JP3329449B2 - 電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサー - Google Patents

電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサー

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫クロマトグラ
フィーの原理を利用しながら、ホルモン、タンパク質、
酵素等のような分析物質を簡便に且つ正確に定量できる
新しい定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの疾病の病症及び進度に対する予測
を可能にするホルモン、タンパク質、そして微生物のよ
うな指標物質等はその構造が比較的複雑なため、このよ
うな分析物質等は主に抗原-抗体反応を利用した免疫分
析法により測定される。このような検査は、一般に特別
な機器が備わった臨床実験室等で普通遂行されてきた
が、最近の免疫分析のひとつの範ちゅうとして病院や応
急室等、医療現場での検査そして家庭での自家診断の必
要性が急激に要求されている(参考文献：C.P. Price
等, Principles and Practice of Immunoassay, 1997,
Page 579-603,Macmillan Reference Ltd., London)。こ
のため、専門知識や複雑な過程が要求されない上、使用
が簡便で遂行時間が短い免疫分析システムの考案が試み
られて来ており、このような診断性能は一般的に細孔性
メンブレンを結合性タンパク質(例：抗体)を固定化母体
として使用する免疫クロマトグラフィーの方法により、
ある程度成し遂げられた(参考文献：R.Chen 等, 1987,
Clin. Chem. Vol. 33, Page 1521-1525;M. P. A. Laiti
nen, 1996, Biosens. Bioelectron., Vol. 11, 1207-12
14; S. C. Lou 等, 1993, Clin. Chem., Vol. 39,619-6
24; S. H. Paek 等 1999,Anal. Lett., Vol. 32, 335-3
60)。分析物質が含まれた試料を、メンブレンストリッ
プ下段から吸水させると、細孔を通した毛細管現象によ
り分析物質は、固定化された結合性タンパク質層へと運
搬され固体表面で分析物質と結合性タンパク質との結合
反応が起き、結合されない成分は流体の流れにより分離
される。このような原理に基いたメンブレン免疫クロマ
トグラフィー技術は、流体の側方流動(lateral flow)を
利用して反応成分等の物質運搬を加速させることによ
り、分析物質の迅速な分析と単なる試料の添加のみで分
析が完了される簡便な1段階測定法を提供する。
【０００３】免疫クロマトグラフィー分析を遂行するた
めの免疫ストリップモデルシステムは、一般的に次のよ
うな3種類のメンブレンストリップを用いて構成される
(図1のa)。その下段から、(1)試料添加のためのガラス
繊維メンブレン、(2)分析物質に対し特異的に結合する
タンパク質が固定化されたニトロセルロース(NC)メンブ
レン、そして(3)吸水パッドとして作用するセルロース
メンブレンで構成される。このようなメンブレンストリ
ップ等を部位的に重ねてプラスチックフィルム上に配列
させた後、両面テープを用いて固定させる。分析過程を
調べてみると、結合性タンパク質とシグナル発生物質
(例：金コロイド粒子、酵素、有色プラスチックビーズ
等)との重合体をガラス繊維メンブレン上の一定部位に
添加した後、分析物質を含む運搬溶液を免疫ストリップ
の下段端から吸水させると、分析物質は毛細管現象によ
り誘導される流体の流れにしたがってストリップの上部
に移動し、前記の重合体に出会うと重合体中の結合性タ
ンパク質との免疫反応により結合される(図1のb)。運搬
溶液の移動が継続されニトロセルロースメンブレン上に
固定化された結合性タンパク質と出会うと、その免疫結
合体は固定化された結合性タンパク質(この結合性タン
パク質が認知する抗原分子上の場所は、シグナル発生物
質と結合された結合性タンパク質が認知する場所と異な
る)との免疫反応により捕獲され(図1のc)、捕獲されな
い成分は流体の流れに従って吸水パッドとして作用する
セルロースメンブレンへと移送され分離される。メンブ
レン上の一定地域に捕獲されたサンドウィッチ結合体
(分析物質分子を中心に両方に二つの結合性タンパク質
分子が付着された結合体)は、表示物質として色素発生
物質を含むため、肉眼で確認可能な発色シグナルを発生
させる。
【０００４】このような定性分析形態は、単にある身体
的症状や病原菌感染有無の確認のために遂行されるが、
大部位の臨床試験の対象指標物質の場合、各試料内に含
まれた成分の濃度決定が絶対的に要求される。このよう
な定量分析を遂行するため、分析結果から現れる発色シ
グナルを既存の光学的シグナル変換手段を利用して光学
密度(又は吸光度)に変換することはできるが、変換方法
の煩わしさと測定の敏感度が高くないという欠点のた
め、実際は広く利用されていない。
【０００５】従って、使用が簡便で、遂行時間が短い免
疫クロマトグラフィー方法をそのまま利用しながら、光
学密度測定法より簡便で正確に分析物質濃度を定量でき
る新しい定量方法の開発が切実に要求されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】これに本発明者らは、
前記免疫クロマトグラフィー方法でシグナル発生物質と
して一般的に使用されている金コロイド粒子が、電気伝
導性を有する金属粒子であることに着眼し本発明を完成
させた。
【０００７】したがって、本発明の目的は、既存の免疫
クロマトグラフィー方法の長所をそのまま生かし、より
簡便で正確な新しい定量方法を提供することにある。言
い換えれば、本発明は免疫クロマトグラフィー原理を利
用しつつも定性分析に止まらず、ホルモン、タンパク
質、酵素等のさまざまな分析物質を簡便で且つ敏感に定
量できる新しい定量方法ならびに電気化学分析の定性分
析法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、 (1)試料添加
用メンブレンパッド、(2)分析物質に対し特異的に結合
する結合性タンパク質が固定化されていて、少なくとも
一対の電極がそのタンパク質層上にスクリーンプリント
されているシグナル発生用メンブレンパッド、(3)吸水
用メンブレンパッド、そして、(4)シグナル発生物質で
ある金属コロイド粒子と結合性タンパク質との重合体を
含み、パッド(2)の片面の両端に長さで(1)と(3)が部分
的に重ねて固定され、重合体(4)が試料添加用メンブレ
ン(1)上の一定地域に前もって乾燥状態で添加したり、
分析直前に添加して使用できるように、別の容器に保管
されている電気伝導度メンブレンストリップバイオセン
サーに関するものである。
【０００９】前記の試料添加用メンブレンパッド、シグ
ナル発生用メンブレンパッド、吸水用メンブレンパッド
及び重合体は、既存の免疫クロマトグラフィー方法で使
われる一般的なものであるが、シグナル発生用メンブレ
ンパッドに電極がスクリーンプリントされていることの
み相違する。
【００１０】前記パッドに使われる材料は、各パッドの
目的に合うものであれば如何なる材料であっても利用で
き、その代表的な例としては、試料添加用メンブレンパ
ッドはガラス繊維メンブレンを、シグナル発生用メンブ
レンパッドはニトロセルロースメンブレンを、吸水用メ
ンブレンパッドはセルロースメンブレンを用いることが
できる。
【００１１】前記結合性タンパク質は、分析物質と特異
的に反応する物質であり、その例としてはマーカー抗
体、酵素、受容体等が挙げられる。従って本発明のバイ
オセンサーは、抗原-抗体反応に基いた免疫反応システ
ムならびに酵素反応と核酸ハイブリダイゼーションとを
利用した酵素センサー及び遺伝子センサーの製造に適用
することができる。
【００１２】前記シグナル発生用メンブレンパッドに固
定化されている結合性タンパク質と前記重合体中の結合
性タンパク質は、各々同一分析物質と特異的に反応する
ことのできる分析物質に対する結合性タンパク質であ
り、両結合性タンパク質が反応する分析物質上の結合部
位は互いに相違する。
【００１３】前記の金属コロイド粒子としては、例を挙
げると金コロイド粒子、銀コロイド粒子、鉄コロイド粒
子等があり、好ましくは金コロイド粒子である。
【００１４】本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーにおいて、前記重合体を試料添加用メン
ブレンパッドに前もって乾燥状態で添加してバイオセン
サーを構成することもでき、又は別の容器に保管して分
析直前に添加できるよう構成することもできる。
【００１５】本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーにおいて、重合体、すなわち金属コロイ
ド粒子は、分析物質と重合体との結合性複合体中の分析
物質が、表面に固定化された結合性タンパク質と反応す
ることによりシグナル発生用メンブレンの表面に分布
し、この金属コロイド粒子の密度はシグナル発生用メン
ブレンパッドにスクリーンプリントされている2つの電
極を通じて電気伝導度シグナルへと変換される。測定さ
れる電気伝導度シグナルは、金属粒子濃度(即ち、分析
物質濃度)に比例して現れる。
【００１６】本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーにおけるシグナル発生用メンブレンパッ
ド上に、電極をスクリーンプリントさせる方法は、既存
のスクリーンプリント技術をそのまま適用できる。例を
挙げると、メンブレンに直接又は絶縁体上に電極材料ペ
ースト(白金、金、銀、炭素等)をパターン化されたスク
リーンを通してプリントし、高温(一般的に100℃以上)
で乾燥させることを反復して製造できる。この時、シグ
ナル発生用メンブレンパッドに固定化される結合性タン
パク質は、一対の電極間に位置させる。そして電極を絶
縁体にプリントする場合には、絶縁体を固定化された結
合性タンパク質とともにメンブレンの片面又は両面に位
置させた後、適切な圧力を加えたり、又はテープを用い
てメンブレンに接着させることができる。
【００１７】本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーのために、任意の電極パターンを使用で
きるが、交差枝(interdigitated)構造がトゥーフィンガ
ー(two-fingered)構造に比べて望ましい。これは向かい
合う二つの電極間の表面積を著しく増加させ、測定敏感
度を増大させることができるためである。電極がスクリ
ーンプリントされたメンブレン電極のセンサー部位に結
合性タンパク質を固定化することによってシグナル発生
用メンブレンパッドが完成できる。
【００１８】本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーに適用できる電極パターンの具体的な例
を挙げて説明すると次の通りである。
【００１９】図2aに示したものが一つの例である。シグ
ナル発生用メンブレンパッド(20)上に電極(23)がスクリ
ーンプリントされており、伝導度測定用装置との電気接
触部位、即ち電気接点(24)はメンブレンに吸水されて移
動する水溶液から絶縁された絶縁体(22)(例えばプラス
チックフィルム)上に形成され、シグナル発生用メンブ
レンパッド(20)と同じ方向で電極の上部に位置させたも
のである。電気接点(24)は、手動の様式で、スクリーン
プリントされた電極に電気的に連結させることができ
る。
【００２０】他の例としては図2bが挙げられる。製造さ
れた電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサーと
電気伝導度測定装置との空間的配列互換性を高めるため
に電気接点(24)をシグナル発生用メンブレンパッド(2
0)、すなわち、バイオセンサーの側面(例えば、直角方
向に)に位置させる。
【００２１】又、他の例としては、図3が挙げられる。
図2a及び図2bのようにスクリーンプリントされた電極で
は、そのセンサー部位がメンブレンの外側に形成され、
分析物質-結合性タンパク質反応は主にメンブレン細孔
内部表面で起きるため、反応した結合体の一部位のみが
電気伝導度に寄与する。このような問題を解決するため
に、一対の電極、即ち陰極と陽極とを別に取り外してメ
ンブレンを中心に各々両側に置き、サンドウィッチ型に
形成したものである。このようなサンドウィッチ型電極
の製造方法を例を挙げて説明すると次の通りである。
【００２２】第一の製造方法としては、プラスチックフ
ィルムのような絶縁体上に、電極を各々一つずつプリン
トした後、高温で乾燥させ、このようにして製造された
一対の電極を、メンブレンを中心に両側に各々サンドウ
ィッチ型に位置付けする。ここでメンブレンと電極との
接触が不完全な場合、抵抗が増加して電気伝導度が測定
できなくなるため、両母体間に適切な圧力を加えられる
ようにシステムを考案したり、或いはテープを利用して
電極をメンブレンに付ける方法が好ましい。
【００２３】第二の製造方法としては、メンブレンの両
側に各々電極を直接プリントし、直接サンドウィッチ型
に位置付けすることができる。この場合、電極が部分的
に接触することにより短絡(short circuit)しないよう
に留意する必要がある。
【００２４】また他の例としては、図4が挙げられる。
図3のような多くのサンドウィッチ型電極を同時にいく
つか配置する。2種類以上の分析物質を測定するシステ
ムを製造するには、いくつかのセンサーを一緒に狭い空
間に配置することが必要である。一対の電極を同じ平面
上に配列させる交差枝構造の場合、短絡しないように電
極間の間隔をある程度維持しなければならないため、各
センサー当りの所要面積が多く要求される。従って、複
数の交差枝センサーを一つのシステム内に設置する場
合、シグナル発生用メンブレンパッドの長さが長くなる
ため、センサーの位置により分析物質と固定化された結
合性タンパク質との反応において変化がもたらされ得
る。一方、サンドウィッチ型に配列させた電極の場合、
図4に現したように、一対の電極間の距離はメンブレン
の厚さにより決められるため、同一平面上に電極を最小
限の距離で垂直配置させることができる。従って、サン
ドウィッチ型電極を利用する場合、分析物質-結合性タ
ンパク質間の反応に対する変移を最小化させながら、狭
い空間のシグナル発生用メンブレンパッド内に多重セン
サーを設置できる。以上で説明した電極形式意外にも、
電極の形態と配置は非常に多く考案できる。
【００２５】シグナル発生用メンブレンパッドの結合性
タンパク質に結合しない他の成分は、液体の流れに従い
移行し、吸水パッドに吸収される。従って吸水パッド
は、このような目的に合うものであれば、どんなもので
も用いられる。
【００２６】本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーで定量シグナルを発生させる金属コロイ
ド粒子は金属であるため、シグナル発生用メンブレンパ
ッド表面に結合した金属コロイド粒子に従って電気伝導
が発生し、そのシグナルは配置された金属粒子濃度(即
ち、最終的には分析物質濃度)に比例して増加するよう
になる。従って本発明の電気伝導度メンブレンストリッ
プバイオセンサーは、既存の光学技術を用いた免疫クロ
マトグラフィーアッセイ法に比べてさらに優れた利点を
提供する。第一に、電気伝導回路内での分析物質-結合
性タンパク質間の反応に関与することで、表面に結合す
る金コロイド粒子を反復的に蓄積させ金コロイド粒子間
の平均距離を漸進的に短縮させるため、電気伝導度は指
数的に増加する(参考文献：A.Heller, 1990, Acc. Che
m. Res., Vol. 23, 128-134)。従って、このように発生
した電気シグナルは、光学技術に基づく既存の光学測定
法によるシグナルと比較し増幅される(参考文献：T. M.
Swager, 1998, Chem. Res.,Vol. 31, 201-207)。第二
に、電気伝導度は、多くの実験室で保有している一般的
な伝導度測定装置を使用し、測定できる。この装置は、
比較的安定で正確であり、また、価格が相対的に安く、
操作が簡単である。(R.T. da Rocha 等, 1997,J. Chem.
Edu., Vol. 74, 572-574)。最後に、金トレーサーは目
で見ることができるため、そのアッセイの進行を肉眼で
確認し、定量測定後発色シグナルを後々の資料として保
管できる。
【００２７】クロマトグラフィー分析方法では、結合性
タンパク質-金属重合体、すなわちシグナル発生物質の
製造時に、非特異的相互作用を減少させるために、ブロ
ッキング剤として、免疫グロブリンおよびカゼインのよ
うなタンパク質分子で粒子を取り囲んで、金粒子の外側
にイオン性ポリマーの外殻を付与する。これは伝導性媒
介体間の電気伝導の主要な段階である電子ホッピング(e
lectronhopping)を妨害する(G. Cavelier, 1995, Bioel
ectroch. Bioener.Vol. 40, Page 197-213; A. Heller,
1990, Acc. Chem. Res., Vol. 23, 128-134)。タンパ
ク質分子は、無定形半導体と類似した性質を備え、この
分子層はその厚さが効果的な電子跳躍距離(2〜2.5 nm)
を超過するため、電気伝導度に対し障壁として作用す
る。このような抵抗を減少させるため、相対的に金属粒
子表面から外部に拡張され開放されたポリエチレングリ
コールを利用してブロッキングすることができる。この
ような条件下でシグナル／雑音比はイオン性タンパク質
のコーティングを行った場合との比較時に増加する。し
かし、伝導度に対し抵抗として作用できる高分子層が依
然と金属粒子表面に存在するため、このような問題点を
克服できる特別な方法の開発が要求される。
【００２８】従って、本発明の電気伝導度メンブレンス
トリップバイオセンサーも、その金属性コロイド粒子表
面にブロッキング用タンパク質を吸着させ、使用できる
だけでなく、又その金属性コロイド粒子表面にブロッキ
ング用タンパク質を吸着させる前に伝導性高分子を先に
吸着させ使用することもできる。本発明で使用されるブ
ロッキング用タンパク質としては、前記で記述されたよ
うに牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等を例とし
て挙げられ、伝導性高分子としてはポリアニリン(polya
niline)、ポリピロール(polypyrrole)、ポリチオフェン
(polythiophene)、ポリパラフェニレン(poly(p-phenyle
ne))等が挙げられる。前記伝導性高分子中、本発明で最
も好ましいのはポリアニリンである。粒子表面に存在す
る伝導性高分子は、近接した金属コロイド粒子を架橋さ
せたり、互いをさらに近接させ電荷伝達状態を著しく向
上させられる。前記の伝導性高分子は伝導性が高く、酸
化/還元による電子伝達速度が非常に高いため、エネル
ギー保存用新素材、電気変色性素子、電気化学感知機、
電子基遮蔽素材、畜電器(capacitor)、イオンゲート(io
ngate)等への応用と関連し活発に研究されている有機機
能性物質である。
【００２９】他の伝導度調節方法として、高分子鎖内の
エネルギーギャップ(gap)間に存在する電子運搬体(carr
ier)、或いは電子受容体を化学処理し、カルボカチオン
やカルボアニオンを導入させるドーピング法を使用する
ことができる。
【００３０】前記伝導性高分子は、高い電気伝導度を示
しはするが、水溶性が低く、これは、本発明の分子ワイ
ヤーとして、機能性を決定すると考えられる。従って、
高分子のこのような物性を向上させるために、次の一つ
の方法を用いることができる。 1) イオン性塩を利用してドーピングする方法。イオン
性塩の例としてはLiCl、LiClO4、LiBF4等が挙げられ
る。 2) 1)の方法を適用することと同時にレドックス(redo
x)分子を伝導性高分子に化学結合させる方法。レドック
ス分子の例としては、フェロセン(ferrocene)、ルテニ
ウム(ruthenium)等が挙げられる。 3) 伝導性高分子に対する対イオン(counterion)を添加
する方法。例えばポリアニリンの対イオンとして、ポリ
スチレンスルホン化物(sulfonatedpolystyrene)を利用
することができる。
【００３１】従って、シグナル発生用メンブレンパッド
(20)に固定化された結合性タンパク質(21)に、分析物質
(1)の存在下で捕獲されシグナルを発生させる、金属コ
ロイド粒子-結合性タンパク質の重合体は、次のような
方法で製造することが好ましい(図5参照)。先ず、金属
コロイド粒子表面に結合性タンパク質を化学反応或いは
物理的吸着方法で重合させた後、選択された伝導性高分
子を順次的に付着させる。金属粒子-結合性タンパク質
重合体に伝導性高分子を添加すると、分子は金属表面に
拡散され、残りの部位に吸着され配列された高分子層を
形成する(参考文献：J.H. Cheungら, 1997, Macromolec
ules, Vol. 30, 2712-2716)。最後に最終金属粒子の残
りの表面を上気したような方法でブロッキング用タンパ
ク質でブロッキングさせる。
【００３２】伝導性高分子濃度が非常に高い場合、一つ
の高分子鎖により金属粒子間に交差結合が起こり、結果
的に凝集現象を引き起こすため、シグナル発生物質とし
ての機能に対し高分子濃度の最適化が要求される。ポリ
アニリンの場合0.01〜1mg/mlの濃度が好ましい。
【００３３】本発明の電気伝導度測定用バイオセンサー
を用いて分析する際、その測定性能は使用された構成成
分の質的水準だけでなく、分析物質が含有された水溶液
の物理的条件(例えば、温度；参考文献：A. de Diego
等，1997, Electrochim. Acta,Vol. 42, 1449-1456; O.
Quadrat 等 1998,Synthetic Met., Vol. 97, 37-42)な
らびに化学的条件(例えば各イオンの濃度：A. de Diego
等, 1997, Electrochim. Acta, Vol.42, 1449-1456；
及び T. A. Sergeyeva 等,1998, Biosens. Bioelectro
n., Vol. 13, 359-369)により影響を受ける。測定時の
温度変化は、探知機に設定された補償機能により、簡単
に補正されるが、イオンの妨害は多様なイオンが、異な
る方法で伝導度に対して影響するために、これを予測し
て補正する作業は非常に難しい。従って、イオン濃度及
びpH等の溶液における化学的組成は、シグナル対雑音比
に対し適切に最適化されなければならない。
【００３４】運搬溶液のpHは、中性酸性度(pH5〜8)を維
持することが好ましく、従って緩衝液を利用することが
できる。運搬溶液として使われる緩衝液としては、例え
ば、燐酸緩衝液、トリス緩衝液等がある。緩衝液の濃度
は雑音を抑制するためにタンパク質溶解に要求される最
小範囲内から選択され、好ましくは5〜50mMの範囲であ
る。
【００３５】しかし、中性酸性度は抗原-抗体反応に対
し最適条件を提供する反面、酸性条件下でドーピング状
態を維持するポリアニリン(参考文献：J.-C. Chiang
等,1986, Synthetic Met., Vol. 13, 193-205; J. Stej
skal 等, 1996, Polymer, Vol.37,367-369)に対しては
適切ではない。従って、バイオ反応とシグナル発生など
の、各々違った最適条件を提供するため抗原-抗体反応
を中性で遂行した後、pHを変化させて酸性状態(例：pH
2)で電気伝導度シグナルを測定する方法を採択し、電気
伝導度アッセイ法の正確度を高めることもできる。
【００３６】一方、分析物質が含まれた試料は、電気伝
導度測定を妨害するイオンが含まれ得る。このような可
能性のある問題点は、シグナル測定部位が2個以上であ
る多重センサーシステム(図4)を選択して解決できる。
一つ或いはそれ以上のセンサーは、分析物質-結合性タ
ンパク質間の反応を利用して単数或いは複数の分析物質
に各々比例したシグナルを測定し、残りのセンサーはイ
オン伝導効果等による雑音を感知して測定されたシグナ
ルから雑音を除外することによって試料による非特異的
妨害効果を除去する。
【００３７】本発明の基本原理は、分析物質-結合性タ
ンパク質間の特定の反応に基づく。抗原-抗体反応は選
択された抗体の特性上、特異性が高く、また典型的な例
として、結合親和力が非常に強く、極めて低い濃度で存
在する分析物質を検出できる敏感性を示す。さらに、本
発明は同様なセンサーシステム内の反応パートナー(即
ち、特異抗体、酵素、受容体等)等を単に交替すること
によって次のような他の分析物質の測定に適用できる一
般性を提供する：食品汚染物質(例：農薬、抗生物質、
食中毒細菌等)と、環境ホルモン(例：除草剤、殺虫剤、
ダイオキシン類)、医療診断用の指標物質として利用さ
れる生化学成分(例：ホルモン、タンパク質、細胞等)。
【００３８】本発明に係るセンサーにおいては、[１]
(1)試料添加用メンブレンパッド、(2)分析物質に対し特
異的に結合する結合性タンパク質が固定化されていて、
少なくとも一対の電極がスクリーンプリントされている
シグナル発生用メンブレンパッド、(3)吸水用メンブレ
ンパッド、および(4)シグナル発生物質である金属コロ
イド粒子と結合性タンパク質との重合体を含む、電気伝
導度メンブレンストリップバイオセンサーであることを
特徴とする。
【００３９】また、本発明に係るセンサーにおいては、
[２]前記試料添加用メンブレンパッドがガラス繊維メン
ブレンパッドであり、シグナル発生用メンブレンパッド
がニトロセルロースメンブレンパッドであり、且つ吸水
用メンブレンパッドがセルロースメンブレンパッドであ
る、上記[1]記載の電気伝導度メンブレンストリップバ
イオセンサーであることを特徴とする。
【００４０】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［３］前記結合性タンパク質が分析物質と特異的に反応
する抗体、酵素、又は受容体である、上記[1]記載の電
気伝導度メンブレンストリップバイオセンサーであるこ
とを特徴とする。
【００４１】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［４］前記金属コロイド粒子が、金コロイド粒子、銀コ
ロイド粒子、又は鉄コロイド粒子である、上記[1]記載
の電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサーであ
ることを特徴とする。
【００４２】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［５］前記電極が絶縁体の上にスクリーンプリントされ
たものである、上記[1]記載の電気伝導度メンブレンス
トリップバイオセンサーであることを特徴とする。
【００４３】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［６］前記電極が白金ペースト、金ペースト、銀ペース
ト、または炭素ペーストでスクリーンプリントされたも
のである、上記[1]記載の電気伝導度メンブレンストリ
ップバイオセンサーであることを特徴とする。
【００４４】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［７］前記電極が交差枝電極である、上記[1]記載の電
気伝導度メンブレンストリップバイオセンサーであるこ
とを特徴とする。
【００４５】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［８］測定装置の前記電極との電気接点がシグナル発生
用メンブレンパッドの側面に位置させた、上記[1]記載
の電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサーであ
ることを特徴とする。
【００４６】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［９］前記電極の陰極と陽極がシグナル発生用メンブレ
ンパッドを中心に各々両側に位置し、サンドウィッチ型
電極を形成する、上記[1]記載の電気伝導度メンブレン
ストリップバイオセンサーであることを特徴とする。
【００４７】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［１０］前記電極の陰極と陽極が少なくとも二対存在
し、少なくとも二種類の異なる分析物質が同時に測定で
きるようになった、上記[9]記載の電気伝導度メンブレ
ンストリップバイオセンサーであることを特徴とする。
【００４８】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［１１］前記の金属コロイド粒子と結合性タンパク質と
の重合体が、金属コロイド粒子の表面に結合性タンパク
質を吸着重合させ、続いて伝導性高分子をそれに結合さ
せた後、金属コロイド粒子の残りの表面にブロッキング
用タンパク質を吸着させることにより製造された、上記
[1]記載の電気伝導度メンブレンストリップバイオセン
サーであることを特徴とする。
【００４９】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［１２］前記伝導性高分子がポリアニリン、ポリピロー
ル、ポリチオフェン、又はポリ（パラフェニレン）であ
り、前記ブロッキング用タンパク質が牛血清アルブミ
ン、カゼインまたはゼラチンである、上記[11]記載の電
気伝導度メンブレンストリップバイオセンサーであるこ
とを特徴とする。
【００５０】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［１３］前記伝導性高分子が、次のうちのいずれか一つ
の方法で処理されたものである、上記[11]記載の電気伝
導度メンブレンストリップバイオセンサーであることを
特徴とする： 1) イオン性塩を用いてドーピングする方法； 2) 1)の方法を適用させることと同時にレドックス分
子を伝導性高分子に化学結合させる方法； 3) 伝導性高分子に対する高分子対イオンを添加する
方法。
【００５１】また、本発明に係るセンサーにおいては、
［１４］前記イオン性塩がLiCl、LiClO4、又はLiBF4で
あり、前記レドックス分子がフェロセン、又はルテニウ
ムであり、前記対イオンがスルホン酸ポリスチレンであ
る、上記[13]記載の電気伝導度メンブレンストリップバ
イオセンサーであることを特徴とする。
【００５２】
【発明の実施の形態】次の実施例及び実験例は、本発明
の内容をより具体的に説明し、その利点および有用性を
提示しようと具体的な例を挙げて記述したものであり、
決して本発明を限定するものではない。本明細書ではモ
デル分析物質として、結合性タンパク質であるヒト血清
アルブミンに特異的な抗体、および金属コロイド粒子と
して金コロイド粒子を用いる腎不全症診断時の尿中のヒ
ト血清アルブミン濃度を分析するのに使用できるメンブ
レンストリップバイオセンサーに対し例示している。
【００５３】実験材料 実施例及び実験例で使用された材料は次の通りである。
ヒト血清アルブミン(HSA)、塩化金(HAuCl4)、グルター
ルアルデヒド、カゼイン(乳汁より抽出されたナトリウ
ム塩の形態)及びCNBr活性化セファロース4Bは、Sigma社
(St.Louis, MO,米国)から購入された。HSAに対し特異的
なヤギ抗血清(IgG断片, 8.3mg/ml)、アニリン、過硫酸
アンモニウム(ammoniumpersulfate, APS)、塩化リチウ
ム(LiCl)、そして銀ペースト(silver paste)は、各々In
ternational Enzymes社(Fallbrook,CA, 米国)、Fluka社
(スイス)、Yakuri Pure Chemicals社(日本)、Junsei Ch
emical社(日本)、そしてソウル化学研究所（韓国）から
供給された。ニトロセルロース(NC)メンブレン(5μm孔
径、ポリエステルバックを含む)は、Millipore社(Bedfo
rd,MA, 米国)から、ガラス繊維メンブレン(G6グレード)
は、Fisher Scientific社(Springfield, NJ, 米国)、そ
してセルロースメンブレン(クオリテイティブ#1および3
MMクロマトグラフィーグレード)は、Whatman社(シンガ
ポール)から購入された。20nmの粒子の大きさの金コロ
イド粒子は、クエン酸ナトリウム方法(参考文献；R.M.
Albrecht等, Immunocytochemistry：A Practical Appro
ach, 1993, Page 151-176,Oxford University Press, O
xford；J. Roth, Techniques inImmunocytochemistry,V
ol. 2, 1983, Page 217-284, Academic Press, London)
により合成された。他の試薬等は全て分析用等級が選択
され、全ての溶液は、0.1μS/cm以下の電気伝導度を有
する脱イオン水を用いて調製した。
【００５４】
【実施例】
実施例1：結合性タンパク質(ヒト血清アルブミンに対す
る抗体)の精製 ヒト血清アルブミン(HSA)に特異的な抗血清を精製する
ため、製造社から提供された過程によりCNBr反応基を有
するセファロース4Bゲル上にHSAを固定化した。製造さ
れたゲルをガラスカラム(11×200mm、ゲル体積7ml)内に
詰め、酸性緩衝液および塩基性緩衝液液で3回巡回反復
して洗浄した。140mMNaClが含まれた10mM燐酸緩衝液(pH
7.4, PBS)をゲルカラムに加え、ゲル膨張に対し平衡に
到達させた後、HSA特異的抗血清3mlをカラムに注入し
た。特異的抗体の分画は、液体クロマトグラフィーシス
テム(Model 210, Isco, Lincoln, NE, 米国)を用いて遂
行した。ゲルに吸着させた後、ゲル上に固定化されたHS
Aと結合していない未反応タンパク質は、15ml/hの速度
で燐酸緩衝液を流すことにより洗浄し、反応したHSA特
異的抗体は0.1Mグリシン(glycine)緩衝液(pH3.0)を用い
て溶出した。特異的抗体を含む画分を収集し、一連の緩
衝液、すなわち、50mM酢酸緩衝液（pH 4.0）、10mM燐酸
緩衝液（pH 6.0）、および続いてPBSで透析した。この
ように精製された抗体溶液は、限外ろ過(Amicon,Beverl
y, MA, 米国)過程で濃縮させた後、ブラッドフォード(B
radford)方法を利用して定量し(M. M. Bradford, 1976,
Anal. Biochem. :Vol.72, Page 248-254)、急速冷凍
後、使用時まで-20℃で保管した。
【００５５】実施例2：抗体の固定化 実施例1にて精製されたHSA抗体を次のような方法でシグ
ナル発生用メンブレンパッドに化学的に固定化させた。
ニトロセルロースメンブレンストリップ(5×20mm)をシ
グナル発生用メンブレンパッドとして用いた。
【００５６】メンブレンを10%(v/v)メタノールで30分間
処理した後、空気中で乾燥させた。その後メンブレンを
0.5%(v/v)グルタールアルデヒド溶液に漬け、表面を1時
間処理した後、脱イオン水で徹底洗浄した。乾燥させた
後、メンブレン上の一定部位に10mM燐酸緩衝液で希釈し
た抗体溶液(0.5mg/ml)2.5μLを添加した後、100%の湿度
を維持できる密閉された箱に入れ、37℃で1時間反応さ
せた。残りの反応基の不活性化及び固体表面のブロッキ
ングは、0.1%(v/v)ツィーン(Tween)-20を含む100mMトリ
ス緩衝液(pH7.6)内で45分間遂行し、再び乾燥させた。
【００５７】 実施例3：金属コロイド粒子-結合性タンパク質重合体の
製造 実施例1にて精製された抗体に発色物質で標識をつける
ため、精製抗体と金コロイド粒子との重合体を形成し
た。(S.H. Paek 等, 1999, Anal. Lett., Vol. 32, 335
-360)。抗体溶液を10mM燐酸緩衝液(pH 7.4)で透析させ
た後、脱イオン水を用いて150μg/mlまで希釈した。こ
の水溶液(800μL)は、pH9.5に調整された金溶液(8ml)と
混ぜ合わせ、30分間反応させた。金粒子の残りの表面
は、5%のカゼインが含まれた0.1Mトリス緩衝液(pH7.6,
5% カゼイン−トリス)1mlを加えて、30分間ブロッキン
グさせた。反応液を遠心分離した後、上層液は除去し、
0.5%のカゼイン-トリスを再び添加した。遠心分離して
金粒子を再び沈殿させ、上層液を除去した。最終体積
は、0.5%のカゼイン-トリスを添加して0.4mlに調整し、
形成された重合体は使用時まで4℃で保管した。
【００５８】 実施例4〜6：伝導性高分子を導入させた金属コロイド粒
子-結合性タンパク質重合体の製造 先ず、好ましい電気化学的シグナル発生源を製造するた
めに、導入する伝導性高分子のポリアニリンを合成し
た。過硫酸アンモニウム(APS)の存在下で、アニリン単
量体を酸化させる方法を利用した(X.-L. Wei 等, 1996,
JACS, Vol. 118,2545〜2555；X. Wei 等, 1995, Synt
h. Met.,Vol. 74, 123〜125)。1M HCl溶液で希釈された
アニリン(0.4M)と、APS(0.2mM)を混ぜ合わせた後、室温
で30分間反応させて高分子物質を生成させた後ろ過し
た。このろ過物にフェニルヒドラジン(phenylhydrazin
e)溶液5ml/gを加えて還元させた後、亜硫酸成分が含ま
れた硫酸(fumingsulfonic acid)20ml/gを添加し、5℃で
1時間硫化反応させることによって硫化ポリアニリン(su
lfonated polyaniline)を合成した、この産物を0℃で沈
殿させた後、ろ過して順次的に乾燥し所望の濃度に溶解
させた。
【００５９】実施例3と同様条件で金コロイド-抗体重合
体を形成させた後、異なる濃度（0.01、0.1及び1mg/m
l）の10mM燐酸緩衝液(pH7.4)で希釈したポリアニリン水
溶液を金コロイド-抗体重合体に添加して、30分間反応
させた。金コロイド-抗体重合体の最終溶液にLiCl(0.00
1〜0.1%(w/v)；0.0236〜23.6mM)を添加したことを除け
ば、ブロッキングと重合体の回収過程は実施例3で提示
された重合体製造法と同じだった。このようにして伝導
性高分子ポリアニリンを0.01、0.1及び1mg/ml濃度で各
々導入させた金属コロイド粒子-結合性タンパク質重合
体を製造した(実施例4、5及び6)。
【００６０】 実施例7：抗体が固定化された厚膜電極(thick-filmelec
trode)の製造 電気化学センサー型バイオストリップを考案するために
ニトロセルロースメンブレンを支持体として使用する厚
膜電極を次のような方法で製造した。
【００６１】プラスチックで裏面がコーティングされた
ニトロセルロースメンブレン(5×20mm)を、脱イオン水
で3回洗浄した後、空気中で乾燥した。準備されたメン
ブレン上に、2電極系構造でパターン化されたスクリー
ンを通してプリント方法で銀ペーストで覆った後、3分
間100℃で乾燥させ、このような同一過程を3回反復遂行
し、メンブレンストリップ電極(交差枝構造の2×3デジ
ットパターン、センサー部位4×5mm2；図2a)を製造し
た。ニトロセルロースメンブレンの交差枝電極部位に実
施例1で精製した抗体を、実施例2のような化学的方法に
より固定化した。
【００６２】電極上の電気接触部位を設けるために、銀
ペーストをプラスチック(一般複写機用PP-3300、5×2.5
mm2)上にトゥーフィンガー(two-finger)構造でスクリー
ンプリントした後、3分間100℃で乾燥した。このプラス
チック接点部位を、抗体が固定化されたメンブレン電極
上段に両面テープを用いて積載させた後、その両部品の
間に銀ペーストを加えて電気的に連結させることによっ
て厚膜電極を完成させた。
【００６３】 実施例8：電気伝導度メンブレンバイオセンサーシステ
ムの構成I 本発明に係る電気伝導度メンブレンバイオセンサーシス
テムを構築した。その構造は図2aに示した通りで、試料
添加用メンブレンパッド(10)としては、0.1%(v/v)ツィ
ーン-20で処理されたガラス繊維メンブレン(5×25mm)
を、シグナル発生用メンブレンパッド(20)としては、ニ
トロセルロースメンブレン(5×20mm)を、吸水用メンブ
レンパッド(30)としては、セルロースメンブレン(5×35
mm)を用いた。前記シグナル発生用メンブレンパッドに
は、実施例7のような方法で電極をスクリーンプリント
させ、実施例2のような方法で抗体を両電極の間に固定
化させた。
【００６４】実施例3にて製造した金-抗体重合体溶液5
μLを、ガラス繊維メンブレンの下段から15mmの部位に
添加した後、室温で乾燥した。各メンブレンストリップ
は部分的に重ねて構成し、両面テープを用いてプラスチ
ック板に接着させた。
【００６５】 実施例9〜11：電気伝導度メンブレンバイオセンサーシ
ステムの構成II 実施例3の重合体の代わりに、実施例4、5及び6にて製造
したポリアニリン導入重合体を各々使用することを除い
ては、実施例8と同じ方法で本発明に係る電気伝導度メ
ンブレンバイオセンサーシステムを構築した。
【００６６】 比較実施例1：光学分析用メンブレンストリップ免疫セ
ンサーシステムの構成 比較例として、肉眼判別や吸光度を測定する既存のメン
ブレンクロマトグラフィー分析システムを構築した。そ
の構造は、図1に示した通りであり、試料添加用メンブ
レンパッド(10)としては、0.1%(v/v)ツィーン-20で処理
されたガラス繊維メンブレン(5×25mm)を、シグナル発
生用メンブレンパッド(20)としては、ニトロセルロース
メンブレン(5×20mm)を、吸水用メンブレンパッド(30)
としては、セルロースメンブレン(5×35mm)を利用して
実施例2のような方法で抗体をシグナル発生用メンブレ
ンパッドに固定化させた。実施例3にて製造した金-抗体
重合溶液5μLを、ガラス繊維メンブレンの下段から15mm
の部位に添加した後、室温で乾燥した。各メンブレンス
トリップ等は部分的に重ねて構成し、両面テープを用い
てプラスチック板に接着させた。
【００６７】 実験例1：電気化学測定装置を用いた分析I：ポリアニリ
ンの効果実験 本発明の電気化学分析システムのヒト血清アルブミン(H
SA)標準濃度に対する応答を得るため、次のような実験
を実施した(図1参照)。
【００６８】0.01%(v/v)ツィーン-20が含まれた10mMト
リス緩衝液で希釈することにより10μg/mlのHSA標準溶
液を製造した後、各濃度別に150μLずつマイクロウェル
内に分注した。実施例8(ポリアニリン導入濃度0mg/m
l)、実施例9(ポリアニリン導入濃度0.01mg/ml)、実施例
10(ポリアニリン導入濃度0.1mg/ml)及び実施例11(ポリ
アニリン導入濃度1mg/ml)で製造されたバイオストリッ
プセンサーシステムを、各μウェル内に垂直に浸して立
てた。ストリップ下段から水溶液を、約6分間吸水させ
た後、電気伝導度測定法を用いて濃度応答のデータを求
めた。測定を行う前に伝導度メーター(Model 150, Orio
n Corp., Beverly, MA, 米国)を、ニトロセルロースメ
ンブレン電極と同一条件下にてスクリーンプリントされ
たプラスチック電極を用いて補正した。メーターは、製
造されたプラスチック電極を0.01MKCl標準溶液(伝導
度：1413μS/cm、溶解された総量をNaClを基準に換算し
た濃度：692ppm)に浸して機器により1次自動補正して完
全に洗浄した後、電極を再び脱イオン水に浸して伝導度
値が0になるように2次補正した。このような条件下で電
極尚数(cell constant)は、0.475〜1cm-1範囲に分布さ
れていることが示され、このように補正されたメーター
を用いて分析物質濃度に伴うバイオストリップセンサー
の応答を伝導度変化により測定した。
【００６９】図6に示されたように、金粒子に重合され
たポリアニリン濃度が増加するごとに伝導度シグナル
は、その濃度に比例して増加したが、1mg/ml以上の濃度
ではむしろ減少する傾向を見せた。特に高濃度範囲でポ
リアニオン溶液に添加する際、金粒子溶液の色が赤色か
ら紫色に変化し、これはポリアニリン分子が金粒子等を
交差結合させることによって、凝集現象が招かれたため
である。反面に背景シグナル、即ち雑音は使用された伝
導性高分子濃度に関係なく一定なものと示された。結果
的に雑音に対するシグナル強度の比は、ポリアニリン濃
度0.1mg/ml(実施例10)で最大値に到達した。
【００７０】 実験例2：電気化学測定装置を用いた分析II：測定時間
の効果実験 実施例10にて製造した電気伝導度メンブレンバイオセン
サーに対し、実験例1と同じ方法で分析した。ここで、
免疫反応後の最適な電気シグナル測定時間を確認しよう
と、電圧を負荷した後の初期の一時的な電気伝導度の変
化を時間ごとに記録した。その結果を図7に示す。
【００７１】両電極間に電圧を加えると、電極表面で電
気化学反応が初期に発生し、捕獲された重合体(即ち、
金)の密度により数秒から約1分間、電気伝導度の不安定
状態が続いた。しかし、そのシグナルは直ぐに正常状態
になり、電気伝導度の値が測定装置から出力された。そ
の後伝導度数値は徐々に減少したが、このような現象は
水溶液(分離溶液)に浸ったメンブレンストリップが空気
中で乾燥されることにより起こるものと判断される(参
考文献：J.-C.Chiang 等, 1986, Synthetic Met., Vol.
13,193-205)。従って実際の測定時には、電圧を負荷し
た後30〜60秒程度、測定して一定値を読むことが好まし
いと判断される。
【００７２】 実験例3：電気化学測定装置を用いた分析III：電気化学
分析性能評価 実施例10にて製造した電気伝導度メンブレンバイオセン
サーのHSA標準溶液に対する分析能を、比較実施例1で製
造した光学測定用メンブレン免疫センサーのHSA標準溶
液に対する分析能と比較して評価した。
【００７３】HSA標準溶液は、0.01%(v/v)ツィーン-20が
含まれた10mMトリス緩衝液で、一連の濃度、すなわち0.
01、0.1、1、2.5、5、10及び50μg/mlに希釈した後、各
濃度別に150μLずつマイクロウェル内に分注し調製し
た。
【００７４】実施例10にて製造した電気伝導度メンブレ
ンバイオセンサーを用いた測定方法は、一定値を、測定
時間を電圧負荷後60秒程度にして測定したことを除いて
は実験例1と同一にした。
【００７５】比較実施例1にて製造した光学測定用メン
ブレン免疫センサーを用いた測定では、HSA標準溶液に
対する濃度応答で発生された発色シグナルをスキャン光
学測定方法で測定した。先ず0.01%(v/v)ツィーン-20を
含む10mMトリス溶液を用いてHSA標準溶液を製造し、各
濃度別に150μLずつ個別のマイクロウェルに分注した。
比較実施例1にて製造されたメンブレンストリップ免疫
センサーの下端を、各マイクロウェル内に垂直に置いて
浸した後、水溶液を約6分にわたり毛細管現象によりス
トリップ内部に吸水させた。抗体が固定化された領域か
ら発色されたシグナルを定量的に決定するためにスキャ
ナー(HP ScanJet 6100C, Hewlett-Packard, Palo Alto,
CA, 米国)を利用した。発色されたストリップをスキャ
ンした後、コンピューターに内蔵されたスキャナーボー
ドとソフトウェア(Biomed Instruments, 米国)を利用し
て、メンブレンイメージを捕捉した。捕捉されたイメー
ジ上の発色部分は、イメージ分析プログラム(Multianal
yst version 1.1, Bio-Rad Laboratories, Hercules, C
A, 米国)を用いて発色部分が全て含まれるように選択し
た後、発色輝度に比例する積分値である吸光度に変換さ
せた。
【００７６】その結果を図6に示す。先ず図8aは、測定
された電気伝導度及び光学測定法に基づく濃度応答を示
している。２つの異なるシグナル、すなわち電気伝導度
および吸光度のいずれもフック効果(分析物質高濃度範
囲で、シグナルが減少する効果：S.A. Fernando, 1992,
J. Immunol. Meth., Vol. 151, 67-86)が現れる前、分
析物質濃度範囲でその濃度に正比例し、共に増加すると
示されたが、濃度応答曲線の形態において大きく異なっ
た。フック領域を除いた半ログ図式(semi-logplot；参
考文献：J. H. Peterman, Immunochemistry of Solid-P
hase Immunoassay, 1991,Page 47-65, CRC Press, Lond
on)にて光学シグナルは、既存の応答曲線形態であるS字
形(sigmoidal)曲線を見せた反面、電気化学シグナルは
特異な指数曲線のパターンを示した。
【００７７】また、互いに異なるシグナル発生体系の性
能を比較するため、濃度応答シグナル等をシグナル対雑
音比に変換して各分析物質濃度に対し図示した(図8b)。
電気伝導度シグナルから求めたシグナル/雑音比数値
は、光学測定法から求めたものと比較して、分析物質濃
度全範囲にわたり高かっただけでなく、使われた実験条
件化で最大2.3倍まで増加した。
【００７８】この結果から、電気化学シグナル測定時の
指数形態の濃度応答が更にはっきりと示しただけでな
く、シグナル増幅効果も確認された。
【００７９】
【発明の効果】本発明は、電気伝導度メンブレンストリ
ップバイオセンサーは発色を吸光度に変換する既存の光
学技術と比較して、シグナル対雑音比として代表される
測定敏感度を著しく増加させただけでなく、その電気伝
導度シグナルを測定するため、一般的に普及された低価
格台の伝導度メーターを用いることができる利点を提供
する。付随的に、定量分析後に発色されたメンブレンス
トリップは、臨床資料として長期的に保管できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 免疫クロマトグラフィー分析原理に基いた従
来のメンブレンストリップ免疫分析システム及び、これ
を用いた分析物質の定性分析原理を示した模式図であ
る。
【図２】 多様な構造でスクリーンプリントされた厚膜
電極を有する本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーを示した模式図の例である。
【図３】 多様な構造でスクリーンプリントされた厚膜
電極を有する本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーを示した模式図の例である。一対の電極
を別に取り外してメンブレンを中心に各々両側に置き、
サンドウィッチ型に形成した。
【図４】 多様な構造でスクリーンプリントされた厚膜
電極を有する本発明の電気伝導度メンブレンストリップ
バイオセンサーを示した模式図の例である。図3のよう
な多くのサンドウィッチ型電極を同時にいくつか配置し
た。
【図５】 金属コロイド表面に吸着させた伝導性高分子
の電子伝達促進作用メカニズムに関する概略図である。
【図６】 本発明に係る電気伝導度メンブレンストリッ
プバイオセンサーにおいて、伝導性高分子として用いら
れたポリアニリンの濃度(0mg/ml、実施例8；0.01mg/m
l、実施例9；0.1mg/ml、実施例10；及び1mg/ml、実施例
11)による電気伝導度及びそのシグナル/雑音比の変化を
示したグラフである。
【図７】 本発明に係る電気伝導度メンブレンストリッ
プバイオセンサー(実施例10)を用いた分析で結合性タン
パク質-分析物質間の反応後のシグナル測定時間に対す
る電気伝導度値の変化を示したグラフである。
【図８】 実施例10にて製造した電気伝導度メンブレン
ストリップバイオセンサーと、比較実施例1にて製造し
た既存の光学分析用メンブレンストリップ免疫センサー
を用いて、ヒト血清アルブミンの標準溶液に対して各々
測定したシグナル分析値(図8a)とその値から算出される
シグナル/雑音比(図8b)の濃度について図示したグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５１ 特許法第30条第１項適用申請有り Ｃｏｎｄｕｃｔｉｍ ｅｔｒｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｉｐ ｉｍｍｕ ｎｏｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ −ｂｏｕｎｄ ｇｏｌｄ ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｓ ｓ ｉｇｎａｌ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ，ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ Ｓ ＆ ＢＩＯＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ，Ｆｅｂｒｕａ ｒｙ 2000 Ｖｏｌ 14，Ｎｏ．12，Ｐ907−915 に発 表 (56)参考文献 特開2000−65835（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−352128（ＪＰ，Ａ) 特開2000−46830（ＪＰ，Ａ) 特開2000−19175（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/12 G01N 27/327 G01N 33/48 - 33/98

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (1)試料添加用メンブレンパッド、(2)
    分析物質に対し特異的に結合する結合性タンパク質が固
    定化されていて、少なくとも一対の電極がそのタンパク
    質層上にスクリーンプリントされているシグナル発生用
    メンブレンパッド、(3)吸水用メンブレンパッド、そし
    て、(4)シグナル発生物質である金属コロイド粒子と結
    合性タンパク質との重合体を含み、パッド(2)の片面の
    両端に長さで(1)と(3)が部分的に重ねて固定され、重合
    体(4)が試料添加用メンブレン(1)上の一定地域に前もっ
    て乾燥状態で添加したり、分析直前に添加して使用でき
    るように、別の容器に保管されている電気伝導度メンブ
    レンストリップバイオセンサー。
  2. 【請求項２】 前記試料添加用メンブレンパッドがガ
    ラス繊維メンブレンパッドであり、シグナル発生用メン
    ブレンパッドがニトロセルロースメンブレンパッドであ
    り、且つ吸水用メンブレンパッドがセルロースメンブレ
    ンパッドであることを特徴とする、請求項1記載の電気
    伝導度メンブレンストリップバイオセンサー。
  3. 【請求項３】 前記結合性タンパク質が分析物質と特
    異的に反応する抗体、酵素、又は受容体であることを特
    徴とする、請求項1記載の電気伝導度メンブレンストリ
    ップバイオセンサー。
  4. 【請求項４】 前記金属コロイド粒子が、金コロイド
    粒子、銀コロイド粒子、又は鉄コロイド粒子であること
    を特徴とする、請求項1記載の電気伝導度メンブレンス
    トリップバイオセンサー。
  5. 【請求項５】 前記電極が絶縁体の上にスクリーンプ
    リントされたものであることを特徴とする、請求項1記
    載の電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサー。
  6. 【請求項６】 前記電極が白金ペースト、金ペース
    ト、銀ペースト、または炭素ペーストでスクリーンプリ
    ントされたものであることを特徴とする、請求項1記載
    の電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサー。
  7. 【請求項７】 前記電極が交差枝電極であることを特
    徴とする、請求項1記載の電気伝導度メンブレンストリ
    ップバイオセンサー。
  8. 【請求項８】 測定装置の前記電極との電気接点がシ
    グナル発生用メンブレンパッドの側面に位置させたこと
    を特徴とする、請求項1記載の電気伝導度メンブレンス
    トリップバイオセンサー。
  9. 【請求項９】 前記電極の陰極と陽極がシグナル発生
    用メンブレンパッドを中心に各々両側に位置し、サンド
    ウィッチ型電極を形成することを特徴とする、請求項1
    記載の電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサ
    ー。
  10. 【請求項１０】 前記電極の陰極と陽極が少なくとも
    二対存在し、少なくとも二種類の異なる分析物質が同時
    に測定できるようになったことを特徴とする、請求項9
    記載の電気伝導度メンブレンストリップバイオセンサ
    ー。
  11. 【請求項１１】 前記の金属コロイド粒子と結合性タ
    ンパク質との重合体が、金属コロイド粒子の表面に結合
    性タンパク質を吸着重合させ、続いて伝導性高分子をそ
    れに結合させた後、金属コロイド粒子の残りの表面にブ
    ロッキング用タンパク質を吸着させることにより製造さ
    れたことを特徴とする、請求項1記載の電気伝導度メン
    ブレンストリップバイオセンサー。
  12. 【請求項１２】 前記伝導性高分子がポリアニリン、
    ポリピロール、ポリチオフェン、又はポリ（パラフェニ
    レン）であり、前記ブロッキング用タンパク質が牛血清
    アルブミン、カゼインまたはゼラチンであることを特徴
    とする、請求項11記載の電気伝導度メンブレンストリッ
    プバイオセンサー。
  13. 【請求項１３】 前記伝導性高分子が、次のうちのい
    ずれか一つの方法で処理されたものであることを特徴と
    する、請求項11記載の電気伝導度メンブレンストリップ
    バイオセンサー： 1) イオン性塩を用いてドーピングする方法； 2) 1)の方法を適用させることと同時にレドックス分
    子を伝導性高分子に化学結合させる方法； 3) 伝導性高分子に対する高分子対イオンを添加する
    方法。
  14. 【請求項１４】 前記イオン性塩がLiCl、LiClO4、又
    はLiBF4であり、前記レドックス分子がフェロセン、又
    はルテニウムであり、前記対イオンがスルホン酸ポリス
    チレンであることを特徴とする、請求項13記載の電気伝
    導度メンブレンストリップバイオセンサー。
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