JPH0875748A - 特異結合分析方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】汎用性に優れ、試料中の非特異反応物質、分析
環境、試薬の失活等の活性の変化の程度など測定値の信
頼性を低下させる要因を排除して、高精度かつ迅速な測
定が可能な特異結合分析方法、およびその実施に好適な
特異結合分析装置を提供する。 【構成】特異結合に関与しかつ信号物質を発する信号物
質発生体および前記液性試料を所定の流路を所定方向に
流動させると共に、流路中において分析対象物の特異結
合反応を発生させて流路中に分析対象物濃度に応じた信
号物質発生体の分布を形成し、流路内に分布する信号物
質発生体によって信号物質を発生させ、発生した信号物
質を、流動方向に異なる位置に複数配置される検出手段
によって検出し、この複数の検出結果より分析対象物の
濃度以外の要因による分析結果への影響が極小になるよ
うに演算処理を行うことにより、前記目的を達成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、分析対象物と特異的に
結合する物質（特異結合物質）と、分析対象物とによる
特異結合反応を利用して、試料中の分析対象物を、非特
異的な影響や夾雑物の影響なしに簡便・迅速・正確に測
定することを可能とした特異結合分析方法、およびこの
方法を実施するのに好適な特異結合分析装置に関する。

【０００２】詳細には、例えば、分析対象物と競合して
特異結合物質と結合する物質、あるいは分析対象物に特
異的に結合する物質等の特異結合反応に関与する物質で
あって、かつ直接あるいは間接的に信号物質を発生でき
る物質を標識（信号物質発生体）として用い、特異結合
物質が不溶化された流路において、分析対象物と特異結
合物質との少なくとも１つの特異結合反応を利用して、
分析対象物の濃度に応じて検出部に対する信号物質発生
体の相対的な距離の分布を形成し、さらに、信号物質発
生体によって発生される信号物質を検出部によって検出
し、検出部において観測される信号強度が、信号物質発
生体と検出部との距離（すなわち信号物質の拡散距離）
に応じて変調することを利用して、分析対象物を分析す
る分析方法であって、前記検出部を流れ方向に対して異
なる位置に複数配置することによって、夾雑物や温度等
による影響を最大限に排除して、正確な分析を行うこと
を可能とした特異結合分析方法、およびこの分析方法の
実施に好適な特異結合分析装置に関する。

【０００３】

【従来の技術】特異結合分析方法としては、抗原抗体反
応を応用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプタ
ーアッセイ、相補的核酸配列のハイブリダイゼーション
を用いた核酸プローブアッセイなど多くの方法が知られ
ており、その特異性の高さから、臨床検査をはじめとす
る広い分野で繁用されている。これらの方法は、一般的
に、特異結合反応後、未反応物の除去工程、いわゆるＢ
／Ｆ分離操作を必要とするヘテロジニアス法と、Ｂ／Ｆ
分離操作を必要としないホモジニアス法に分類される。

【０００４】ヘテロジニアス法は、Ｂ／Ｆ分離操作を行
うことによって、未反応物および試料の干渉なしに特異
結合反応の程度を検出できるため、比較的高感度の測定
が可能で、汎用性に富んでいる。しかしながら、未反応
物の分離操作は煩雑で、洗浄装置など、特殊な用具もし
くは機器を必要とする場合があり、その簡易化や迅速化
が求められている。

【０００５】これに対し、操作を簡便化するために、凝
集反応法、ＥＭＩＴ法、酵素チャネリング法などのプロ
キシマールリンケージイムノアッセイ、免疫クロマトグ
ラフ法など各種のホモジニアス法が開発されてきたが、
性能および汎用性の点で、ヘテロジニアス法に及ばない
のが現状である。特に、試料の存在下で検出反応を行う
ホモジニアス法では、Ｂ／Ｆ分離操作を行った後に検出
反応を行うヘテロジニアス法に比べて、試料の干渉や測
定環境等に由来する誤差を受けやすいことも問題点とし
て残っている。

【０００６】このような誤差を小さくするために、通
常、特異結合分析方法では、標準検体による測定値較正
が行われている。すなわち、含有されている分析対象物
量が不明の未知検体を、分析対象物量既知の標準検体と
共に分析し、得られた未知検体の信号強度を標準検体の
信号強度と比較することにより、未知検体の分析対象物
量を求める方法である。一般には、分析方法の測定範囲
に渡って、既知濃度の希釈列から構成される複数の標準
検体の分析から信号強度と分析対象物濃度の応答曲線
（標準曲線）を作製し、この標準曲線を基準として未知
検体の信号強度を分析対象物濃度に換算する方法が多用
されている。従って、未知検体が１検体であっても、そ
の分析には多数の標準検体の分析を並行して行う必要が
あり、操作が煩雑となり、経済的にも無駄を生じてい
た。また、試料の干渉や測定環境等に由来する非特異的
な測定誤差要因の別種の補正として、ブランク補正が汎
用されている。これは、同一試料に対して分析対象物濃
度に応答する特異結合分析と共に、分析対象物濃度に応
答しない対照分析を同時に行い、その特異結合分析結果
と対照分析結果との差分を、その分析結果として採用す
る方法である。しかし、この分析法においても、操作が
煩雑であると共に、補正法としても不十分なため、前記
した標準検体による測定値較正が必要とされていた。

【０００７】しかも、近年では、在宅医療および地域医
療の充実や、緊急性の高い臨床検査等の増加に伴ない、
臨床検査の専門家でなくとも、迅速簡便で確実に測定が
実施できる特異結合分析方法の開発がとみに望まれるよ
うになってきた。通常、在宅検査や緊急検査は１検体ず
つ迅速に行われる必要がある。従って、このような分析
においては、余分な分析操作を必要とする上に時間と試
薬の浪費でもある標準検体の同時分析は特に好まれな
い。その反面、測定の信頼性が特に問われる分野でもあ
る。

【０００８】このような問題点を解決するために、本発
明者らは鋭意検討を重ね、液性試料中の分析対象物の特
異結合反応を利用して、液性試料中の分析対象物の量に
応じた信号物質発生体の検出部に対する距離の分布を形
成させ、この分布を信号物質発生体が発生した信号物質
の物質移動、すなわち拡散距離に律速される信号強度と
して検出部で検出するＭＥＤＩＡ（Mediator Diffusion
-controlled Immunoassay ）法と呼ばれる特異結合分析
方法を開発し、先にこれを提案した（特開平５−２６４
５５２号公報、欧州特許公開公報 0 525 723 A2 号参
照）。この方法によれば、未反応物の除去操作なしに簡
便かつ迅速に試料中の分析対象物を高感度に測定でき
る。しかしながら、他のホモジニアス法と同様に、この
分析方法でも、試料の干渉、反応温度などの測定環境、
あるいは分析に用いている試薬の変化などが、検出部で
検出される信号強度に対して影響を与えることがあり、
試料中の分析対象物量を測定する場合の誤差が存在する
場合があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は前記従来技術
の問題点を解決するために成されたものであり、特異結
合分析の原理を利用した、未反応物の分離操作（洗浄操
作）を伴なわない、簡便で汎用性に優れた分析方法であ
って、試料が測定に与える非特異的な影響や反応温度な
どの分析環境、分析に用いている試薬の失活等の活性の
変化の程度など測定値の信頼性を低下させる要因を排除
して、高精度かつ迅速な測定が可能な特異結合分析方
法、およびこの特異結合分析方法の実施に好適な特異結
合分析装置を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の特異結合分析方法は、液性試料中の分析対
象物を、その特異結合反応によって測定する特異結合分
析方法であって、特異結合反応に関与しかつ信号物質を
発する信号物質発生体および前記液性試料を所定の流路
を所定方向に流動させると共に、前記分析対象物の特異
結合反応を発生させ、この特異結合反応を利用して、前
記流路中に液性試料中の分析対象物濃度に応じた信号物
質発生体の分布を形成し、流路内に分布する信号物質発
生体によって信号物質を発生させ、発生した信号物質
を、前記流動方向に異なる位置に複数配置される検出手
段によって検出し、この複数の検出結果を用いることに
よって、分析対象物の濃度以外の要因による分析結果へ
の影響が極小になるように演算処理を行うことを特徴と
する特異結合分析方法を提供する。

【００１１】本発明の特異結合分析装置は、前記本発明
の特異結合分析方法を実施するものであって、液性試料
導入部と、それに連結して配置される液性試料を流すこ
とのできる流路と、液性試料中の分析対象物とそれに特
異的に結合する特異結合物質との特異結合反応により前
記流路内に形成された、液性試料中の分析対象物量に応
じた信号物質発生体の分布を、前記信号物質発生体から
発生される信号物質の拡散による物質移動に律速される
信号強度として検出するための、前記流路の液流方向に
対して異なる位置に配置される複数の検出部とを有する
ことを特徴とする特異結合分析装置を提供する。また、
前記本発明の特異結合分析装置において、前記複数の検
出部が、電気化学的に信号検出を行える複数の電極であ
るのが好ましい。さらに、前記本発明の特異結合分析装
置において、前記検出部の位置が、流動方向に１０μｍ
以上離れているのが好ましい。

【００１２】以下、本発明の特異結合分析方法および装
置について詳細に説明する。はじめに、本明細書中の用
語を説明する。

【００１３】分析対象物とは、本発明の方法および装置
により、測定される物質である。具体的には抗体分子や
抗原として機能する各種蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白
質、多糖類、複合糖脂質など、あるいは核酸、エフェク
ター分子、レセプター分子、酵素、インヒビター等が例
示される。さらに具体的には、α−フェトプロテイン、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９等
の腫瘍マーカーや、β₂ −ミクログロブリン（β
₂ ｍ）、フェリチンなどの各種蛋白質； エストラジオ
ール（Ｅ₂ ) 、エストリオール（Ｅ₃)、ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、
ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）などの各種ホルモン；
ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、Ｈ
Ｂｃ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体などの各種ウイルス
関連抗原あるいはウイルス関連抗体； 各種アレルゲン
およびこれに特異的なＩｇＥ抗体； 麻薬性薬物、医療
用薬物およびこれらの代謝産物； ウイルスおよび疾患
関連ポリヌクレオチド配列の核酸等が例示される。

【００１４】分析対象物類縁体とは、後記する特異結合
物質との結合反応において、分析対象物と同様の挙動を
示す物質をいう。例えば、分析対象物の構造的類縁物質
であり、すなわち分析対象物の各種構造的アナログであ
る。本発明では、主に、競合法による特異結合反応が行
なわれる場合に、後記する信号物質発生体の構成成分と
して使用される。具体的には、分析対象物がステロイド
などの低分子のホルモンや薬物化合物などの場合には、
その構造的類縁物とは、分析対象物と同一化合物あるい
はその修飾化合物である。また、分析対象物が蛋白質や
核酸、多糖類である場合には、特異結合反応に関与する
部分ペプチド、部分オリゴヌクレチオド、部分オリゴ糖
なども構造的類縁体である。別の例として、分析対象物
が抗体などの場合に、特異結合物質としての特異抗原に
対して分析対象物と競合的に結合できる物質、具体的に
は抗体、レセプター、レクチンなどの前記分析対象物の
各種機能的アナログも例示される。

【００１５】液性試料とは、分析対象物が含まれると予
測される液体のことである。具体的には、尿、血清、血
漿、全血、唾液、涙液、髄液、乳頭などからの分泌液等
が例示されるが、粘液、体組織あるいは細胞、菌体等の
固形またはゲル状もしくはゾル状物を、緩衝液、抽出液
あるいは溶解液等の液体に懸濁もしくは溶解させたもの
であってもよい。

【００１６】特異結合物質とは、分析対象物等のある特
定の物質に特異的に結合する、すなわち、特定の物質に
特異結合反応しうる物質である。ある特定の物質とそれ
に対する特異結合物質との組合せとしては、抗原とそれ
に対する抗体、相補的核酸配列、エフェクター分子とレ
セプター分子、酵素とインヒビター、酵素と補因子、酵
素と基質、糖鎖を有する化合物とレクチン、ある抗体と
その抗体に対する抗体、レセプター分子とそれに対する
抗体等が例示される。また、これらの組合せにおいて、
どちらの物質も相手方の物質に対する特異結合物質とな
りうる。

【００１７】また、特異結合物質として、特異結合活性
が消失しない程度に化学修飾されたもの、あるいは、他
の成分と結合してなる複合性物質もあげられる。このよ
うな特異結合物質としては、ビオチンで化学修飾された
抗体もしくはポリヌクレオチド、アビジン共有結合抗体
等が例示される。また、遺伝子組換え法で作成した抗体
と酵素、あるいは抗体とレセプターとの融合蛋白質など
も例示される。なお、本明細書では、次に説明する信号
物質発生体のように、その一部に特異結合物質として働
く部分を有する物質も、特異結合物質と称することがあ
る。

【００１８】信号物質発生体とは、分析対象物と競合し
て特異結合物質と結合する物質、あるいは分析対象物に
特異的に結合する物質等の、特異結合反応に関与する物
質であって、かつ直接または間接に信号物質を発生する
物質である。後に詳述するが、この信号物質発生体は、
流路内で、分析対象物の量と相関関係を有する分布を形
成する。つまり、信号物質発生体とは、特異結合物質と
して働く部分と、後記する信号物質の生成に寄与する部
分とを有する物質、すなわち標識特異結合物質である。

【００１９】特異結合物質として働く部分とは、分析対
象物に対して特異結合物質となる構造、あるいは、分析
対象物もしくは分析対象物類縁物質の構造を有する部分
であり、信号物質の生成に寄与する部分とは、具体的に
は、通常の免疫反応等で標識剤として使用されている各
種酵素等により構成される部分である。すなわち、信号
物質発生体は、１つの側面として、分析対象物とそれに
対する特異結合物質との特異結合反応に参加し、その流
路内での分布が分析対象物量に応じて変化する物質であ
り、もう１つの側面として、信号物質の生成反応を司る
物質である。

【００２０】信号物質とは、信号物質発生体の関与する
反応によって生成される物質であり、後記する検出部に
おいて、自身が所定の信号を発する、あるいは他の物質
に信号を発生させる物質である。

【００２１】信号物質の発生に関与する物質とは、字義
通りの解釈をすると、前述の信号物質発生体も含むが、
本発明においては、信号物質発生体以外の、主に、信号
物質の前駆物質や、この前駆物質を信号物質に変化させ
るに寄与する物質を指す。例えば後述する電子メディエ
ータあるいは電子メディエータを発生させる物質、酵素
基質、酵素補因子、水素供与体等である。

【００２２】また、信号の発生に関与する物質とは、信
号物質が直接には信号を発生せず、他の物質に信号を発
生させる物質である場合、あるいは、信号物質が他の物
質の存在下でもしくは他の物質と協同して信号を発生す
る物質である場合に、信号の発生に寄与する物質のう
ち、信号物質を除いた物質をいう。

【００２３】信号としては、電気化学的に計測可能な電
子移動、蛍光光度計で計測可能な蛍光、発光光度計で計
測可能な発光、目視判定および色差計で計測可能な呈色
等が例示される。好ましくは、血球成分、血色素などの
存在する全血試料中等でも精度の高い測定が可能な電気
化学的な測定である。

【００２４】以上説明した特異結合物質、信号物質発生
体、信号物質の発生に関与する物質、ならびに信号の発
生に関与する物質は、あらかじめ反応系内に存在しても
よいし、液性試料の導入に先立ち、あるいは液性試料と
同時に、あるいは液性試料の導入後に、反応系内に導入
されてもよい。なお、あらかじめ反応系内に存在する場
合は、反応系内に均質に分布していてもよいし、反応系
内の特定の箇所に備えられ、液性試料または試料以外の
展開液によって溶解するものであってもよい。

【００２５】流路とは、試料導入部から導入された液性
試料が流れる経路であり、分析対象物および信号物質発
生体が展開され、分析対象物濃度に依存した特異結合反
応が起こる場をいう。試料導入部から導入された液性試
料は、ポンプなどの外圧、重力などの外力あるいは自発
的な浸透力によって、流路内へ導入される。簡便な装置
構成で、再現性ある液性試料の流路内への導入を可能と
するためには、流路を細管（キャピラリ）あるいは狭い
間隙で構成するか、あるいは流路を多孔性部材で構成し
て、液性試料の自発的な浸透力によって液性試料を流路
中へ導入するのが望ましい。

【００２６】例えば、流路を構成する細管あるいは多孔
性部材に特異結合物質が不溶化されており、液性試料お
よび信号物質発生体がここを所定方向に流れることで、
特異結合反応が起こり、信号物質発生体が流れ方向に分
布を示す。より具体的な例を挙げれば、分析対象物と信
号物質発生体が、特異結合物質に対して競合的に特異結
合するか、分析対象物が特異結合物質に結合し、さらに
信号物質発生体が分析対象物にサンドイッチ型に特異結
合する等、流路内あるいは流路の上流域で分析対象物の
少なくとも１つの特異結合反応が起こることによって、
流路は液性試料中の分析対象物の濃度に応じた信号物質
発生体の分布が形成される場になる。なお、特異結合反
応によって、信号物質発生体の試料の流れ方向の分布が
決定される場である流路は、特異結合物質が不溶化され
ている例に限定されるものではなく、特異結合反応に伴
って起こる分子量あるいは粒子サイズの変化等に基づい
てそれを分布として示すものであってもよい。

【００２７】検出部とは、到達した信号物質が発する信
号を検出する部位であり、肉眼での目視で、もしくは、
信号の性質に応じた好適な外部の計測器で、信号の変調
の程度を計測できる部位である。本発明においては、こ
の検出部を流路における液性試料の流れ方向に異なる位
置に複数有することにより、分析対象物の濃度以外の要
因、具体的には、夾雑物、粘度などの試料特性、反応
（展開）温度等の環境条件、酵素活性の低下、基質の分
解などの分析に用いている試薬の変化等に起因する分析
結果への影響を最小化して、正確な分析を可能としたも
のである。

【００２８】吸収部は、吸水性材料で構成され、必要に
応じ、信号物質の発生に関与する物質等を保持する部位
である。また、通常、吸収部は流路の下流域に設置さ
れ、導入された試料液を吸引し保持する役割もはたす。

【００２９】以上のように定義された用語を用い、本発
明をさらに具体的に説明する。なお、本発明の特異結合
分析方法および装置の基本的な概念は、本出願人による
特開平５−２６４５５２号公報、欧州特許公開公報 0 5
25 723 A2 号により詳細に開示される。従って、同公報
に開示される態様は、すべて本発明に利用可能である。

【００３０】本発明の特異結合分析方法は、図１に概念
的に示されるように、液性試料を導入する試料導入部ａ
と、それに連結した液性試料の流れる流路ｂと、液性試
料の流れ方向（図１では矢印ｘ方向）に対して異なる位
置に複数設けられる（図示例では２つ）第１検出部ｃ₁
および第２検出部ｃ₂ （以下、両者をまとめて検出部ｃ
と称することもある）とを有する装置によって行われ
る。図１に示される例において、分析対象物量未知の液
性試料を試料導入部ａから装置内に導入し、分析対象物
と特異結合物質との少なくとも１つの特異結合反応によ
り、流路ｂ内で液性試料中の分析対象物量に応じた信号
物質発生体１０の分布を形成させ、必要な場合には信号
物質の発生に関与する物質１４を反応させて、流路ｂ内
に分布する各々の信号物質発生体１０によって信号物質
１２を発生させ、発生した信号物質１２が、それぞれ流
路内を拡散して検出部ｃまで到達して発する信号を、検
出部ｃにおいて計測する。

【００３１】すなわち、図１においては１つの信号物質
発生体１０のみを例示するが、それぞれの検出部ｃにお
いて計測されるのは、流路ｂ内に分布する多数の信号物
質発生体１０から連続的に発生された信号物質１２の拡
散による物質移動に律速された信号に依存する。つま
り、信号物質１２の発生源である信号物質発生体１０か
ら検出部ｃに至るまで、拡散によって信号物質１２が流
路内を移動しなければならない距離ｘ₁ およびｘ₂ に依
存した信号となる。

【００３２】ここで、後に詳述するが、信号物質発生体
１０の分布は液性試料中の分析対象物の量に依存する。
従って、試料導入部ａから流路ｂに導入された液性試料
中の分析対象物量が異なると、信号物質発生体１０から
検出部ｃに至るまでの信号物質１２の拡散距離の分布が
分析対象物量に応じて異なる結果となり、この信号物質
発生体１０の分布の違いを検出部ｃに到達した信号物質
１２が発する信号の違いとして検出することができる。
本発明は、上記の仕組みを利用したものであって、複数
の検出部ｃにおいて信号物質１２が発する信号から液性
試料中の分析対象物量を測定することを特徴とする特異
結合分析方法および特異結合分析装置である。

【００３３】前述のように、特異結合反応とは、分析対
象物とそれに特異的に結合する特異結合物質（含信号物
質発生体１０）との反応、特異結合物質と信号物質発生
体１０との反応等をいう。すなわち、本発明は、 信号物質発生体１０の標識によって発生され、かつ、
検出部ｃにおいてのみ検出可能な信号を発生するあるい
は発生させる信号物質１２を用いる場合、検出部ｃにお
いて観測される信号は、標識（信号物質発生体１０）と
検出部ｃとの距離（すなわち信号物質１２の拡散距離）
に応じた出力強度となること； 分析対象物と特異結合物質との少なくとも１つの特異
結合反応によって、信号物質発生体１０（すなわち標
識）の位置分布を液性試料中の分析対象物濃度に応じて
異なるものとできること； 従って、検出部ｃにおいて検出される信号は、液性試
料中の分析対象物濃度に対応していること； をその分
析方法の基本概念として、さらに、検出部ｃを液流方向
に対して異なる位置に備えられた複数の検出部、例え
ば、図示例のように第１検出部ｃ₁ および第２検出部ｃ
₂ 等の複数の検出部によって上記信号を検出することに
より、反応（展開）温度等の分析環境条件や、試料中に
含まれる夾雑物、分析に用いている試薬の失活などの活
性変化等の、分析対象物濃度以外の原因に起因する分析
結果への影響を最小化して、正確かつ簡易な分析を可能
としたものである。

【００３４】本発明者らは、上記基本概念を見出し、先
にこれを用いた特異結合分析方法および装置を提案した
（特開平５−２６４５５２号公報、欧州特許公開公報 0
525723 A2 号参照）。この分析方法は、ＭＥＤＩＡ（M
ediator Diffusion-controlled Immunoassay ）法と呼
ばれる。この分析方法（装置）によれば、未反応物の除
去操作なしに、試料中の分析対象物を高感度、かつ迅速
に測定することが可能である。しかしながら、この方法
をもってしても、夾雑物の干渉、反応温度などの測定環
境、分析に用いている試薬の活性の変化などの影響を完
全に拭うことは困難であり、未知試料中の分析対象物量
を測定する場合の誤差が存在する場合があった。

【００３５】このような問題点を解決するために、本発
明者らが鋭意検討を重ねた結果、後に詳述するが、ＭＥ
ＤＩＡ（Mediator Diffusion-controlled Immunoassay
）法と呼ばれる上述の特異結合反応を利用する分析方
法において、液性試料の流れ方向に異なる位置に配置さ
れる複数の検出部によって検出される複数の信号、さら
にはこの複数の信号と未知試料中の分析対象物量（すな
わち信号物質発生体の分布）との間には、いずれの場合
にも特定の関係を有することを見出した。さらに、この
関係を実験的あるいは経験的に調査することにより、分
析対象物の濃度（試料中の分析対象物の量）以外の要因
による分析結果への影響、すなわち、夾雑物、反応（展
開）温度等の環境条件、酵素活性の低下などの分析に用
いている試薬の失活等による信号への影響を小さくでき
る演算式を作成できることを見出し、これを用いて信号
の計測結果を演算処理することによって、より正確な特
異結合分析が可能であることを見出して、本発明を完成
したものである。

【００３６】すなわち、本発明は以下の技術的思想から
なるものである。後の実施例でも詳述するが、本発明の
分析方法（装置）において、流れ方向に異なる位置に配
置された検出部において計測される信号は、同じ信号物
質発生体に由来する信号であるにもかかわらず、液性試
料中の分析対象物濃度に対して異なる関数となる。なぜ
ならば、検出部の位置が液性試料の流動方向、すなわち
信号物質発生体の分布の形成方向に対して異なるため
に、特定の信号物質発生体の分布が形成されているにも
かかわらず信号物質発生体と各検出部との距離分布はそ
れぞれの検出部ごとに異なっているからである。これ
は、同一分析対象物量に依存する特異的な信号強度成分
が検出部ごとに実質的に異なることを意味する。本発明
は、流れ方向に異なる位置にある検出部での分析対象物
濃度に対する応答関数を複数用い、流路での信号物質発
生体の分布を信号への非特異的な影響を含めて測定し
て、その結果非特異的な影響のうちでも加算的影響や比
率的影響が混在しているような同一関数では表せない多
様な影響を測定することができるので、この測定結果か
ら、以下のように分析対象物濃度に非特異的な信号強度
成分を極小にする関係式を見出すことができるようにな
り、信号強度変化を分析対象物濃度の適切な関係式とし
て表すことができる。それぞれの検出部で計測されてい
る信号は、特定の信号物質が拡散によって到達した時に
発する信号を計測しているという点で全く同じ信号発生
機構に由来しているため、液性試料中の夾雑物、反応
（展開）温度などの環境条件、酵素活性の低下などの分
析に用いている試薬の失活などによる信号への影響も非
特異的な信号強度成分として同様に受けることになる。

【００３７】各検出部で計測される信号は、分析対象物
量に依存する特異的な信号強度成分と非特異的な信号強
度成分との重ね合わせである。非特異的な信号強度成分
には、単純化すれば、信号強度の差で除去できる成分と
信号強度の比で除去できる成分とがあるがこれらの非特
異成分は複数の電極に共通に存在していてそれぞれ信号
強度として測定できるのでこれらの信号強度の間の関係
を適切に示す演算式を選択することにより、分析対象物
の濃度以外の要因による分析結果への影響を小さくする
ような演算式（内部関係式）を作成でき、この内部関係
式を用いて、複数の検出の計測結果から分析対象物量を
求めることにより、試料や分析環境あるいは分析装置の
経時変化等の影響を極小化できる、正確な特異結合分析
を実現したものである。ここで、内部関係式とは、従来
技術のように測定者が標準検体の分析によって得ること
のできる標準曲線（外部関係式）に対して、あらかじめ
装置内に演算機構として組み込むことが可能な信号と分
析対象物との関係式を意味している。すなわち、本発明
の特異結合分析方法（装置）は、未知検体の測定だけで
分析対象物量を求め得る、いわゆるスタンダードレス分
析法の新規な手法を提供する。このような技術的思想
は、標準物質との特異結合反応あるいは標準信号発生反
応を別途行うか、あるいは装置内で同時に行い、その標
準信号を用いて未知検体の信号を判断する信号較正法と
は全く異なる思想に基づいている。このような技術的思
想およびこれを実施できる装置は従来全く開示されては
いない。

【００３８】複数の検出部の流動方向の位置のズレの大
きさには特に限定はないが、本発明者らの検討によれ
ば、特異結合反応を利用する本発明においては、好まし
くは複数の検出部を流路ｂの液流方向に対して幾何学的
に１０μｍ以上離して、より好ましくは１００μｍ以上
離して配置することである。これにより、特異結合反応
によって形成された信号物質発生体１０の分布に応じて
信号物質１２の物質移動（拡散）に律速され、かつ複数
の検出部で検出される信号を有為に異なるものとして検
出でき、分析対象物の濃度以外の要因による分析結果へ
の影響を好適に小さくできる演算式を作成して、正確な
分析を実現することができる。すなわち、複数の検出部
が、液流方向に少なくとも１０μｍ、好ましくは１００
μｍ離れていれば、試料中の分析対象物濃度に非特異的
な信号強度成分のうち、流れ方向に位置が異なることに
よって特異的な信号成分に影響しない非特異成分（加算
的影響）のみならず、特異的な信号成分に影響する非特
異成分（比率的影響）も測定することができる。

【００３９】本発明の特異結合分析方法は、特異結合反
応によって、液性試料中の分析対象物の量に応じて、流
路ｂ内での信号物質発生体１０の分布を変化させ、この
分布の変化を、液性試料の流動方向に異なる位置に配置
される複数の検出部で測定する。液性試料中の分析対象
物の量に応じて、流路内の信号物質発生体１０の分布を
変化させる方法は、種々の方法が可能であり、以下に記
載する方法は一例にすぎない。

【００４０】本発明方法の分析対象物に対する特異結合
物質を用いた特異結合反応の具体例として、免疫反応系
の一成分が分析対象物である場合について、流路ｂ内で
の免疫反応（特異結合反応）を例示する。

【００４１】その第一は、分析対象物と同じ物質あるい
はその類縁物質を不溶化して行う競合法である。この場
合、流路ｂの少なくとも一部には、分析対象物と同じ物
質あるいはその類縁物質を不溶化しておき、信号物質発
生体１０としては、特異結合物質である抗分析対象物抗
体と標識剤（例えば信号物質１２を発生させる反応に関
与する酵素）との結合体を用いる。液性試料にあらかじ
め信号物質発生体１０を混合しておき、これを流路ｂに
流すことにより、あるいは、流路ｂの上流域に存在する
信号物質発生体１０を含む含浸部において信号物質発生
体１０と液性試料とを混合した後、流路ｂの分析対象物
（類縁物質）不溶化部分に流すことにより、試料中の分
析対象物と不溶化された分析対象物（あるいはその類縁
物質）とを、信号物質発生体１０中の抗体部分（特異結
合物質）に対して、競合的に反応させる。その結果、液
性試料中の分析対象物量が多いほど、信号物質発生体１
０は流路ｂ内のより下流側に分布が変動する。この方法
は、分析対象物がハプテン様の低分子量物質の場合で
も、分析対象物が高分子量物質の場合でも好適に用いる
ことができる。分析対象物がハプテンの場合、分析対象
物と同じハプテンかあるいは特異結合物質が交叉反応し
うる別のハプテンを、特異結合物質が結合可能な様式で
流路ｂの少なくとも一部に不溶化すればよい。分析対象
物が高分子量の蛋白質などの場合、蛋白質自体あるいは
特異結合物質が結合するエピトープのペプチドを流路ｂ
の少なくとも一部に不溶化すればよい。

【００４２】第二は、分析対象物が複数の抗体と同時に
結合しうる高分子量物質の場合に好適なサンドイッチ法
を用いる例である。この場合、流路ｂの少なくとも一部
には、分析対象物の第１の特異結合物質であるエピトー
プＡに対する抗体を不溶化しておき、分析対象物の第２
の特異結合物質であるエピトープＢに対する抗体と標識
剤との結合体を信号物質発生体１０として、液性試料に
あらかじめ信号物質発生体１０を混合しておき、これを
流路ｂに流すことにより、あるいは、流路ｂの上流域に
存在する信号物質発生体１０を含む含浸部において信号
物質発生体１０と液性試料とを混合した後、流路ｂに流
すことにより、分析対象物に反応させるとよい。すなわ
ち、試料中の分析対象物をサンドイッチ型に反応させる
のである。その結果、液性試料中の分析対象物量が多い
ほど、信号物質発生体１０は流路ｂ内のより上流側に分
布が変動する。また、分析対象物が抗体の場合、流路ｂ
の少なくとも一部には特異結合物質である抗原を不溶化
しておき、抗（抗体）抗体と標識剤との結合体を信号物
質発生体１０として分析対象物に反応させるとよい。

【００４３】第三は、分析対象物に対する特異結合物質
を不溶化して行う競合法である。この場合、流路ｂの少
なくとも一部には、特異結合物質である抗分析対象物抗
体を不溶化しておき、信号物質発生体１０としては、不
溶化特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質で
ある分析対象物と同じ物質あるいはその類縁物質と標識
剤との結合体を用い、液性試料にあらかじめ信号物質発
生体１０を混合しておき、これを流路ｂに流すことによ
り、あるいは流路ｂの上流域に存在する信号物質発生体
１０を含む含浸部において信号物質発生体１０と液性試
料とを混合した後、流路ｂに流すことにより、試料中の
分析対象物と信号物質発生体１０とを、不溶化された特
異結合物質に対して競合的に反応させるとよい。その結
果、液性試料中の分析対象物量が多いほど、信号物質発
生体１０は流路内のより下流側に分布が変動する。ま
た、分析対象物が抗体の場合、流路ｂの少なくとも一部
には特異結合物質である抗原あるいはエピトープ部分を
不溶化しておき、不溶化特異結合物質に対して分析対象
物の抗体と競合的に結合する別の抗体と標識剤との結合
体を信号物質発生体１０として用いることができる。

【００４４】ところで、上記説明では、流路ｂの少なく
とも一部に抗体あるいは抗原を不溶化させ、信号物質発
生体１０や分析対象物を抗体に直接あるいは間接に結合
させたが、信号物質発生体１０や分析対象物を流路ｂに
結合させなくても、すなわち先の例における抗体あるい
は抗原が流路ｂの少なくとも一部に不溶化されていなく
ても、分析対象物の量に応じて信号物質発生体１０の流
路ｂ内での分布を変化させることは可能であり、そのよ
うな例も、本発明方法に含まれる。

【００４５】例えば、分析対象物が微生物（例えば病原
性真菌等）であり、信号物質発生体１０が抗微生物抗体
（抗病原性真菌抗体等）と標識剤とが結合してなる標識
特異結合物質である場合、分析対象物（微生物）は、信
号物質発生体１０に比べてかなり大であるため、分析対
象物と信号物質発生体１０との複合体と、フリーの信号
物質発生体１０とでは、流路ｂ内での移動速度、すなわ
ち到達位置に大きな差を生じる。この場合には、流路ｂ
として、例えば多孔性材質のものを用い、そのメッシュ
（ポアサイズ）を適正に選択することによって、あるい
は、ゲル状もしくはゾル状担体を用い、その粘度を微生
物サイズに応じて適正に選択することによって、この到
達位置の差異を検出可能な差とすることができる。従っ
て、分析対象物は、流路ｂには結合されないが、その流
路ｂ内での分布は局在化され、分析対象物と特異結合反
応しうる信号物質発生体１０は、分析対象物の局在化に
ともなって流路ｂ内で分析対象物量に応じた分布をする
ようになる。

【００４６】また、別の例として、フリーの標識抗体と
フリーの分析対象物との自発的な沈降性結合物（免疫沈
降物）形成（いわゆるゲル内免疫沈降反応等）を利用し
た測定があげられる。この場合には、分析対象物の量に
応じて免疫沈降物の形成量が変化し、また、形成された
免疫沈降物は、多孔性材質および／またはゲル状担体か
らなる流路ｂの上流域に留まるが、免疫沈降反応に関与
しなかったフリーの標識抗体は、流路ｂの下流域へ侵入
し得るため、試料中の分析対象物量に応じて信号物質発
生体１０の分布が変化する。同様に、特異結合物質を不
溶化した微粒子担体と分析対象物との特異結合凝集反応
による微粒子の会合サイズの変化を信号物質発生体１０
の分布変化に利用することもできる。

【００４７】続いて、本発明方法における信号の発生に
ついて、具体的に説明する。信号物質発生体が、酵素標
識特異結合物質である場合を代表例として、図１および
下記表１に基づいて説明する。

【００４８】

【表１】

【００４９】

【表２】

【００５０】表１は、本発明方法における信号の発生
を、典型的な６例について説明したものである。なお、
表１中の各欄において、上段には、先に説明した本明細
書中の用語を、また下段には、上段の用語で示されるも
のの具体例を示した。

【００５１】まず、であるが、これは検出部ｃが電極
であり、信号が電子移動である例である。図１に基づい
て説明する。この場合は、流路ｂ内の信号物質発生体
（α−ガラクトシダーゼ標識特異結合物質）１０に、信
号物質の発生に関与する物質（ｐ−アミノフェニル−α
−Ｄ−ガラクトシド）１４が到達すると、信号物質の発
生に関与する物質１４が信号物質（ｐ−アミノフェノー
ル）１２に変化する。この信号物質１２が拡散によって
＋４００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）に電位設定され
た検出部ｃ₁ （電極）あるいはｃ₂ に到達すると、信号
物質１２は酸化（ｐ−ベンゾキノンモノイミンとなる）
され、同時に酸化電流という信号（電子移動）をそれぞ
れの検出部ｃで発生する。そこで、電気量や電流値とし
て、信号である電子移動に係る数値を計測すればよい。

【００５２】次にであるが、これも、検出部ｃが電極
であり、信号が電子移動である例である。ただし、電子
の受け渡しのための電子メディエータを用いている。同
様に図１に基いて説明する。電子メディエータとは、本
発明においては、酵素反応と電極反応との間を媒介し
て、両反応間の電子移動を可能ならしめる酸化還元化合
物を総称して用いられており、その中には、両反応いず
れにおいても不可逆な副生成物を実質的に生じず、両反
応の間をサイクリング可能な物質を含んでいる。なお、
電子メディエータとしては、具体的には、後述する表３
に示されるような物質が例示される。この場合は、流路
ｂ内の信号物質発生体（グルコースオキシダーゼ標識特
異結合物質）１０に、信号物質の発生に関与する物質
（グルコースと酸化型電子メディエータであるフェリシ
ニウムイオン）１４が到達すると、フェリシニウムイオ
ンが還元されてフェロセンに変化する。この還元型電子
メディエータであるフェロセンが信号物質１２である。
この信号物質１２が拡散によって＋４００ｍＶ（ｖｓ．
Ａｇ／ＡｇＣｌ）に電位設定された検出部ｃ₁ （電極）
あるいはｃ₂ に到達すると、信号物質１２は酸化されて
再び酸化型電子メディエータのフェリシニウムイオンに
戻り、同時に酸化電流という信号（電子移動）をそれぞ
れの検出部ｃで発生する。また、この場合は、電子メデ
ィエータ間の電子ホッピング等による電子自体の拡散伝
達と、その結果検出部ｃにおいて発生する信号（電子移
動）の測定も考えられる。

【００５３】また、の場合は、流路ｂ内の信号物質発
生体（パーオキシターゼ標識特異結合物質）１０に信号
物質の発生に関与する物質（過酸化水素と還元型電子メ
ディエータ）１４が反応すると、還元型電子メディエー
タが酸化型電子メディエータに変換される。この酸化型
電子メディエータが信号物質１２である。この信号物質
１２が拡散によって−１５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣ
ｌ）に電位設定された検出部ｃ₁ （電極）あるいはｃ₂
に到達すると、信号物質１２は還元されて再び還元型電
子メディエータに戻り、同時に還元電流という信号（電
子移動）をそれぞれの検出部ｃで発生する。なお、信号
物質の発生に関与する物質１４となる還元型電子メディ
エータ（水素供与体）としては、ハイドロキノン、Ｐ−
フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ
−フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ
´−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＰ
Ｄ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラエチル−ｐ−フェニ
レンジアミン（ＴＥＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テト
ラキス−カルボキシメチル−ｐ−フェニレンジアミン
（ＴＣＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキス−（２
´−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（Ｔ
ＨＥＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキス−（２
´，３´−ジヒドロキシプロピル）−ｐ−フェニレンジ
アミン（ＴＤＨＰＤ）等が例示され、好ましくはＴＤＨ
ＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤである。

【００５４】は、検出部ｃが酵素電極であり、信号が
電子移動である例である。この例では、酵素電極の性能
を上げるために、酵素電極部分に、電子メディエータお
よび／または導電性高分子化合物（ポリピロール、ポリ
チオフェンなど）を構成成分として含ましめることも可
能である。酵素電極の構成に関わらず、信号物質が検出
部ｃ（酵素電極）と反応して信号（電子移動）を発生す
るあるいは発生させることに変りない。なお、好適な信
号物質としては、酵素電極に対する基質、補因子あるい
は補酵素が例示できる。また、信号物質が他の物質と協
同して信号を発生する場合、すなわち、酵素電極が信号
物質と他の信号の発生に関与する物質の存在下で信号を
発生する場合には、この信号の発生に関与する物質を検
出部ｃおよび／または検出部ｃ近傍に存在させておけば
よい。この場合は、流路ｂ内の信号物質発生体（グルコ
ースオキシダーゼ標識特異結合物質）１０と、信号物質
の発生に関与する物質（グルコースと溶存酸素）１４が
反応すると、信号物質（過酸化水素）１２が生成され
る。この信号物質１２が−１５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／Ａ
ｇＣｌ）に電位設定された検出部ｃ₁ （パーオキシダー
ゼ電極）あるいはｃ₂ に到達すると、電子メディエータ
を介してあるいは介さずに、電子を電極から受け取り、
それぞれの検出部ｃ（あるいはその近傍）に存在する信
号の発生に関与する物質（水素イオン）１５と反応して
信号物質１２自身は還元される。その際、各検出部ｃ
（パーオキシダーゼ電極）において、信号（電子移動）
が発生する。

【００５５】は、検出部ｃが酵素（パーオキシダー
ゼ）を実質上不動化してなる部分であり、信号が発光で
ある例である。この例も、信号物質１２自身は信号を発
生しないので、信号の発生に関与する物質を使用する。
この場合は、流路ｂ内の信号物質発生体（グルコースオ
キシダーゼ標識特異結合物質）１０と信号物質の発生に
関与する物質（グルコースと溶存酸素）１４が反応する
と、信号物質（過酸化水素）１２が生成される。この信
号物質１２が、検出部ｃ₁ （ペルオキシダーゼ不動化部
位）あるいは検出部ｃ₂ に到達すると、信号の発生に関
与する物質（ルミノール）１５を変化させ、信号（発
光）を発生させる。従って、所定時間経過後に、あるい
は所定時間経過後までの発光強度をそれぞれの検出部ｃ
で測定すればよい。

【００５６】は、検出部ｃが酵素（パーオキシダー
ゼ）を実質上不動化してなる部分であり、信号が呈色で
ある例である。この例も、信号物質１２自身は信号を発
生しないので、信号の発生に関与する物質を使用する。
この場合は、流路ｂ内の信号物質発生体（ウリカーゼ標
識特異結合物質）１０と信号物質の発生に関与する物質
（尿酸塩と溶存酸素）１４が反応すると、信号物質（過
酸化水素）１２が生成される。この信号物質１２が、検
出部ｃ₁ （パーオキシダーゼ不動化部位）あるいは検出
部ｃ₂ に到達すると、信号の発生に関与する物質（オル
トジアニシジン）を発色体に変化させ、信号（呈色）を
発生させる。従って、所定時間経過後に、あるいは所定
時間経過後までの呈色を、それぞれの検出部ｃにおい
て、吸光度、反射光、肉眼等で測定すればよい。

【００５７】また、上記の〜において、信号物質の
発生に関与する物質（酵素反応の基質に相当、ただし、
溶存酸素ではない方）１４と信号物質発生体１０を構成
する標識剤（酵素）は、交互に交換されてもよい。しか
し、この場合、酵素を標識剤として用いた方が、反応効
率に優れるのでよい。

【００５８】本発明の特異結合分析方法において、信号
物質の発生に好適な酵素（前記表１における信号物質発
生体の一構成成分、標識）と、該酵素の基質（前記表１
における信号物質の発生に関与する物質）との組合せの
一例を、下表２に示す。

【００５９】

【表３】

【００６０】表２に示した組合せは、前記表１中のお
よび〜の場合に用いることができる。しかしなが
ら、の場合（信号物質１２の電極上での酸化還元反応
によって信号を発生させる例）には、発生される信号物
質１２がｐ−アミノフェノール、ハイドロキノン、ｐ−
クレゾール等である組合せを用いるのがよい。これら
は、銀・塩化銀電極に対して＋数百ｍＶ程度の電位を印
加すれば、十分に電極への電子移動が生じる。

【００６１】また、前記表１中のの場合には、表２中
の基質として、Ｏ₂ のかわりに、電子メディエータとし
て知られる酸化還元物質（酸化状態）を用いる。それに
より、表１に示すように反応が行なわれ、信号物質１２
（還元状態の電子メディエータ）が発生され、この信号
物質１２から、と同様に、電子メディエータに応じた
電位を印加した電極に電子が放出され、電子メディエー
タ自身は酸化状態へ戻る。

【００６２】電子メディエータの候補としては、金属イ
オン、金属錯体、ルテニウム錯体化合物、フェロセン化
合物、キノン化合物、ビオロゲン化合物、ポルフィリン
誘導体など数多く知られている。この中には、水素供与
体として酵素反応に関わる化合物も含まれる。

【００６３】下表３に代表例を挙げるが、本発明ではこ
れらの化合物の化学修飾物や他の好適な電子メディエー
タも利用可能である。また、電子メディエータは、信号
物質発生体１０によって酸化状態から還元状態に変化す
るものに限定されず、逆に、還元状態から酸化状態に変
化するものであってもよい。具体的には、西洋わさびパ
ーオキシターゼの場合には、表２中の水素供与体、すな
わち還元型メディエータを用いる。それにより、表１に
示すような反応が行われ、信号物質（酸化型電子メディ
エータ）１２が発生され、この信号物質から、前記と
同様に電子メディエータに応じた電位を印加した電極か
ら電子を奪い、電子メディエータ自身は還元状態に戻
る。

【００６４】

【表４】

【００６５】前記表１中の〜の例のように、二段階
の酵素反応を行なわせる場合であって、信号は、一段目
の酵素反応によって発生された信号物質１２が他の物質
に働きかけて生成される場合の二段目の反応に関与する
物質は、次の通りである。

【００６６】前記表１中のには、検出部ｃが酵素電極
である例を示したが、この場合は、一段目の反応によっ
て発生される信号物質１２の種類に応じ、酵素電極の酵
素が限定される。

【００６７】例えば、一段目の反応で発生される信号物
質１２が過酸化水素である場合は、検出部ｃを西洋わさ
び由来パーオキシダーゼなどのパーオキシダーゼを固定
化した酵素電極( J. E. Frew et al, J. Electoanal. C
hem., Vol. 201, 1 - 10, 1986 ; R.M. Paddock & E.
F. Bowden, J. Electroanal. Chem., Vol. 260, 487 -4
94, 1989 ; Ulla Wollenberger et al, Analytical Let
ters, Vol.23, 1795 -1808, 1990 など参照）とし、ま
た、例えば、信号物質１２がＮＡＤ⁺ あるいはＮＡＤＨ
である場合は、検出部ｃを好熱菌由来のジアフォラーゼ
Ｉを固定化した酵素電極( K. Miki et al, Analytical
Sciences, Vol. 5, 269 - 274, 1989 など参照）とすれ
ばよい。

【００６８】検出部ｃをこのような酵素電極とする場合
は、表１に示したように、信号の発生に関与する物質と
して、電子メディエータを用いる場合がある。この場
合、電子メディエータは、検出部において酵素反応と電
極反応を媒介して、信号である電子の移動をおこす。な
お、電子メディエータについては、先に表３に例示した
通りである。

【００６９】なお、酵素電極に類似のものとして、化学
修飾電極が知られており、これらの酵素電極および化学
修飾電極については、「 R. W. Murray, Chemically Mod
ified Electrode, Electroanalytical Chemistry, Volu
me 13, 191 - 368, Marcel Dekker, Inc., New York, 1
984 」、 「 K. Nakamura, M. Aizawa & O. Miyawaki, Ele
ctroenzymology Coenzyme Regeneration, Springer - V
erlag, Berlin, 1988」、 「 V. J. Razumas, J. J. Jasai
tis & J. J. Kulys, Bioelectrochemistry and Bioener
getics, Volume 12, 297 - 322, 1984 」 等に記載され
ている。

【００７０】また、前記表１中のの場合のように、信
号が蛍光や発光である場合は、一段目の反応によって発
生される信号物質１２の種類に応じ、二段目の反応に関
与する物質（酵素および酵素の基質である蛍光性（発光
性）物質）が限定される。

【００７１】例えば信号が蛍光であり、信号物質１２が
過酸化水素である場合は、二段目の反応に関与する物質
が、パーオキシダーゼと、４−ヒドロキシフェニル酢
酸、もしくは、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピ
オン酸との組合せである例がある。

【００７２】また、信号が発光である場合には、次のよ
うな組合せが例示される。すなわち、信号物質１２がＡ
ＴＰの場合は、二段目の反応に関与する物質として、ホ
タルルシフェラーゼと、ルシフェリンおよびＭｇ²⁺との
組合せが例示される。また、信号物質１２がＮＡＤＨの
場合は、二段目の反応に関与する物質として、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ：ＦＭＮオキシドレダクターゼおよび発光バク
テリア由来のルシフェラーゼと、ＦＭＮおよびテトラデ
カナールなどの飽和長鎖脂肪族アルデヒドとの組合せが
例示される。

【００７３】このような例において、検出部ｃ₁ および
ｃ₂ は、いずれも二段目の反応に関与する物質のうちの
いずれか１種以上を不動化させてなるもので構成される
が、反応効率の観点からは、酵素を不動化させてなるも
のであるのがよい。

【００７４】なお、蛍光や発光を信号とする場合には、
前記表１中ののように、信号物質１２自体から信号を
発生せしめることも可能である。すなわち、例えば、信
号物質１２の発生に関与する物質として、ルシフェリン
の誘導体（例えばＤ−ルシフェリン−ｏ−リン酸）、信
号物質発生体１０を構成する標識剤として、アルカリフ
ォスファターゼを選択し、信号物質１２であるルシフェ
リンを発生させ、ＡＴＰおよびＭｇ²⁺の存在下に、ルシ
フェリンにルシフェラーゼを作用させれば、発光（信
号）が生じる。この場合、検出部ｃ₁ およびｃ₂ は、い
ずれもＡＴＰ、Ｍｇ²⁺およびルシフェラーゼのうちのい
ずれか１種以上を不動化させてなるもので構成される
が、反応効率の観点から、ルシフェラーゼを不動化させ
てなるものであるのが好適である。

【００７５】さらに、前記表１中ののように、信号が
呈色である場合も、一段目の反応によって発生される信
号物質１２の種類に応じ、二段目の反応に関与する物質
（酵素および酵素の基質である発色体の前駆物質）が限
定される。例えば信号物質１２が過酸化水素の場合に
は、二段目の反応に関与する物質が、パーオキシダーゼ
と、呈色物質の前駆物質である、５−アミノサリチル
酸、ｏ−ジアニシジン、２，２′−アジノジ−（３−エ
チルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウ
ム塩（ＡＢＴＳ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリン
ヒドラゾン（ＭＢＴＨ）と３−（ジメチルアミノ）安息
香酸（ＤＭＡＢ）の混合物、ｏ−トリジン、３，３′−
ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、１，２−フェニレンジ
アミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン
等との組合せが挙げられる。

【００７６】また、信号物質１２がＮＡＤＨの場合に
は、二段目の反応に関与する物質が、ジアフォラーゼ
と、呈色物質の前駆物質であるヨードニトロテトラゾリ
ウム・バイオレットとの組合せが挙げられる。この場合
も、検出部ｃ₁ およびｃ₂ は、いずれも二段目の反応に
関与する物質のうちのいずれか１種以上を不動化させて
なるもので構成されるが、反応効率の観点からは、酵素
を不動化させてなるものであるのがよい。

【００７７】以上、本発明方法における信号の発生につ
いて、具体例に即して説明したが、本発明方法における
信号の発生機構は、これらに限定されない。

【００７８】前述のように、本発明の特異結合分析方法
を実施する分析装置は、基本的に、試料導入部ａ、流路
ｂおよび複数の検出部ｃ、さらに必要により、液性試料
の流れる装置内のいずれかの箇所に、信号物質の発生に
関与する物質および／または信号の発生に関与する物質
を備えた装置である。

【００７９】試料導入部ａは、液性試料を流路ｂの所定
の場所から導入させるために流路ｂに連結して設けられ
る部位であり、流路ｂへの液性試料等の入り口である。
試料導入部ａは、通常は流路ｂに連結した液性試料導入
口であるが、分析に必要な液性試料を一時的に蓄える部
位として作用させてもよく、また、必要に応じて、試料
導入部ａに夾雑物等を取り除くフィルターなどを設置し
てもよい。また、試料導入部ａと流路ｂとの間に、また
は流路ｂの上流域に信号物質発生体１０、信号物質の発
生に関与する物質１４、信号の発生に関与する物質、特
異結合物質等、反応に必要な各種の物質を含浸した含浸
部を設けてもよい。

【００８０】流路ｂは、試料導入部ａの下流に連結し、
導入された液性試料の流動する部位であり、特異結合反
応によって、液性試料中の分析対象物の量（分析対象物
の濃度）に応じた信号物質発生体１０の分布が形成され
る場所である。本発明においては、分析操作を簡便化す
るために、液性試料はポンプなどの外力を必要とせず
に、自発的に流路ｂを流れることが望ましい。そのた
め、流路ｂは細管や狭い間隙で形成されるキャピラリあ
るいは多孔性部材で構成されている方が望ましい。ま
た、流路ｂをキャピラリあるいは多孔性部材で構成する
ことにより、特異結合反応の反応効率が増大したり、信
号物質発生体の分布が明瞭に形成されるなどの付加的な
効果も期待できる。なお、液性試料の自発的な流れを増
強したり、流路ｂを通過する試料液量を増大させるため
に、必要に応じて、流路ｂの下流域に連結して吸収部を
配置することもできる。

【００８１】流路ｂは、例えば多孔性担体あるいはゲル
担体で構成する。ただし、ゲル担体の場合は、試料と接
触することによってゲル状態あるいはゾル状態となるも
のを用いるのがよい。好ましくは、多孔性担体である。
あるいは、多孔性担体に、水溶性高分子化合物を含浸さ
せ、乾燥させたものを流路ｂとして用いてもよい。さら
には、前記多孔質担体等に固体状物質を保持させたもの
であってもよい。

【００８２】より具体的には、多孔性担体としては、セ
ルロースアセテート製、ニトロセルロース製あるいはナ
イロン製の多孔性メンブレン、ガラス繊維製あるいはセ
ルロース繊維製の濾紙、多孔性セラミックス等が、ま
た、ゲル担体としては、寒天、アガロース、デキストラ
ン、ポリアクリルアミド等が例示される。さらに、前記
水溶性高分子化合物としては、デンプンおよびその誘導
体、マンナン、ガラクタン、寒天、アガロース、アルギ
ン酸ナトリウム、アラビアゴム、デキストラン、ゼラチ
ン、カゼイン、コラーゲン、メチルセルロース（Ｍ
Ｃ）、エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシエチルセ
ルロース（ＨＥＣ）、カルボキシメチルセルロース（Ｃ
ＭＣ）、ポリビニールアルコール（ポバール）、ポリア
クリル酸ナトリウムなどが例示できる。加えて、前記固
体状物質としては、デキストラン等の多孔性粒子、ポリ
スチレン製等のラテックス、ガラス製微粒子等の微粒
子、またはそれらに結合用の活性基を付与した微粒子が
例示される。

【００８３】流路ｂは、前記したように、特異結合反応
の場であり、信号物質発生体が分布する場でもあるの
で、この部分の構成が、検出結果に大きな影響を与え
る。そこで、分析対象物の種類、特異結合反応の方式
（競合型、サンドイッチ型など）等に応じて、流路ｂを
適当な性状を示すように構成することが望ましい。すな
わち、その材質、大きさ（厚み）、ポアサイズあるいは
ゲル状態となった時の粘度（粘稠性）等を選択、調整す
ることにより、信号物質発生体の分布状態や信号物質等
の拡散速度を任意に調節する。

【００８４】また、流路ｂを複数の構造および材質から
構成させることにより、例えば積層体等とすることによ
り、その性状を詳細に調節することができる。例えば、
流路ｂの検出部ｃ₁ およびｃ₂ いずれも近傍にポアサイ
ズの小さい材質を用い、試料導入部ａ側には、ポアサイ
ズの大きい材質を用いると、分析対象物量による特異結
合反応後の信号物質発生体の分布の差異をより明瞭にで
きる。これを実現する具体例としては、ポリアクリルア
ミドのグラディエントゲルおよびポアサイズの異なる多
孔性メンブレンの積層体等が例示できる。

【００８５】流路ｂに分析対象物に対する特異結合物質
を存在あるいは不溶化させる場合、それは、全体に均等
に存在させあるいは不溶化してもよいが、流路ｂの一部
分に局在させてもよい。また、上流側には多く存在ある
いは不溶化させ、下流側には少なく存在あるいは不溶化
させる等の濃度傾斜をつけてもよい。

【００８６】なお、流路ｂに分析対象物に対する特異結
合物質を不溶化させるには、多孔性担体あるいはゲル担
体に共有結合あるいは吸着によって不溶化させればよ
い。また、流路ｂを複数の部材から構成する場合、ある
いは、多孔性担体と水溶性高分子化合物とで構成する場
合、あるいは、多孔性担体等とそれに保持される固体状
物質とで構成する場合、特異結合物質の不溶化は、構成
要素全てに対して行なってもよいし、一部にのみ行なっ
てもよい。

【００８７】本発明の装置の流路ｂの試料の流れ方向の
長さは、小さくすればするほど、試料の必要液量を少な
くできるが、小さくしすぎると、分析対象物の量に応じ
た信号物質発生体の分布の変化が明瞭でなくなる。従っ
て、一般的には、１０μｍ〜数十ｍｍ程度とする。

【００８８】検出部ｃは、到達した信号物質が発する信
号を、肉眼での目視で、もしくは、信号の性質に応じた
好適な外部の計測器で、信号の変調の程度を計測できる
部位であり、液性試料の流れ方向に異なる位置に、流路
ｂから信号物質１２を受け取ることができる位置に複数
配置される。複数の検出部ｃのうち、少なくとも１つ
は、流路ｂ内での信号物質発生体１０の位置分布の変化
から生じる信号変調の大きい部位に設ければよい。通常
は、流路ｂの最下流側あるいは最上流側である。別の検
出部は、同様に流路ｂ内での信号物質発生体１０の位置
分布の変化から生じる信号変調の大きい部位に設けても
よいし、あるいは、流路ｂ内での信号物質発生体１０の
位置分布の変化から生じる信号変調を受けにくい部位に
設けてもよい。

【００８９】ただし、複数の検出部が流路ｂ内での信号
物質発生体の位置分布の変化に対して全く同等で、それ
ぞれの検出部で信号変調に差が認められない場合には、
複数検出部による本発明の分析が成立しない。従って、
本発明においては、流路ｂの液流方向に対して異なる位
置に複数の検出部を配置する。ここで、流路ｂ内での信
号物質発生体の分布の分析対象物量による変動は、基本
的に試料液流の方向に起こるため、流路ｂの液流方向に
対して異なる位置に複数の検出部を配置すれば、それぞ
れの検出部での信号変調は同等とはならない。

【００９０】検出部における検出手段には特に限定はな
く、信号物質による信号（あるいは信号物質によって検
出部が発する信号）に応じて、各種の公知の手段が利用
可能である。特に電気化学的測定が好ましく利用され
る。例えば、電気化学的信号であれば、検出部として各
種の電極を用いればよい。具体的には、作用電極および
対電極としては、白金、金、銀、カーボン電極等が使用
できるが、製造に適したカーボン印刷電極が好適であ
る。この場合、電極基板としては、液体不透過性の板、
例えばＰＥＴフィルム、塩化ビニル板あるいはガラス板
などを使用してもよいし、液体透過性のシート、例えば
濾紙などを使用してもよい。さらに微細な電極構成とす
るために、マイクロアレイ電極を作製することもでき
る。

【００９１】また、前記電極の参照電極としては、Ａｇ
／ＡｇＣｌ電極等が例示される。これも、印刷技術等に
よって製造できる。

【００９２】検出部ｃを酵素電極とすれば、電極反応の
特異性や感度が上昇する。この場合には、信号物質は、
酵素電極の基質もしくは補因子として作用し、電子が電
極上で授受され、信号が測定される。酵素電極は、生化
学分析あるいは分析化学分野では多数知られている。

【００９３】信号が蛍光、発光、呈色等である場合は、
各々、具体的には、検出部ｃは、発光反応に必要な少な
くとも１つの信号の発生に関与する物質を実質上不動化
した発光発生部、蛍光反応に必要な少なくとも１つの信
号の発生に関与する物質を実質上不動化した蛍光発生
部、呈色反応に必要な少なくとも１つの信号の発生に関
与する物質を実質上不動化した呈色発生部等である。

【００９４】さらに、検出部ｃが蛍光、発光、呈色等が
検出される部位である場合、検出部ｃは、流路ｂまたは
後記する吸収部の一部に、あるいは、検出部ｃの下流側
に設けられた基板がある場合は、その基板に、信号の発
生に関与する物質を不動化させることで作製することが
できる。その場合、不動化には、３−アミノプロピルト
リエトキシシラン処理したガラス基板とグルタルアルデ
ヒドとを用いて酵素を基板に結合する等の、種々の方法
が利用できる。また、本発明の装置は、さらに、支持体
（あるいは基板）やカバーを有していてもよい。

【００９５】図２に、このような本発明の特異結合分析
装置であって、電気化学的信号によって測定を行う特異
結合分析装置の一例の分解斜視図を、図３にこの装置を
組み立てた際の断面図を、それぞれ示す。図２に示され
る分析装置は、上から、上部カバー５０、フィルター５
２、第１含浸部５４、第２含浸部５６、連通部材５８、
複数の検出部を有する電極部６０、特異結合物質不溶化
流路（マトリクス）６２、吸収部６４、および下部基板
６６を有して構成され、図３に示されるように、各部材
が上記順番で積み重ねられて、組み合わされて構成され
る。

【００９６】図示例の装置においては、上部カバー５０
（その試料導入口５０ａ）、フィルター５２、第１含浸
部５４、第２含浸部５６および連通部材５８によって試
料導入部が構成される。なお、フィルター５２、第１含
浸部５４、第２含浸部５６および連通部材５８は、分析
に利用する特異結合反応や装置構成等に対応して、必要
に応じてあるいは好ましい態様として配置されるもので
あり、本発明はこれらを有するものに限定されない。す
なわち、本発明においては、試料導入口５０ａのみで試
料導入部を形成して、ここから直接流路６２に液性試料
を導入してもよく、あるいは、その他の部材を必要に応
じて適宜選択し、組み合わせて試料導入部を形成しても
よい。

【００９７】上部カバー５０は、前述の各種の材料によ
って成形されるものであり、中心部分には液性試料を注
入するための試料導入口５０ａが形成される。

【００９８】フィルター５２は、試料に含まれる測定に
不要な固形物（妨害物質）を除去すると共に、試料の導
入が均一に行えるようにするものであって、通常、織
布、不織布等によって形成される。

【００９９】第１含浸部５４および第２含浸部５６は、
液性試料の種類、分析対象物、利用する特異結合反応等
に応じて適宜配置されるものであって、ガラス繊維濾
紙、セルロース繊維濾紙、不織布等に、信号物質発生
体、信号物質の発生に関与する物質、信号の発生に関与
する物質、電子メディエータおよびこれらの安定化剤も
しくは保護剤、イオン強度および／またはｐＨ調整のた
めの塩成分、緩衝液成分、界面活性剤などの液性試料の
流動円滑化剤等が含浸・乾燥されてなるものである。第
１含浸部５４や第２含浸部５６を液性試料が通過するこ
とによって、信号物質発生体等が溶出して液性試料と混
合され、あるいは反応が開始される。なお、１つの含浸
部に保持される物質は複数であってもよく、また、図示
例のように第１含浸部５４と第２含浸部５６とに分けず
に、含浸部を１つとしてもよいのはもちろんである。

【０１００】また、このような第１含浸部５４や第２含
浸部５６等を有することによって、試料の流れ時間を長
くして反応時間を十分に確保することが可能となる。さ
らに、図示例においては、好ましい態様として第２含浸
部５６の上面中心部分には水が通過不可能なシール部５
６ａが形成される。シール部５６ａを有することによ
り、鉛直方向であった試料の流れを水平方向に変更する
ことができ、試料の流れ時間をより長くして反応時間を
十分に確保することが可能となると共に、混合効果によ
って反応効率が上り、より正確な測定を実現することが
できる。シール部５６ａの形成材料および形成方法には
特に限定はなく、塩化ビニル、セルロースアセテート、
ポリエステル等の各種の水不透性材料を、接着剤、例え
ばアクリル系接着剤等の手段を用いて第２含浸部５６の
中心部分に貼着すればよい。もしくは、水不透性樹脂あ
るいは水不透性ポリマーなどの薄膜を印刷法、光重合法
あるいは光硬化法などで形成させればよい。

【０１０１】なお、本発明の分析装置（分析方法）にお
いては、第１含浸部５４や第２含浸部５６等は必須要件
ではないのは前述のとおりであるが、これらを有さない
場合（これらに信号物質発生体等を含浸させない場合）
には、信号物質発生体等の分析に必要な物質は、あらか
じめ液性試料と混合しておく、液性試料の注入の前ある
いは後に試料導入口５０ａから注入する等の方法で反応
系に導入すればよいのは前述のとおりである。

【０１０２】連通部材５８は、第２含浸部５６を通過し
た試料等を電極部６０の貫通孔６８を通過させて流路６
２に導入するものであり、ガラス繊維濾紙やセルロース
繊維濾紙等より形成される。このような連通部材５８
は、必要に応じて、後述する電極部６０の貫通孔６８に
挿入されて配置される。電極基板６１の厚さが大きくな
い場合には必ずしも必要ではない。

【０１０３】電極部６０は、本発明の構成要素の一つで
ある複数の検出部ｃが形成されるものであって、図示例
の装置においては、電極部６０は、ＰＥＴ（ポリエチレ
ンテレフタレート）等の絶縁性基板６１の上面に参照極
／対極を、下面に検出部となる作用極が形成され、流路
６２に形成された信号発生体の分布に応じた電気的信号
が作用極によって検出される。

【０１０４】図４（ａ）に電極部６０の上面を、図４
（ｂ）に電極部６０の下面を、それぞれ示す。図示例の
電極部６０の上面には、環状の対極（参照極）７０およ
びその端子７０ａが形成され、対極７０を除いて、斜線
で示されるように絶縁層７４が形成されている。一方、
電極部６０の裏面には、上面と同様にして、環状の第１
作用極７６およびその端子７６ａが形成され、さらに、
第１作用極７６と同一中心を有しかつ第１作用極７６よ
りも大きな略環状の第２作用極７８およびその端子７８
ａが形成される。また、第１作用極７６、第２作用極７
８および両者の間隙を除いて、斜線で示されるように絶
縁層７４が形成されている。すなわち、図示例において
は、第１作用極７６が図１の第１検出部ｃ₁ に、第２作
用極７８が同第２検出部ｃ ₂ に相当する。さらに、絶縁
性基板６１には、対極７０および第１作用極７６の内側
を貫通して貫通孔６８が形成される。

【０１０５】前述のように、液性試料は貫通孔６８ある
いは必要に応じて貫通孔６８に挿入された連通部材５８
を通過して後述する特異結合物質不溶化流路６２に導入
される。そのため、図示例の装置においては、特異結合
物質不溶化流路６２内での液性試料は貫通孔６８すなわ
ち第１作用極７６の中心から外方向に向かって放射状に
流れる。従って、図示例に示すように、電極（検出部）
を同一中心を有しサイズの異なる環状とし、その中心か
ら液性試料が流れる構成とすることにより、第１作用極
７６および第２作用極７８は、液性試料の流れ方向に異
なる位置に配置されることになる。なお、第１作用極７
６と第２作用極７８との間隙には、特に限定はないが、
１０μｍ以上が好ましいのは前述のとおりである。

【０１０６】検出部となる第１作用極７６および第２作
用極７８は、前述の各種の材料によって形成される。対
極７０は、銀電極、銀／塩化銀電極等で形成される。ま
た、基板２８は、ＰＥＴ、ポリ塩化ビニル、ポリイミ
ド、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性材料で形成さ
れる。さらに、絶縁層３６は、アクリル系樹脂、ポリエ
ステル等の公知の各種の絶縁性インク材料で形成され
る。

【０１０７】なお、図示例の装置において、各作用極、
対極（参照極）および絶縁層は、共に、スクリーン印
刷、ドクターナイフ等の厚膜形成技術、スパッタリン
グ、ＣＶＤ等の薄膜形成技術等の公知の膜形成技術によ
って形成すればよい。

【０１０８】本発明において、第１作用極７６、第２作
用極７８等の形状は図示例の環状に限定はされず、液性
試料の拡散方向に異なる位置（好ましくは一定間隔）を
もって配置されるものであれば、例えば、図５に示され
る形状等、様々な形状が利用可能である。また、本発明
においては、複数の検出部は２つに限定されないのはも
ちろんであり、例えば、図６に示されるように、３つの
作用極を形成してもよく、あるいはそれ以上であっても
よい。さらに、図示例においては、液性試料の特異結合
物質不溶化流路６２への導入点を中心に、これを囲む円
周で検出を行っているが、これ以外にも、図１、図５ｂ
および図６ｂに示されるように、直線的な一方向に異な
る位置に配置される作用極としてもよいのはもちろんで
ある。

【０１０９】特異結合物質不溶化流路６２は、本発明の
特異結合分析装置における流路ｂとして作用するもの
で、例えば、分析対象物および信号物質発生体と特異結
合する抗体が不溶化して固定されており、液体試料中の
分析対象物等の特異結合反応によって、液体試料中の分
析対象物の量に応じた信号物質発生体の分布を形成す
る。特異結合物質不溶化流路６２に形成された信号物質
発生体の第１作用極７６および第２作用極７８からの距
離分布が、信号物質を介して電流値として測定される。
このような特異結合物質不溶化流路６２は、前述の流路
ｂと同様にして形成され、例えば、メンブレン等の多孔
質膜に、特異結合反応のための抗体や抗原、核酸等を、
不溶化して保持・乾燥してなるものである。また、余剰
の試料は、特異結合物質不溶化流路６２を通過して後述
の吸収部６４で吸収される。

【０１１０】吸収部６４は、前述のように特異結合物質
不溶化流路６２を通過した余剰の試料を吸収するもの
で、例えば、クロマトグラフ濾紙などのセルロース濾
紙、高吸水性ポリマーで形成される。また、吸収部６４
に信号物質の発生に関与する物質および／または信号の
発生に関与する物質を含浸しておいてもよい。

【０１１１】図示例の装置においては、好ましい態様と
して吸収部６４の上面中心部分に水が通過不可能なシー
ル部６４ａが形成される。前述のシール部５６ａと同
様、シール部６４ａを有することにより、鉛直方向であ
った試料の流れを水平方向に変更することができ、試料
の流れ時間を長くして、特異結合反応の効率を向上させ
ると共に、流路内の信号物質発生体（標識体）分布が明
瞭になり、より正確な測定を実現することができる。図
示例の装置においては、複数の電極７６および７８が、
シール部６４ａの巾以内に複数存在すると、第１検出部
と第２検出部の信号強度の分析対象物濃度に対する応答
が非特異的信号と共に検出でき、これに対し複数の電極
の一方７６をシール部６４ａの巾以内に設け、他方７８
をシール部６４ａの巾の充分外側に配置すればするほ
ど、他方の電極７８で検出される信号強度は分析対象物
濃度に依存する部分が少なくなり、充分外側に配置すれ
ば、実質的に非特異的信号のみを検出するように設計す
ることができる。なお、シール部６４ａは、前述のシー
ル部５６ａと同様に形成される。

【０１１２】図示例の分析装置は、これらの各部材を図
２および図３に示される順序で、下部基板６６上に積層
して、上部カバー５０と下部基板６６とを貼り合わせ、
あるいはねじ止め、ボルトとナット等を用いて固定して
作製される。

【０１１３】このような分析装置においては、前述のよ
うに、試料は上部カバー５０に形成される試料導入口５
０ａより注入される。試料導入口５０ａより注入された
試料は、フィルター５２を通過して異物等を除去され、
第１含浸部５４に流入し、次いで第２含浸部５６に流入
する。含浸部に試料が流入することにより、乾燥・保持
された信号物質発生体等が溶出し、試料と混合され、あ
るいは分析対象物の特異結合反応が開始される。なお、
図示例においては、第２含浸部５６の上面にはシール部
５６ａが形成されるので、試料の流れ方向が鉛直方向か
ら水平方向に変更され、十分な反応時間が確保できるの
は前述のとおりである。

【０１１４】第２含浸部５６を通過した試料は、連通部
材５８によって電極部６０の貫通孔６８を通過され、特
異結合物質不溶化流路６２に流入する。流路６２に試料
が流入すると、特異結合物質不溶化流路６２内で液体試
料中の分析対象物の特異結合によって信号物質発生体の
分布が決り、信号物質発生体の作用によって発生する信
号物質が拡散によって第１作用極７６、あるいは第２作
用極７８に到達し、両作用極において、信号物質発生体
の特異結合物質不溶化流路６２内の作用極の半径方向の
分布が、反応に対応した電気化学的信号として検出され
る。余剰の試料は、特異結合物質不溶化流路６２を通過
して吸収部６４で吸収される。

【０１１５】第１作用極７６や第２作用極７８からの出
力（電気信号のみならず各種の検出部からの出力）は、
試料導入部に所定量の液性試料を添加し、所定時間経過
後に、あるいは、所定時間が経過するまで連続的に、読
み取りを行えばよい。なお、複数の検出部での信号計測
は同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。複数の
検出部での信号計測を別々に行う場合、各検出部を順々
に反復して計測してもよい。また、データは、所定時間
経過後の出力強度（例えば電流値）、所定時間内の出力
強度の平均値、出力が所定強度となるまでの時間、連続
的な出力の積分値（例えば電気量）出力が一定の強度に
なるまでの時間等として読み取ればよい。

【０１１６】前述のように、本発明は、特異結合反応を
利用する分析方法において、液性試料の流れ方向に異な
る位置に配置される複数の検出部によって検出される信
号から、液性試料中の分析対象物の量以外の非特異的要
因による分析結果への影響を小さくできる演算式を作成
できることを見出し、これを用いて信号の計測結果を演
算処理することによって、より正確な特異結合分析を可
能としたものである。

【０１１７】ここで、試料中の分析対象物量をＣ、検出
部の信号強度に影響する試料中の夾雑物量をＺ、複数の
検出部の信号強度をＩ₁ 、Ｉ₂ 、……Ｉ_n とすると、 Ｉ₁ ＝ｆ₁ （Ｃ，Ｚ） ∴ Ｚ＝ｇ₁ （Ｉ₁ ，Ｃ） -1式 Ｉ₂ ＝ｆ₂ （Ｃ，Ｚ） ∴ Ｚ＝ｇ₂ （Ｉ₂ ，Ｃ） -2式 ： ： ： ： Ｉ_n ＝ｆ_n （Ｃ，Ｚ） ∴ Ｚ＝ｇ_n （Ｉ_n ，Ｃ） -n式 であり、任意の少なくとも２つの式からＺの項を消去で
きる。例えば、-1式と-2式から、 ｇ₁ （Ｉ₁ ，Ｃ）−ｇ₂ （Ｉ₂ ，Ｃ）＝０ ∴ ｈ₁ （Ｉ₁ ，Ｉ₂ ，Ｃ）＝０ 式

【０１１８】この式は、測定信号強度Ｉ₁ および測定
信号強度Ｉ₂ から分析対象物の未知量Ｃを求める方程式
に他ならないから、この方程式の解である式から分析
対象物量Ｃを求めることができる。 Ｃ＝ｋ₁ （Ｉ₁ ，Ｉ₂ ） 式 従って、少なくとも２つの検出部の計測結果から、試料
中の夾雑物Ｚに影響されない分析対象物量Ｃを求めるこ
とが可能となる。さらに多くの検出部の計測結果があれ
ば、推計学的により精度の高い結果を得ることもでき
る。

【０１１９】ただし、２つの検出部によって検出される
信号が同じ時、すなわち式が次式のような場合、 Ｉ₁ ＝ｆ（Ｃ，Ｚ） Ｉ₂ ＝ｆ（Ｃ，Ｚ） ∴ Ｉ₁ ＝Ｉ₂ にはＣは求められない。

【０１２０】本発明の特異結合分析方法においては、液
性試料中の分析対象物との少なくとも１つの特異結合反
応により、分析対象物量に応じた流路内での信号物質発
生体の分布を形成させ、信号物質発生体から検出部まで
拡散移動して信号を発する信号物質の拡散に律速される
信号を計測しているため、通常、複数の検出部を液流方
向に対して異なる位置に配置すれば、２つの検出部の信
号強度は分析対象物量Ｃに対して、必ず異なる関数とな
る。液流方向に対して異なる位置とは、一般的には、検
出部同士が液流に対して上流下流の関係にあることを意
味する。ただし、電極サイズが大きい場合や電極形状に
よっては、液流方向に対して位置的に重なりを有する場
合もありうる。このような場合でも、電極の幾何学的な
中心あるいは電極端が異なっていれば、信号強度が異な
ることが期待されるので、液流方向に対して異なる位置
に配置しているとみなせる。好ましくは、電極の幾何学
的中心あるいは電極端が１０μｍ以上離れた位置に配置
される。

【０１２１】本発明の特異結合分析方法および特異結合
分析装置は、このように複数の検出部を用いることによ
り、分析対象物との特異結合反応による信号物質発生体
の流路内分布に実質的に影響しない種々の非特異的影響
を極小化することが可能である。本発明の特異結合分析
方法および特異結合分析装置で極小化できる主要な測定
誤差要因Ｚとして以下のようなものが例示できる。

【０１２２】Ｉ. 試料中の夾雑物質や試料特性による非
特異的因子 試料に由来する信号物質発生体と類似の活性 例えば、信号物質発生体が西洋ワサビパーオキシダーゼ
の場合には、試料に由来するパーオキシダーゼ活性など 試料に由来する信号物質発生体あるいは信号物質に対す
る妨害物質 例えば、アスコルビン酸、尿酸などの酸化還元物質、信
号物質の発生に関与する物質が過酸化水素の場合には、
カタラーゼ活性など 試料特性 例えば、信号物質の拡散定数に影響する試料粘度、信号
物質発生体の活性に影響するｐＨ、イオン強度、補因子
濃度、インヒビター濃度 全血試料のヘマトクリット値など II．分析環境 例えば、反応温度など III.失活等の試薬成分の活性の変化程度 例えば、信号物質発生体の活性の変化 信号物質の発生に関与する物質の活性の変化 信号の発生に関与する物質の活性の変化など

【０１２３】これらの中には、分析対象物との特異結合
反応による信号物質発生体の流路内分布に対しても実質
的に影響する可能性のある因子が含まれているが、本発
明の特異結合分析方法および特異結合分析装置は、これ
らの因子に対しても分析対象物との特異結合反応による
信号物質発生体の流路内分布に実質的に影響しない非特
異的影響の部分を極小化することが可能である。

【０１２４】すなわち、上記の数式を用いた説明では、
Ｚを検出部の信号強度に影響する試料中の夾雑物量とし
たが、一般に、Ｚが、Ｉの試料中の試料中の夾雑物質や
試料特性による非特異的因子、IIの分析環境、あるいは
IIIの試薬成分の失活程度のいずれの場合としても同じ
説明が可能である。任意の試料の任意の分析に対して、
その試料およびその分析において、これらの因子はそれ
ぞれ定まっているから、これらの因子の総合的なパラメ
ーターとしてＺを定義しても同様の説明が成立する。す
なわち、本発明の信号検出系では、図２７に例示される
ように、信号物質発生体（標識酵素など）によって信号
物質（電子メディエータなど）を発生させ、発生した信
号物質を検出手段（電極など）によって信号（電流な
ど）として検出する。そのため、計測される信号強度
は、信号物質が発生した場所（すなわち、信号物質発生
体の存在場所）から検出手段までの信号物質の拡散距
離、実質的には多数の分子を考慮した距離分布に大きく
依存する。

【０１２５】ここで、図２８に競合型の特異結合反応で
例示するように、特異結合反応を利用して流路中に液性
試料中の分析対象物濃度に応じた信号物質発生体の分布
を形成させ、かつ、流動方向に異なる位置に配置された
２つの検出手段によって前記の信号検出を行うとする。
すると、各々検出手段は、ある特定の分析対象物濃度に
対応して形成された信号物質発生体の分布を計測してい
るにも係わらず、信号物質発生体の分布に対する相対的
な位置が異なるために信号物質発生体と検出手段との距
離分布がそれぞれ異なり、その結果、一般に異なる信号
強度を示す。つまり、２つの検出手段の信号強度は、液
性試料中の分析対象物濃度に対して異なる応答曲線を示
す。その各々の応答曲線は、複数の係数を有する数学的
な関数（回帰式など）で近似できる。例えば、２つの検
出手段での応答が線形関数の場合、信号強度Ｉと分析対
象物濃度Ｃとの関数はいずれもＩ＝ａ・Ｃ＋ｂと表せる
が、ａおよびｂの係数が各々の電極で異なっていること
になる。

【０１２６】ところで、２つの検出手段の信号検出系は
図２９に例示したように同一であるので、液性試料中の
非特異的な測定誤差要因Ｚの影響は同等に受けている。
これらの測定誤差要因が信号強度に対して与える影響
は、図３１に示すように加算的影響と比率的影響に大別
できるが、一般的には両者の影響が混在している。従っ
て、加算的影響の補正を主たる目的として、この分野で
汎用されている対照値を測定値から差し引くという補正
法、いわゆるブランク補正だけでは精度の高い結果が得
られない。また、従来のブランク補正法では、対照用の
検出手段は、測定用の検出手段と同等の位置に、かつ、
分析対象物濃度に対する応答を全く示さない様式で設置
しなければならないという制約があり装置構成が複雑と
なっていた。本発明の分析方法では、分析対象物濃度に
応じて信号物質発生体の分布が形成される流路が存在す
るため、流動方向のいかなる位置に設置された検出手段
も分析対象物濃度に多少とも応答するにも関わらず、精
度の高い補正法を提供できる。さらに、本発明の分析方
法では、非特異的な測定誤差要因Ｚの加算的影響と比率
的影響が混在していても、複数の検出手段に対して等し
く影響を与えていることに着目して、その影響を極小化
するように演算処理を行える。

【０１２７】つまり、本発明の分析方法によれば、複数
の検出手段における信号強度と分析対象物濃度との応答
関係と、複数の検出手段における信号強度と測定誤差要
因Ｚとの関係とから、測定誤差要因の影響が極小である
分析対象物濃度を求める関係式を導出できる。この導出
方法には種々の方法が可能であるが、以下の方法が簡便
で精度の高い方法として好ましい。 方法測定誤差要因Ｚの影響が極小化できるパラメータ
を用いる。この方法は、目的とする分析における測定誤
差要因を予測し、その影響を極小化できるパラメータ
（複数検出部の信号強度の関数式）を選択し、予測され
る測定誤差要因の存在下で分析を行ってパラメータを最
適化する方法である。一般に、加算的影響は複数の検出
手段の信号強度の差をとることによって除去でき、比率
的影響は比をとることによって除去できるから、後記す
るパラメータ式Ｐ，Ｑ，Ｒなどが例示できる。ただし、
目的とする分析における測定誤差要因の影響を極小化で
きるパラメータであれば、いかなる式でもよい。 方法分析対象物濃度に対する応答曲線の近似式の係数
に測定誤差要因の関係式を導入する。この方法は、複数
の検出手段における分析対象物濃度に対する応答曲線の
近似式の係数に現れる測定誤差要因Ｚの影響を関数関係
として近似し、これら応答曲線の近似式と関数関係とか
ら分析対象物濃度を求める式を導出する方法である。こ
の場合も、目的とする分析における測定誤差要因を予測
し、その予測される測定誤差要因Ｚの存在下で分析を行
うことにより、応答曲線の近似式の係数に現れる測定誤
差要因Ｚの影響をより精密に関数関係として表現でき、
精度の高い分析が可能となる。

【０１２８】本発明は、未反応物の分離操作（洗浄操
作）を伴なわない簡便な方法であって、汎用性に優れ、
迅速測定が可能でありながら、なおかつ、分析操作上何
ら余分な操作なしに、特異結合分析の非特異的な影響に
よる測定誤差を極小化することができる方法と、この方
法の実施に好適な特異結合分析装置の提供を可能とした
のである。

【０１２９】複数の検出部の信号から液性試料中の分析
対象物量を定量する方法について、さらに具体的に述べ
る。分析対象物、特異結合物質、信号物質発生体、信号
物質、特異結合反応の様式、信号物質発生様式、検出部
の配置および分析装置の構成などによって、前述の式
の関数ｆは決定される。しかしながら、これらの要素に
より関数ｆは異なるので、その関数自体を数式化するこ
とは通常困難である。そこで、内部関係式となる式を
得る１つの方法は、Ｚは異なるが分析対象物量の同じ検
体を複数選んで分析を行い、同じ分析対象物量Ｃにおけ
る信号強度Ｉ ₁ とＩ₂ との関係式を推定し、次いで、そ
の関係式と分析対象物濃度Ｃとの関係を推測することに
より、内部関係式式を得る方法である。この方法は、
後述する実施例２に詳述されている。しかしながら、こ
の方法は、内部関係式を得るために、多くの予備検討を
必要とする。

【０１３０】もっと簡便な方法は、最初から式が成立
することを前提として、Ｚの影響を極小化できる内部パ
ラメーターを導入する方法である。内部パラメーターと
は、Ｉ₁ とＩ₂ の関数とすることができ、分析対象物、
特異結合物質、信号物質発生体、信号物質、特異結合反
応の様式、信号物質発生様式、検出部の配置および分析
装置等、各種の要因によって決まる。 内部パラメーター Ｐ＝ｕ（Ｉ₁ ，Ｉ₂ ） 従って、分析対象物量Ｃは内部パラメーターＰの関数と
なり、これをのかわりに内部関係式として用いること
ができる。 Ｃ＝ｖ（Ｐ）

【０１３１】内部パラメーターは、Ｚの影響を極小化で
きるＩ₁ とＩ₂ の関数式であればいかなる関数式でも採
用できる。一般的には、次のような関数が好ましい。 内部パラメーター Ｐ＝Ｉ₁ −ａ・Ｉ₂ あるいは、 内部パラメーター Ｑ＝（Ｉ₁ −ａ）／（Ｉ₂ −ｂ） なお、上記ａおよびｂは定数である。

【０１３２】後述する実施例３において、ヘパリン血漿
を試料とした場合に、これら内部パラメータＰおよびＱ
のいずれも、Ｚの影響を極小化することができることを
具体的に示した。また、この方法は、Ｚが試料中の夾雑
物の非特異的影響、反応温度、信号物質発生体の活性の
変化のいずれの場合においても有用であることを、実施
例３，４および５において具体的に示した。また、実施
例６において、全血試料でも同様の方法が有用であるこ
とを内部パラメーターＱの例で示した。以上の実施例は
いずれもｈＣＧを分析対象物としたサンドイッチ型の特
異結合反応である。

【０１３３】内部パラメーターは上記のＰおよびＱの例
に限定されるものではなく、ＰおよびＱを組み合わせた
関数でも当然Ｚの影響を極小化できる。例えば、 （上記式において、ａ，ｂ，ｃ，ｄ，およびｆはいずれ
も定数である）等が例示され、一般に、Ｚの影響を低減
できる関数であれば、内部パラメーターとして有用であ
る。また、内部パラメータは、ＰあるいはＱあるいはそ
の組み合わせ関数であるＲに限定されるものではなく、
これらはその一例に過ぎない。液性試料の流動方向に異
なる位置に複数配置された検出手段によって検出された
複数の検出結果を用いて、分析対象物濃度以外の要因に
よる分析結果への影響を極小化できる演算法は種々存在
し、そのいずれの方法も利用できる。それらの演算法は
極小化できる程度に関して差があるので、一般には最も
極小化に有効な関数を内部パラメータとして採用すれば
よい。例えば、後記する内部関係式Ｓの例のように、上
記内部パラメータＲよりもさらに精巧な関数を導入する
ことによって、分析対象物の濃度以外の要因による分析
結果への影響の極小化の程度を向上させることもでき
る。

【０１３４】ここで、信号強度Ｉ₁ ，Ｉ₂ として電流値
を用いることができるが、実施例３，４，５，６，７お
よび８のように電流密度（電流値／電極面積）を用いて
も、同様の処理が可能である。このようにして得られた
内部パラメータおよび／または内部関係式を、あらかじ
め計測装置の演算機構に組み込んでおくか、測定時に計
測装置にパラメータとして入力し、計測後に演算させ分
析対象物量を表示させることは特に望ましい。

【０１３５】あらかじめ計測装置の演算機構に組み込ん
である内部関係式に対して、分析装置に固有の定数を入
力する方式は、分析装置のロット差を補正する上で好ま
しい。すなわち、上記した内部パラメータ関数の定数部
分（例えば、内部パラメータ関数Ｒの場合におけるａ，
ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ）の一部あるいはすべてが分析装置
のロットに依存する場合、分析を開始する前にこれらの
定数部分を計測装置にセットすることにより分析装置の
ロット差を補正することができる。これらの定数部分を
計測装置にセットする方法としては、リングスイッチあ
るいはディップスイッチなどのハードウェアスイッチに
よる設定、キーボード、マウスあるいはペンなどの入力
装置による入力、磁気テープあるいは磁気カードなどの
磁気情報読み取り、センサー部の電気的特性値あるいは
ＩＣメモリーなどの電気的情報読み取り、バーコードな
どの光学的読み取りなど一般的な入力手段が利用でき
る。

【０１３６】次に、分析装置ロットに固有な内部関係式
の係数部分の決定方法について、実施例７の全血試料中
の分析対象物エストラジオールの競合反応法に基づいて
例示する。実施例７では、前記した関係式導出方法に
従って、全血試料中のＺの影響を極小化するためにロジ
スティック曲線に基づいた解析から導出された内部関係
式Ｓを用いてＺを極小化している。また、実施例８にお
いては、この内部関係式に含まれる分析装置のロット依
存性の定数項は、検定用血清試料から決定されている。
全血試料の安定な長期保存は困難であるため、この検定
用血清試料による分析装置のロット依存性の定数項決定
方法は、検定用全血試料を用いた定数項決定法よりも標
準化しやすく、また簡便でもあり、分析装置の製造時の
ロット管理に適している。

【０１３７】実施例７は分析対象物がエストラジオール
というハプテンであり、特異結合反応として競合法を採
用しているため、試料中の分析対象物濃度Ｃに対する第
１検出部の信号強度Ｉ₁ は、例えばロジスティック曲線
（式）のようなＳ字状曲線が適合する。

【０１３８】本発明者らは、実施例７の分析装置におい
て各種全血試料にエストラジオールを添加した検体を測
定した結果に基づき、Ｚの影響はａ１とｄ１の２つの係
数を変動させるが、ｂ１とｃ１の２つの係数には大きな
変動を与えないことを見い出した。すなわち、式にお
いて、ｂ１とｃ１は定数であるが、ａ１とｄ１とは全血
試料に依存して異なるＺの関数であった。また、実施例
７に例示した分析装置では、試料中の分析対象物濃度Ｃ
に対する第２検出部の信号強度Ｉ₂ も、同様にロジステ
ィック曲線（式）が適合する。

【０１３９】実施例７の分析装置では、第１検出部の場
合と同様に、式において、ｂ２とｃ２は定数である
が、ａ２とｄ２とは全血試料に依存して異なるＺの関数
であった。また、実施例７の分析装置では、ｂ１＝ｂ２
＝ｂ（定数）およびｃ１＝ｃ２＝ｃ（定数）と近似でき
た。式および式を変形すると、それぞれ式および
式となる。

【０１４０】また、本発明者らは、実施例７の分析装置
において各種全血試料を測定した結果に基づき、ａ１と
ｄ１との間には関数関係が存在して、例えばｄ１＝ｆ₁
（ａ１）と表すことができ、ａ２とｄ２との間にも関数
関係が存在して、例えばｄ２＝ｆ２（ａ２）と表すこと
ができることを見い出した。さらに、ａ１とａ２との間
にも関数関係が存在して、例えばａ２＝ｇ（ａ１）と表
すことができることを見い出した。これらの関数関係式
を用いると、式および式から、例えばａ２、ｄ１、
ｄ２を消去して、ａ１＝ｈ（Ｉ₁ ，Ｉ₂ ）という関数を
求めることができる。これは、前記した関数関係から明
かなように、試料に依存する係数ａ１、ｄ１、ａ２、ｄ
２のすべてがＩ₁ とＩ₂ とから求めうることを意味して
いる。従って、式あるいは式から試料に依存する係
数ａ１、ｄ１、ａ２、ｄ２を消去して、Ｉ₁ とＩ₂ から
Ｃを求めることのできる内部関係式Ｃ＝Ｓ（Ｉ₁ ，
Ｉ₂ ）を誘導できる。それゆえ、この内部関係式Ｃ＝Ｓ
（Ｉ₁ ，Ｉ₂ ）は、種々の全血試料における非特異的な
影響を最少にする。

【０１４１】ここで、信号強度Ｉ₁ および信号強度Ｉ₂
がそれぞれロジスティック曲線のようなＳ字状曲線に適
合し、少なくともｂ１＝ｂ２、ｃ１＝ｃ２である時に
は、これらの和（Ｉ₁ ＋Ｉ₂ ）あるいは差（Ｉ₁ −
Ｉ₂ ）もロジスティック曲線のようなＳ字状曲線に適合
しうる。従って、Ｉ₁ あるいはＩ₂ のいずれか一方、あ
るいは両方を和（Ｉ₁ ＋Ｉ₂ ）あるいは差（Ｉ₁ −
Ｉ₂ ）としても上記説明と同様の処理が可能である。実
施例７では、Ｉ₁ とＩ₁ ＋Ｉ₂ を用いて内部関係式を求
めている。

【０１４２】さらに、本発明者らは、実施例８におい
て、この内部関係式に含まれる分析装置のロット依存性
の定数項を全血試料ではなく検定用血清試料から決定で
きることを示している。これは、次のような方法で達成
できる。すなわち、全血試料において、上記した係数ａ
１、ｄ１、ａ２、ｄ２がそれぞれ試料依存性を示すとい
うことは、前記した試料中の夾雑物、試料特性、分析環
境あるいは試薬成分の活性変化などのＺによって、ａ
１、ｄ１、ａ２、ｄ２が変化することを示している。と
ころで、係数ａ１、ｄ１、ａ２、ｄ２は、それぞれ、第
１検出部のＳ状応答曲線の下側漸近線、上側漸近線、第
２検出部のＳ状応答曲線の下側漸近線、上側漸近線の位
置に相当する。これは、ある試料中において、分析対象
物濃度が十分低い時の第１検出部の信号強度がａ１、分
析対象物濃度が十分高い時の第１検出部の信号強度がｄ
１、分析対象物濃度が十分低い時の第２検出部の信号強
度がａ２、分析対象物濃度が十分高い時の第２検出部の
信号強度がｄ２であると言い換えることもできる。従っ
て、これらの係数の間に前記した関数関係、例えばｄ１
＝ｆ１（ａ１）、ｄ２＝ｆ２（ａ２）、ａ２＝ｇ（ａ
１）が見い出されるということは、これらの漸近線の位
置はＺに対して規則性を有して変動していることを意味
している。一般的には、これらの関数関係は、例えば、
次のような言葉で表現できる。ｄ１＝ｆ１（ａ１）は、
第１検出部のＳ状応答曲線の下側漸近線が血清試料より
高目になる全血試料では、第１検出部のＳ状応答曲線の
上側漸近線も高目になる傾向があることを示す。ｄ２＝
ｆ２（ａ２）は、第２検出部のＳ状応答曲線の下側漸近
線が血清試料より高目になる全血試料では、第２検出部
のＳ状応答曲線の上側漸近線も高目になる傾向があるこ
とを示す。ａ２＝ｇ（ａ１）は、第１検出部のＳ状応答
曲線の下側漸近線が高目になる全血試料では、第２検出
部のＳ状応答曲線の下側漸近線も高目になる傾向がある
ことを示す。

【０１４３】全血試料を複数測定すれば、これらの関数
関係を見い出すことができ、それらを用いて内部関係式
を求めうることは前記したが、全血試料を複数測定する
という操作は、Ｚの値の異なる複数の試料を測定するこ
とによって、Ｚの影響が各係数にどのような規則性を持
って出現するかという関数関係を決定することに他なら
ない。すなわち、このような分析装置に固有の内部パラ
メータ関係式を導出するために用いられる検定用試料と
しては、必ずしも全血試料である必要はなく、全血試料
と同様の挙動を示すことがあらかじめ知られているＺの
値の異なる試料であればよいことになる。

【０１４４】このような検定用試料は、例えば、標準と
なる血漿に予測されるＺ要因を添加することによって得
られる。添加するＺ要因としては、夾雑物質、信号物質
発生体と類似の活性、試料特性を変化させる因子、信号
物質発生体あるいは信号物質に対する妨害物質などが例
示でき、例えば、パーオキシダーゼあるいはカタラーゼ
などの酵素、ヘモグロビンなどの血色素成分あるいは溶
血成分、アスコルビン酸、尿酸などの酸化還元物質、酸
成分あるいは塩基成分などのｐＨ変動要因、塩などのイ
オン強度変動要因、金属イオンあるいは補酵素などの補
因子、酵素阻害剤、多糖類などの粘性物質などが好適な
ものとして例示できる。また、ヘマトクリット値を変動
させるために添加できるＺ要因として、ラテックス粒
子、高分子微粒子球あるいは固定化血球などの血球類縁
物質が例示できるが、ヘマトクリット値による影響を受
けやすい電子メディエータ濃度あるいは酵素標識物質濃
度を変動させるために電子メディエータあるいは／およ
び酵素標識物質を添加した検定用試料も好適なものとし
て例示できる。さらに、Ｚ要因は添加物質である必要は
なく、分析環境変動因子として、反応温度を変化させて
検定を行ってもよいし、高温あるいは高湿条件下などで
分析装置に含まれる試薬成分の活性を変化させてから検
定を行ってもよい。ただし、検定手段はこれらの例示に
限定されるものではなく、内部パラメータ関係式の決定
が可能な検定手段であれば、いずれの手段も用いること
ができる。

【０１４５】実施例７あるいは上記した説明は、第２検
出部の信号強度も分析対象物濃度に依存して応答する場
合を例示している。ただし、第１検出部と第２検出部は
液流方向に異なる位置に配置されているため、それぞれ
の検出部の信号強度の分析対象物濃度に対する応答は全
く同等とはならず、そのため内部パラメータ関係式を導
き出せることを示した。第１検出部と第２検出部の信号
強度の分析対象物濃度に対する応答が全く異なるよう
に、それぞれの検出部を配置することもできる。このよ
うな配置として、例えば図４の電極部６０において、第
１検出部７６の配置は変えずに、第２検出部７８の内径
および外径を図２の分析装置例におけるシール部６４ａ
の直径より十分大きくして、第２検出部をシール部６４
ａの十分外側に配置する場合を例示できる。この場合、
第２検出部の信号強度は分析対象物濃度に実質上依存せ
ず、Ｚにのみ依存すると見なせる。この場合、試料中の
分析対象物濃度Ｃに対する第２検出部の電流応答Ｉ
₂ は、式ではなく、次の式が適合する。 Ｉ₂ ＝ｄ2 式 この場合も、第１検出部の応答式あるいは式と、第
２検出部の式、および、ｄ１＝ｆ１（ａ１）、ａ２＝
ｇ（ａ１）の関数関係式から、内部パラメータ関数Ｃ＝
Ｓ（Ｉ₁ ，Ｉ₂ ）を誘導できる。すなわち、流動方向に
異なる位置に複数配置される検出手段が存在し、少なく
ともその内の１つの検出手段での信号応答が試料中の分
析対象物濃度に依存すれば、分析対象物の濃度以外の要
因による分析結果への影響を極小になるように演算処理
を行うことができる。従って、流動方向に異なる複数の
検出手段の配置は、後記する実施例あるいは前記した例
示に限定されるものではなく、分析装置の形状も後記す
る実施例あるいは前記した例示に限定されるものではな
い。

【０１４６】

【実施例】以下、実施例により、本発明を具体的に説明
する。

【０１４７】［電極部の作製］厚さ０．２５ｍｍの透明
ＰＥＴフィルムの表側および裏側に、導電性カーボンイ
ンク（４００−ＣＴ、アサヒ化研社製）、導電性銀ぺー
スト（ＬＳ４１１Ｎ、アサヒ化研社製）およびレジスト
（ＸＢ−１０１Ｇ、藤倉化成社製）を用いてスクリーン
印刷し、図４に示されるような電極部６０を各種作製し
た。まず、絶縁性基板６１となるＰＥＴフィルムの表面
に、カーボンインクを用いてスクリーン印刷を行い、対
極（参照極）７０、端子７０ａを形成し、次いで、絶縁
性レジストを用いて絶縁層７４を形成した。さらに、対
極７０を銀ペーストで上塗り印刷した。続いて、絶縁性
基板６１となるＰＥＴフィルムの裏面に、同様にして第
１作用極７６、端子７６ａ、第２作用極７８および端子
７８ａをカーボンインクで形成し、さらに絶縁層７４を
形成した（すなわち、銀ペースト印刷はおこなっていな
い）。各電極および絶縁層を形成した後、ＰＥＴフィル
ムを長さ５０ｍｍ、幅２０ｍｍのサイズに切断し、さら
に、対極７０および第１作用極７６の中心をパンチング
して貫通孔６８を形成し、図４に示されるような電極部
６０で、第１作用極７６や第２作用極７８、貫通孔６８
等のサイズが異なる電極部６０を７種類作製した。

【０１４８】各電極部の諸元は下記のとおりである。な
お、電極部６０ａから電極部６０ｆまでの対極（参照
極）は、電極部６０の表面に第１作用極７６と同位置に
形成され、さらに全く同サイズ、同形状であるので、こ
こでは、電極部６０の裏面の作用極の諸元のみを示す。
電極部６０ｇの対極（参照極）はサイズが異なるため、
電極部６０の裏面の作用極と共に表面の対極（参照極）
の諸元も示す。 ＜電極部６０ａ＞ 貫通孔６８（第１作用極７６の内径）：３ｍｍ、 第１
作用極７６の外径：５ｍｍ（すなわち、第１作用極７６
の幅１ｍｍ）、 第１作用極７６と第２作用極７８との
間隙：０．５ｍｍ、 第２作用極７８の外径：８ｍｍ
（すなわち、第２作用極７８の幅１ｍｍ） ＜電極部６０ｂ＞ 貫通孔６８（第１作用極７６の内径）：３ｍｍ、 第１
作用極７６の外径：６ｍｍ（すなわち、第１作用極７６
の幅１．５ｍｍ）、 第１作用極７６と第２作用極７８
との間隙：１ｍｍ、 第２作用極７８の外径：１１ｍｍ
（すなわち、第２作用極７８の幅１．５ｍｍ） ＜電極部６０ｃ＞ 貫通孔６８（第１作用極７６の内径）：３ｍｍ、 第１
作用極７６の外径：６ｍｍ（すなわち、第１作用極７６
の幅１．５ｍｍ）、 第１作用極７６と第２作用極７８
との間隙：１．５ｍｍ、 第２作用極７８の外径：１２
ｍｍ（すなわち、第２作用極７８の幅１．５ｍｍ） ＜電極部６０ｄ＞ 貫通孔６８（第１作用極７６の内径）：３ｍｍ、 第１
作用極７６の外径：５ｍｍ（すなわち、第１作用極７６
の幅１ｍｍ）、 第１作用極７６と第２作用極７８との
間隙：２ｍｍ、 第２作用極７８の外径：１１ｍｍ（す
なわち、第２作用極７８の幅１ｍｍ） ＜電極部６０ｅ＞ 貫通孔６８（第１作用極７６の内径）：２ｍｍ、 第１
作用極７６の外径：５ｍｍ（すなわち、第１作用極７６
の幅１．５ｍｍ）、 第１作用極７６と第２作用極７８
との間隙：１ｍｍ、 第２作用極７８の外径：１０ｍｍ
（すなわち、第２作用極７８の幅１．５ｍｍ） ＜電極部６０ｆ＞ 貫通孔６８（第１作用極７６の内径）：２ｍｍ、 第１
作用極７６の外径：５ｍｍ（すなわち、第１作用極７６
の幅１．５ｍｍ）、 第１作用極７６と第２作用極７８
との間隙：１．５ｍｍ、 第２作用極７８の外径：１１
ｍｍ（すなわち、第２作用極７８の幅１．５ｍｍ） ＜電極部６０ｇ＞ 貫通孔６８（第１作用極７６の内径）：２ｍｍ、 第１
作用極７６の外径：４ｍｍ（すなわち、第１作用極７６
の幅１ｍｍ）、 第１作用極７６と第２作用極７８との
間隙：０．５ｍｍ、 第２作用極７８の外径：６ｍｍ
（すなわち、第２作用極７８の幅０．５ｍｍ） 表面の対極（参照極）の内径：２．５ｍｍ、対極（参照
極）の外径：６ｍｍ

【０１４９】作製した各電極部６０について、第１作用
極７６、第２作用極７８および対極７０が電気的に独立
しており、また、それぞれに対応する端子７６ａ、端子
７８ａおよび端子７０ａに電気的に接続されていること
を確認した。

【０１５０】また、対極７０に関しては、上述の銀ペー
スト電極をそのまま使用するか、あるいは、０．１Ｍ塩
化ナトリウム水溶液中で電解反応（＋１．０Ｖ ｖｓ銀
／塩化銀電極）を１０分間行うことにより、表面に塩化
銀層を形成させてから、対極（参照極）として使用し
た。

【０１５１】［実施例１］ ｈＣＧ特異結合分析装置における複数検出部の電流応答

【０１５２】＜１＞抗ｈＣＧβ抗体と西洋ワサビパーオ
キシダーゼとの結合体（標識抗体）の作製 ｈＣＧのβ鎖を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ８
１（持田製薬社製）を１００ｍＭ 塩化ナトリウム−１
ｍＭ ＥＤＴＡ−６０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ８．０）（ＴＥＡ緩衝液）に７．７ｍｇ／ｍＬ
濃度となるように溶解し、窒素ガス置換したＴＥＡ緩衝
液に十分に透析した。この抗体溶液２．８ｍＬに対し
て、ＴＥＡ緩衝液中に調製した５０ｍＭの２−イミノチ
オラン塩酸塩（Pierce社製）溶液１４３μＬを添加し、
撹拌後、窒素ガス雰囲気下、４℃で１．５時間静置し
た。その後、窒素ガス置換した１００ｍＭ 塩化ナトリ
ウム−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１００ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）（ＥＤＴＡ−ＰＢ）で十分に透析し、Ｓ
Ｈ基が導入された抗ｈＣＧβ抗体ＨＭ８１を得た。ＥＤ
ＴＡ−ＰＢで２０ｍｇ／ｍＬ濃度に調製された西洋ワサ
ビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ，東洋紡社製）溶液５０
０μＬを３０℃でゆっくり撹拌しながら、１００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に調製した５０ｍＭのスル
ホＳＭＣＣ（Pierce社製）５００μＬを添加して２０分
間反応させた。反応後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−Ｐ
Ｂで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（ファルマシ
ア社製）カラム（２．６φ×１５ｃｍ）を通して未反応
のスルホＳＭＣＣを除去し、濃縮器ＣＥＮＴＲＩＰＲＥ
Ｐ−１０（Amicon社製）を用いて濃縮し、マレイミド化
ＨＲＰＯを得た。得られたマレイミド化ＨＲＰＯの濃度
は、４０３ｎｍの吸光度から求めた。３．６６×１０^-7
モルのマレイミド化ＨＲＰＯ溶液に対して、１／５倍モ
ル量のＳＨ基導入ＨＭ８１抗体を添加混合後、窒素ガス
雰囲気下、４℃にて１２時間反応させた。次いで、ＥＤ
ＴＡ−ＰＢ中に調製した５００ｍＭのシステアミン溶液
１２９μＬを添加し、窒素ガス雰囲気下、４℃にて６０
分間反応させ、その後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−Ｐ
Ｂで平衡化したＵＬＴＲＯＧＥＬ ＡｃＡ３４（ＩＢＦ
Biotechnics 社製）カラムを用いてゲルろ過クロマト
グラフィーを行った。２８０ｎｍおよび４０３ｎｍにお
ける吸光度測定を、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出
分画について行い、遊離の酵素を含まないＨＭ８１とＨ
ＲＰＯとの結合体の分画を集めて濃縮した。濃縮標品
（ＨＲＰＯ−ＨＭ８１と称す）は、Ｐｈａｓｔシステム
による電気泳動（ファルマシア社製）で分子量を確認
後、吸光度と酵素活性から含有される抗体および酵素量
を決定し、後記する測定において信号物質発生体として
用いた。

【０１５３】＜２＞第１含浸部５４（信号物質発生体含
浸部＝西洋わさびパ−オキシダ−ゼ標識抗ｈＣＧβ抗体
を含浸させた乾燥体）の作製 前記＜１＞で作製した西洋わさびパ−オキシダ−ゼ標識
抗ｈＣＧβ抗体を０．０１％Ａｍｉｓｏｆｔ ＬＳ−１
１（味の素社製）−５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１
０％サッカロ−ス／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ６．０にて希釈した溶液を調製した。次
いで、ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東
洋社製）からパンチングして作製した直径１２ｍｍの円
形濾紙に上記溶液を１４０μｌ点着し、凍結乾燥を行
い、第１含浸部５４（信号物質発生体含浸部）を作製し
た。

【０１５４】＜３＞第２含浸部５６（電子メディエータ
含浸部＝Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキス−（２´−ヒ
ドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩
（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の作製 ＴＨＥＰＤを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０−０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ ６．０に溶解
し、５．０ｍＭのＴＨＥＰＤ溶液を調製した。次いで、
ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社
製）からパンチングして作製した直径１２ｍｍの円形濾
紙に上記溶液を１４０μｌ点着し、凍結乾燥を行い、第
２含浸部５６（電子メディエータ含浸部）を作製した。

【０１５５】＜４＞吸収部６４（過酸化水素・尿素を含
浸させた乾燥体）の作製 過酸化水素および尿素（共に和光純薬工業製）を蒸留水
に溶解し、３．０Ｍ過酸化水素−３．０Ｍ尿素溶液を調
製した。次いで、クロマトグラフ濾紙（１７Ｃｈｒ、Wh
atman 社製）からパンチングして作製した直径１２ｍｍ
の円形ろ紙に上記溶液を１２０μｌ点着し、凍結乾燥を
行い、吸収部６４（過酸化水素−尿素の乾燥体）を作製
した。従って、この吸収部は、信号物質の発生に関与す
る物質である酵素基質（過酸化水素）の存在部を兼ねて
いる。

【０１５６】＜５＞抗体不溶化流路６２（抗体不溶化メ
ンブレン＝抗ｈＣＧα抗体不溶化多孔性セルロース混合
エステル膜）の作製 ０．４５％塩化ナトリウム−０．０７６Ｍリン酸緩衝液
（ＰＢＳ）に、ウシγグロブリン（製品コードＧ７５１
６、シグマ社製）を１．０％（Ｗ／Ｖ）濃度で溶解した
溶液２００ｍＬを入れたビーカー中に、ポアサイズ８．
０μｍ、直径１３ｍｍの円形の酢酸セルロース／硝酸セ
ルロース混合エステル多孔性膜（カタログ番号ＳＣＷＰ
０１３００、日本ミリポア工業株式会社製）２００枚を
入れ、ゆっくり撹拌しながら６０℃で２時間加熱した。
上澄みを除去し、さらに残液を吸引除去した後、洗浄液
として十分量のＰＢＳを加えてよく撹拌し、再度内容液
を除去して洗浄を行った。ＰＢＳの洗浄をさらに２回行
い、その後、蒸留水での洗浄を７回繰り返した。洗浄終
了後、１．０％ グルタルアルデヒド水溶液２００ｍＬ
を添加し、ゆっくり撹拌しながら２５℃で３時間反応さ
せた。反応後、蒸留水で１０回洗浄を行い、ガラス板の
上に多孔性膜を１枚ずつ並べて乾燥した。ｈＣＧのα鎖
を認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ２１（持田製薬
社製）を０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム−０．０５Ｍ塩
化ナトリウム水溶液に溶解して１．０ｍｇ／ｍＬ濃度に
調製した。この溶液を、ガラス板上で乾燥させた多孔性
膜（１３ｍｍφ）当たり２５μＬを中央部分から浸潤さ
せた。室温で１時間反応させた後、多孔性膜を０．２％
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液２００ｍＬ
に移し、振とう撹拌しながら、４℃で２日間ブロッキン
グ反応した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ
溶液で３回洗浄し、さらにＰＢＳで７回洗浄した。次い
で、４％マンニトール−０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／Ｐ
ＢＳに室温にて３０ｍｉｎ浸漬した後、シャーレ上で減
圧乾燥を行い、抗体不溶化流路６２（抗ｈＣＧα抗体不
溶化多孔性セルロース混合エステル膜）を得た。

【０１５７】＜６＞特異結合分析装置の作製 このようにして作製した各部位、および先に作製した電
極部６０ａ〜ｆを用い、下記のようにして、図２および
図３に示される特異結合分析装置を各種作製した。ま
ず、アクリル製の下部基板６６上に吸収部６４（過酸化
水素・尿素を含浸させた乾燥体）を積層した。なお、吸
収部中央には、メンディングテープ（住友スリーエム株
式会社製）からパンチングして作製した直径６ｍｍのシ
ールを貼り付けた。次いで、抗体不溶化流路６２（抗ｈ
ＣＧα抗体不溶化多孔性セルロース混合エステル膜）を
シール部６４ａを有する吸水部６４上に中心位置を合わ
せて重積した。さらに、電極部６０を貫通孔６８の中心
を抗体不溶化流路６２の中心と一致して、作用極側を下
にして電極部６０を積層し、ガラス繊維ろ紙（ＧＡ５
５、アドバンテック東洋株式会社製）からパンチングし
て作製した直径２ｍｍもしくは３ｍｍの円形ろ紙を、電
極の貫通孔にはめ込んで連通部５８とした。次に、第２
含浸部５６（電子メディエータ含浸部）を、その中心が
電極の貫通孔の中心と一致するように重積した。この第
２含浸部５６の上部表面中央に、メンディングテープか
らパンチングして作製した直径６ｍｍのシールを貼り付
けた。その上に、第１含浸部５４（信号物質発生体含浸
部）を重積した。さらにその上に、界面活性剤処理をし
たエルタス（カタログ番号Ａ０５０７０、旭化成社製）
からパンチングして作製した直径１２ｍｍの円形部材を
重積してフィルター部５２とした。その上に、直径６ｍ
ｍの試料導入口５０ａを有するアクリル製の上部カバー
５０を、その試料導入口５０ａの中心が貫通孔６８の中
心と一致するように上乗せし、上部カバー５０と下部基
板６６の四隅のネジ孔を合わせネジ留めして、電極部６
０ａ〜ｆのそれぞれを使用した、図２および３に示され
るような、ｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を６種
作製した。

【０１５８】＜７＞各装置を用いたｈＣＧ測定 このようにして作製した各種の特異結合分析装置を用
い、対極７０（銀ペースト環状電極）を対極・参照極と
し、第１作用極７６（検出部１) あるいは第２作用極７
８（検出部２) と対極７０の各端子とをポテンショスタ
ットＨＡ−１５０（北斗電工株式会社製）に接続した。
また、ポテンショスタットにＸＹ記録計および電極電位
設定のためのファンクションジェネレーターＨＢ−１０
４（北斗電工株式会社製）を接続し、記録計からＧＰＩ
Ｂラインを通じてコンピュータへ接続し、計測およびデ
ータ処理を行った。０．１％ウシ血清アルブミン−０．
１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ ６．０
に標準ｈＣＧを添加してそれぞれ、ｈＣＧ ０ＩＵ／
Ｌ、およびｈＣＧ１０００ＩＵ／Ｌの試料液を調製し
た。各試料液を２５０μｌ、各特異結合分析装置に上部
カバー５０の試料導入口５０ａを通じて導入した。試料
導入後、各作用極を対極・参照極に対して−１５０ｍＶ
となるように電位設定し、電流値をそれぞれ個別に記録
した。

【０１５９】＜８＞結果 図７に電極部６０ａを用いて作製した特異結合分析装置
による測定結果を、以下同様にして、図８に電極部６０
ｂ、図９に電極部６０ｃ、図１０に電極部６０ｄ、図１
１に電極部６０ｅ、および図１２に電極部６０ｆを用い
て作製した特異結合分析装置による測定結果を、それぞ
れ示す。なお、測定結果は、いずれも液性試料導入後、
４分後の電流値で、第１作用極７６で測定された電流値
をＩ₁ 、第２作用極７８で測定された電流値をＩ₂ とし
た。図７〜図１２に示されるように、第１作用極７６や
第２作用極７８のサイズが異なる場合であっても、複数
の作用極（検出部）を有する電極部６０を用いた装置の
いずれにおいても、ｈＣＧ濃度に依存して電流値が変化
した。これは、信号物質発生体（酵素標識抗体）の流路
内の分布が、分析対象物であるｈＣＧ濃度に応じて変化
していること、そして、いずれの複数検出部も、信号物
質の拡散に律速された電流信号の変調としてこの信号物
質発生体の分布の変化を検出していることを示してい
る。

【０１６０】［実施例２］ 特異結合分析装置を用いたｈＣＧ濃度の測定

【０１６１】＜１＞界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）処理
ガラス繊維濾紙の作製 ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社
製）を０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）水
溶液に浸漬させ、室温にて一晩静置した。その後、蒸留
水にて１０回洗浄し、次いで、オーブン（８０℃）にて
乾燥させ界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）処理ガラス繊維
濾紙を作製した。

【０１６２】＜２＞第１含浸部５４（信号物質発生体含
浸部＝西洋わさびパ−オキシダ−ゼ標識抗ｈＣＧβ抗体
を含浸させた乾燥体）の作製 前記実施例１の＜１＞で作製した西洋わさびパ−オキシ
ダ−ゼ標識抗ｈＣＧβ抗体を５％正常ウサギ血清（ＮＲ
Ｓ）−１０％サッカロ−ス／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有
０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０にて希釈した溶液を調
製した。この溶液を、先に＜１＞で作製したＴｗｅｅｎ
２０処理ガラス繊維濾紙からパンチングして作製した直
径１２ｍｍの円形濾紙に上記溶液を１４０μｌ点着し、
凍結乾燥を行い、第１含浸部５４（信号物質発生体含浸
部）を作製した。

【０１６３】＜３＞第２含浸部５６（電子メディエータ
含浸部＝Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキス−（２´−ヒ
ドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩
（ＴＨＥＰＤ））を含浸させた乾燥体）の作製 ＴＨＥＰＤを０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液 ｐＨ ６．０に溶解し、５．０ｍＭのＴＨＥＰＤ
溶液を調製した。この溶液を、先に＜１＞で作製したＴ
ｗｅｅｎ２０処理ガラス繊維濾紙からパンチングして作
製した直径１２ｍｍの円形濾紙に上記溶液を１４０μｌ
点着して凍結乾燥を行い、第２含浸部５６（電子メディ
エータ含浸部）を作製した。

【０１６４】＜４＞吸収部６４（過酸化水素および尿素
を含浸させた乾燥体）の作製 過酸化水素（和光純薬工業製）および尿素（和光純薬工
業製）を蒸留水に溶解し、１．０Ｍ過酸化水素−１．０
Ｍ尿素溶液を調製した。次いで、クロマトグラフ濾紙
（１７ Ｃｈｒ、Whatman 社製）からパンチングして作
製した直径１２ｍｍの円形ろ紙に上記溶液を１２０μｌ
点着して凍結乾燥を行い、吸収部６４（過酸化水素−尿
素の乾燥体）を作製した。

【０１６５】＜５＞抗体不溶化流路６２（抗体不溶化メ
ンブレン＝抗ｈＣＧ抗体不溶化多孔性ニトロセルロース
膜）の作製 実施例１＜５＞に記載した方法に準じて、ｈＣＧを認識
するウサギ多クローン性抗体ＳＥ０３０（持田製薬社
製）をポアサイズ５μｍのニトロセルロース膜（アドバ
ンテック東洋社製）に不溶化し、抗体不溶化流路６２と
した。

【０１６６】＜６＞特異結合分析装置の作製 このようにして作製した各部位を用い、下記のようにし
て、図２および図３に示される特異結合分析装置を各種
作製した。まず、アクリル製の下部基板６６上に吸収部
６４（過酸化水素・尿素を含浸させた乾燥体）を積層し
た。なお、吸収部中央には、メンディングテープ（住友
スリーエム株式会社製）からパンチングして作製した直
径６ｍｍのシールを貼り付けた。次いで、抗体不溶化流
路６２（抗ｈＣＧ抗体（ＳＥ０３０）不溶化多孔性ニト
ロセルロース膜）をシール部６４ａを有する吸水部ろ紙
の上に中心位置を合わせて重積した。さらに、電極部６
０ａを貫通孔６８の中心を抗体不溶化流路６２の中心と
一致して、作用極側を下にして電極部６０を積層し、ガ
ラス繊維ろ紙（ＧＡ５５、アドバンテック東洋株式会社
製）からパンチングして作製した直径３ｍｍの円形ろ紙
を、電極の貫通孔にはめ込んで連通部５８とした。次
に、第２含浸部５６（電子メディエータ含浸部）を、そ
の中心が電極の貫通孔の中心と一致するように重積し
た。この第２含浸部５６の上部表面中央に、メンディン
グテープからパンチングして作製した直径６ｍｍのシー
ルを貼り付けた。その上に、第１含浸部５４（信号物質
発生体含浸部）を重積した。さらにその上に、界面活性
剤処理をしたエルタス（カタログ番号Ａ０５０７０、旭
化成社製）からパンチングして作製した直径１２ｍｍの
円形部材を重積してフィルター部５２とした。その上
に、直径６ｍｍの試料導入口５０ａを有するアクリル製
の上部カバー５０を、その試料導入口５０ａの中心が貫
通孔６８の中心と一致するように上乗せし、上部カバー
５０と下部基板６６の四隅のネジ孔を合わせネジ留めし
て図２および３に示されるような、ｈＣＧ濃度測定用の
特異結合分析装置を作製した。

【０１６７】＜７＞ヘパリン血漿中でのｈＣＧ測定 このようにして作製した特異結合分析装置の電極部６０
ａにおいて、対極７０を対極・参照極としてその端子７
０ａを２チャンネル同時測定用のμ―ＰＧＳ１０ポテン
ショスタット／ガルバノスタット（Teknologue社製）の
対極（参照極）端子に接続し、同機器のチャンネル１お
よびチャンネル２の作用極端子に、それぞれ第１作用極
７６（検出部１) および第２作用極７８（検出部２）の
端子７６ａおよび７８ａをそれぞれ接続した。そして、
同機器からＧＰＩＢラインを通じてコンピュータに接続
し、計測およびデータ処理を行った。他方、ヘパリン添
加健常男性血漿３検体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を用
い、標準ｈＣＧを添加してそれぞれ、ｈＣＧ ６００Ｉ
Ｕ／Ｌ、ｈＣＧ ７００ＩＵ／ＬおよびｈＣＧ ９００
ＩＵ／Ｌのヘパリン血漿検体を調製した。このようにし
て調製したｈＣＧを含む各ヘパリン血漿検体を、特異結
合分析装置の上部カバー５０の試料導入口５０ａを通じ
て、それぞれ２５０μｌずつ分析装置に導入した。試料
導入後、各作用極を対極・参照極に対して−１５０ｍＶ
となるように電位設定し、電流値を記録した。

【０１６８】＜８＞結果１． 複数検出部の電流値から
ｈＣＧ濃度を算出する内部関係式の導出 ３種のヘパリン血漿検体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を
用いて調製した各濃度のｈＣＧ溶液を導入した際の第１
作用極７６および第２作用極７８で測定された電流値の
６〜８分間の平均値（それぞれＩ₁ およびＩ₂ ）を図１
３に示す。また、各ｈＣＧ濃度でのＩ₁ に対するＩ₂ の
関係を図１４に示す。図１４に示されるように各ｈＣＧ
濃度におけるＩ₁ に対するＩ₂ には直線関係が認められ
たため、その血漿検体間の直線回帰式を求めた。下記表
４に得られた直線回帰式を示す。

【０１６９】

【０１７０】この場合、切片はｈＣＧ濃度にほとんど依
存せず（ほぼ−８．８×１０^-1）、傾きがｈＣＧ濃度に
依存していた。Ｉ₁ に対するＩ₂ の関係は下記の１式で
表される。なお、式中Ｓは、上表の傾きであり、これが
ｈＣＧ濃度の関数である。 Ｉ₂ ＝ＳＩ₁ −８．８×１０^-1 １式

【０１７１】以上の結果より、図１５に示すようにｈＣ
Ｇ濃度Ｃと１式の傾きＳ間に直線関係を仮定し、その直
線回帰式（下記２式）を求めて、ｈＣＧ濃度（Ｃ）に対
する傾き（Ｓ）の関係を導いた。 Ｓ＝１．３６×１０^-3Ｃ−０．９５ ２式 ２式（ＣとＳの関係式）を１式（Ｉ₁ とＩ₂ の関係式）
に代入して、Ｉ₁ およびＩ₂ の複数検出部の電流値から
ｈＣＧ濃度を求める内部関係式（３式）を導いた。

【０１７２】（９）結果２． 単数検出部からｈＣＧ濃
度を算出する関係式の導出（対照実験） 単数作用極系の場合、つまり抗ｈＣＧ抗体不溶化多孔性
ニトロセルロース膜内での特異結合反応の分布を１カ所
の検出部だけで測定しｈＣＧを定量した場合に算出され
る各検体のｈＣＧ濃度を求めた。すなわち、Ｉ₁ のみで
ｈＣＧを定量する場合、ｈＣＧ濃度に対するＩ₁ の関係
は図１６に示すように直線関係が認められたため、直線
回帰を行い、この回帰式を基にして単数検出部の電流値
Ｉ₁ からｈＣＧ濃度を求める関係式（下記４式）を導い
た。

【０１７３】（１０）結果３． 結果１と結果２の比較 複数検出部測定および単数検出部測定から導出された関
係式（上記３式および４式）にそれぞれの電流値を代入
し、ｈＣＧ濃度を算出して比較した。結果を下記表５に
示す。

【０１７４】

【０１７５】この結果から、両測定間の各ｈＣＧ濃度の
平均値およびＣＶ値を比較した。結果を下記表６に示
す。

【０１７６】 上記表６に示されるように、単数検出部測定で得られた
Ｉ₁ のみを用いてｈＣＧの定量を行った場合には検体中
の夾雑物の影響を反映してそのＣＶ値は大きかった。そ
れに比して、複数検出部測定で得られたＩ₁ およびＩ₂
を用いてｈＣＧの定量を行った場合には、それぞれＣＶ
値（変動係数）が１２％以下であり検体間の測定誤差要
因に対する補正効果が明瞭に認められた。従って、同じ
分析操作でも、複数検出部を用いた分析方法は、単数検
出部を用いた分析方法に比べて著しく測定精度が向上し
た。

【０１７７】［実施例３］ 特異結合分析装置を用いたｈＣＧ濃度の測定

【０１７８】＜１＞第１含浸部５４（信号物質発生体−
電子メディエータ含浸部＝西洋わさびパ−オキシダ−ゼ
標識抗ｈＣＧβ抗体およびＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ
キス−（２´−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジ
アミン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の
作製 前記実施例１の＜１＞で作製した西洋わさびパ−オキシ
ダ−ゼ標識抗ｈＣＧβ抗体およびＴＨＥＰＤ（最終濃度
５ｍＭ）を、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１０％サ
ッカロ−ス／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液 ｐＨ６．０にて希釈した溶液を調製した。次い
で、前記実施例２の＜１＞で作製したＴｗｅｅｎ２０処
理ガラス繊維濾紙からパンチングして作製した直径１２
ｍｍの円形濾紙に、上記溶液を１４０μｌ点着して凍結
乾燥を行い、第１含浸部５４（信号物質発生体−電子メ
ディエータ含浸部）を作製した。

【０１７９】＜２＞吸収部６４（過酸化水素・尿素を含
浸させた乾燥体）の作製 クロマトグラフ濾紙（１７ Ｃｈｒ、Whatman 社製）か
らパンチングして作製した直径１２ｍｍの円形ろ紙に、
前記実施例２の＜４＞で作製した１．０Ｍ過酸化水素−
１．０Ｍ尿素溶液を１００μｌ点着し、凍結乾燥を行
い、過酸化水素−尿素の乾燥体を作製した。

【０１８０】＜３＞特異結合分析装置の作製 このようにして作製した各部位を用い、下記のようにし
て、図２および図３に示される特異結合分析装置を各種
作製した。まず、アクリル製の下部基板６６上に吸収部
６４（過酸化水素・尿素を含浸させた乾燥体）を積層し
た。なお、吸収部中央には、メンディングテープ（住友
スリーエム株式会社製）からパンチングして作製した直
径６ｍｍのシールを貼り付けた。次いで、前記実施例２
の＜５＞で作製した抗体不溶化流路６２（抗ｈＣＧ抗体
（ＳＥ０３０）不溶化多孔性ニトロセルロース膜）をシ
ール部６４ａを有する吸水部ろ紙の上に中心位置を合わ
せて重積した。さらに、［電極部の作製］の項で作製し
た電極部６０ａを貫通孔６８の中心を抗体不溶化流路６
２の中心と一致して、作用極側を下にして電極部６０ａ
を積層し、ガラス繊維ろ紙（ＧＡ５５、アドバンテック
東洋株式会社製）からパンチングして作製した直径３ｍ
ｍの円形ろ紙を、電極の貫通孔にはめ込んで連通部５８
とした。次に、実施例２の＜１＞で作製した界面活性剤
（Ｔｗｅｅｎ２０）処理ガラス繊維濾紙を、その中心が
電極の貫通孔の中心と一致するように重積し第２含浸部
５６とした。この第２含浸部５６の上部表面中央に、メ
ンディングテープからパンチングして作製した直径６ｍ
ｍのシールを貼り付けた。その上に、第１含浸部５４
（信号物質発生体−電子メディエータ含浸部）を重積し
た。さらにその上に、界面活性剤処理をしたエルタス
（カタログ番号Ａ０５０７０、旭化成社製）からパンチ
ングして作製した直径１２ｍｍの円形部材を重積してフ
ィルター部５２とした。その上に、直径６ｍｍの試料導
入口５０ａを有するアクリル製の上部カバー５０を、そ
の試料導入口５０ａの中心が貫通孔６８の中心と一致す
るように上乗せし、上部カバー５０と下部基板６６の四
隅のネジ孔を合わせネジ留めして図２および３に示され
るような、ｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を作製
した。

【０１８１】＜４＞ヘパリン血漿中でのｈＣＧ測定 このようにして作製した特異結合分析装置の電極部６０
ａにおいて、対極７０を対極（参照極）として２チャン
ネル同時測定用のμ―ＰＧＳ１０ ポテンショスタット
／ガルバノスタット（Teknologue社製）の参照極端子お
よび対極（参照極）端子に接続し、同機器のチャンネル
１およびチャンネル２の作用極端子に、それぞれ第１作
用極７６（検出部１）および第２作用極７８（検出部
２）の端子７６ａおよび７８ａを接続した。そして、同
機器からＧＰＩＢラインを通じてコンピュータに接続
し、計測およびデータ処理を行った。他方、ヘパリン添
加健常男性血漿３検体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を用
い、標準ｈＣＧを添加してそれぞれ、ｈＣＧ ５０ＩＵ
／Ｌ、ｈＣＧ １００ＩＵ／ＬおよびｈＣＧ ２００Ｉ
Ｕ／Ｌのヘパリン血漿検体を調製した。このようにして
調製したｈＣＧを含む各ヘパリン血漿検体を、特異結合
分析装置の上面カバー５０の試料導入口５０ａを通じ
て、それぞれ２５０μｌずつ分析装置に導入した。試料
導入後、各作用極を対極・参照極に対して−１５０ｍＶ
となるように電位設定し、電流値を記録した。

【０１８２】＜５＞結果１． 複数検出部からｈＣＧ濃
度を算出する内部関係式の導出１ ヘパリン血漿３検体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を用い
て調製した各濃度のｈＣＧ溶液を点着した際の第１作用
極７６および第２作用極７８で測定された電流値の８〜
１０分間の平均値（Ｉ₁ およびＩ₂ ）を図１７に示す。
さらに、各ｈＣＧ濃度でのＩ₁ からＩ₂ を差し引いた内
部パラメーター（Ｐ＝Ｉ₁-Ｉ₂ ）の関係を図１８に示
す。各検体での各ｈＣＧ濃度 （Ｃ）に対するＰとの相
関から、内部パラメーターＰとｈＣＧ濃度Ｃとの関係式
を求めた（下記５式）。 Ｐ＝５．９９×１０^-6Ｃ² −３．５２×１０^-3Ｃ−７．５９×１０^-2 ５式 この式５からｈＣＧ濃度（Ｃ）を求める内部関係式を導
いた（下記６式）。

【０１８３】＜６＞結果２． 単数検出部からｈＣＧ濃
度を算出する関係式の導出１（対照実験） 単数作用極系で抗体不溶化流路６２（抗ｈＣＧ抗体不溶
化多孔性ニトロセルロース膜内）での特異結合反応の分
布を測定しｈＣＧを定量した場合（Ｉ₁ もしくはＩ₂ の
みでｈＣＧを定量）に算出される各検体のｈＣＧ濃度
（Ｃ）を求めた。ここでは、Ｉ₁ のみでｈＣＧを定量す
る場合はｈＣＧ濃度に対するＩ₁ の相関（図１９）か
ら、Ｉ₂ のみでｈＣＧを定量する場合はｈＣＧ濃度に対
するＩ₂ の相関（図２０）からｈＣＧ濃度（Ｃ）を算出
する関係式を求めた。（７式および８式）。Ｉ₁ のみで
ｈＣＧを定量する場合 Ｉ₂ のみでｈＣＧを定量する場合

【０１８４】複数検出部測定および単数検出部測定から
導出された関係式（６式、７式および８式）にそれぞれ
の電流値を代入してｈＣＧ濃度を算出し、各測定間のｈ
ＣＧ濃度の平均値およびＣＶ値を比較した。結果を下記
表７に示す。 上記表７に示されるように、単数検出部測定で得られた
Ｉ₁ およびＩ₂ 単独の値を用いてｈＣＧの定量を行った
場合、ＣＶ値はかなり大きく検体間の測定誤差要因を補
正できておらず、測定値には全く信頼性がなかった。そ
れに比して、複数検出部測定で得られたＩ₁ およびＩ₂
両者を用いてｈＣＧの定量を行った場合には、分析操作
は同じであるにもかかわらず、各ｈＣＧ濃度の読み値の
ＣＶ値が顕著に減少し、充分な補正効果が示された。

【０１８５】＜７＞結果３． 複数検出部からｈＣＧ濃
度を算出する内部関係式の導出２ 前述のヘパリン血漿３検体（Ａ）、（Ｂ）、および
（Ｃ）を用いて調製した各濃度のｈＣＧ溶液の測定にお
いて、第１作用極７６および第２作用極７８で測定され
た８〜１０分間の電流値の平均（Ｉ₁ およびＩ₂ ）よ
り、電流密度（電流値／各電極面積（μＡ／ｃｍ² ））
の平均値Ｄ₁ およびＤ₂ を求めた。各ｈＣＧ濃度でのＤ
₁ からバックグラウンド（−１．５μＡ／ｃｍ² ）を差
し引いた値を、Ｄ₂ からバックグラウンド（−０．２μ
Ａ／ｃｍ² ）を差し引いた値で割り、さらにその値から
定数１．３を差し引いた内部パラメータＱと、ｈＣＧ濃
度との関係を図２１に示す。図２１に示される各ｈＣＧ
の濃度（Ｃ）に対する Ｑ＝［（Ｄ₁ ＋１．５）／（Ｄ₂ ＋０．２）］−１．３ との相関から、ｈＣＧ濃度を算出する内部関係式を求め
た（９式）。

【０１８６】＜８＞結果４． 単数検出部からｈＣＧ濃
度を算出する関係式の導出２． 単数検出部で同様に測定を行い、ｈＣＧを定量した場合
（Ｄ₁ もしくはＤ₂ のみでｈＣＧを定量）に算出される
各検体のｈＣＧ濃度（Ｃ）を求めた。ここで、Ｄ₁ のみ
でｈＣＧを定量する場合はｈＣＧ濃度に対するＤ₁ の相
関から、Ｄ₂ のみでｈＣＧを定量する場合はｈＣＧ濃度
に対するＤ₂ の相関からｈＣＧ濃度（Ｃ）を算出する関
係式を求めた（下記１０式および１１式）。 Ｄ₁ のみでｈＣＧを定量する場合 Ｄ₂ のみでｈＣＧを定量する場合

【０１８７】複数検出部測定および単数検出部測定から
導出された関係式（９式、１０式および１１式）にそれ
ぞれの電流密度を代入し、ｈＣＧ濃度を算出し、各測定
間の各ｈＣＧ濃度の平均値およびＣＶ値を比較した。結
果を下記表８に示す

【０１８８】

【０１８９】上記表８に示されるように、内部関係式９
式を用いたｈＣＧの定量（複数検出部）は、内部関係式
６式を用いた場合（表７）と同様に、単数検出部測定に
対し明らかな補正効果を示し、これらの式によって検体
中の莢雑物質の影響が補正されることが明かとなった。

【０１９０】［実施例４］第１含浸部５４（信号物質発
生体−電子メディエータ含浸部）として、西洋わさびパ
−オキシダ−ゼ標識抗ｈＣＧβ抗体の失活度が異なる３
種のもの（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を用いた以外は、
前記実施例３と全く同様にして特異結合分析装置（特異
結合分析装置（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）とする）を３
種作製し、実施例３と同様にヘパリン血漿中のｈＣＧ測
定（ｈＣＧ ２００ＩＵ／ＬおよびｈＣＧ ４００ＩＵ
／Ｌ）を行った。

【０１９１】＜結果＞パーオキシダーゼ活性の失活度が
異なる西洋わさびパーオキシダーゼ抗ｈＣＧβ抗体を含
浸した第１含浸部５４を用いた特異結合分析装置
（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）による測定結果より、前記
実施例３の＜７＞および＜８＞と同様に、電流密度の４
〜５分間の平均値Ｄ₁ およびＤ₂ を求めて、複数検出部
測定および単数極検出部測定（Ｄ₁ ）から導出された関
係式にそれぞれ代入し、ｈＣＧ濃度を算出した。結果を
下記表９に示す。

【０１９２】 以上のように、複数検出部測定から導出された内部関係
式を用いて、酵素標識抗体の酵素の失活を補正できた。

【０１９３】［実施例５］前記実施例３と同様の特異結
合分析装置を作製し、これをＣｏｎｓｔａｎｔＴｅｍｐ
ｅｒａｔｕｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒｓ
ｍｏｄｅｌＩＶ２１（ヤマト科学社製）内で測定を行
い、２５℃および４０℃でのヘパリン血漿中のｈＣＧ測
定（ｈＣＧ ４００ＩＵ／Ｌ）を行った。

【０１９４】前記実施例３の＜７＞および＜８＞と同様
に、電流密度の４〜５分間の平均値Ｄ₁ およびＤ₂ を求
めて、複数検出部測定および単数極検出部測定（Ｄ₁ ）
から導出された関係式にそれぞれ代入し、ｈＣＧ濃度を
算出した。結果を下記表１０に示す。

【０１９５】 以上のように、複数検出部測定から導出された内部関係
式を用いて、温度による効果を補正できた。

【０１９６】［実施例６］ 特異結合分析装置を用いた全血中のｈＣＧ濃度の測定

【０１９７】＜１＞第１含浸部５４（信号物質発生体−
電子メディエータ含浸部＝西洋わさびパ−オキシダ−ゼ
標識抗ｈＣＧβ抗体およびＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ
キス−（２´−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジ
アミン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の
作製 前記実施例１の＜１＞で作製した西洋わさびパ−オキシ
ダ−ゼ標識抗ｈＣＧβ抗体およびＴＨＥＰＤ（最終濃度
２ｍＭ）を、５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１０％サ
ッカロ−ス／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液 ｐＨ６．０にて希釈した溶液を調製した。次い
で、前記実施例２の＜１＞で作製したＴｗｅｅｎ２０処
理ガラス繊維濾紙からパンチングして作製した直径１２
ｍｍの円形濾紙に、上記溶液を１４０μｌ点着して凍結
乾燥を行い、第１含浸部５４（信号物質発生体−電子メ
ディエータ含浸部）を作製した。

【０１９８】＜２＞第２含浸部５６（緩衝液成分含浸部
＝０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ
６．０を含浸させた乾燥体）の作製 ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ
６．０を調製し、前記実施例２の＜１＞で作製したＴｗ
ｅｅｎ２０処理ガラス繊維濾紙からパンチングして作製
した直径１２ｍｍの円形濾紙に上記溶液を１４０μｌ点
着し、凍結乾燥を行い、緩衝液成分の乾燥体を作製し
た。

【０１９９】＜３＞抗体不溶化流路６２（抗体不溶化メ
ンブレン＝抗ｈＣＧ抗体不溶化多孔性セルロース混合エ
ステル膜）の作製 ｈＣＧを認識するウサギ多クローン性抗体ＳＥ０３０
（持田製薬社製）をＰＢＳに溶解して６．４ｍｇ／ｍＬ
濃度に調製した溶液３０μｌを、シャーレ上にて、ポア
サイズ８．０μｍのセルロース混合エステル多孔性膜
（カタログ番号ＳＣＷＰ０１９０Ｒ、日本ミリポア社
製）からパンチングして作製した直径１６ｍｍの円形多
孔性膜に中央部分から浸潤させた。デシケータ内で室温
で２時間乾燥後、直径１３ｍｍのサイズにパンチング
し、抗体不溶化流路６２（抗ｈＣＧ抗体（ＳＥ０３０）
不溶化多孔性セルロース混合エステル膜）を作製した。

【０２００】＜４＞特異結合分析装置の作製 このようにして作製した各部位を用い、下記のようにし
て、図２および図３に示される特異結合分析装置を各種
作製した。まず、アクリル製の下部基板６６上に前記実
施例３で作製した吸収部６４（過酸化水素・尿素を含浸
させた乾燥体）を積層した。なお、吸収部中央には、メ
ンディングテープ（住友スリーエム株式会社製）からパ
ンチングして作製した直径８ｍｍのシールを貼り付け
た。次いで、抗体不溶化流路６２（抗ｈＣＧ抗体（ＳＥ
０３０）不溶化多孔性ニトロセルロース膜）をシール部
６４ａを有する吸水部ろ紙の上に中心位置を合わせて重
積した。さらに、電極部６０ａを貫通孔６８の中心を抗
体不溶化流路６２の中心と一致して、作用極側を下にし
て、電極部６０ａを積層し、ガラス繊維ろ紙（ＧＡ５
５、アドバンテック東洋株式会社製）からパンチングし
て作製した直径３ｍｍの円形ろ紙を、電極の貫通孔には
め込んで連通部５８とした。次に、第２含浸部５６（緩
衝液成分含浸部）を、その中心が電極の貫通孔の中心と
一致するように重積した。この第２含浸部５６の上部表
面中央に、メンディングテープからパンチングして作製
した直径６ｍｍのシールを貼り付けた。その上に、第１
含浸部５４（信号物質発生体−電子メディエータ含浸
部）を重積した。さらにその上に、界面活性剤処理をし
たエルタス（カタログ番号Ａ０５０７０、旭化成社製）
からパンチングして作製した直径１２ｍｍの円形部材を
重積してフィルター部５２とした。その上に、直径６ｍ
ｍの試料導入口５０ａを有するアクリル製の上部カバー
５０を、その試料導入口５０ａの中心が貫通孔６８の中
心と一致するように上乗せし、上部カバー５０と下部基
板６６の四隅のネジ孔を合わせネジ留めして図２および
３に示されるような、ｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析
装置を作製した。

【０２０１】＜５＞ヘパリン全血中でのｈＣＧ測定 このようにして作製した特異結合分析装置の電極部６０
ａにおいて、対極７０を対極・参照極として電流計測回
路の対極（参照極）端子に接続し、同回路のチャンネル
１およびチャンネル２の作用極端子に、それぞれ第１作
用極７６（検出部１) および第２作用極７８（検出部
２) の端子７６ａおよび７８ａを接続した。そして、同
回路からナショナルインスツルメンツ社製のデータ集録
ボードＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｘを通じてコンピュータ内に
データを取り込み解析を行った。ベノジェクトII真空採
血管（テルモ社製）にて採血したヘパリン添加健常男性
全血４検体（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）に標準
ｈＣＧを添加して検体（Ａ）については、ｈＣＧ ５０
ＩＵ／Ｌ、およびｈＣＧ １００ＩＵ／Ｌ、検体（Ｂ）
および（Ｃ）については、ｈＣＧ ２５ＩＵ／Ｌ、ｈＣ
Ｇ ５０ＩＵ／Ｌ、およびｈＣＧ ７５ＩＵ／Ｌ、そし
て検体（Ｄ）についてはｈＣＧ ５０ＩＵ／Ｌのヘパリ
ン全血検体を調製した。ｈＣＧを含む各ヘパリン全血検
体をそれぞれ、特異結合分析装置の上面カバー５０板の
試料導入口５０ａを通じて、試料導入部に２５０μｌ導
入した。試料導入後、各作用極を対極・参照極に対して
−１５０ｍＶとなるように電位設定し、電流値を記録し
た。

【０２０２】＜６＞マイクロタイタープレートを用いた
酵素免疫測定による各血液検体中のｈＣＧ濃度測定 全血にｈＣＧを添加した場合、ｈＣＧは血漿成分に溶解
していると考えられるため、ｈＣＧ添加濃度と実濃度と
は異なり、ヘマトクリット値による補正が必要である。
そこで、全血にｈＣＧを添加した全血検体の血漿分離を
行い、血漿成分中に存在しているｈＣＧを以下に示す酵
素免疫測定法により定量しｈＣＧの実濃度とした。ＮＵ
ＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ（ＮＵＮＣ社製）にＰ
ＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製したｈＣＧを認識するウサ
ギ多クローン性抗体ＳＥ０３０を５０μＬ加え、５６℃
で３０ｍｉｎインキュベイトした。イオン交換水で洗浄
後、ＰＢＳで０．５％に調製したＢＳＡ溶液を１００μ
Ｌ加え、室温で１．５時間インキュベイトしてブロッキ
ングを行った。ＢＳＡ溶液を除去した後、ヘパリン血漿
で０、１０、２０、５０、１００、および２００ＩＵ／
Ｌに希釈した標準ｈＣＧ検体、およびｈＣＧ添加全血検
体から遠心分離操作で得られたヘパリン血漿検体を５０
μＬ加え、室温にて１時間反応させた。反応後、洗浄液
で５回、イオン交換水で２回洗浄した後、０．１％ＢＳ
Ａ−０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ６．０にて希釈した西洋わさびパ−オキシダ−ゼ標
識抗ｈＣＧβ抗体（ＨＲＰＯ−ＨＭ８１）を５０μＬ添
加し、室温で１時間反応させた。反応後、洗浄液で５
回、イオン交換水で２回洗浄した後、ＴＭＢ Ｓｏｌｕ
ｂｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｃｙ Ｔｃｋ社製）を５０
μＬ添加し、酵素反応による呈色反応を１５ｍｉｎ行っ
た。次いで、ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｙ
Ｔｃｋ社製）を１００μＬ加え、酵素反応を停止し
た。その後、分光光度計ＥＴＹ９６（東洋測器社製）に
て吸光度を測定し、標準ｈＣＧのスタンダードカーブか
ら各ヘパリン血漿中のｈＣＧ実濃度を求めた。

【０２０３】＜７＞結果． 複数検出部からｈＣＧ濃度
を算出する内部関係式の導出 ヘパリン全血検体（Ａ）を用いて調製した各実濃度のｈ
ＣＧ溶液を点着した際の第１作用極７６および第２作用
極７８で測定された１０〜１２分間の電流値の平均値Ｉ
₁ およびＩ₂ から、電流密度の平均値（Ｄ₁ および
Ｄ₂ ）を算出した。ｈＣＧ実濃度と電流密度との関係を
図２２に示す。また、各ｈＣＧ濃度でのＤ₁ からバック
グラウンド値（−２３μＡ／ｃｍ² ）を差し引き、さら
にＤ₂ で割った内部パラメーターＱを算出した。ｈＣＧ
実濃度と内部パラメーターＱとの関係を図２３に示す。
図２３に示される各ｈＣＧ実濃度（Ｃ）に対するＱ＝
（Ｄ₁ ＋２３）／Ｄ₂ との相関から、ｈＣＧ濃度を算出
する内部関係式を求めた（下記１２式）。

【０２０４】次いで、１２式にヘパリン全血ｈＣＧ検体
（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）のＱ値を代入し、ｈＣＧ濃
度を算出し、＜６＞に示される酵素免疫測定法によって
求めた全血中ｈＣＧの実濃度との相関を求めた。その結
果、図２４に示すように、両者には優れた相関性があ
り、複数電極による補正の効果が顕著に示された。

【０２０５】［実施例７］ 特異結合分析装置を用いた全血試料中のＥ２濃度の競合
法による測定

【０２０６】＜１＞抗Ｅ２抗体と西洋ワサビパーオキシ
ダーゼとの結合体（信号物質発生体）の作製 Ｅ２を認識するマウス単クローン性抗体Ｆ８１５（持田
製薬社製）を１００ｍＭ 塩化ナトリウム−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−６０ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
８．０）（ＴＥＡ緩衝液）に５．３ｍｇ／ｍＬ濃度とな
るように溶解し、窒素ガス置換したＴＥＡ緩衝液に十分
に透析した。この抗体溶液２．２ｍＬに対して、ＴＥＡ
緩衝液中に調製した５０ｍＭの２−イミノチオラン塩酸
塩（Pierce社製）溶液７０μＬを添加し、撹拌後、窒素
ガス雰囲気下、４℃で１．５時間静置した。その後、窒
素ガス置換した１００ｍＭ塩化ナトリウム−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（Ｅ
ＤＴＡ−ＰＢ）で十分に透析し、ＳＨ基が導入された抗
Ｅ２抗体を得た。１００ｍＭ 塩化ナトリウム−１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（ＰＢ）で２０ｍｇ／
ｍＬ濃度に調製された西洋ワサビパーオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰＯ，東洋紡社製）溶液３．１ｍＬを３０℃でゆっく
り撹拌しながら、５０ｍＭのスルホＳＭＣＣ（Pierce社
製）３．１ｍＬを添加して２０分間反応させた。反応
後、窒素ガス置換したＰＢで平衡化したＳｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５（ファルマシア社製）カラム（２．５φ×１
４．５ｃｍ）を通して未反応のスルホＳＭＣＣを除去
し、濃縮器ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ−１０（Amicon社製）
を用いて濃縮し、マレイミド化ＨＲＰＯを得た。得られ
たマレイミド化ＨＲＰＯの濃度は、４０３ｎｍの吸光度
から求めた。３．３×１０-7モルのマレイミド化ＨＲＰ
Ｏ溶液に対して、１／５倍モル量のＳＨ基導入Ｆ８１５
抗体を添加混合後、窒素ガス雰囲気下、４℃にて１６時
間反応させた。次いで、５００ｍＭのシステアミン−Ｅ
ＤＴＡ−ＰＢ溶液９６μＬを添加し、窒素ガス雰囲気
下、４℃にて６０分間反応させ、その後、窒素ガス置換
したＰＢで平衡化したＵＬＴＲＯＧＥＬ ＡｃＡ３４
（ＩＢＦ Biotechnics 社製）カラムを用いてゲルろ過
クロマトグラフィーを行った。２８０ｎｍおよび４０３
ｎｍにおける吸光度測定を、ゲルろ過クロマトグラフィ
ーの溶出分画について行い、遊離の酵素を含まないＦ８
１５抗体とＨＲＰＯとの結合体の分画を集めて濃縮し
た。濃縮標品（ＨＲＰＯ−Ｆ８１５抗体と称す）は、Ｐ
ｈａｓｔシステムによる電気泳動（ファルマシア社製）
で分子量を確認後、吸光度と酵素活性から含有される抗
体および酵素量を決定し、後記する測定において信号物
質発生体として用いた。

【０２０７】＜２＞６−ケトエストラジオール ６−
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシム−ウシγグロブリン
（Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ）の作製 Ｅ２−６ＣＭＯ（シグマ社製）６．６ｍｇをジオキサン
０．６６ｍｌに溶解し、トリ−ｎ−ブチルアミン（和光
純薬製）４．６２μＬ、およびイソブチルクロロホルメ
ート（ナカライテスク社製）４．６２μＬを加え、１０
℃で３０ｍｉｎ攪拌した。次いで、この溶液をあらかじ
め５０％ジオキサン水溶液で５ｍｇ／ｍＬに調製したウ
シγグロブリン（シグマ社製）溶液３０．３２ｍＬに添
加した。その後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用い
て反応溶液のｐＨを８．０〜８．５に調節しながら１０
℃で４時間攪拌した。蒸留水に対し４℃で２０時間透析
した後、反応溶液に等量のジエチルエーテルを加えてよ
く攪拌し、エーテル層を除去した。この抽出操作を二度
繰り返し、溶液中の未反応Ｅ２−６ＣＭＯを充分除去し
た後、水層をＰＢに対して透析を行い、Ｅ２−６ＣＭＯ
−γＧを作製した。

【０２０８】＜３＞第１含浸部５４（信号物質発生体−
電子メディエータ含浸部＝西洋わさびパ−オキシダーゼ
標識抗Ｅ２抗体およびＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラキス
−（２´−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミ
ン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ）を含浸させた乾燥体）の作製 先に＜１＞項で作製した西洋わさびパ−オキシダ−ゼ標
識抗Ｅ２抗体（ＨＲＰＯ−Ｆ８１５抗体）、およびＴＨ
ＥＰＤ（最終濃度２ｍＭ）、５％正常ウサギ血清（ＮＲ
Ｓ）−１０％ラクトース／０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．
０１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ７．４にて希釈した溶液を調
製した。次いで、実施例２の＜１＞で作製したＴｗｅｅ
ｎ２０処理ガラス繊維濾紙からパンチングして作製した
直径１０ｍｍの円形濾紙に上記溶液を９０μｌ点着し、
凍結乾燥を行い、第１含浸部５４（信号物質発生体−電
子メディエータ含浸部）を作製した。

【０２０９】＜４＞第２含浸部５６（緩衝液成分含浸部
＝０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液 ｐ
Ｈ７．４を含浸させた乾燥体）の作製 ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．０１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ
７．４を調製し、前記実施例２の＜１＞で作製したＴｗ
ｅｅｎ２０処理ガラス繊維濾紙からパンチングして作製
した直径１０ｍｍの円形濾紙に上記溶液を９０μｌ点着
し、凍結乾燥を行い、緩衝液成分の乾燥体を作製した。

【０２１０】＜５＞抗原不溶化流路６２（ハプテン不溶
化メンブレン＝Ｅ２−６ＣＭＯ−γＧ不溶化多孔性セル
ロース混合エステル膜）の作製 先に＜２＞で作製したＥ２−６ＣＭＯ−γＧをＰＢＳに
溶解して２．０ｍｇ／ｍＬ濃度に調製した。この溶液１
００ｍｌに、ポアサイズ８．０μｍのセルロース混合エ
ステル多孔性膜（日本ミリポア社製）からパンチングし
て作製した直径１１ｍｍの円形多孔性膜１０００枚をビ
ーカー内で浸漬し、３０分間２５℃で振とうした。濾紙
で水分をぬぐった多孔性膜を一晩真空乾燥して抗原不溶
化流路６２（ハプテン不溶化メンブレン）を作製した。

【０２１１】＜６＞吸収部６４（過酸化水素・尿素を含
浸させた乾燥体）の作製 クロマトグラフ濾紙（３１ＥＴ、Whatman 社製）からパ
ンチングして作製した直径１０ｍｍの円形ろ紙に、前記
実施例２の＜４＞と同様に作製した２．０Ｍ過酸化水素
−４．０Ｍ尿素溶液を３０μｌ点着し、凍結乾燥を行
い、過酸化水素−尿素の乾燥体を作製した。

【０２１２】＜７＞特異結合分析装置の作製 このようにして作製した各部位を用い、下記のようにし
て、図２および図３に示される特異結合分析装置を各種
作製した。まず、アクリル製の下部基板６６上に吸収部
６４（過酸化水素・尿素を含浸させた乾燥体）を積層し
た。なお、吸収部６４の中央には、メンディングテープ
（住友スリーエム株式会社製）からパンチングして作製
した直径８ｍｍのシールを貼り付けた。次いで、抗原不
溶化流路６２（ハプテン不溶化メンブレン）をシール部
６４ａを有する吸水部ろ紙の上に中心位置を合わせて重
積した。さらに、電極部６０と貫通孔６８の中心を抗原
不溶化流路６２の中心と一致させて、作用極側を下にし
て積層した。次に、第２含浸部５６（緩衝液成分含浸
部）を、その中心が電極の貫通孔の中心と一致するよう
に重積した。この第２含浸部５６の上部表面中央に、メ
ンディングテープからパンチングして作製した直径８ｍ
ｍのシールを貼り付けた。その上に、第１含浸部５４
（信号物質発生体−電子メディエータ含浸部）を重積し
た。さらにその上に、界面活性剤処理をしたアクスター
（カタログ番号Ｂ５０４０１、東レ社製）からパンチン
グして作製した直径１０ｍｍの円形部材を重積してフィ
ルター部５２とした。その上に、直径６ｍｍの試料導入
口５０ａを有するアクリル製の上部カバー５０を、その
試料導入口５０ａの中心が貫通孔６８の中心と一致する
ように上乗せし、上部カバー５０下部基板６６の四隅の
ネジ孔を合わせネジ留めして図２および３に示されるよ
うな、エストラジオール濃度測定用の特異結合分析装置
を作製した。

【０２１３】＜８＞ヘパリン全血中でのＥ２測定 このようにして作製した特異結合分析装置の電極部６０
ｇにおいて、対極７０を対極・参照極として電流計測回
路の対極（参照極）端子に接続し、同回路のチャンネル
１およびチャンネル２の作用極端子に、それぞれ第１作
用極７６（検出部１) および第２作用極７８（検出部
２) の端子７６ａおよび７８ａを接続した。そして、同
回路からナショナルインスツルメンツ社製のデータ集録
ボードＡＴ−ＭＩＯ−１６Ｘを通じてコンピュータ内に
データを取り込み解析を行った。ベノジェクトII真空採
血管（テルモ社製）で採血したヘパリン添加健常男性全
血検体（Ａ）に標準Ｅ２を添加して、Ｅ２ １ｎｇ／ｍ
Ｌ、Ｅ２ ３ｎｇ／ｍＬ、Ｅ２ １０ｎｇ／ｍＬ、Ｅ２
３０ｎｇ／ｍＬおよびＥ２ １００ｎｇ／ｍＬのヘパ
リン全血検体を調製した。また、別の全血検体（Ｂ）お
よび、（Ｃ）にもＥ２を各種濃度で添加して測定試料と
した。Ｅ２を含む各ヘパリン全血検体をそれぞれ、前記
特異結合分析装置の上面アクリル板の試料導入口を通じ
て、試料導入部に１５０μｌ導入した。試料導入後、各
作用極を対極・参照極に対して−１５０ｍＶとなるよう
に電位設定し、電流値を記録した。

【０２１４】＜９＞酵素免疫測定法による各血液検体中
のＥ２濃度測定 上記各全血検体から分離した血漿中のＥ２濃度を市販の
エストラジオール測定試薬エンチムンテストＥ２（ベー
リンガー・マンハイム社製）を用いて測定し、この濃度
を各全血検体のＥ２実濃度とした。

【０２１５】＜１０＞結果． 複数検出部からＥ２濃度
を算出する内部関係式の導出 ヘパリン全血検体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を用いて
調製した各濃度のＥ２溶液を点着した際の第１作用極７
６および第２作用極７８で測定された８〜１０分間の電
流値の平均値Ｉ₁ およびＩ₂ から、電流密度の平均値
（Ｄ₁ およびＤ₂）を算出した。ここでは、応答曲線の
１つは各全血検体中のＥ２実濃度とＤ₁ との関係（図２
５）から求めた近似式とした。また、もう一つの応答曲
線は各全血検体中のＥ２実濃度と、Ｄ₂ の代わりに、Ｄ
₁ ＋Ｄ₂ との関係（図２６）から求めた近似式とした。
図２５および図２６に示されるように、各Ｅ２実濃度の
対数値（ｌｏｇＣ）に対するＤ₁ およびＤ₁ ＋Ｄ₂ の応
答は、ロジスティック曲線（下記１３式および１４式）
に適合した。ここで１３式、１４式および１８式中のＥ
２濃度Ｃは、１０^-1ｎｇ／ｍＬ単位である。 各全血検体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）から求めた応答
曲線の近似式（１３式および１４式）中のｂ１、ｂ２、
ｃ１およびｃ２を比較したところ、これらの係数はｂ１
＝ｂ２＝４．４およびｃ１＝ｃ２＝２．２とすることが
できた。また、応答曲線の近似式（１３式および１４
式）のａ１とｄ１、ａ２とｄ２およびａ１とａ２の間に
は、下記１５式、１６式および１７式に示されるような
関係が認められた。 ｄ１＝ａ１＋９．７ 15式 ｄ２＝ａ２＋１８ 16式 ａ２＝１．１ ａ１−１５ 17式 上記式（１３式、１４式、１５式、１６式および１７
式）より、試料に依存する係数ａ１、ｄ１、ａ２、ｄ２
を消去することで、内部関係式Ｃ＝Ｓ（Ｄ₁ ，Ｄ ₁ ＋Ｄ
₂ ）（１８式）が誘導できる。

【数１】

【０２１６】＜１１＞結果． 単数検出部からＥ２濃度
を算出する関係式の導出 単数検出部で同様に測定を行い、Ｅ２を定量した場合
（Ｄ₁ のみでＥ２を定量）に算出される全血検体（Ａ）
（Ｂ）（Ｃ）のＥ２濃度Ｃを求めた。ここでは、全血検
体（Ａ）を用いた際のＥ２濃度に対するＤ₁ の応答から
Ｅ２濃度Ｃを算出する関係式を求めた。（下記１９式）
なお、１９式中のＥ₂ 濃度Ｃは１０^-1ｎｇ／ｍＬ単位で
ある。

【数２】 複数検出部測定および単数検出部測定から誘導された関
係式（上記１８式および１９式）に全血検体（Ｂ）およ
び（Ｃ）の電流密度を代入し、全血検体（Ｂ）および
（Ｃ）のＥ２濃度をそれぞれ求め、その平均値を比較し
た。結果を表１１に示す。

【０２１７】

【表５】 表１１に示されるように、複数検出部測定から誘導した
内部関係式１８式を用いたＥ２の測定は単数検出部測定
から誘導した関係式１９を用いた場合に比べ明かな補正
効果を示した。ゆえにこの内部関係式１８によって検体
中の夾雑物質等の影響が補正されることが明かとなっ
た。また、内部関係式（１８式）から求めたＥ２濃度と
＜９＞の酵素免疫測定法で求めたＥ２実濃度との間には
良い相関が認められた。

【０２１８】［実施例８］ 検定用血清試料による全血検体測定用内部関係式の装置
ロット依存性定数項の決定 ＜１＞特異結合分析装置の作製 前記実施例７において用いた特異結合分析装置と同一ロ
ットの装置を用い、以下の測定を行った。

【０２１９】＜２＞検定用血清試料中でのＥ２測定 ステロイドフリー血清（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社
製）（検定用血清Ａ（非特異的因子が少ない全血検体に
相当））、上記西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗Ｅ２
抗体およびＴＨＥＰＤをそれぞれ、５×１０^-10 Ｍおよ
び１×１０^-4Ｍを含むステロイドフリー血清（検定用血
清Ｂ（非特異的因子が多い全血検体に相当））、および
上記西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗Ｅ２抗体および
ＴＨＥＰＤをそれぞれ、５×１０^-11 Ｍおよび１×１０
^-4Ｍを含むステロイドフリー血清（検定用血清Ｃ（非特
異的因子が中程度の全血検体に相当））に標準Ｅ２を添
加して、Ｅ２ １ｎｇ／ｍＬ、Ｅ２ ３ｎｇ／ｍＬ、Ｅ
２ １０ｎｇ／ｍＬ、Ｅ２３０ｎｇ／ｍＬおよびＥ２
１００ｎｇ／ｍＬの各検定用血清検体を調製した。Ｅ２
を含む各検定用血清検体をそれぞれ、前記特異結合分析
装置の上面アクリル板の試料導入口を通じて、試料導入
部に１５０μＬ導入した。試料導入後、各作用極を対極
・参照極に対して−１５０ｍＶとなるように電位設定
し、電流値を記録した。

【０２２０】＜３＞結果． 検定用血清検体からＥ２濃
度を算出する補正式の導出 検定用血清検体（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を用いて調
製した各濃度のＥ２溶液を点着した際の第１作用極７６
および第２作用極７８で測定された５．５〜７．５分間
（全血検体測定の８〜１０分間に相当する）の電流値の
平均値Ｉ₁ およびＩ２から、電流密度の平均値（Ｄ₁ お
よびＤ₂ ）を算出した。各Ｅ２実濃度の対数値（ｌｏｇ
Ｃ）に対するＤ₁ およびＤ₁ ＋Ｄ₂ の応答は、実施例７
に記載した全血検体と同様にロジスティック曲線（上記
１３式および１４式）に適合した。ここで１３式、１４
式および２３式中のＥ２濃度Ｃは１０^-1ｎｇ／ｍＬ単位
である。各検定用血清試料（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）
から求めた応答曲線の近似式（１３式および１４式）の
ｂ１、ｂ２、ｃ１およびｃ２を比較したところ、これら
の係数はｂ１＝ｂ２＝４．４およびｃ１＝ｃ２＝２．２
とすることができた。また、応答曲線の近似式（１３式
および１４式）のａ１とｄ１、ａ２とｄ２およびａ１と
ａ２の間には下記２０式、２１式および２２式に示され
るような関係が認められた。 ｄ１＝ａ１＋９．７ 20式 ｄ２＝ａ２＋１８ 21式 ａ２＝１．１ａ１−１５ 22式 上記式（１３式、１４式、２０式、２１式および２２
式）より、試料に依存する係数ａ１、ｄ１、ａ２、ｄ２
を消去することで、内部関係式Ｃ＝Ｔ（Ｄ₁ ，Ｄ ₁ ＋Ｄ
₂ ）（下記２３式）が誘導できる。

【数３】 検定用血清検体から誘導された内部関係式２３式の装置
ロット依存性の定数項は、実施例７で全血検体から誘導
された内部関係式１８式の装置ロット依存性定数項と一
致した。以上より検定用血清検体から得られた内部関係
式を用いることで全血中のＥ２の定量が可能となった。

【０２２１】

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明の特
異結合分析方法および装置によれば、未反応物の分離操
作（洗浄操作）を行う必要がなく、汎用性に優れ、しか
も、夾雑物による影響、試料が測定に与える非特異的な
影響や反応温度などの分析環境、分析に用いている試薬
の失活程度など測定値の信頼性を低下させる要因を排除
して、高精度かつ迅速な測定が可能な特異結合分析方
法、およびこの特異結合分析方法の実施に好適な特異結
合分析装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の特異結合分析方法を説明するための
概念図である。

【図２】 本発明の特異結合分析装置の概略分解斜視図
である。

【図３】 図２に示される特異結合分析装置を組み立て
た際の概略断面図である。

【図４】 （ａ）は図２に示される特異結合分析装置の
電極部の上面、（ｂ）は同電極部の裏面を、それぞれ示
す概略図である。

【図５】 （ａ）は図２に示される特異結合分析装置に
用いられる２つの作用極を有する電極部の裏面の別の例
を示す概略図、（ｂ）はストリップ状の流路を用いた別
の特異結合分析装置に用いられる２つの作用極を有する
電極部の裏面の例を示す概略図である。

【図６】 （ａ）は図２に示される特異結合分析装置に
用いられる３つの作用極を有する電極部の裏面の別の例
を示す概略図、（ｂ）はストリップ状の流路を用いた別
の特異結合分析装置に用いられる３つの作用極を有する
電極部の裏面の例を示す概略図である。

【図７】 ｈＣＧ濃度と複数の検出部によって測定され
た電流値との関係を示すグラフである。

【図８】 ｈＣＧ濃度と複数の検出部によって測定され
た電流値との関係を示すグラフである。

【図９】 ｈＣＧ濃度と複数の検出部によって測定され
た電流値との関係を示すグラフである。

【図１０】 ｈＣＧ濃度と複数の検出部によって測定さ
れた電流値との関係を示すグラフである。

【図１１】 ｈＣＧ濃度と複数の検出部によって測定さ
れた電流値との関係を示すグラフである。

【図１２】 ｈＣＧ濃度と複数の検出部によって測定さ
れた電流値との関係を示すグラフである。

【図１３】 ｈＣＧ濃度と電流値との関係を示すグラフ
である。

【図１４】 検出部１の電流値と検出部２の電流値との
関係を示すグラフである。

【図１５】 ｈＣＧ濃度と傾きＳとの関係を示すグラフ
である。

【図１６】 ｈＣＧ濃度と検出部１による電流値との関
係を示すグラフである。

【図１７】 ｈＣＧ濃度と電流値との関係を示すグラフ
である。

【図１８】 ｈＣＧ濃度と内部パラメータＰとの関係を
示すグラフである。

【図１９】 ｈＣＧ濃度と検出部１による電流値との関
係を示すグラフである。

【図２０】 ｈＣＧ濃度と検出部２による電流値との関
係を示すグラフである。

【図２１】 ｈＣＧ濃度と内部パラメータＱとの関係を
示すグラフである。

【図２２】 ｈＣＧ濃度と電流密度との関係を示すグラ
フである。

【図２３】 ｈＣＧ濃度と内部パラメータＱとの関係を
示すグラフである。

【図２４】 本発明の特異結合分析方法（装置）で求め
たｈＣＧ濃度とマイクロタイタープレートを用いた酵素
免疫測定法で求めたｈＣＧ濃度との関係を示すグラフで
ある。

【図２５】 Ｅ２濃度と電流密度（Ｄ₁ ）との関係を示
すグラフである。

【図２６】 Ｅ２濃度と電流密度（Ｄ₁ ＋Ｄ₂ ）との関
係を示すグラフである。

【図２７】 本発明の検出部の信号検出系の一例を示す
模式図である。

【図２８】 競合型ＭＥＤＩＡ法における試料中の抗原
の有無と標識酵素分布との関係を示す模式図である。

【図２９】 ２つの検出手段の信号強度（Ｉ₁ ，Ｉ₂ ）
に対して測定誤差要因が与える影響の模式図である。

【符号の説明】

１ 試料液 ２ 抗原 ３ 酵素 ４ 酵素標識抗体 ５ 不溶化抗原 ６ 検出部１ ７ 検出部２ １０ 信号物質発生体 １２ 信号物質 １４ 信号物質の発生に関与する物質 ５０ 上面カバー ５０ａ 試料導入口 ５２ フィルタ ５４ 第１含浸部 ５６ 第２含浸部 ５６ａ，６４ａ シール部 ５８ 連通部 ６０ 電極部 ６１ 基板 ６２ 特異結合物質不溶化流路（マトリクス） ６４ 吸収部 ６６ 基台 ６８ 貫通孔 ７０ 対極（参照極） ７０ａ 対極（参照極）端子部 ７４ 絶縁層 ７６ 第１作用極（検出部１） ７６ａ 第１作用極端子部 ７８ 第２作用極（検出部２） ７８ｂ 第２作用極端子部 ８０ 第３作用極（検出部３） ８０ａ 第３作用極端子部 ａ 試料導入部 ｂ 流路 ｃ 検出部

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】液性試料中の分析対象物を、その特異結合
   反応によって測定する特異結合分析方法であって、 特異結合反応に関与しかつ信号物質を発する信号物質発
   生体および前記液性試料を、所定の流路において所定方
   向に流動させると共に、前記分析対象物の特異結合反応
   を発生させ、この特異結合反応を利用して、前記流路中
   に液性試料中の分析対象物濃度に応じた信号物質発生体
   の分布を形成し、 流路内に分布する信号物質発生体によって信号物質を発
   生させ、発生した信号物質を、前記流動方向に異なる位
   置に複数配置される検出手段によって検出し、 この複数の検出結果を用いることによって、分析対象物
   の濃度以外の要因による分析結果への影響が極小になる
   ように演算処理を行うことを特徴とする特異結合分析方
   法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の特異結合分析方法の実施
   に利用される特異結合分析装置であって、 液性試料導入部と、それに連結して配置される液性試料
   を流すことのできる流路と、液性試料中の分析対象物と
   それに特異的に結合する特異結合物質との特異結合反応
   により前記流路内に形成された、液性試料中の分析対象
   物量に応じた信号物質発生体の分布を、前記信号物質発
   生体から発生される信号物質の拡散による物質移動に律
   速される信号強度として検出するための、前記流路の液
   流方向に対して異なる位置に配置される複数の検出部と
   を有することを特徴とする特異結合分析装置。
3. 【請求項３】前記複数の検出部が、電気化学的信号検出
   を行なえる複数の電極である請求項１に記載の特異結合
   分析装置。
4. 【請求項４】前記検出部の位置が、流動方向に１０μｍ
   以上離れている請求項２に記載の特異結合分析装置。