KR100500774B1 - 뇨 알브민 측정용 바코드 표시방식의 면역분석장치 및 그분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당뇨병에 의해 유발될 수 있는 신장질환을 진단하기 위해 소변 내에 포함된 알브민을 측정하는 면역분석 시스템에 관한 것이다.

개발된 시스템은 다른 부가적인 수행이 필요 없으며(1단계 측정), 분석시간이 짧은(5분 이내) 면역 크로마토그래피 방식의 시스템을 사용하고 있다.

더욱이 본 시스템은 분석물질 농도에 비례하여 '사다리 바(ladder bar)수'가 변화되도록 즉, 각 농도범위가 바코드 형태로 나타나도록 고안되어 있다.

이렇게 개발된 시스템은 하단으로부터 비오틴이 결합된 항체-골드 중합체 그리고 비오틴이 결합된 항체 중합체를 축적시켜 놓은 유리섬유 멤브레인, 분석물질을 멤브레인 표면상에 화학결합에 의해 고정화해 놓은 니트로셀룰로우즈 멤브레인과 사다리수 형태로 스트랩트아비딘을 고정화시켜 놓은 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 그리고 과량의 수용액을 흡수할 수 있는 셀룰로우즈 멤브레인으로 구성되어있다.

Description

뇨 알브민 측정용 바코드 표시방식의 면역분석장치 및 그 분석방법{An apparatus for semi-quantitative bar-code version of immuno-chromatographic assay system for urinary albumin and its method}

본 발명은 당뇨병에 의해 유발될 수 있는 합병증인 신부전증을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 바코드 방식의 면역분석 측정장치 및 그 분석방법에 관한 것이다.

혈청알브민의 소변내 배출량이 24시간 당 30-300㎎일 경우 microalbuminuria 증세로 판정하며, 이러한 증세는 당뇨병 합병증에 의한 신부전증 발생의 조기신호이고, 또한 그 질병의 진행정도를 나타내는 지표로서 알려져 있다.

따라서 본 발명에서는 알브민 농도에 비례하여 "사다리바(ladder bar)"를 변화시킴으로써 단지 바코드 표시에 의해 뇨 알브민 농도를 직접 결정할 수 있도록 하였을 뿐만 아니라 기존 제품과 비교하여 더 확장된 영역의 농도를 측정하는 면역진단키트를 개발하였다.

주지하는 바와 같이, 현대사회의 급격한 발전과 식생활의 변화에 의해 당뇨병은 성인병중 높은 비중을 차지할 정도로 보편적인 질병이 되어가고 있으며, 현재 우리나라도 대략 전체인구의 5%인 150만 정도의 사람들이 가지고있는 것으로 보고되고 있다.「참고문헌 : 다네세도미오 외/고진숙,당뇨병,예음사,1995」

혈당을 적절히 조절해 주는 것은 췌장에서 생산되는 인슐린이라는 호르몬인데 이것이 부족하거나 작용에 이상이 있게되면 당뇨병의 원인이 된다.

당뇨병 환자는 식사를 통하여 섭취된 당분(포도당)이 간장이나 근육 또는 지방세포 등에 적절히 저장되지 못하고 혈액 중에 존재한다.

과다한 양의 혈당은 신사구체를 손상시켜 당분이 그대로 통과하여 오줌으로 배출되므로 당뇨병 환자는 비정상적인 기아상태에 있게되어 아무리 많은 양의 식사를 하여도 충분한 영양을 얻을 수 없는 것이 특징이다.

당뇨병이 무서운 것은 당뇨병 자체가 아니라 당뇨병으로 인해 합병증이 발생하고 그 병이 잘 낮지 않는 것으로 중풍, 고혈압, 동맥경화, 협심증, 심근경색, 안구질환, 신장병, 뇨독증, 말초신경증, 자율신경장애, 손과 발의 병, 고혈당 혼수, 저혈당성 혼수 등을 들 수 있다.

당뇨병 합병증으로서 가장 흔한 질병으로서 당뇨병 신증(腎證)이 있는데 이것은 신장질환의 33%를 차지하고 있으며 혈중에 당이 있게되면 사구체, 신동맥 등에 경화가 생겨서 사구체, 기저막의 증식, 사구체 투과성의 증가, fibrin침착증가, 신조직의 섬유화 등으로 급성신염, 만성신염, 신우신염, 신성 고혈압, 뇨독증 등이 나타나는 것을 말한다.「참고문헌: The Diabetes Control and Complications Research Group.kidney.Int 47,1703-1720,1995」

신장은 생명을 유지하기 위하여 영양소를 섭취하여 에너지로 이용하고 남은 분해산물의 배설, 체액균형, 혈압조절 및 조혈기능 등의 중요한 역할을 수행하며 그 기능을 소실하게 되면 2∼3주 내에 사망에 이르게되는 인체내의 중요한 기관이다.

따라서 신장의 이상을 발생초기에 진단을 하는 것은 매우 중요하며 질병 진행과정을 예측하는 것 또한 중요한 일로 여겨지고 있다.

소변 내 알브민의 농도가 정상치 이상으로 증가하는 현상을 마이크로알브민리아(microalbuminurisa)라고 하며, 이것은 당뇨병의 가장 중요한 합병증의 하나인 당뇨병 신증 발생의 초기 이상징후일 뿐만이 아니라 그 증상의 진행을 예고해주는 것으로 보고되고 있다.「참고문헌: The Diabetes Control and Complications Research Group.kidney.Int 47,1703-1720,1995; K. M. Ward. Anal. Chem. 67,383R-391R,1995; C. E. Mogensen. New Engl. J.Med. 310,356-360,1984; C. E. Mogensen. New Engl. J. Med. 311, 89-93, 1984」

더욱이 microalbuminuria는 고혈압의 합병증세로 나타날 수 있는 심장 이상에 대한 조기진단지표로도 보고되고있다.「참고문헌: C. E. Mogensen, ed. "Microalbuminuria, a marker for organ damage", Science Press,London,1993; J. S. Yudkin, C. A. Jackson, and R. D. Forrest. Lancet. ii,530-533, 1998」

이와 같이 합병증은 일반적인 분석물질의 존재 유무만을 결정하는 정성분석으로는 진단될 수 없는 것이다.

이는 정상인이라 하더라도 어느 정도의 양을 가지고 있으며 나이, 성별, 상태에 따라서 분비 양이 틀려지기 때문이다.

따라서 정량분석 또는 측정농도 범위를 포함하는 반정량 분석이 필요하며 이 때문에 측정장치나 대조표와 같은 다른 보조장치를 사용해서 측정을 하고있는 실정이다.「참고문헌: J. P. Michael, A. L. John, E. L. Karl, K. S. Zak, H. W. Frank Jr., Lawrence Phillips. J Clin. Lab. Anal. 12, 280-284,1998.; W. L. Roberts,C. B. Cook, D. L. Gordon, M. L. Moore, S. Moore, W. D. Scheer. Clinica Chimica Acta. 273,21-33, 1998」

뇨 알브민 측정에 사용될 수 있는 정량분석법으로는 방사선 동위원소를 이용한 면역분석법(Radioimmunoassay, RIA)과 효소를 이용하는 면역학적 분석법(Enzyme immunosorbent assay, ELISA)등이 있다. 「참고문헌; E. Engvall and P. Perlmann. J. Immunol. 109, 129-137, 1972」

그러나 이러한 방법은 항원-항체 반응성분과 미반응성분 간의 분리단계를 거쳐야 하기 때문에 전문인이 아닌 일반인들이 사용하기에 너무 복잡할 뿐만이 아니라 수행시간이 길고 신호측정을 위해 고가의 기기를 요구하는 단점을 가지고 있다.

다른 분석법으로는 전문인이 아닌 일반인이 간편하게 사용할 수 있도록 하기 위해 면역 크로마토 그래피 기술을 사용한 딥스틱(dip stick)형 반정량 검사방법으로 Boehringer Mannhiem사에서 제작한 Micral-Test가 있다.「참고문헌: R. E. Gilbert, A. Akdeniz, and G. Jerums. Diabetes Research and Clinical Practice.35, 57-60,1997.; L. M. Gerber, K. Johnston, and M. H. Alderman. AJH, 11, 1321-1327, 1998」

이 방법은 분석시간이 1분으로 짧다는 장점을 가지고 있기는 하지만 pH시험지와 같은 표준 색상 대조표와 비교하여 농도범위를 결정해야 한다는 불편을 가지고 있다.

그러나 이러한 측정방법은 사용자의 주관적인 판단에 의존하기 때문에 민감도가 떨어지게 되며, 측정범위 또한 뇨 알브민 농도측정범위(2-200 mg/L)중 일부(최대 100 ㎎/L)만을 측정하고 있다.

뇨 알브민 배출농도의 정상치와 증가치의 한계구분은 일반적으로 Microalbuminuria 증상으로 정의한다.「참고문헌; D. J. F. Rowe, A. Dawnay, and G. F. Watts. Ann. Clin. Biochem. 27,297-312,1990」

따라서 신증진단시 관심 있는 뇨 알브민 측정범위는 대략 20-200 mg/L 정도일 것으로 예측된다.「참고문헌 : K. M. Ward. Anal. Chem.67, 383R-391R, 1995」

본 발명은 상기에서 지적되고있는 제반의 필요성을 충족시키기 위해 제안된 것으로서, 본 발명의 목적은 별도의 측정장치나 대조표를 필요로 하지 않고 쉽고 간편하며 신증진단 및 병의 진도를 점검할 수 있는 뇨 알브민 측정용 바코드 방식의 면역분석 측정장치 및 그 분석방법을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 전체적인 구성은 분석물질(예: 알브민 등)에 대한 반정량 측정을 위한 바코드(bar code)방식의 면역분석 장치에 있어서,

분석물질을 포함한 시료를 흡수하여 공급해주는 시료흡수패드와; 상기 시료흡수패드에서 흡수된 시료 내에 포함된 분석물질에 특이한 항체중합체를 포함하는 시약패드와; 상기 시약패드에 포함된 항체중합체 중 분석물질과 반응하지 못한 미반응 중합체를 제거하는 미반응성분 제거패드(항원패드)와; 상기 미반응성분 제거패드를 통과한 분석물질과 중합체간 면역결합체를 포획하는 기능성 성분을 사다리모양(bar code 방식)으로 고정화 시켜놓은 신호패드와; 상기 패드들에 일련된 시료운반을 위해 용액의 지속적인 흐름을 유도하는 흡수패드로 구성된 것이다.

이를 이용한 분석방법은 분석물질에 특이하게 반응하는 항체에 포획기능을 하는 비오틴 또는 스트랩트아비딘과 같은 물질을 결합시킨 중합체(포획항체)와 분석물질의 다른 부위를 인지하는 항체에 신호발생물질을 결합시킨 중합체(탐지항체)를 이용하고, 신호패드 상에는 포획항체를 잡기 위해 반대로 스트랩트아비딘 또는 비오틴을 사다리 모양으로 고정화하여 분석물질 농도에 비례한 발색을 바수로 나타내게 하는 아비딘-비오틴 반응을 이용하게 되는 것이다.

이하 본 발명의 전체적인 구성상태 및 이로부터 얻게되는 특유의 효과 등에 대하여 상세히 설명하면 하기와 같다.

본 발명은 뇨 알브민 측정은 정량분석 또는 농도범위를 포함하는 반정량 분석을 필요로 하므로 이것을 충족시키기 위해 면역 크로마토그래피 기술을 기초로 하는 새로운 기술로서 분석물질 농도를 바코드로 읽을 수 있는 면역스트립을 개발하였다.「참고문헌S.C. Lou, C. Patel, S. Ching, and J. Gordon. Clic. Chem. 39, 619-624, 1993」

본 발명은 결국 발색바의 수를 읽으므로서 분석물질의 농도를 반정량할 수 있게 한 것이다.(도3 참조)

따라서 별도의 측정장치나 대조표를 필요로 하지 않으므로 쉽고 간편하게 신증발생 혹은 병의 진도를 진단할 수 있도록 하였다.

결론적으로 뇨 알브민의 농도를 바코드로 읽어 농도범위를 결정하도록 하여 기존제품에 잠재적인 주관적 판단에 의한 오류를 예방하였으며 또한 기존보다 측정범위가 확장된 면역분석 시스템을 개발하였다.「스트랩트아비딘,SA)- 비오틴 포획시스템 도입」

또한 분석물질 농도에 비례하여 재현성 있는 바코드 신호를 발생시키기 위해 SA-비오틴 포획반응(항원-항체 반응과 비교하여 친화력이 전형적으로 1000배 이상 더 높음)을 도입하였다.「참고문헌 : M. Wilchek and E. A. Bayer.(Eds) Methods in Enzymology. 184, 1990」

이 SA-비오틴 반응의 특징으로서 부착 반응된 결합체는 극한조건(극한 pH, 온도, 유기용매 등)이 아니면 쉽게 탈착되지 않으므로 항원-항체 반응보다 훨씬 안정적이다.

SA는 Streptomyces avidinii로부터 생산되어지며 그 분자 상에 4개의 비오틴 부착자리를 갖고있어서 멤브레인 상에 고정화되어도 비오틴 분자와 반응할 수 있는 자리는 항상 열려 있게 되므로 이 반응 시스템을 크로마토그래피 분석시스템에 도입하는 것이 가능하다.

비오틴 분자도 formaldehyde와 같은 유기용매 혹은 특정 산화제의 존재 하에서 불안정한 것을 제외하면 구조적으로 매우 안정하다.

면역 크로마토그래피 분석기술에 이용하기 위해서는 비오틴 분자가 작아서 그 자체로 멤브레인에 고정화하기 어려우므로 일반적으로 우혈청알브민(bovine serum albumin, BSA)과 같은 단백질에 화학적으로 중합시켜 고정화하게 된다.

SA와 비오틴 두 반응성분중 어느 물질이 고정화되는냐는 분석대상물질의 측정효율에 따라 변화될 수 있다.

이렇게 SA와 비오틴 분자중 하나는 멤브레인 상에 고정화시키고 다른 하나는 분석물질 특이항체와 중합시킴으로써 분석물질의 포획반응에 이용할 수 있는 것이다.

SA-비오틴 포획반응이 도입된 면역 크로마토그래피 분석방법에서는 일반적으로 한 분석물질 분자에 동시에 부착 반응할 수 있는 두 종류의 단일클론 항체를 필요로 한다.

한 종류는 SA 혹은 비오틴과 화학 중합시켜 SA-비오틴 반응을 이용하여 분석물질을 포획하기 위한 것이고, 다른 하나는 골드콜로이드와 같은 발색계통의 신호발생원과 중합시킴으로써 포획된 분석물질 분자를 탐지하기 위한 것이다.

두 종류의 다른 단일클론 항체는 본 발명의 실시 예에서 제시된 바와 같이, 기능에 변화를 주지 않고 인간 알브민에 특이한 한 종류의 복합클론 항체로 대체할 수 있다.

한 예로서 이 복합클론 항체를 신호발생물질인 골드콜로이드와 중합시켰고 (항체-골드중합체) 그리고 또한 SA와 화학적으로 연결시켜 중합체(항체-SA-중합체)를 제조하였다.

그리고 SA의 반응 대상물질인 비오틴은 위에서 설명한 바와 같이 BSA와 중합시켜 니트로셀룰로우즈 멤브레인 상에 도 1과 같이 사다리 바(ladder bar)형태로 고정화하였다.

분석물질 존재시 상기한 두중합체(항체-골드 및 항체-SA중합체)를 분석물질과 중합시키면 도2와 같이, 한 분석물질 분자를 중심으로 양편에 두 항체 중합체가 부착된 샌드위치 결합체가 형성된다.

이렇게 형성된 샌드위치 결합체 내의 SA는 멤블레인에 고정화된 비오틴과 반응함으로서 분석물질 농도에 비례한 신호가 사다리 바의 수로 표현되는 것이다.「참고문헌: S.C. Lou, C. Patel, S. Ching, and J. Gordon. Clin. Chem. 39, 619-624, 1993」

이상에서 설명한 바와 유사하게 항체와 비오틴 간의 중합체가 사용되고 니트로셀롤로우즈 멤브레인 상에 SA를 고정화 시켜 사용할 수도 있다.(도 7 참조)

이와 같이 반응성분의 위치가 상대적으로 다른 두 시스템은 상호 장단점을 지니기 때문에 실험을 통하여 결정해주는 것이 좋다.

바코드 신호를 발생시킬 수 있는 다른 방법으로 부착상수가 비교적 높은 항체를 멤브레인 상에 직접 고정하여 수행할 수도 있다.「참고문헌; J. M. Gosling. Clin. Chem. 36, 1408-1427, 1990.,; D. S. Hage. Anal. Chem. 67, 455R, 1995」

이를 위해 분석물질에 대한 포획항체와 탐지항체-표지물질 중합체를 사용하며 위에서 설명한 바와 같은 반응기 작용에 의해 분석물질 농도변화에 비례한 신호발색을 얻을 수 있다.

그러나 항체의 항원에 대한 친화력이 상대적으로 낮기 때문에 항원-항체 결합을 증가시키기 위해 항체의 고정화 밀도를 증가시키거나 혹은 분석시간의 연장이 요구된다.

이러한 성능은 기존제품과 비교하여 열위에 있게되고 더욱이 근본적으로 친화력이 낮기 때문에 분석물질 농도에 따른 발색바의 수조절이 어렵다.

본 발명의 면역분석 시스템의 구성은 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, SA-비오틴 포획반응을 이용한 바코드 방식의 반정량 분삭시스템의 구성성분은 일반적으로 다음과 같은 5개의 상호 길이로 연결된 기능성 멤브레인 패드들로 구성된다.

맨 하단에는 시료첨가용 유리 멤브레인 패드(1)가 위치하고 그 상단에는 항체 중합체(2a)들을 건조상태로 함유한 시약패드(2)가 배열된다.

이 항체중합체(2a)들은 건조시 부동상태로 존재하지만 수용액과 접촉하면 즉각 용해되어 액상에서 항원-항체반응에 참여한다.

그 위쪽으로는 항원(즉, 분석물질)이 고정화된 미반응성분 제거패드(3)가 위치되며 이 미반응성분 제거패드(3)상에서는 미반응된 항체 중합체(3a)들이 고체상에 포착되어 제거된다.

다시 상부에는 BSA-비오틴 중합체(4a)가 일정간격을 두고 사다리 바 형식으로 고정화된 신호패드(4)가 존재하며 여기서 바코드 발색신호가 발생된다.

최상단에는 위에서 열거한 멤브레인 패드들을 통해 모세관 현상에 의한 유체흐름을 지속화시키고자 용액흡수패드(5)가 위치는 구성으로 이루어진 것이다.

상기 각 멤브레인 패드들을 부분적으로 포개어 플라스틱 필름 위에 배열한 후 양면테이프로 고정하여 반정량 분석용 면역스트립(10)을 완성하게되는 것이다.

상기 면역스트립(10)을 이용한 샌드위치 분석시스템의 측정원리는 도 2에 예시되어 있는 바와 같이 다음 3단계로 이루어진다.

첫째로, 분석물질이 함유되어 있는 시료(예:소변)에 면역스트립의 하단을 담그게 되면 도2(a)와 같이 시료가 유리 멤브레인패드(1)를 통하여 시스템 내부로 흡수되고, 이 수용액은 모세관 현상에 의해 스트립을 따라 위쪽으로 이동하게 되는 것이다.

둘째로 도2(b)와 같이, 수용액이 두 항체 중합체들이 축적되어있는 시약패드(2)에 도달되면 즉시 중합체(2a)들을 용해시키고 액체 상에서 항원-항체 반응에 의해 분석물질을 중심으로 샌드위치 결합체가 생성된다.

셋째로, 수용액이 미반응성분 제거패드(3)에 도달되면 면역반응에 참여하지 못한 항체 중합체(3a)들은 미반응성분 제거패드(3)에 고정화되어있는 항원과 반응하여 포획됨으로서 더 이상 이동할 수 없게 된다.

넷째로, 샌드위치 면역결합체는 미반응성분 제거패드(3)를 지나 상부의 신호패드(4)에 고정화되어있는 BSA-비오틴(4a)이 고정화된 자리에 도달하게 된다.(도 3 c)

상기 결합체는 스트랩트아비딘을 포함하므로 스트랩트아비딘-비오틴 반응에 의해서 고체 표면에 포획이 되고 나머지는 유체흐름에 의해서 제거되는 것이다.

마지막으로 샌드위치 결합체는 신호발생물질인 골드콜로이드를 포함하므로 분석물질의 농도에 비례하여 육안으로 확인할 수 있는 발색신호를 발생하게되는 것이다.

더욱이 신호패드(4)에 BSA-비오틴(4a)이 사다리 바 형태로 고정화되어 있기 때문에 분석물질의 농도에 따라 발색바의 수가 변화하게 된다.

또한 본 발명은 위에서 설명한 SA-비오틴 포획반응을 이용한 샌드위치 면역분석시스템을 이용하여 원하는 농도범위의 뇨 알브민을 반정량할 수 있지만 분석시간이 비교적 오래 걸리고 두 종류의 항체 중합체를 사용하기 때문에 기존제품과 비교하여 시스템이 복잡해지는 단점이 있다.

이러한 단점들을 보완하는 방안으로서, 두 항체 중합체의 각 기능들 즉, 항체-SA 중합체를 이용한 포획기능 그리고 항체-골드 중합체로부터의 신호발생기능을 결합시킨 단일 중합체(다중기능 중합체)를 사용하는 새로운 개념을 도입하였다.

이는 도 5에 도시되어 있는 바와 같이, 다중기능 중합체는 분석물질과 특이하게 반응하는 항체를 중심으로 한쪽에는 포획기능을 담당하고있는 스트랩트아비딘을 다른 한쪽에는 신호발생 기능을 담당하는 골드콜로이드를 화학 중합시킴으로써 동시에 이중기능을 수행할 수 있도록 제작하였다.

이와 같은 새로운 중합체를 이용할 경우 얻는 장점으로서, 첫째로 분석물질과 반응한 다중기능 중합체는 모두 신호발생에 참여하므로 샌드위치 면역 분석 시스템과 비교하여 신호손실이 적으며, 둘째로 반응시작이 간단하여 분석시간이 단축되는 성과를 얻을 수 있다.

이러한 다중기능 중합체는 2가지 기능을 하나로 합쳐 놓은 것이기 때문에 그 중에 어느 한 기능이 제대로 발휘되지 않으면 다중기능 중합체로서 역할을 못하게 되므로 두 기능 모두에 대하여 중합조건을 최적화하는 것이 필요하다.

본 발명의 예시에서는 다중기능 중합체의 최적 조건으로서 스트랩트아비딘을 신호발생패드상에 고정화 하였고 비오틴을 항체-골드 중합체와 결합하였다.

이와 같은 조건은 중합체의 2중 기능을 최대로 유지시킬 뿐만 아니라 중합체 제조시 편리성을 제공하였다.

이와 같이 위에서 설명한 샌드위치 면역분석 시스템에서와 마찬가지로 필요에 따라 비오틴과 스트랩트아비딘의 상대적 위치를 변화시킬 수 있다.

또 본 발명의 경쟁반응을 이용한 바코드 반정량 면역분석은 다중기능 중합체의 도입의 취지로서 분석시스템 제작이 간편해지고 분석시간도 현저히 단축되는 성과를 확인할 수 있었으나, 위에서 언급한 바와 같이 비오틴을 다중기능 중합체와 결합시킨 결과 중합체의 스트랩트아비딘과의 친화력이 매우 증가되어 도 6에서와 같이, 가장 하단의 사다리 바에만 단지 발색신호가 국한되는 것으로 나타났다.

이것은 중합체상에 비오틴 중합률이 높아 발생하는 것으로 스트랩트아비딘과의 친화력이 높아지는 장점에도 불구하고 분석물질 농도와 상관관계를 갖는 바코드를 형성시킬 수 있다.

이와 같은 문제점을 극복하기 위해 새로운 아이디어로서 분석물질 농도에 비례한 발색바수를 변화시키기 위해서 새로운 경쟁 방식의 분석시스템을 설계하였다.

이를 위해 사다리바 형태로 고정화된 스트랩트아비딘 분자에 대한 부착경쟁을 유도하는 방식으로 다른 종류의 비오틴 중합체를 사용하여 다중기능 중합체와 경쟁부착을 할 수 있도록 고안하였다.

어떤 기능을 가진 비오틴 중합체를 경쟁에 도입하느냐에 따라서 분석물질 농도변화에 따른 발색바수의 변화가 다르게 나타날 수 있기 때문에 비오틴 중합체의 선택이 중요하다.

본 발명의 예시에서는 항체-비오틴 중합체를 이용하여 다중기능 중합체와의 부착경쟁을 유도하였으며 그에 따른 발색바수의 변화를 성취하였다.(도7)

이와 같은 예시는 본 발명의 결과를 증명하고자 제시하는 것이지 본 발명의 적용범위를 축소하거나 국한시키는 것은 아니다.

이하 본 발명의 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하면 하기와 같다.

먼자 본 발명에 이용되는 재료 및 구입처는 다음과 같다.

분석물질로 인간혈청 알브민(human serum albumin, HSA)과 그에 대한 복합클론 항체(염소로부터 생산)는 Sigma사(미국)와 Enzyme international사(미국)로부터 각각 구입되었다.

골드 콜로이드(직경 20nm, 0.01%)와 카세인(casein,sodium salt 형태, 우유로부터 추출)그리고 우 혈청 알브민(heat shock 공정에 의한 정제,fraction V; bovine serum albumin,BSA)과 Tween 20, 그리고 Triton X-100은 Sigma사 (미국)로부터 공급되었다.

니트로셀룰로우즈 멤브레인(세공크기 5 ㎛, 12 ㎛)과 유리섬유 멤브레인 그리고 셀룰로우즈 멤브레인(3MM chromatography grade)은 Millipore사 (미국)와 Whatman사(미국)로부터 각각 구입하였다.

스트랩트아비딘(SA),N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDP),succinimidyl,4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(SMCC),dithiotheritol(DTT),그리고 N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)-LC-LC-비오틴은 Pierce사(미국)로부터 구입되었다.

그 외 다른 모든 시약들은 분석용급으로 사용되었다.

.실시예 1 : 항체-골드 콜로이드 중합체 합성

중합체 합성을 위해 표준방법에 따라 다양한 반응용액의 산성도와 항체농도를 시험하였고 결정된 최적 조건하에서 중합체를 제조하였다.

최적산성도의 결정을 위해 골드 콜로이드 용액 8 mL에 적당량의 0.1M Na2CO3용액을 가하여 산성도를 pH 9.0범위로 조절하였다.

인간혈청 알브민 특정항체 용액은 0.2 ㎛ 필터로 여과된 탈이온수를 가하여 150 ㎍/mL 농도로 조절되었다.

이 항체용액 800 ㎕를 골드용액에 분주하였고 30분간 반응시켰다.

그 후 이용액에 10 mM 인삼염 완충용액(pH 7.4)에 용해시켜 제조된 5% 카세인 용액(Casein-PB) 1 mL을 추가한 후 30분간 반응시켰다.

반응액은 원심분리기( 한일 Maga 17R,한국)를 이용하여 15,000 rpm에서 45분간 원심 분리된 후 상등액이 제거되었다.

분리된 침전물에 0.5% 카세인 용액을 가하여 중합체의 최종부피를 0.4 mL로 조절하였고 사용시까지 4℃에서 보관되었다.

.실시예 2 : 항체-SA 중합체 합성

인간혈청 알브민 특이항체와 스트랩트아비딘 간 중합은 두 단백질의 기능성을 최대한 보존하기 위해 크로스 링커(cross-linker)를 사용하는 화학반응에 의해 수행되었다.

항체는 20배 몰 과잉농도의 SMCC와 4℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 과량의 SMCC는 sephadex G-15 젤 크로마토그래피에 의해 제거되었고, 이것을 아래와 같이 활성화된 스트랩트아비딘과 바로 중합 반응시켰다.

스트랩트아비딘의 활성화를 위해 그 단백질은 5 mM EDTA가 함유된 반응용액에 용해되었고 몰농도가 2배 더 높은 SPDP와 상온에서 1시간 동안 반응되었다.

그 분자상에 sulfhydryl 반응기를 생성시키기 위해 DTT(최종 100mM)를 반응혼합액에 첨가하여 37℃에서 2시간동안 다시 반응시켰다.

과량의 시약들은 sephadex G-15 칼럼을 이용하여 제거되었다. 두 종류의 활성화된 반응물질 즉 항체와 스트랩트아비딘은 그몰비가 1:3이 되도록 혼합되었고 4℃에서 밤새 반응되었다.

합성된 항체-SA 중합체의 정제는 디아미노비오틴-아가로즈 젤층(1×2 cm)과 sephdex G-100 젤층(1×10 cm)의 이중으로 구성된 칼럼을 이용하여 수행되었다.

반응혼합물 1 mL을 칼럼내에 주입하였고 시료가 젤내로 모두 스며든 뒤 PBS로 세척하였다.(유속: 1 mL/h).

유출부피가 10 mL에 도달했을 때 50 mM 아세테이트 완충용액(pH 3.5)으로 교체하였고, 그 용액이 5 mL 유출된 후 다시 PBS를 운반용액으로 사용하였다.

각 유출액 내 단백질은 블레드포드(Bradford) 분석방법에 의해 측정되었고 중합체합성 및 정제는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE(7% gel)분석에 의해 확인되었다.

.실시예 3 : 신호발생패드(비오틴 고정화)

신호발생 패드의 재질은 면역 클로마토그래피에서 널리 사용되고있는 니트로셀룰로우즈(NC)멤브레인을 사용하였으며 제조회사와 세공크기에 의해 고정화 효율이 달라지므로 시험을 통하여 최적의 재질을 선택 사용하였다.

선택된 니트로셀룰로우즈 멤브레인(세공크기: 5 ㎛ Milipore)을 사용하여 비오틴을 고정화 하였는데, 고정화 효율을 높이기 위해서 비오틴을 직접 사용하지 않고 우혈청알브민(Bovine serum albumin,BSA)에 비오틴을 중합시킨 BSA-비오틴을 사용하여 고정화하였다.

고정화 방법은 물리흡착방법과 화학적 방법이 있는데 실험을 해본 결과 제작의 편리성과 재현성을 고려해서 결정이 되었다.

멤브레인(0.5×2 cm)에 BSA-비오틴용액(1 mg/mL)을 하단으로부터 0.5 cm 지역에서부터 0.4cm 간격으로 마이크로-디스펜서를 이용하여 1 ㎕/bar를 가한 후에 100% 습도가 유지되는 상자 내에 넣어 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

BSA-비오틴 중합체가 고정화된 스트립은 0.5% 카세인 용액(casein-PB)에 담가 1시간동안 잔여 표면 처리된 후 0.1% Triton X-100을 포함하는 100 mM Tris 완충용액(pH 7.6)으로 3번 세척되었고 실온에서 건조되었다.

.실시예 4 : 미반응성분 제거패드(항원패드)

미반응성분 제거패드의 재질 또한 니트로셀룰우즈 멤브레인을 사용하였으며 신호발생패드와 마찬가지로 실험을 통하여 재질 및 세공크기를 결정하였다.

선택된 니트로셀룰로우즈 멤브레인(세공크기: 5㎛ Milipore)을 사용하여 분석물질을 고정화하는데 여기서는 물리흡착방법보다는 화학처리방법에 의해 고정화되었다.

물리분석의 특성에 따라서 고정화 방법에는 약간의 차이를 보였으나 일반적으로 PLL과 같은 중간 매개물질을 사용하여 고정화하는 것이 효율이 좋았다.

그러나 본 시스템의 분석물질인 알브민 같은 경우에는 중간매개물질을 사용하는 것이 좋지 않은 결과를 보여 화학적 방법으로 사용하여 직접 고정화하였다.

니트로셀룰로우즈 멤브레인(0.5×1.5cm)을 0.5% glutaraldehyde (GA)용액에 담그고 1시간동안 반응시킨 후 DIW로 5번 세척되었고 실온에서 건조하였다.

GA가 처리된 멤브레인에 분석물질을 1 mg/mL 농도로 만들어 피펫을 사용하여 7.5L/cm를 가하였다.

그 후에 100% 습도가 유지되는 상자 내에 넣어 상온에서 1시간동안 반응시킨 다음 0.5% casein-Tris 용액내에 담가 1시간동안 잔여 표면 처리된 후 0.1% Triton X-100을 포함하는 100 mM Tris 완충용액 (pH 7.6)으로 3번 세척되었고 실온에서 건조되었다.

.실시예 5 : 면역스트립 제작

각각 구성성분의 특성에 맞게 제작된 기능성 패드들을 하나의 연결된 면역스트립으로 구성을 하기 위해서 플라스틱 필름(OHP)위에 양면테이프를 이용하여 각 멤브레인이 약 0.2 cm 정도씩 겹치게 배열하여 도 1과 같이 연결을 하였다.

샌드위치 면역시스템의 하단에 위치될 유리섬유 멤브레인(0.5×2 cm, 시료흡수패드)은 0.1% tween 20이 포합된 100 mM Tris 완충용액으로 처리된 상태로 건조시킴으로서 전처리 되었고, 그 위쪽으로부터 0.5 cm 부분에는 두 항체중합체(항체-골드,항체-SA)를 축적시켜 놓았다.

중단부분의 니트로셀룰로우즈 멤브레인(0.5cm×1.5cm) 상에는 분석물질인 인간혈청 알브민(HSA)이 고정화되었고(미반응성분 제거패드), 위쪽의 니트로셀룰로우즈 멤브레인 (0.5×2 cm)상에는 아래쪽 끝으로부터 0.5 cm 지역부터 0.4 cm 간격으로 BSA-비오틴 중합체가 고정화되었다.

상단부분에 위치될 셀룰로우즈 멤브레인 (0.5×3cm,흡수패드)은 과량의 시료를 신속히 흡수시켜 분석시스템 내에서 모세관 현상의 흐름을 계속 유지시키는데 사용되었다.

이와 같은 4종류의 멤브레인들은 서로 부착된 것이 아니라 겹쳐져 있는 상태로서 분석과정 수행시 시료용액에 의해 접착이 되어 최종적으로 시료용액이 흡수패드까지 도달하게 된다.

이렇게 제작된 면역스트립은 절단기에 의해서 0.5 cm 폭으로 절단이 되어 사용되었다.

.실시예 6 : 샌드위치 면역분석 시스템 성능평가

이상에서와 같이 최적 조건하에서 제조된 샌드위치 면역분석 시스템의 성능을 평가하기 위해 분석물질인 알브민의 농도변화에 대한 시스템의 응답을 구하였다.

분석물질인 알브민은 150 mM NaCl이 포합된 10 mM 인산염 완충용액에 의해 희석되어 사용하였으며 알브민 농도변화에 따라 신호발색바수의 변화를 측정하였다.

상기 실시예3에서와 같이, 신호발생패드 상에 BSA-비오틴 중합체는 1mg/mL로 고정화되었으며 두 항체중합체(항체-SA, 항체-골드)의 몰비는 100:1로 하였다.

또한 실시예 4와 같이 미반응성분 제거패드와 다른 기능성 패드들은 최적 조건상에서 제조되어 사용되어졌다.

알브민 측정농도는 0,1,2.5,5,10,25,50,100 ㎍/mL로 하였으며 분석시간은 20분 이내로 조절되었다.

알브민 농도변화에 따라 미반응성분 제거패드 상에서는 발색신호가 감소하였으며, 신호발생패드상의 발색바수는 증가되었다.

측정하한농도는 1 ㎍/mL로 나타났으며, 50 ㎍/mL 에서는 2개의 신호발색바수가 나타났고, 100 ㎍/mL 이상에서는 3개의 발색된 바를 보였다.(도4 참조)

따라서 다른 측정장치나 대조표의 도움 없이 원하는 분석물질의 농도변화를 발색바수로 나타낼 수 있으며 이것으로 인해 주관적 판단에 의한 측정오류를 범하지 않는 자가진단 시스템을 개발할 수 있었다.

.실시예 7 : 다중기능 중합체 제조

이상에서와 같이 발명된 샌드위치 면역분석 시스템은 복잡하고 시간이 오래 걸리기 때문에 간단하면서 시간이 단축된 바코드 면역분석 시스템이 필요하였다.

그래서 새로운 다중기능 중합체를 제작하였는데 이것은 도 5에서와 같이 제작이 간편해야되고 항체의 면역반응과 비오틴의 부착반응 성질들을 모두 갖추어야 했다.

모든 성질들을 최대한 유지시키고 간편하게 만들기 위해 항체와 골드 콜로이드를 물리흡착방법으로 먼저 중합(실시예1 참조)을 하고 BSA를 이용 잔여 표면을 브로킹한 후에 비오틴을 중합하는 방법을 사용했다.

산성도 9.0으로 조절된 골드용액 8 mL에 투석에 의해 준비된 150 ㎍/mL 항체용액 0.8 mL을 가한 후 30분간 반응시켰다.

그 후 이용액에 10 mM 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해시켜 제조된 10% BSA용액 (BSA-PB) 1 mL을 추가한 후 30분간 반응시켰다.

반응액은 원심분리기(한일 메가 17R,한국)를 이용하여 15,000 rpm에서 45분간 원심 분리된 후 상등액이 제거되었다.

분리된 골드 침전물에 10mM 인산염 완충용액(pH 7.4)을 가하여 중합체의 최종부피를 0.4mL로 조절하였고 여기에 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해된 NHS-LC-LC-비오틴 (2 mg/mL)100L를 넣어 30분간 상온에서 반응시켰다.

반응액은 원심분리기를 이용하여 15,000 rpm에서 45분간 원심 분리된 후 상등액이 제거되었다.

분리된 골드 침전물에 1% BSA-PB 완충용액 2 mL을 가하여 다시 녹여내고 또 한번 원심분리기를 이용하여 15,000 rpm에서 45분간 원심 분리된 후 상등액을 제거하였다.(반응하지 않은 비오틴 제거)

마지막 남은 골드 침전물에 1% BSA-PB 완충용액을 가하여 중합체의 최종부피는 0.1mL로 조절되었고 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.

.실시예 8 : 신호발생패드(스트랩트아비딘 고정화)

실시예 3과 거의 같은 방법으로 니트로셀룰로우즈 멤브레인(세공크기: 12㎛ Millipore)을 사용하여 스트랩트아비딘을 고정화하였으며 고정화 방법은 효율을 높여주기 위하여 우선 0.5% 카세인 용액내에 담가 1시간동안 표면처리를 한 후에 과량의 카세인을 제거해주고 상온에서 건조시켰다.

건조된 니트로셀룰로우즈 멤브레인(0.5×2 cm)은 0.5% GA가 처리된 멤브레인에 스트랩트아비딘 용액(1 mg/mL)을 하단으로부터 0.5cm 지역에서부터 0.3 cm 간격으로 마이크로 디펜서를 이용하여 1L/bar를 가한 후에 100% 습도가 유지되는 상자내에 넣어 상온에서 1시간동안 반응시켰다.

스트랩아비딘이 고정화된 스트립은 0.1% Triton X-100을 포함하는 100mM Tris 완충용액(pH 7.6)으로 3번 세척되었고 실온에서 건조되었다.

.실시예 9 : 미반응성 제거패드(PLL 이용)

실시예 4와 같은 방법이지만 세공크기가 다른 니트로셀룰로우즈 멤브레인(세공크기: 12 ㎛,Millipore)을 사용하였고 알브민의 고정화 효율을 높이기 위해 PLL을 매개로 하여 화학적 처리방법에 의해 고정화하였다.

니트로셀룰로우즈 멤브레인(0.5×1.5 cm)을 0.1M 탄산염 완충용액(pH 9.5)에 용해시켜 제조된 PLL용액 (0.5 mg/mL)에 담그고 1시간동안 반응시킨 후 10mM 인산염 완충용액으로 5번 세척 후 상온에서 건조하였다.

PLL 처리된 멤브레인은 0.5% GA 용액에 담그고 1시간동안 반응시킨 후 DIW로 5번 세척되었고 실온에서 건조하였다.

GA가 처리된 멤브레인에 알브민을 1 mg/mL 농도로 만들어 피펫을 사용하여 7.5 ㎕/cm를 가하였다.

그 후에 100% 습도가 유지되는 상자내에 넣어 상온에서 1시간동안 반응시킨 다음 0.1% Triton X-100을 포함하는 100 mM Tris 완충용액(pH 7.6)으로 3번 세척되었고 실온에서 건조되었다.

.실시예 10 : 경쟁반응 바코드 면역분석

실시예 7에서와 같이 제작된 다중기능 중합체를 사용하게 되면 분석물질 농도와 무관하게 발색바수가 하나로 일정하게 나타나고 있음을 도 6에서 확인할 수 있다.

이것을 해결하기 위해서 경쟁반응을 도입하게 되었다.

경쟁반응을 유도하기 위해 다중가능 중합체와는 별도로 비오틴을 가지고 있는 중합체를 넣어 줌으로써 일정 농도로 고정화된 스트랩트아비딘에 대해 부착경쟁을 할 수 있도록 해주었다.

분석물질 농도가 증가함에 따라 부착경쟁자의 농도가 증가되도록 하여 발색바수를 증가시키기 위해 부착경쟁자를 선택하는 것이 중요하며 또한 선택된 부착경쟁자의 양에 의해서 경쟁의 정도가 달라지므로 농도도 중요하다.

그런데 부착경쟁자의 농도를 변화시키는 것에는 어느 정도 한계를 가지고 있으므로 경쟁반응을 조절할 수 있는 변수로 고정화될 스트랩트아비딘의 농도와 다중기능 중합체의 농도를 변화시켜 얼마만큼 경쟁반응이 발생되는지를 살펴보았다.

분석물질의 농도변화에 대해 부정경쟁자의 농도가 비례적으로 변할 수 있다면 발색바수 또한 변화할 것이기 때문에 분석물질의 양에 의해 조절될 수 있는 변수들을 찾아 그 변화를 야기하는 성분을 비오틴과 중합시킴으로써 경쟁상대자를 선택하였다.

위에서 설명된 바와 같이, 항체성분이 분석물질과 면역 결합할 경우 미반응성분 제거패드를 통과하고 또한 그 양은 분석물질농도에 비례한다.

따라서 알브민의 특이항체에 비오틴을 중합(항체-비오틴)시켜 다중기능 중합체에 대한 부착경쟁자로 사용하게 되었다.(도7 참조)

이 부착경쟁자를 사용하여 공정화된 스트랩트아비딘에 대해 골드 중합체와의 부착경쟁을 유도함으로서 분석물질 농도에 따른 발색바수의 변화가 어떻게 발생되는지 또한 가장 좋은 부착경쟁조건이 무엇인지를 결정하였다.

결과적으로 분석물질의 양이 증가되면 도8에서와 같이, 두 비오틴 중합체의 양이 증가되고 그에 따라 스트랩트아비딘에 대한 부착경쟁이 심화되어 발색바수가 증가되는 것으로 나타났다.

그리고 그 변화되는 정도는 항체-비오틴중합체의 양과 신호발생 패드상에 고정화되어있는 스트랩트아비딘의 농도에 따라 다르게 나타났으며, 최적농도는 각각 150 ㎍/mL과 1 mg/mL로 결정이 되었다.

.실시예 11 : 바코드 면역분석 시스템 성능시험

최적조건하에서 제조된 바코드 면역분석 시스템의 성능을 평가하기 위해 분석물질인 알브민의 농도변화에 대한 시스템의 응답을 구하였다.

분석물질인 알브민은 150 mM NaCl이 포함된 10 mM 인산염 완충용액에 의해 희석되어 사용하였으며 알브민 농도변화에 따라 신호발색바수의 변화를 측정하였다.

신호발생 패드상에 스트랩트아비딘은 실시예 8에서와 같이 1 mg/mL 농도로 1 L/bar로 고정화되었으며, 실시예 10에서와 같이 두 항체중 합체(항체-골드-비오틴, 항체-비오틴)의 농도는 각각 80X, 150 ㎍/mL로 하였다.

또한 미반응성분 제거패드는 최적조건상에서 제조되어 사용되어졌다.

알브민 측정농도는 0,30,60,90,120,150,200 ㎍/mL로 하였으며 분석시간은 5분 이내로 조절되었다.

또한 실제 시료인 뇨를 사용하여 본 분석시스템의 성능시험을 하기 위해 정상인 뇨에 알브민을 희석하여 넣어주어 위와 같은 방법으로 분석이 수행되었다.

이러한 조건하에서 본 시스템은 분석물질 농도변화에 따라 발색바수가 원하는 농도범위에서 민감하게 변화되는 것을 볼 수 있었다.(도 9 참조)

또한 항체-비오틴 중합체 농도를 변화시켜 본 결과 조기진단용과 질병진도점검용으로도 구분이 가능하였다.

조기진단용은 기 상업화된 Micral-Test 와 농도 측정범위(0,20,50,〉100 mg/L)가 유사하여 좁은 농도 범위에서 바수가 민감하게 변화되었고, 질병진도 점검용은 뇨 알브민 측정범위(20~200 mg/L)를 광범위하게 포함함으로써 환자의 질병 진행정도를 파악할 수 있을 것으로 보여진다.

본 발명은 당뇨병의 합병증인 신장질환의 조기진단용으로 기 상업화되어 있는 제품보다 사용자에게 편의를 주며 주관적 판단의 오류를 최소화시킨 바코드 방식의 반정량 면역분석 시스템으로 단지 발색바수를 읽으므로서 누구나 손쉽게 알브민의 양을 측정할 수 있도록 제작하였다.

이와 같이 제조된 바코드 면역분석 시스템은 다른 반정량 또는 정량분석 시스템에서 필요한 고가의 측정장치를 필요로 하지 않을 뿐만 아니라 일반 정석분석시스템(예: 임신진단 시약)처럼 간단하게 사용을 하면서도 단지 발색된 바수를 세는 것으로 충분히 그 양을 반정량할 수 있다.

또한 항원-항체반응을 사용함으로써 원하는 분석물질과 그에 대한 항체를 가지고있다면 본 시스템에 그대로 적용하여 사용이 가능하며 그리고 하나의 분석물질이 아닌 여러 가지 원하는 분석물질들을 한번에 측정하는 것도 가능할 것이다.

도 1은 본 발명의 면역분석장치의 구성성분 및 면역스트립의 구성상태도

도 2는 본 발명의 분석원리를 나타낸 것으로서,

(a)는 시료흡수단계,(b)는 면역반응단계,(c)는 미반응성분 제거 및 신호발생단계를 도시한 것이다.

도 3은 뇨 알부민의 임상농도범위와 그 농도변화에 대한 발색바(ladder bar)의 수를 나타낸 모식도

도 4는 샌드위치 면역분석 시스템의 농도응답을 보여주는 것으로 발색된 바의 수는 농도에 비례하는 것을 보여주는 예시도

도 5는 다중기능 중합체가 만들어진 배경 및 제조과정을 나타낸 모식도

도 6은 다중기능 중합체인 항체-골드-비오틴 중합체를 신호발생물질로 사용했을 때의 농도응답을 나타낸 것으로 분석물질의 농도와 무관한 일정한 발색된 바수를 보여주고 있다.

도 7은 다중기능 중합체를 신호발생물질로 사용하고 항체-비오틴 중합체를 부착경쟁성분으로 사용하는 면역 크로마토그래피 분석시스템의 모식도로서,

(a)는 저농도 분석물질에서는 분석물질분자와 중합체간 반응된 결합체의 농도가 낮아 스트랩트아비닌(스트랩트아비딘;SA)부착자리에서의 경쟁이 없음을 나타내는 것이며,

(b)는 고농도 분석물질에서는 분석물질과 중합체간 결합체의 농도가 증가하여 SA 부착자리에서 부착반응경쟁이 발생하여 발색된 바의 수가 늘어나는 원리를 보여주고 있다.

도 8 (a)는 도7에서와 같은 원리를 이용한 경우 일정 조건하에서 분석시스템의 농도응답의 예를 나타낸 것이며,

도 8 (b)는 그에 따른 발색바수의 변화를 나타낸 그래프를 보여주고 있다.

도 9 (a)는 최적조건하에서 제조한 면역 크로마토그래피 분석시스템의 알브민 농도에 대한 농도응답을 예시한 것이며,

도 9 (b)는 그에 따른 발색바수를 나타낸 그래프를 보여주고 있다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1…유리 멤브레인패드 2a…항체중합체 2…시약패드

3…미반응성분 제거패드 3a…항체중합체 4…신호패드

4a…BSA-비오틴중합체 5…용액흡수용 패드 10…면역스트립

Claims (14)

1. 분석물질(예: 알브민 등)에 대한 반정량 측정을 위한 바코드(bar code)방식의 면역분석 장치에 있어서,

   분석물질을 포함한 시료를 흡수하여 공급해주는 시료흡수패드와;

   상기 시료흡수패드에서 흡수된 시료 내에 포함된 분석물질에 특이한 항체중합체를 포함하는 시약패드와;

   상기 시약패드에 포함된 항체중합체 중 분석물질과 반응하지 못한 미반응 중합체를 제거하는 미반응성분 제거패드 (항원패드)와;

   상기 미반응성분 제거패드를 통과한 분석물질과 중합체간 면역결합체를 포획하는 기능성 성분을 사다리모양(bar code 방식)으로 고정화 시켜놓은 신호패드와;

   상기 패드들에 일련된 시료운반을 위해 용액의 지속적인 흐름을 유도하는 흡수패드로 구성된 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 시약패드는 분석물질(예: 알브민 등)에 특이한 항체에 신호발생 물질이 결합된 항체중합체 그리고 다른 특이한 항체와 신호패드 상에 부착되어 있는 포획기능성분간에 결합시켜 놓은 항체중합체를 멤브레인 등 고체표면에 축적 건조시킨 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석 장치.
3. 제1항에 있어서, 상기 미반응성분 제거패드(항원패드)는 시약패드에 포함된 항체중합체들과 분석물질간에 반응하지 못한 미반응 중합체를 제거하기 위해 항원 (분석물질과 동일 성분)이 멤브레인 등 고체표면에 물리흡착 또는 화학적 방법으로 고르게 도포되어 고정화되는 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석 장치.
4. 제1항에 있어서, 상기 신호패드는 분석물질 농도에 비례하여 바코드 방식의 신호발생이 가능하도록 골드입자가 포함된 면역결합체를 포획하기 위해 그 결합체와 결합능력을 지닌 물질이 멤브레인 등 고체표면에 사다리 모양으로 물리흡착 또는 화학적 방법으로 고정화되는 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석장치.
5. 제2항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체표면을 제공하는 물질은 주로 멤브레인으로써, 세공크기가 0.1-20 ㎛ 범위이고, 그 성분은 셀루로우즈, 니트로셀루로우즈, 나일론, 유리섬유 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF)로 형성된 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석 장치.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미반응성부 제거패드(항원패드)는 멤브레인에 0.1∼100 ㎎/mL 농도범위의 항원을 고르게 도포하여 물리 흡착시킨 후 잔여표면은 BSA나 카세인과 같은 비반응성 단백질로 처리하거나, 멤브레인을 0.1∼5% glutaraldehyde 용액에 1시간 동안 담가 처리하여 세척한 후 공기 중에 건조시킨 후 분석물질을 고르게 도포하여 반응시키고, 상기 멤브레인을 0.1∼5% triton X100과 같은 계면활성제를 포함한 BSA나 카세인과 같은 비반응성 단백질 용액에 담궈 처리된 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석장치.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호패드는 멤브레인에 0.1∼10 ㎎/mL 범위의 포획기능성 단백질(스트랩트아비딘, BSA-biotin, 항체 등)을 사다리 모양으로 물리 흡착시킨 후 잔여표면은 BSA나 카세인과 같은 비반응성 단백질로 처리하거나, 혹은 멤브레인을 0.1∼5% glutaraldehyde 용액에 1시간동안 담가 처리하여 세척한 후 공기 중에 건조시킨 후 기능성 단백질을 사다리 모양으로 0.1∼10 ㎎/mL 농도로 고정화시킨 후, 상기 멤브레인을 0.1∼5% triton X100과 같은 계면활성제를 포함한 BSA나 카세인과 같은 비반응성 단백질 용액에 담가 처리된 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석장치.
8. 제7항에 있어서, 상기 미반응성분 제거패드와 신호패드는 멤브레인 상에 poly-lysine 이나 polyethylene glycol과 같은 polymer를 0.1∼10 ㎎/mL로 먼저 고정화한 후에 0.1∼5% glutaraldehyde 용액에 1시간동안 담가 처리하여 세척한 후 공기중에 건조시킨 후 분석물질 또는 기능성 단백질을 고정화시킨 후, 멤브레인을 0.1∼5% triton X100과 같은 계면활성제를 포함한 BSA나 카세인과 같은 비반응성 단백질 용액에 담가 처리된 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 면역분석장치.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시약패드는 선택된 분석물질에 특이하게 반응하는 항체 (탐지항체)에 표지된 신호발생원 그리고 같은 분석물질에 동시에 반응할 수 있는 다른 항체 (포획항체)에 비오틴 또는 스트랩트아비딘을 중합시킨 것을 건조 축적시키거나, 혹은 특이항체에 신호발생원과 비오틴 또는 스트랩트아비딘 등을 동시에 중합 (다중기능 중합체)하여 건조 축적시킨 것을 주요성분으로 하는 바코드 방식의 면역분석장치.
10. 제 9항에 있어서, 상기 다중기능 중합체는 분석물질에 대한 특이항체나 다른 기능성 단백질 등을 사용하여 신호발생 기능(골드 콜로이드)과 포획기능(비오틴, 스트랩트아비딘 등)을 동시에 가지며 그 활성을 최대로 유지시키기 위해 항체와 골드 콜로이드를 물리흡착 방법으로 먼저 중합을 하고 BSA를 이용 잔여 표면을 blocking 한 후에 화학적 방법을 이용하여 비오틴 또는 스트랩트아비딘을 중합하는 방법을 사용한 것을 특징으로 다중기능 중합체 제조방법 및 상기 다중중합체를 이용한 면역분석장치.
11. 바코드 방식의 면역분석장치 신호측정 방법에 있어서, 분석물질에 특이하게 반응하는 항체에 포획기능을 하는 비오틴 또는 스트랩트아비딘과 같은 물질을 결합시킨 중합체 (포획항체)와 분석물질의 다른 부위를 인지하는 항체에 신호발생 물질을 결합시킨 중합체 (탐지항체)를 이용하고, 신호패드 상에는 포획항체를 잡기 위해 반대로 스트랩트아비딘 또는 비오틴을 사다리 모양으로 고정화하여 분석물질 농도에 비례한 발색을 바 수로 나타내게 하는 아비딘-비오틴 반응을 이용한 바코드 방식의 샌드위치 면역분석방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 신호측정방법으로 분석장치의 신호측정 민감도 및 정확도를 높이기 위해 다중기능 중합체와 경쟁물질을 첨가해 신호패드 상에 고정화되어 있는 비오틴 또는 스트랩트아비딘 등과의 경쟁을 유발시켜 분석물질 농도변화에 따라 발색 바 수를 조절하도록 하는 것을 특징으로 한 경쟁면역분석방법.
13. 제12항에 있어서, 다중기능 중합체의 경쟁물질은 분석물질에 특이한 항체에 비오틴 또는 스트랩트아비딘을 결합시킨 중합체, 혹은 분석물질에 비오틴 또는 스트랩트아비딘을 결합시킨 중합체 등과 같이 다중기능 중합체와 동일한 포획기능만을 하고 신호발색에는 영향을 주지 않는 것으로 경쟁반응을 조절하기 쉬우며 분석물질의 농도에 비례하여 경쟁반응이 증가될 수 있게 된 것을 특징으로 한 경쟁면역분석방법.
14. 반정량 측정을 위한 바코드 방식의 면역분석장치에 있어서, 분석물질을 포함한 시료를 흡수하여 공급해주는 시료흡수패드와; 상기 시료흡수패드에서 흡수된 시료내에 포함된 분석물질과 반응할 항체-골드-비오틴 중합체와 항체-비오틴 중합체가 건조상태로 측정되어있는 시약패드와; 상기 시약패드에서 분석물질과 반응하지 못한 중합체를 제거하는 미반응성분 제거패드(항원패드)와; 상기 미반응성분 제거패드를 통과한 분석물질을 포함한 항체-골드-비오틴 중합체와 항체-비오틴 중합체가 사다리 모양으로 고정화되어있는 스트랩트아비딘과 경쟁반응을 통해 부착되어 신호가 발생되는 신호패드와; 상기 패드들에 일련된 시료운반을 위해 용액의 지속적인 흐름을 유도하는 흡수패드로 구성된 것을 특징으로 하는 바코드 방식의 경쟁면역 분석장치.