素であると好ましい。一つの実施態様では、第１触媒の基質も又支持部材上に存在するが、これは適当な物資中にカプセル化されているか又は装置が流動体と接触するまで第１触媒と接触しないようにする。

支持部材は更に除去可能に載置した、第１触媒が結合する好適量の分析物を含有している透過層を有していてよい。このような層は適当な条件下で分析物に結合した第１触媒を透過させ、支持体の少なくとも１つのゾーンに拡散させ得るのが適当である。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）Ｎｏ、　ＩｉＰ紙は透過層として使用するのに適している。分離された層の中に、第１触媒と結合する分析物を最初は分離することにより、ラベルした分析物と生化学的成分又は支持部材との時期尚早の結合が避けられる１、このことにより、分析物及び第１触媒と結合する分析物の対応の生化学的成分との競合的結合が平衡なレベルに達成するのに必要な時間が減少し、そのためにより迅速なアッセイが可能となる。

本発明装置は種々のアッセイ法に有用であり、広範な従来のアッセイ法に適応できる。一つの方法は分析物と反応して検出可能な反応生成物を生成しうる第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定するのに有用である。

この方法は、第１触媒が反応を触媒し、補償手段が所定の速度で第１触媒を阻害しうるに適した条件下で、分析物が第１試薬と反応して検出可能な反応生成物を生成するための第１触媒と第１触媒を阻害する補償手段とに流動体を接触させることからなる。

検出可能な反応生成物の存在を検出することにより、流動体中の分析物の存在を測定する。検出可能な反応生成物と指示試薬とを反応させて可視光吸収化合物を生成させることにより、化合物の出現を視覚的に観察して検出ができる。

一つの本発明方法は、酵素基質と反応して検出可能な反応生成物を生成しつる第１試薬を含有する流動体中の酵素の存在を測定するのに有用である。この方法は、検出可能な反応生成物を生成するための酵素基質と酵素を阻害するための補償手段とに流動体を接触させることを含んでいる。酵素が反応を触媒し、補償手段が所定の速度で酵素を阻害するのに適した条件下で接触が行なわれる。

検出可能な反応生成物の存在を検出することにより、流動体中の酵素の存在を測定する。

もう一つの方法は、分析物と反応して検出可能な反応生成物を生成しうる第１試薬を含有する流動体中に所定の濃度以上の濃度で存在する分析物を測定するのに有用である。この方法は、検出可能な反応生成物の生成用第１触媒と、分析物の所定の濃度に対する量の検出可能な反応生成物と反応することができ、従ってそれを消費する既知量の定量化試薬と、第１触媒と阻害する補償手段とに流動体を接触させることを含んでいる。第１触媒が検出可能な反応生成物の生成を触媒し、定量化試薬が検出可能な反応生成物を消費し、補償手段が所定の速度で第１触媒を阻害することのできる適当な条件下で接触が行なわれる。

検出可能な反応生成物の存在の検出により、所定濃度以上の濃度で流動体中に存在する分析物を測定できる。

もう一つの実施態様も流動体中の一定量の分析物の存在又は濃度を測定する競合的結合アッセイ法に関する。この方法は前述の如く除去可能に載置した、ラベルした分析物を含有する透過層を有する本発明装置に関与する。この方法は、流動体中の分析物及び除去可能に載置した透過層中のラベルした分析物が少なくとも１つの反応ゾーンに拡散し、装置の反応ゾーン内で分析物及びラベルした分析物が競合的に生化学的試薬と結合しうるに十分な時間に亘り、好適条件下で装置を流動体と接触させ、適当な時間の後に例えば洗浄又は吸取り（ｂｌｏｔｔｉｒ＋ｇ）により装置から過剰な流動体やラベルした分析物を除去し、基質がラベルした分析物の反応試薬と反応して反応生成物を生成しうるに適する条件下で、適当量の反応試薬ラベルの適当な基質と装置の反応ゾーンを接触させ、反応生成物の存在を検出する反応ゾーンを同定し、流動体中の分析物の濃度と同定したゾーンを相関させることからなる。

もう一つの方法は、第１触媒の基質と反応して検出可能な反応生成物を生成しつる第１試薬を含有している流動体中の分析物の存在を測定するためのへテロジ− ナス結合アッセイである。

この方法は第２既知量の分析物が結合する第１触媒の第１既知吊を流動体に添加することを含んでいる。次いで、その混合液を適当な条件下で分析物と結合しうる生化学的試薬と接触させて複合体と形成する。分析物が結合している非複合体化第１触媒から、例えば洗浄又は過剰な流動体を除去することにより複合体を分離し、第１触媒が検出可能な反応生成物の生成と触媒し補償手段が所定の速度で第１触媒を阻害しうる好適条件下で第１触媒の基質と第１触媒を阻害するための補償手段とに該複合体を接触させる。そのように生成しＩＣ検出可能な反応生成物の存在を検出することによって、流動体中の分析物の存在が測定できる。

本発明のもう１つの方法は第１触媒の基質と反応して検出可能な反応生成物を生成しうる第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定するためのホモジ− ナスアッセイである。この方法は第２既知量の分析物が結合している第１触媒の第１既知量を流動体に添加することを含んでいる。次いで、その混合液を適当な条件下で分析物と結合しうる生化学的試薬と接触させて複合体を形成する。従来のホモジ−ナスアッセイ法におけるのと同様に、非複合体化分析物に結合した好適な第１触媒の触媒活性は複合体化分析物に結合した第１触媒の触媒活性に比し検出可能な位大きい。次いで、第１触媒が検出可能な反応生成物の生成を触媒し補償手段が所定の速度で第１触媒を阻害しうるに適する条件下で、第１触媒の基質と第１触媒を阻害するための補償手段とに流動体を接触さゼる。そのようにして生成した検出可能な反応生成物の存在を検出し、検出された検出可能な反応生成物の量と分析物が存在しないときに生成されたその量とを比較することにより、流動体中の分析物の存在が測定できる。

もう１つの方法は、第１触媒の基質と反応して検出可能な反応生成物を生成しうる第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定するのに有用である。この方法はサンドインチ法であり、第２生化学的試薬が結合する第１触媒と第１生化学的試薬とに流動体を接触させることを含み、両生化学的試薬は好適条件下で分析物と結合して両生化学的試薬と結合した分析物からなる複合体を生成することができる。第２生化学的試薬が結合する非複合体化第１触媒から複合体を分離する。次に、第１触媒が検出可能な反応生成物の生成を触媒し補償手段が所定の速度で第１触媒を阻害しうる好適条件下で、第１触媒を阻害するための補償手段の存在下に第１触媒の基質と分離した複合体とを接触させる。そのよっに生成した検出可能な反応生成物の存在を検出することにより、流動体中の分析物の存在が測定できる。

これらの方法は全て本発明装置を用いて実施することができる。このように、分析物と反応して検出可能な反応生成物を生成しうる第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定する方法においては、前述の如く、検出可能な反応生成物を生成するための第１触媒と所定の速度で第１触媒を阻害するための補償手段を含浸した支持部材を含む装置を使用できる。この方法では、装置を流動体と接触させ、流動体から装置を除去し、検出可能な反応生成物の存在が装置上で検出される。それにより流動体中の分析物の存在が測定される。

もう１つの方法は、触媒基質と試薬の触媒反応を制御するために一般的に用いられる。この方法は、本発明に従い、触媒が反応を触媒し補償手段が所定の速度で触媒を阻害しうる好適条件下で、触媒基質、触媒及び補償手段とに試薬を接触させることからなる。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであるが、後述の請求の範囲に示す発明の範囲を限定することを意図するものではなく又限定すべきものでもない。

以下の実施例で使用した材料はシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（セントルイス、エムオー（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、Ｎｏ））、アル１−″リッヒ　ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（ミルウオーキー、ダヴリュ　アイ（Ｈｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））及びカルバイオケムーベーｌノング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）　（ラジオラ、シーｘ−（Ｌａｊｏｌｌａ、ＣＡ））等の供給元から市販されている。

（以下余白）炎旌拠実施例■ 本実施例は血中グルコース測定用装置の製造例である。

下記溶液を調製した。

溶液Ａ脱イオン水中８．３ｍＭアスコルビン酸ナトリウム肪辰旦グルコースオキシダーゼ　２０００単位セイヨウワサビペルオキサイド　１０００単位フェニレンジアミン　Ｏ，１Ｍマンゾロニトリルリアーゼ　５０単位ポリビニルアルコール　０．１ｐＨ７，４にするための０．０１Ｍリン酸バッファー（全て脱イオン水５００ｃｃ中）ｌ隈旦アセトン中に０．５％マンゾロニトリル０．１％ポリビニルアセテート上記溶液を用いて、ペーパー含浸用溶液を次のようにして調製した。

溶液Ｎｏ、１　２　３　４　５溶液Ａｄ　１０　２０　３０　４０　５０溶液Ｂｄ　１０　１０　１０　１０　１０脱イオン水　４０　３０　２０　１０　０紙片の調製ワットマン＃１ペーパーの各紙片を各溶液に浸漬させた。紙片を約２分間溶液中に浸漬させ、次いで真空中で加熱することなく乾燥させた。軽く乾燥後、各紙片の片側に溶液Ｃを噴霧した。各紙片を、それを調製した溶液の番号（１，２，３，４および５）で表示した。

定量用装置の製造上記で調製した５枚の紙片を１／８インチ幅に切断し、予め感圧型接着剤を塗布した重質プラスチックシート上に固定した。

次いで、組み合されたアセンブリを独立した５個のゾーンを含む１／８インチストリップに切断した。各ゾーンを、そのゾーンを製造した同じ番号の紙片に対応させて＃１．＃２．＃３゜＃４．および＃５と表示した。これらの装置を密封容器内に乾燥剤と一緒に貯蔵した。

実施例■ 実施例■で製造した装置を用いて、全血中のグルコースを次のようにしてアッセイした。

実施例工の装置の５個のゾーンの各々に血液１Ｗ４を滴下させた。約２分後、血液を湿ったペーパータオルでぬぐい取った。

血液サンプルがグルコース１２０＋ｉη／ｄ！Ｑを含んでいるとき、ゾーン１および２は赤橙色となり、ゾーン３−５はオフホワイトのままであった。

各ゾーンの対応するグルコース濃度値は次のとおりである。

面中グルコース測定用装置を次のようにして製造した。溶液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを下記のようにして調製した。

直進Ａ脱イオン水（以下日２．０と略す）中で９８％加水分解された（平均ＭＷ７５Ｋ）２０％ポリビニルアルコール溶液Ｂグルコースオキシダーゼ　４０００単位セイヨウワサビペルオキシダーゼ　２０００単位β−グルコシダーゼ　６００単位ｍ−アミンサリチル酸　１ｃｃ（全て８２０　２０ｃｃ中）溶液Ｃ９０％アセトン／１０％Ｈ２０中　０．５％アミグダリン直履旦０．１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液次いで、溶液Ｂ１．Ｂ２およびＢ３を以下のように調製した。

溶液Ｂ１　：溶液８５ｃｃに溶液Ｄ０．０１４ｃｃを添加した。

溶液Ｂ２　：溶液Ｂ５ＣＣに溶液Ｄ０．０４２ｃｃを添加した。

溶液Ｂ３：溶液３５ｃｃに溶液Ｄｏ、０７０ｃｃを添加した。

定量用装置の製造上記の如く調製した紙片を１／８インチ幅に切断し、これを用いて実施例工と同様に定量用装置を製造した。但し、各ゾーンを製造した同じ数の紙片に対応する３個のゾーン＃１．　＃２および＃３を含有さぜた。

実施例■ 実施例■の装置を全血液中のグルコースのアッセイに使用した。実施例■のアッセイ法に従った。グルコース濃度が８０ｍ３／ｄ！２を超えるとゾーン＃１は赤色に変色し、１１０ｆｎｇ／ｄｕを超えると＃２は赤色に変色し、１４０ｍ！７／ｃｌＱを超えると＃３は赤色に変色した。

実施例■ 血液中のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の分析装置及び分析方法ＮＡＤ＋ラクテートーー仕興り一→ピルベート＋　Ｎ　Ａ　Ｄ　ＨＮＡＤＨ＋メチレンブル−−〉Ｎ　Ａ　Ｄ＋メチレンブル−（酸化）　（還元）メチレンブルー＋Ｑ　−一→メチレンブルー＋Ｈ２Ｏ２（還元）　く酸化）過剰のラクテートおよび充分量のＮＡＤが存在すると、上記一連の反応式に従いＬ［）Ｉ−１濃度に比例してＨ２Ｏ２が発生する。

実施例■の試験片中のグルコース第４ニジダーゼをラクテートおよび触ｔｓ量のＮＡＤとメチレンブルーで置き換えると、血液中のＬＤＨ測定用装置が得られる。

実施例ＶＩ妊娠判定用イムノアッセイにおける装置の使用無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ＞に対する精製抗体を無水物含有ポリマー例えばガントレッッＡＮ１１％（Ｇａｎｔｒｅｚ　ＡＮ　１１％）（ＧＡＦＩ−ボレーションより入手可能）と反応させ、該蛋白質をポリマーにカップルさせた。同時に、マンゾロニトリルリアーゼもまたポリマーにカップルさせた。マンゾロニトリルリアーゼは内部的な時間及び温度の補償体である。このカップリング反応は、反応剤の濃度にもよるが、室温で１日乃至５日間を要する。

カップリング反応が終了した後、ガントレッツの架橋剤として１，４−ブタンジオールをＤＭＳＯ溶液に添加する。

ワットマン＃１濾紙片をＤＭＳＯ溶液に浸漬し、取り出し、過剰量の溶液を排除した後、架橋が完全になるまで室温下約３〜５日間Ｎ２雰囲気下に保持した。

次いで、この紙片をｐＨ約７．４の１Ｍリン酸塩緩衝水溶液中に浸漬し、ガントレッツ基体に残存している未反応無水物を加水分解した。最後に、この紙片をアスコルビン酸ナトリウムの溶液中に浸漬し、真空下に乾燥し、プラスチック製支持片上に載せ、試験片に裁断した。

ヒト尿のサンプルを分析用に採取した。セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識したヒトＨＣＧを尿に加え、試験片を尿サンプル中に２０分間浸漬した。試験片を取り出し、ｐＨ＝７の０．０１ｍリン酸塩緩衝液で洗浄した。

発色液をＨ２Ｏ２，フェニレンジアミンおよびマンゾロニトリルを含めて調製した。過剰量の液体を試験片から除去し、発色液の数滴を試験お上に落とした。約５分後、紙片のテスト領域の色を調べた。赤味がかった茶色は妊娠反応が陰性であることを示すが、変色しないテスト領域は陽性であることを示す。

浄書（内容に変更なし）手続補正書昭和６０年８り／女日１、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　８４１０１６６５２、発明の名称　流動体迅速定量分析用装置３、補正をする者事件との関係　特許出願人名　称　イノメデイクス・イン］−ポレイデッド４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル６、補正により増加する発明の数７、補正の対象　図面の翻訳文８、補正の内容（１）鮮明な図面の翻訳文を別紙の通り補充する。

（内容に変更なし）国際調査銀箔 −１−如−＾＋’＋’ｌ”””Ｎ＆　ＰＣＴ／ＵＳ８１１１０１４；Ｉ’ｉｌ’ ；ＩｎＩｗｎａ＠ｅｗｍＩ＾ａｐｕ−ユ１１ｕ−コ１１ｓ−ＰＣＴ／ＵＳ８１１１０１６６５

Claims

【特許請求の範囲】

（１）分析物と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の該分析物の存在を測定するための装置であって、検出可能な反応生成物を生成するための第１触媒と第１触媒を所定の割合で阻害するための補償手段を含浸した支持部材を含む装置。
（２）触媒が酵素であり、分析物が該酵素の基質であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（３）補償手段が第２触媒を含んでおり、流動体が第２触媒用の基質と第２試薬を含有しており、第２試薬と第２触媒用の基質との反応によって第１触媒の阻害剤が生成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（４）補償手段が第２触媒用の基質を含んでおり、流動体が第２触媒と第２試薬を含有しており、第２試薬と第２触媒用の基質との反応によって第１触媒の阻害剤が生成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（５）補償手段が第２触媒とこの第２触媒用の基質を含んでおり、流動体が第２試薬を含有しており、第２試薬と第２触媒用の基質との反応によって第１触媒の阻害剤が生成することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（６）第１触媒が酵素であり、第２触媒がマンデロニトリルリアーゼであり、第２触媒用の基質がマンデロニトリルであり、第２試薬が水であり、第２触媒用の基質と第２試薬との反応によって生成する第１触媒の阻害剤がシアン化物イオンであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の装置。
（７）第１触媒が酵素であり、第２触媒がβ−グルコシダーゼであり、第２触媒用の基質がアミグダリンであり、第２試薬が水であり、第２触媒用の基質と第２試薬との反応によって生成する第１触媒の阻害剤がシアン化物イオンであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の装置。
（８）補償手段が、装置が流動体に接触した後所定の速度で第１触媒の阻害剤を放出し得る適切な材料中にカプセル化された該阻害剤であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（９）検出可能な反応生成物が可視光を吸収する化合物であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（１０）検出可能な反応生成物が指示試薬と反応して可視光を吸収する化合物を生成する反応の第二の触媒も含浸されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（１１）適切な量の指示試薬も含浸されていることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の装置。
（１２）検出可能な反応生成物と反応する定量化試薬も既知量で含浸されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（１３）第１触媒、補償手段および定量化試薬がそれぞれ支持部材上の少なくとも２か所の別々のゾーン内に存在し、少なくとも２か所のゾーン内の定量化試薬の量が異なることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の装置。
（１４）装置が試験片であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（１５）含浸支持部材に半透過性膜物質が被覆されていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の装置。
（１６）第１試薬を含有する流動体中の酵素の基質と該第１試薬との還元によって検出可能な反応生成物を生成するための該酵素の存在を測定するための装置であって、酵素の基質を含浸した支持部材、検出可能な反応生成物と反応して可視光を吸収する化合物を生成し得る指示試薬、指示試薬と検出可能な反応生成物との反応用の触媒、およびその触媒を所定の速度で阻害するための補償手段からなる装置。
（１７）分析物と反応して第１の反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の該分析物の存在を測定するための装置であって、第１の反応生成物の生成用の第１触媒を含浸した支持部材、第１の反応生成物が指示試薬と反応して検出可能な化合物を生成する際の第二の触媒、該指示試薬、および第二の触媒を所定の速度で阻害するための補償手段からなる装置。
（１８）第１の反応生成物が過酸化物であり、第二の触媒がシアン化物イオンによって阻害されるペルオキシダーゼ酵素であることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の装置。
（１９）分析物と反応して第１の反応生成物を生成し得る第１試薬を含有しかつ指示試薬を含有する流動体中の該分析物の存在を測定するための装置であって、第１の反応生成物の生成用の第１触媒を含浸した支持部材、第１の反応生成物が指示試薬と反応して検出可能な化合物を生成する際の第二の触媒、および第二の触媒を所定の速度で阻害するための補償手段からなる装置。
（２０）第１試薬を含有する流動体中の、酵素の基質が第１試薬と反応して検出可能な反応生成物を生成する際の該酵素の存在を測定するための装置であって、酵素の基質と酵素を所定の速度で阻害するための補償手段を含浸した支持部材を含む装置。
（２１）第１試薬と、この第１試薬と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第２試薬とを含有する流動体中の分析物の存在を測定するための装置であり、該第２試薬が検出可能な反応生成物の生成用の第１触媒の基質であり、該第１触媒が分析物に結合しており、装置が分析物に結合し得る生化学的試薬と第１触媒を所定の速度で阻害するための補償手段を含浸した支持部材を含んでいる装置。
（２２）触媒が抗体によって分析物に結合していることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（２３）触媒が既知量の分析物に直接結合していることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（２４）分析物が抗原であり、生化学的試薬が該抗原に対する抗体であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（２５）分析物がリガンドであり、生化学的試薬が該リガンドに結合し得る受容体であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（２６）分析物が核酸配列であり、生化学的試薬が相補配列であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（２７）補償手段が第２触媒の基質を含んでおり、流動体が第２触媒と第２試薬を含有しており、第２試薬と第２触媒の基質との反応によって第１触媒の阻害剤が生成することを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（２８）補償手段が第２触媒と第２触媒の基質とを含んでおり、流動体が第２触媒を含有しており、第２試薬と第２触媒の基質との反応によって第１触媒の阻害剤が生成することを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（２９）第１触媒が酵素であり、第２触媒がマンデロニトリルリアーゼであり、第２触媒の基質がマンデロニトリルであり、第２試薬が水であり、第２触媒の基質と第２試薬の反応によって生成する第１触媒の阻害剤がシアン化物イオンであることを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の装置。
（３０）第１触媒が酵素であり、第２触媒がβ−グルコシダーゼであり、第２触媒の基質がアミグダリンであり、第２試薬が水であり、第２触媒の基質と第２試薬の反応にって生成する第１触媒の阻害剤がシアン化物イオンであることを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の装置。
（３１）補償手段が、装置が流動体に接触した後所定速度で阻害剤を放出し得る適切な材料中にカプセル化された第１触媒の阻害剤であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（３２）検出可能な反応生成物が可視光を吸収する化合物であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（３３）検出可能な反応生成物が指示試薬と反応して可視光を吸収する化合物を生成する際の第二の触媒も含浸されていることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載の装置。
（３４）適切な量の指示試薬も含浸されていることを特徴とする請求の範囲第３３項に記載の装置。
（３５）検出可能な反応生成物と反応する定量化試薬も既知量で含浸されていることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（３６）生化学的試薬、補償手段および定量化試薬がそれぞれ支持部材上の少なくとも２か所の別々のゾーン内に存在し、少なくとも２か所のゾーン内の定量化試薬の量が異なっていることを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の装置。
（３７）装置が試験片であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（３８）含浸支持部材に半透過性膜物質が被覆されていることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の装置。
（３９）分析物と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の該分析物の存在を測定するための方法であって、（ａ）該流動体を、分析物が第１試薬と反応して検出可能な反応生成物を生成する際の第１触媒と、第１触媒を阻害するための補償手段とに、第１触媒が該反応を触媒し得かつ補償手段が第１触媒を所定速度で阻害し得るような適切な条件下で接触させ、（ｂ）検出反応の反応生成物の存在を検出し、（ｃ）これにより流動体中の分析物の存在を測定することからなる方法。
（４０）該検出が、検出可能な反応生成物を指示試薬と反応させて可視光を吸収する化合物を生成させ、該化合物の現出を視覚によって観察することからなることを特徴とする請求の範囲第３９項に記載の方法。
（４１）酵素の基質と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の該酵素の存在を測定する方法であって、（ａ）該流動体を、検出可能な反応生成物の生成用の酵素の基質と酵素を阻害するための補償手段とに、酵素が反応を触媒しかつ補償手段が酵素を所定速度で阻害するのに適切な条件下で接触させ、（ｂ）検出可能な反応生成物の存在を検出し、（ｃ）これにより流動体中の酵素の存在を測定することからなる方法。
（４２）分析物と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中に所定濃度より大きい濃度で存在する該分析物を測定するための方法であって、（ａ）該流動体を、検出可能な反応生成物の生成用の第１触媒と、所定濃度の分析物に相当する量の検出可能な反応生成物と反応してこれを消費し得る既知量の定量化試薬と、第１触媒を阻害するための補償手段とに、第１触媒が検出可能な反応生成物の生成を触媒し得、定量化試薬が検出可能な反応生成物を消費し得、かつ補償手段が第１触媒を所定速度で阻害し得るような適切な条件下で接触させ、（ｂ）検出可能な反応生成物の存在を検出し、（ｃ）こうして、所定濃度より高い濃度で流動体中に存在する分析物を測定することからなる方法。
（４３）第１触媒の基質と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定するための方法であって、（ａ）第２既知量の分析物が結合している第１既知量の第１触媒を流動体に添加し、（ｂ）得られた流動体を分析物に結合し得る生化学的試薬と適切な条件下で接触させてこれらの複合体を形成し、（ｃ）この複合体を、分析物が結合しており複合体を形成していない第１触媒から分離し、（ｄ）この複合体を、第１触媒の基質と第１触媒を阻害するための補償手段とに、第１触媒が検出可能な反応生成物の生成を触媒し得かつ補償手段が第１触媒を所定速度で阻害し得るような適切な条件下で接触させ、（ｅ）こうして生成した検出可能な反応生成物の存在を検出し、（ｆ）これによって流動体中の分析物の存在を測定することからなる方法。
（４４）第１触媒の基質と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定するための方法であって、（ａ）第２既知量の分析物が結合している第１既知量の第１触媒を流動体に添加し、（ｂ）得られた流動体を分析物に結合し得る生化学的試薬にこれらの複合体が形成されるのに適した条件下で接触させ、ただし、複合体を形成していない分析物に結合している第１触媒の触媒活性は、複合体を形成した分析物に結合している第１触媒の触媒活性より検出可能な程大きくし、（ｃ）流動体を第１触媒の基質と第１触媒を阻害するための補償手段とに接触させて、検出可能な反応生成物の生成を触媒させかつ補償手段が第１触媒を所定速度で阻害するようにし、（ｄ）こうして生成した検出可能な反応生成物の存在を検出し、（ｅ）こうして検出した検出可能な反応生成物の量を分析物がないときに生成するその量と比較し、（ｆ）これにより流動体中の分析物の存在を測定することからなる方法。
（４５）第１触媒の基質と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定するための方法であって、（ａ）第１生化学的試薬と第２生化学的試薬が結合している第１触媒とを流動体に添加し、ただしこの両者の生化学的試薬は適切な結合条件下で分析物に結合し、両者の生化学的試薬に結合した分析物からなる複合体を生成し得るものであり、（ｂ）第２生化学的試薬が結合しており複合体を形成していない第１触媒から複合体を分離し、（ｃ）この複合体を第１触媒を阻害するための補償手段の存在下に第１触媒の基質に、第１触媒が検出可能な反応生成物の生成を触媒し得かつ補償手段が第１触媒を所定速度で阻害し得るような適切な条件下で接触させ、（ｄ）こうして生成した検出可能な反応生成物の存在を検出し、（ｅ）これによって流動体中の分析物の存在を測定することからなる方法。
（４６）分析物と反応して検出可能な反応生成物を生成し得る第１試薬を含有する流動体中の分析物の存在を測定するための方法であって、請求の範囲第１項に記載の装置を流動体と接触せしめ、装置を流動体から除去し、装置上の検出可能な反応生成物の存在を検出することからなる方法。
（４７）試薬と触媒の基質の触媒反応を制御する方法であって、触媒が該反応を触媒し得かつ補償手段が触媒を所定速度で阻害するような適切な条件下で触媒の基質、触媒および補償手段に該試薬を接触させることからなる方法。