JPH11295314A - 流体試験試料中の分析対象物を検出する方法及び試験具 - Google Patents
流体試験試料中の分析対象物を検出する方法及び試験具Info
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- JPH11295314A JPH11295314A JP11052480A JP5248099A JPH11295314A JP H11295314 A JPH11295314 A JP H11295314A JP 11052480 A JP11052480 A JP 11052480A JP 5248099 A JP5248099 A JP 5248099A JP H11295314 A JPH11295314 A JP H11295314A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 流体試験試料中の分析対象物の決定のための
簡素化した検出法及び診断試験具を提供する。 【解決手段】 固体支持体上に分析対象物を固定化する
方法であって、捕捉ゾーン内に結合性試薬を有する支持
体を結合性標識−アミノ酸−分析物複合体と接触させ
て、試薬及び複合体を支持体と相互作用させ、分析物が
存在する流体試験試料に接触させた時に、分析物は競合
的に標識された抗−分析物抗体と競合的に結合できるよ
うに複合体を結合させる方法及びその試験具である。
簡素化した検出法及び診断試験具を提供する。 【解決手段】 固体支持体上に分析対象物を固定化する
方法であって、捕捉ゾーン内に結合性試薬を有する支持
体を結合性標識−アミノ酸−分析物複合体と接触させ
て、試薬及び複合体を支持体と相互作用させ、分析物が
存在する流体試験試料に接触させた時に、分析物は競合
的に標識された抗−分析物抗体と競合的に結合できるよ
うに複合体を結合させる方法及びその試験具である。
Description
【０００１】
【従来の技術】訓練を受けていない人でも実施すること
ができる、一般的な疾患のための簡単な診断試験の必要
性がある。試験がより簡単であるならば、現在の手法で
あれば分析を外部の研究施設に委託しなければならない
場合でも、家庭又は医師の診療所で試験することが可能
になる。より簡単な試験で考えられる利点は、所要時間
の短縮及び費用の削減である。代表例は、家庭での妊娠
診断及びグルコース試験である。
ができる、一般的な疾患のための簡単な診断試験の必要
性がある。試験がより簡単であるならば、現在の手法で
あれば分析を外部の研究施設に委託しなければならない
場合でも、家庭又は医師の診療所で試験することが可能
になる。より簡単な試験で考えられる利点は、所要時間
の短縮及び費用の削減である。代表例は、家庭での妊娠
診断及びグルコース試験である。
【０００２】これらのより簡単な試験に共通のフォーマ
ットは、試験に用いる試薬が毛管現象によりそこを通っ
て流れることができる固体支持体を含む免疫細片フォー
マットである。普通、このフォーマットは、試験溶液及
び光学的に標識された分析対象物−特異的結合性パート
ナーからなる移動相を含有している。分析対象物は光学
的に標識された分析対象物−特異的結合性パートナーに
結合し、その上に固定化した捕捉−分析対象物（captur
e-analyte）を含有する捕捉ゾーンを通過する。ここで
捕捉−分析対象物は修飾された分析対象物であり、その
ため免疫細片の捕捉ゾーンに固定化することができる。
染料を充填したリポゾームのような他の光学的標識を用
いてもよいが、代表的な光学的標識は、金ゾル又はラテ
ックス粒子のような着色粒子である。光学的、つまり視
覚的に検出できる標識が好まれるが、このタイプの細片
フォーマットは、検出ゾーンが酵素標識のための基質を
含有している場合、酵素のような検出できる標識の他の
タイプを用いることができる。分析対象物と結合して、
分析対象物／標識された特異的結合性パートナーの複合
体を形成する標識された分析対象物特異的結合性パート
ナーが、この複合体を検出する検出ゾーンに移動する時
に、捕捉ゾーンは、過剰な標識された分析対象物特異的
結合性パートナーを捕捉する。
ットは、試験に用いる試薬が毛管現象によりそこを通っ
て流れることができる固体支持体を含む免疫細片フォー
マットである。普通、このフォーマットは、試験溶液及
び光学的に標識された分析対象物−特異的結合性パート
ナーからなる移動相を含有している。分析対象物は光学
的に標識された分析対象物−特異的結合性パートナーに
結合し、その上に固定化した捕捉−分析対象物（captur
e-analyte）を含有する捕捉ゾーンを通過する。ここで
捕捉−分析対象物は修飾された分析対象物であり、その
ため免疫細片の捕捉ゾーンに固定化することができる。
染料を充填したリポゾームのような他の光学的標識を用
いてもよいが、代表的な光学的標識は、金ゾル又はラテ
ックス粒子のような着色粒子である。光学的、つまり視
覚的に検出できる標識が好まれるが、このタイプの細片
フォーマットは、検出ゾーンが酵素標識のための基質を
含有している場合、酵素のような検出できる標識の他の
タイプを用いることができる。分析対象物と結合して、
分析対象物／標識された特異的結合性パートナーの複合
体を形成する標識された分析対象物特異的結合性パート
ナーが、この複合体を検出する検出ゾーンに移動する時
に、捕捉ゾーンは、過剰な標識された分析対象物特異的
結合性パートナーを捕捉する。
【０００３】他のフォーマットが考えられ、好都合であ
るかもしれない。たとえば、混合物が標識された分析対
象物特異的結合性パートナーと接触する前に、捕捉−分
析対象物を試験溶液と混合しておくことで、試験溶液中
の捕捉−分析対象物と分析対象物が標識された分析対象
物特異的結合性パートナーと同時に競合して反応するこ
とが好ましいかもしれない。得られる混合物は、その
後、捕捉ゾーンに移動し、そこで捕捉−分析対象物−標
識された分析対象物特異的結合性パートナー複合体及び
未結合の捕捉−分析対象物は捕捉ゾーンで捕捉される。
その分析対象物−標識された分析対象物特異的結合性パ
ートナー複合体及び未結合の標識された分析対象物特異
的結合性パートナーは検出ゾーンに移動を続け、そこで
捕捉される。もう一つの例は、捕捉−分析対象物を分離
したゾーンに置くことに関し、そこでその捕捉−分析対
象物は固定化されていないため、試験溶液中の分析対象
物は、標識された分析対象物特異的結合性パートナーと
最初に結合することができる。その混合物は、その後、
捕捉−分析対象物ゾーンに移動し、そこで未結合の標識
された分析対象物特異的結合性パートナーは捕捉−分析
対象物に結合する。最終混合物は検出ゾーンに移動し、
そこで捕捉−分析対象物−標識された分析対象物特異的
結合性パートナー複合体及び未結合の捕捉−分析対象物
は捕捉される。その分析対象物−標識された分析対象物
特異的結合性パートナー複合体及び未結合の標識された
分析対象物特異的結合性パートナーは検出ゾーンに移動
を続け、そこで捕捉される。第三の例では、標識された
分析対象物特異的結合性パートナーを捕捉−分析対象物
と混合して、捕捉−分析対象物−標識された分析対象物
特異的結合性パートナー複合体を形成させ、そして標識
された分析対象物特異的結合性パートナーゾーンに置
く。その試験溶液を試験具と接触させた時、試験溶液中
の分析対象物は遊離の捕捉−分析対象物と競合して、標
識された分析対象物特異的結合性パートナーと結合し、
その後に得られる混合物は捕捉ゾーンに移動し、そこで
捕捉−分析対象物−標識された分析対象物特異的結合性
パートナー複合体、及び未結合の捕捉−分析対象物は捕
捉ゾーン中で捕捉される。分析対象物−標識された分析
対象物特異的結合性パートナー複合体及び未結合の標識
された分析対象物特異的結合性パートナーは検出ゾーン
に移動を続け、そこで捕捉される。
るかもしれない。たとえば、混合物が標識された分析対
象物特異的結合性パートナーと接触する前に、捕捉−分
析対象物を試験溶液と混合しておくことで、試験溶液中
の捕捉−分析対象物と分析対象物が標識された分析対象
物特異的結合性パートナーと同時に競合して反応するこ
とが好ましいかもしれない。得られる混合物は、その
後、捕捉ゾーンに移動し、そこで捕捉−分析対象物−標
識された分析対象物特異的結合性パートナー複合体及び
未結合の捕捉−分析対象物は捕捉ゾーンで捕捉される。
その分析対象物−標識された分析対象物特異的結合性パ
ートナー複合体及び未結合の標識された分析対象物特異
的結合性パートナーは検出ゾーンに移動を続け、そこで
捕捉される。もう一つの例は、捕捉−分析対象物を分離
したゾーンに置くことに関し、そこでその捕捉−分析対
象物は固定化されていないため、試験溶液中の分析対象
物は、標識された分析対象物特異的結合性パートナーと
最初に結合することができる。その混合物は、その後、
捕捉−分析対象物ゾーンに移動し、そこで未結合の標識
された分析対象物特異的結合性パートナーは捕捉−分析
対象物に結合する。最終混合物は検出ゾーンに移動し、
そこで捕捉−分析対象物−標識された分析対象物特異的
結合性パートナー複合体及び未結合の捕捉−分析対象物
は捕捉される。その分析対象物−標識された分析対象物
特異的結合性パートナー複合体及び未結合の標識された
分析対象物特異的結合性パートナーは検出ゾーンに移動
を続け、そこで捕捉される。第三の例では、標識された
分析対象物特異的結合性パートナーを捕捉−分析対象物
と混合して、捕捉−分析対象物−標識された分析対象物
特異的結合性パートナー複合体を形成させ、そして標識
された分析対象物特異的結合性パートナーゾーンに置
く。その試験溶液を試験具と接触させた時、試験溶液中
の分析対象物は遊離の捕捉−分析対象物と競合して、標
識された分析対象物特異的結合性パートナーと結合し、
その後に得られる混合物は捕捉ゾーンに移動し、そこで
捕捉−分析対象物−標識された分析対象物特異的結合性
パートナー複合体、及び未結合の捕捉−分析対象物は捕
捉ゾーン中で捕捉される。分析対象物−標識された分析
対象物特異的結合性パートナー複合体及び未結合の標識
された分析対象物特異的結合性パートナーは検出ゾーン
に移動を続け、そこで捕捉される。
【０００４】上記の３例すべてにおいて、捕捉−分析対
象物は試験具に固定化されていない。試験具が試験溶液
と接触した後、標識された分析対象物特異的結合性パー
トナーを含有している混合物は試験溶液の分析対象物に
結合し、標識された分析対象物−特異的結合性パートナ
ーが捕捉−分析対象物に結合し、未結合の捕捉−分析対
象物は毛管現象により捕捉ゾーンに流れ、そこで標識さ
れた分析対象物特異的結合性パートナーは捕捉−分析対
象物に結合し、未結合の捕捉−分析対象物は捕捉ゾーン
に固定化された結合性試薬に競って結合する。結合性試
薬は固体支持体と捕捉−分析対象物を結合させる能力が
ある試薬である。分析対象物に結合していない標識され
た分析対象物特異的結合性パートナーは捕捉ゾーンを通
過して、検出ゾーンに移動して、検出試薬により回収さ
れる。
象物は試験具に固定化されていない。試験具が試験溶液
と接触した後、標識された分析対象物特異的結合性パー
トナーを含有している混合物は試験溶液の分析対象物に
結合し、標識された分析対象物−特異的結合性パートナ
ーが捕捉−分析対象物に結合し、未結合の捕捉−分析対
象物は毛管現象により捕捉ゾーンに流れ、そこで標識さ
れた分析対象物特異的結合性パートナーは捕捉−分析対
象物に結合し、未結合の捕捉−分析対象物は捕捉ゾーン
に固定化された結合性試薬に競って結合する。結合性試
薬は固体支持体と捕捉−分析対象物を結合させる能力が
ある試薬である。分析対象物に結合していない標識され
た分析対象物特異的結合性パートナーは捕捉ゾーンを通
過して、検出ゾーンに移動して、検出試薬により回収さ
れる。
【０００５】第四の例では、捕捉−分析対象物を結合性
試薬により試験具中の捕捉ゾーンに固定化する。試験具
が試験溶液と接触する時、試験溶液中の分析対象物は接
触が許容され、標識された分析対象物特異的結合性パー
トナーに最初に結合し、そうして混合物は捕捉ゾーンに
移動し、そこで分析対象物−未結合の標識された分析対
象物特異的結合性パートナーは、固定化された捕捉−分
析対象物により捕捉される。捕捉されていない標識され
た分析対象物特異的結合性パートナーは、その後、検出
ゾーンに移動し、検出試薬により回収される。標識され
た分析対象物特異的結合性パートナーは試験溶液中の分
析対象物の濃度に反比例の関係で捕捉−分析対象物試薬
と結合する。
試薬により試験具中の捕捉ゾーンに固定化する。試験具
が試験溶液と接触する時、試験溶液中の分析対象物は接
触が許容され、標識された分析対象物特異的結合性パー
トナーに最初に結合し、そうして混合物は捕捉ゾーンに
移動し、そこで分析対象物−未結合の標識された分析対
象物特異的結合性パートナーは、固定化された捕捉−分
析対象物により捕捉される。捕捉されていない標識され
た分析対象物特異的結合性パートナーは、その後、検出
ゾーンに移動し、検出試薬により回収される。標識され
た分析対象物特異的結合性パートナーは試験溶液中の分
析対象物の濃度に反比例の関係で捕捉−分析対象物試薬
と結合する。
【０００６】光学的に標識された分析対象物結合性パー
トナーに対する捕捉−分析対象物及び分析対象物の結合
競合は、結合速度及び結合強度に関して変化することが
あり、捕捉ゾーンに達する前に変更できる接触時間が必
要とされるかもしれない。これらのフォーマットは、別
の接触時間を提示している。
トナーに対する捕捉−分析対象物及び分析対象物の結合
競合は、結合速度及び結合強度に関して変化することが
あり、捕捉ゾーンに達する前に変更できる接触時間が必
要とされるかもしれない。これらのフォーマットは、別
の接触時間を提示している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】簡素化された検出法が
利点となるかもしれない分析対象物が数多くある。その
ような分析対象物の例は、ジゴキシン、サイロキシン、
コカインのような乱用される薬物、フェノバルビタール
のような抗けいれん剤を含んでいる。具体例として、骨
吸収マーカであるデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）を用
いることにより、本発明の意図するところは、捕捉−分
析対象物として働く結合性標識−アミノ酸分析対象物試
薬を記載して、免疫細片の捕捉ゾーンに分析対象物を固
定するための別のフォーマットを提供することである。
利点となるかもしれない分析対象物が数多くある。その
ような分析対象物の例は、ジゴキシン、サイロキシン、
コカインのような乱用される薬物、フェノバルビタール
のような抗けいれん剤を含んでいる。具体例として、骨
吸収マーカであるデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）を用
いることにより、本発明の意図するところは、捕捉−分
析対象物として働く結合性標識−アミノ酸分析対象物試
薬を記載して、免疫細片の捕捉ゾーンに分析対象物を固
定するための別のフォーマットを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、流体試験試料
中の分析対象物の測定のための診断用試験具を形成させ
るために、固体支持体上に分析対象物（又はその類似
物）を固定化する方法に関する。その固体支持体を、結
合性標識−アミノ酸−分析対象物（又はその類似物）複
合体と接触させ、結合性試薬及び複合体を固体支持体と
相互作用させて、そこに複合体を結合させる。この手順
は、分析対象物が存在する流体試験試料と接触した時
に、フリーの分析対象物（又はその類似物）を標識され
た抗−分析対象物抗体に競合的に結合させる。
中の分析対象物の測定のための診断用試験具を形成させ
るために、固体支持体上に分析対象物（又はその類似
物）を固定化する方法に関する。その固体支持体を、結
合性標識−アミノ酸−分析対象物（又はその類似物）複
合体と接触させ、結合性試薬及び複合体を固体支持体と
相互作用させて、そこに複合体を結合させる。この手順
は、分析対象物が存在する流体試験試料と接触した時
に、フリーの分析対象物（又はその類似物）を標識され
た抗−分析対象物抗体に競合的に結合させる。
【０００９】本発明の方法は、固体支持体上に分析対象
物（又はその類似物）を固定化する方法であって、その
捕捉ゾーン内に結合性試薬を有する固体支持体を、結合
性標識−アミノ酸−分析対象物（又はその類似物）複合
体と接触させ、その結果、結合性試薬及び複合体が固体
支持体と相互作用して、分析対象物が存在する流体試験
試料に接触させると、フリーの分析対象物（又はその類
似物）が標識された抗−分析対象物抗体と競合的に結合
できるようにそれに複合体を結合させることを特徴とす
る。
物（又はその類似物）を固定化する方法であって、その
捕捉ゾーン内に結合性試薬を有する固体支持体を、結合
性標識−アミノ酸−分析対象物（又はその類似物）複合
体と接触させ、その結果、結合性試薬及び複合体が固体
支持体と相互作用して、分析対象物が存在する流体試験
試料に接触させると、フリーの分析対象物（又はその類
似物）が標識された抗−分析対象物抗体と競合的に結合
できるようにそれに複合体を結合させることを特徴とす
る。
【００１０】結合性試薬を、結合性標識−アミノ酸−分
析対象物複合体と接触させる前に、固体支持体と接触さ
せ、結合性試薬を、それを固体支持体と接触させる前
に、結合性標識−アミノ酸−分析対象物複合体と接触さ
せて、結合性試薬−結合性標識された−アミノ酸−ＤＰ
Ｄコンプレックスを得、次いで、これを固体支持体と接
触させることが好ましい。
析対象物複合体と接触させる前に、固体支持体と接触さ
せ、結合性試薬を、それを固体支持体と接触させる前
に、結合性標識−アミノ酸−分析対象物複合体と接触さ
せて、結合性試薬−結合性標識された−アミノ酸−ＤＰ
Ｄコンプレックスを得、次いで、これを固体支持体と接
触させることが好ましい。
【００１１】固体支持体が、ニトロセルロースであり、
結合性標識が、フルオレセイン構造を有し、そして結合
性試薬が、抗フルオレセイン抗体であることが好まし
い。
結合性標識が、フルオレセイン構造を有し、そして結合
性試薬が、抗フルオレセイン抗体であることが好まし
い。
【００１２】本発明の方法の別法として、デオキシピリ
ジノリンの特定のエピトープに特異的な標識された抗体
を、流体試験媒体と合わせ、その流体試験媒体をその上
にデオキシピリジノリンが固定化されている固体支持体
と接触させることにより、流体試験媒体中でデオキシピ
リジノリンと反応していない標識された抗体が、固定化
されたデオキシピリジノリンと反応し、次いで固定化さ
れたデオキシピリジノリンにより結合させられる、流体
試験媒体中のデオキシピリジノリンの免疫検定方法にお
いて、抗−抗原抗体を不可逆的に結合させることができ
る固体支持体、及び抗−抗原抗体を介してデオキシピリ
ジノリンを固体支持体に結合させる抗原−アミノ酸−デ
オキシピリジノリン複合体の使用を特徴とする方法が好
ましい。
ジノリンの特定のエピトープに特異的な標識された抗体
を、流体試験媒体と合わせ、その流体試験媒体をその上
にデオキシピリジノリンが固定化されている固体支持体
と接触させることにより、流体試験媒体中でデオキシピ
リジノリンと反応していない標識された抗体が、固定化
されたデオキシピリジノリンと反応し、次いで固定化さ
れたデオキシピリジノリンにより結合させられる、流体
試験媒体中のデオキシピリジノリンの免疫検定方法にお
いて、抗−抗原抗体を不可逆的に結合させることができ
る固体支持体、及び抗−抗原抗体を介してデオキシピリ
ジノリンを固体支持体に結合させる抗原−アミノ酸−デ
オキシピリジノリン複合体の使用を特徴とする方法が好
ましい。
【００１３】抗原は、フルオレセイン構造を有し、そし
てアミノ酸が、カルボン酸及び第１級アミンで誘導体化
されたポリ（エチレングリコール）であることが好まし
い。
てアミノ酸が、カルボン酸及び第１級アミンで誘導体化
されたポリ（エチレングリコール）であることが好まし
い。
【００１４】本発明の方法では、結合性標識−アミノ酸
−分析対象物複合体が、捕捉ゾーンとは別の固体支持体
のある部分に位置し、それにより、固体支持体を流体試
験試料と接触させると、それが捕捉ゾーンにおいて結合
性試薬により結合させられる前に、試料中に含有されて
いる分析対象物及び標識された抗−分析対象物−抗体と
自由に相互作用することができる。
−分析対象物複合体が、捕捉ゾーンとは別の固体支持体
のある部分に位置し、それにより、固体支持体を流体試
験試料と接触させると、それが捕捉ゾーンにおいて結合
性試薬により結合させられる前に、試料中に含有されて
いる分析対象物及び標識された抗−分析対象物−抗体と
自由に相互作用することができる。
【００１５】本発明の試験具は、流体試験媒体中の分析
対象物を検出するための試験具であって、毛管現象によ
り流体試験媒体が通ることができる多孔質材料の固体支
持体を含み、該固体支持体は、結合性試薬が結合される
区別された捕捉ゾーンを有し、そして該固体支持体内
に、結合性標識−アミノ酸−分析対象物（又は分析対象
物誘導体）複合体及び標識された抗−分析対象物−抗体
に対して特異的に反応性である結合性標識を含む。
対象物を検出するための試験具であって、毛管現象によ
り流体試験媒体が通ることができる多孔質材料の固体支
持体を含み、該固体支持体は、結合性試薬が結合される
区別された捕捉ゾーンを有し、そして該固体支持体内
に、結合性標識−アミノ酸−分析対象物（又は分析対象
物誘導体）複合体及び標識された抗−分析対象物−抗体
に対して特異的に反応性である結合性標識を含む。
【００１６】本発明の試験具では、複合体は、捕捉ゾー
ン上の結合性標識を介して、その補足ゾーン中の結合性
試薬に結合されることが好ましい。
ン上の結合性標識を介して、その補足ゾーン中の結合性
試薬に結合されることが好ましい。
【００１７】本発明の試験具では、複合体は、捕捉ゾー
ンとは別の試験具中のあるゾーン内にあり、かつ、流体
試験媒体と試験具を接触させると、捕捉ゾーンに自由に
流れ、その結果、複合体上の分析対象物（又は分析対象
物誘導体）が標識された抗−分析対象物抗体について、
流体試験媒体中の分析対象物と競合的に相互作用するこ
とができ、かつ複合体は捕捉ゾーン内の結合性試薬との
相互作用で固定化されることが好ましい。
ンとは別の試験具中のあるゾーン内にあり、かつ、流体
試験媒体と試験具を接触させると、捕捉ゾーンに自由に
流れ、その結果、複合体上の分析対象物（又は分析対象
物誘導体）が標識された抗−分析対象物抗体について、
流体試験媒体中の分析対象物と競合的に相互作用するこ
とができ、かつ複合体は捕捉ゾーン内の結合性試薬との
相互作用で固定化されることが好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】補足分析対象物中にある結合性標
識を介してその捕捉−分析対象物と結合することができ
る結合性試薬を、図１に示したタイプの免疫細片の捕捉
ゾーン内に固定化する。捕捉−分析対象物（結合性標識
−アミノ酸−分析対象物複合体の形態で）を、結合性試
薬と捕捉−分析対象物間のコンプレックス形成により、
固体支持体の捕捉ゾーン上に固定化する。結合性標識
は、抗原であっても、ビオチンであってもよい。結合性
試薬は、結合性標識抗原に特異的な抗体であるか、又は
ビオチンに結合し、固体支持体上に捕捉−分析対象物複
合体を固定化するアビジンであってもよい。たとえば、
その結合性標識は、そのカルボキシル基が分析対象物
（又はその分析対象物に対する抗体と特異的に反応性で
ある分析対象物の類似物）を有するアミノ基と反応し
て、結合性標識−アミノ酸−分析対象物複合体を形成す
るアミノ酸（ペプタイド）のアミノ基に結合したフルオ
レセインであってもよい。
識を介してその捕捉−分析対象物と結合することができ
る結合性試薬を、図１に示したタイプの免疫細片の捕捉
ゾーン内に固定化する。捕捉−分析対象物（結合性標識
−アミノ酸−分析対象物複合体の形態で）を、結合性試
薬と捕捉−分析対象物間のコンプレックス形成により、
固体支持体の捕捉ゾーン上に固定化する。結合性標識
は、抗原であっても、ビオチンであってもよい。結合性
試薬は、結合性標識抗原に特異的な抗体であるか、又は
ビオチンに結合し、固体支持体上に捕捉−分析対象物複
合体を固定化するアビジンであってもよい。たとえば、
その結合性標識は、そのカルボキシル基が分析対象物
（又はその分析対象物に対する抗体と特異的に反応性で
ある分析対象物の類似物）を有するアミノ基と反応し
て、結合性標識−アミノ酸−分析対象物複合体を形成す
るアミノ酸（ペプタイド）のアミノ基に結合したフルオ
レセインであってもよい。
【００１９】コラーゲンは、すべての組織に種々の形態
で存在する。コラーゲンは、ピリジニウム架橋剤ピリジ
ノリン（ＰＹＤ）及びデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）
によって架橋されたアミノ酸鎖の形態を有することが十
分に認められている。ピリジニウム架橋は、３個のヒド
ロキシリシン残基から形成され、それらの２個は、コラ
ーゲン分子の末端ペプチド（非らせん形）が反応の前に
酵素的にアルデヒドに転換されたものからであり、第三
のヒドロキシリシンが隣接するコラーゲン分子のらせん
部に位置している。文献には、ピリジノリンに特異的な
酵素標識された抗体を使用して、ピリジノリン−酵素標
識コンプレックスを形成し、これを酵素結合イムノソル
ベント検定によって検出することにより、尿中のピリジ
ノリンを測定する技術が記載されている。ＰＹＤの分析
は、骨吸収症及び慢性関節リウマチをスクリーニングす
る手段として有用であるが、結合組織及び骨におけるそ
の存在が、偏った結果を生じさせるおそれがある。した
がって、骨の退化の初期の検出においては、骨中にのみ
見い出されるデオキシピリジノリンの免疫検定がＰＹＤ
の免疫検定よりも好まれるようになった。本発明の下記
の説明において、ＤＰＤは、その検出がここに開示され
た固定化技法を用いることにより改善されることができ
る分析対象物の例である。
で存在する。コラーゲンは、ピリジニウム架橋剤ピリジ
ノリン（ＰＹＤ）及びデオキシピリジノリン（ＤＰＤ）
によって架橋されたアミノ酸鎖の形態を有することが十
分に認められている。ピリジニウム架橋は、３個のヒド
ロキシリシン残基から形成され、それらの２個は、コラ
ーゲン分子の末端ペプチド（非らせん形）が反応の前に
酵素的にアルデヒドに転換されたものからであり、第三
のヒドロキシリシンが隣接するコラーゲン分子のらせん
部に位置している。文献には、ピリジノリンに特異的な
酵素標識された抗体を使用して、ピリジノリン−酵素標
識コンプレックスを形成し、これを酵素結合イムノソル
ベント検定によって検出することにより、尿中のピリジ
ノリンを測定する技術が記載されている。ＰＹＤの分析
は、骨吸収症及び慢性関節リウマチをスクリーニングす
る手段として有用であるが、結合組織及び骨におけるそ
の存在が、偏った結果を生じさせるおそれがある。した
がって、骨の退化の初期の検出においては、骨中にのみ
見い出されるデオキシピリジノリンの免疫検定がＰＹＤ
の免疫検定よりも好まれるようになった。本発明の下記
の説明において、ＤＰＤは、その検出がここに開示され
た固定化技法を用いることにより改善されることができ
る分析対象物の例である。
【００２０】ＤＰＤの試験は、流体試料、たとえば尿
を、ＤＰＤに特異的な光学的に標識された抗体と接触さ
せることによって実施することができる。特に便利なＤ
ＰＤの測定方法は、図１に示すタイプの細片の使用を含
む。
を、ＤＰＤに特異的な光学的に標識された抗体と接触さ
せることによって実施することができる。特に便利なＤ
ＰＤの測定方法は、図１に示すタイプの細片の使用を含
む。
【００２１】図１を参照すると、細片１０の塗付ゾーン
１２に塗付した試験試料を、光学的に標識された抗ＤＰ
Ｄ抗体（代表的には、標識物質として金ゾルを有する）
とゾーン１３への毛管的流れにより接触させる。試験試
料のいかなるＤＰＤも光学的に標識された抗ＤＰＤ抗体
と結合して、毛管作用により細片の捕捉ゾーン１４を通
って光学的検出ゾーン１６に移動するコンプレックスを
形成する。捕捉ゾーン１４には、ＤＰＤ又はその類似物
が固定化されており、これが未結合の光学的に標識され
た抗ＤＰＤ抗体を捕捉する抗ＤＰＤ抗体のための特異的
な結合性パートナーとして働く。捕捉された抗ＤＰＤ抗
体上の標識によって生成された信号を、たとえば反射分
光光度計によって測定し、既知量のＤＰＤを含有する流
体試料を検定するのに使用される複製試験片細片の結果
と相関させる。古典的な競合的免疫検定におけるよう
に、捕捉ゾーンで生成される信号の強さは、流体試料中
のＤＰＤの濃度に反比例する。流体試料中のＤＰＤと結
合していたために捕捉ゾーン１４では捕捉されなかった
光学的に標識された抗ＤＰＤ抗体は、検出ゾーン１６
で、このゾーンに固定されている抗マウスＩｇＧ抗体の
ような抗ＤＰＤ抗体に特異的な抗体により捕捉される。
捕捉ゾーン及び検出ゾーンからのスペクトル応答を測定
し、適切なアルゴリズムを使用してこの応答を解析する
ことにより、検定の精度を高めることができる。
１２に塗付した試験試料を、光学的に標識された抗ＤＰ
Ｄ抗体（代表的には、標識物質として金ゾルを有する）
とゾーン１３への毛管的流れにより接触させる。試験試
料のいかなるＤＰＤも光学的に標識された抗ＤＰＤ抗体
と結合して、毛管作用により細片の捕捉ゾーン１４を通
って光学的検出ゾーン１６に移動するコンプレックスを
形成する。捕捉ゾーン１４には、ＤＰＤ又はその類似物
が固定化されており、これが未結合の光学的に標識され
た抗ＤＰＤ抗体を捕捉する抗ＤＰＤ抗体のための特異的
な結合性パートナーとして働く。捕捉された抗ＤＰＤ抗
体上の標識によって生成された信号を、たとえば反射分
光光度計によって測定し、既知量のＤＰＤを含有する流
体試料を検定するのに使用される複製試験片細片の結果
と相関させる。古典的な競合的免疫検定におけるよう
に、捕捉ゾーンで生成される信号の強さは、流体試料中
のＤＰＤの濃度に反比例する。流体試料中のＤＰＤと結
合していたために捕捉ゾーン１４では捕捉されなかった
光学的に標識された抗ＤＰＤ抗体は、検出ゾーン１６
で、このゾーンに固定されている抗マウスＩｇＧ抗体の
ような抗ＤＰＤ抗体に特異的な抗体により捕捉される。
捕捉ゾーン及び検出ゾーンからのスペクトル応答を測定
し、適切なアルゴリズムを使用してこの応答を解析する
ことにより、検定の精度を高めることができる。
【００２２】ゾーン１３は、光学的に標識された抗−Ｄ
ＰＤ抗体を含有し、試験試料中のＤＰＤと反応しなかっ
たものは、捕捉ＤＰＤと組み合わさって、捕捉ゾーン１
４に固定化される。したがって、図１に示す細片のタイ
プでの好結果な操作のカギは、標識された抗−ＤＰＤ抗
体とのその免疫反応性を維持しながら、ＤＰＤのような
分析対象物を細片の捕捉ゾーンに固定化する能力であ
る。
ＰＤ抗体を含有し、試験試料中のＤＰＤと反応しなかっ
たものは、捕捉ＤＰＤと組み合わさって、捕捉ゾーン１
４に固定化される。したがって、図１に示す細片のタイ
プでの好結果な操作のカギは、標識された抗−ＤＰＤ抗
体とのその免疫反応性を維持しながら、ＤＰＤのような
分析対象物を細片の捕捉ゾーンに固定化する能力であ
る。
【００２３】種々のフォーマットを、捕捉ゾーン内での
ＤＰＤ（又は他の分析対象物）の固定化を達成するのに
用いることができる。フルオレセイン結合性標識の例を
用いると、その捕捉−分析対象物を細片の適用ゾーン１
２又は分離された捕捉−分析対象物ゾーン（図示してい
ない）中に位置せしめることができるが、その結果、そ
れは標識されたＤＰＤ特異的結合性パートナーと混合で
き、それにより捕捉ゾーン１４内で捕捉−分析対象物を
固定化する前に、ＤＰＤと捕捉−分析対象物の標識され
た結合性パートナーに対する競合を許容する。より長い
インキュベーション時間が所望される時に、この態様は
必要であろう。別法として、標識された抗−ＤＰＤ抗体
を捕捉−分析対象物と混合し、ゾーン１３内での複合体
形成を許容する。その細片を試験流体で濡らすことは複
合体を捕捉ゾーンに運び、その間に捕捉−分析対象物が
フルオレセイン結合性標識と抗フルオレセイン抗体結合
性標識との相互作用により固定化される前に、分析対象
物と遊離の捕捉−分析対象物間の標識された抗−ＤＰＤ
抗体に対する競合を許容して、結合反応が弱く、かつ遅
いか、又は弱いか若しくは遅い系において、捕捉−分析
対象物と標識された抗−ＤＰＤ抗体間の結合を許容す
る。
ＤＰＤ（又は他の分析対象物）の固定化を達成するのに
用いることができる。フルオレセイン結合性標識の例を
用いると、その捕捉−分析対象物を細片の適用ゾーン１
２又は分離された捕捉−分析対象物ゾーン（図示してい
ない）中に位置せしめることができるが、その結果、そ
れは標識されたＤＰＤ特異的結合性パートナーと混合で
き、それにより捕捉ゾーン１４内で捕捉−分析対象物を
固定化する前に、ＤＰＤと捕捉−分析対象物の標識され
た結合性パートナーに対する競合を許容する。より長い
インキュベーション時間が所望される時に、この態様は
必要であろう。別法として、標識された抗−ＤＰＤ抗体
を捕捉−分析対象物と混合し、ゾーン１３内での複合体
形成を許容する。その細片を試験流体で濡らすことは複
合体を捕捉ゾーンに運び、その間に捕捉−分析対象物が
フルオレセイン結合性標識と抗フルオレセイン抗体結合
性標識との相互作用により固定化される前に、分析対象
物と遊離の捕捉−分析対象物間の標識された抗−ＤＰＤ
抗体に対する競合を許容して、結合反応が弱く、かつ遅
いか、又は弱いか若しくは遅い系において、捕捉−分析
対象物と標識された抗−ＤＰＤ抗体間の結合を許容す
る。
【００２４】タンパク質を結合するために一般に使用さ
れるニトロセルロースが、図１に示すタイプの細片を調
製するために固体支持体として用いるのに好ましい材料
である。ポリスルホン、及び疎水性の相互作用になじむ
ことができる他の材料もまた、適当な細片材料を提供す
る。ＤＰＤの検出及び測定のための細片は、ウシの血清
アルブミン（ＢＳＡ）−ＤＰＤ又はポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）−ＤＰＤ複合体をニトロセルロース支持
体に吸収させることにより調製されているが、これはフ
ォーマットを、固定化分析対象物、ここではＢＳＡ−Ｄ
ＰＤ又はＰＥＧ−ＤＰＤを捕捉ゾーンに予め固定化した
ものに制限する。
れるニトロセルロースが、図１に示すタイプの細片を調
製するために固体支持体として用いるのに好ましい材料
である。ポリスルホン、及び疎水性の相互作用になじむ
ことができる他の材料もまた、適当な細片材料を提供す
る。ＤＰＤの検出及び測定のための細片は、ウシの血清
アルブミン（ＢＳＡ）−ＤＰＤ又はポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）−ＤＰＤ複合体をニトロセルロース支持
体に吸収させることにより調製されているが、これはフ
ォーマットを、固定化分析対象物、ここではＢＳＡ−Ｄ
ＰＤ又はＰＥＧ−ＤＰＤを捕捉ゾーンに予め固定化した
ものに制限する。
【００２５】分析対象物ＤＰＤを、標識された捕捉−分
析対象物の使用を示す例として用いる。結合性標識−ア
ミノ酸−ＤＰＤ複合体を、そのアミノ酸と、ＤＰＤ及び
結合性標識を反応させることにより調製する。ここで用
いられる用語「アミノ酸」は１以上の官能性カルボン酸
基及び官能性アミノ部分を含有する化学物の意味を意図
している。アミノ酸として特に有用なのは、カルボン
酸、たとえばカルボキシメチル基及び第１級アミン基
で、ポリエステル鎖に沿った様々な箇所で誘導体化され
ているポリエチレングリコールである。いかなるアミノ
酸であっても用いることができ、グリシン、アラニン又
はアミノ酪酸のように最も一般的なものに選択枝があ
る。好ましい結合性標識はフルオレセイン構造、すなわ
ち、下記式：
析対象物の使用を示す例として用いる。結合性標識−ア
ミノ酸−ＤＰＤ複合体を、そのアミノ酸と、ＤＰＤ及び
結合性標識を反応させることにより調製する。ここで用
いられる用語「アミノ酸」は１以上の官能性カルボン酸
基及び官能性アミノ部分を含有する化学物の意味を意図
している。アミノ酸として特に有用なのは、カルボン
酸、たとえばカルボキシメチル基及び第１級アミン基
で、ポリエステル鎖に沿った様々な箇所で誘導体化され
ているポリエチレングリコールである。いかなるアミノ
酸であっても用いることができ、グリシン、アラニン又
はアミノ酪酸のように最も一般的なものに選択枝があ
る。好ましい結合性標識はフルオレセイン構造、すなわ
ち、下記式：
【００２６】
【化２】
【００２７】（式中、Ｒ1又はＲ2の一方は共有的に結合
したアミノ酸架橋性肢であり、他のものは水素である）
で示されるものを含有しているこれらの部分である。ア
ミノ酸がフルオレセイン含有構造と反応する場合、得ら
れるフルオレセイン化アミノカルボン酸は、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド、又はｐ−ニトロフェノール、ペン
タフルオロフェノール若しくはペンタクロロフェノール
のような他の試薬とエステルを形成し、次いでそのエス
テルをＤＰＤと反応させることにより活性化することが
できる中間体を提供する。この複合体を、結合性試薬、
抗フルオレセイン抗体と、その抗体がニトロセルロース
膜のような固体支持体に結合する前か、後のいずれかに
反応させて、分析に用いられる標識された抗−ＤＰＤ抗
体に免疫反応性である、固定化されたＤＰＤを有する基
質を与える。他の固体支持体／受容体の組み合わせも本
発明での使用に適切である。官能化された抗原が調製で
き、共有結合的にアミノ酸のアミノ基に結合している限
り、いかなる抗体−抗原対を用いてもよい。例は、ジゴ
キシン、サイロキシン、及びフェノバルビタールを含ん
でいる。アビジン−ビオチン複合体のような他の結合性
コンプレックスも、また、用いることができる。
したアミノ酸架橋性肢であり、他のものは水素である）
で示されるものを含有しているこれらの部分である。ア
ミノ酸がフルオレセイン含有構造と反応する場合、得ら
れるフルオレセイン化アミノカルボン酸は、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド、又はｐ−ニトロフェノール、ペン
タフルオロフェノール若しくはペンタクロロフェノール
のような他の試薬とエステルを形成し、次いでそのエス
テルをＤＰＤと反応させることにより活性化することが
できる中間体を提供する。この複合体を、結合性試薬、
抗フルオレセイン抗体と、その抗体がニトロセルロース
膜のような固体支持体に結合する前か、後のいずれかに
反応させて、分析に用いられる標識された抗−ＤＰＤ抗
体に免疫反応性である、固定化されたＤＰＤを有する基
質を与える。他の固体支持体／受容体の組み合わせも本
発明での使用に適切である。官能化された抗原が調製で
き、共有結合的にアミノ酸のアミノ基に結合している限
り、いかなる抗体−抗原対を用いてもよい。例は、ジゴ
キシン、サイロキシン、及びフェノバルビタールを含ん
でいる。アビジン−ビオチン複合体のような他の結合性
コンプレックスも、また、用いることができる。
【００２８】フルオレセイン部分の適切な原料は、フル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレ
セインジクロロトリアジニルアミノ、フルオレセインヨ
ードアセチルフルオレセイン、及びジクロロトリアジニ
ルフルオレセイン、並びにカルボキシアルキルカルボニ
ルアミノフルオレセイン及びカルボキシアルキルチオカ
ルボニルアミノフルオレセイン類の活性化エステルを含
んでいる。抗−フルオレセイン抗体は、代表的にはフル
オレセインに対して産生したモノクローナル抗体であ
る。
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレ
セインジクロロトリアジニルアミノ、フルオレセインヨ
ードアセチルフルオレセイン、及びジクロロトリアジニ
ルフルオレセイン、並びにカルボキシアルキルカルボニ
ルアミノフルオレセイン及びカルボキシアルキルチオカ
ルボニルアミノフルオレセイン類の活性化エステルを含
んでいる。抗−フルオレセイン抗体は、代表的にはフル
オレセインに対して産生したモノクローナル抗体であ
る。
【００２９】
【実施例】本発明を、下記の実施例により更に詳細に説
明する。
明する。
【００３０】実施例Ｉ〔ＦＩＴＣ−ＰＥＧ（ＭＷ：３４
００）−ＤＰＤ複合体の調製〕 Shearwater polymers製のアミノＰＥＧ（ＭＷ：３４０
０）カルボン酸０．２５０ｇ（７３．５mmol）、塩基と
してトリエチルアミン７３．５mg（７３．５mmol）、及
びフルオレセインイソシアネート３１mg（７９．５μmo
l）の混合物を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ml
中、アルゴン雰囲気下で２時間撹拌した。更なるトリエ
チルアミン２μLを添加した。薄層クロマトグラフィー
試料のニンヒドリン可視化（Ninhydrin visualizatio
n）〔シリカゲル６０、４：１エタノール／水中の１M重
炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）〕は、更に２
時間撹拌した後に第１級アミンがフルオレセインイソチ
オシアネートと完全に反応したことを示唆した。ＤＭＦ
を蒸発させ、その残渣をメタノール３mlに再度溶解し
た。得られたものを、メタノールで溶離する、３×９０
cmLH-20カラムでのクロマトグラフィーに付した。２０
のml画分を回収し、画分６〜１０は生成物を含有してい
た。これらを合わせ，蒸発させ、エタノール４mlと合わ
せ、蒸発させ、その後、ヘキサン２mlと合わせた。得ら
れたガム質の残渣を橙色の固体として凝固させて、高圧
下に５８℃で一晩乾燥させ、生成物０．２４ｇ（理論値
の８６％）を得た。
００）−ＤＰＤ複合体の調製〕 Shearwater polymers製のアミノＰＥＧ（ＭＷ：３４０
０）カルボン酸０．２５０ｇ（７３．５mmol）、塩基と
してトリエチルアミン７３．５mg（７３．５mmol）、及
びフルオレセインイソシアネート３１mg（７９．５μmo
l）の混合物を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ml
中、アルゴン雰囲気下で２時間撹拌した。更なるトリエ
チルアミン２μLを添加した。薄層クロマトグラフィー
試料のニンヒドリン可視化（Ninhydrin visualizatio
n）〔シリカゲル６０、４：１エタノール／水中の１M重
炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）〕は、更に２
時間撹拌した後に第１級アミンがフルオレセインイソチ
オシアネートと完全に反応したことを示唆した。ＤＭＦ
を蒸発させ、その残渣をメタノール３mlに再度溶解し
た。得られたものを、メタノールで溶離する、３×９０
cmLH-20カラムでのクロマトグラフィーに付した。２０
のml画分を回収し、画分６〜１０は生成物を含有してい
た。これらを合わせ，蒸発させ、エタノール４mlと合わ
せ、蒸発させ、その後、ヘキサン２mlと合わせた。得ら
れたガム質の残渣を橙色の固体として凝固させて、高圧
下に５８℃で一晩乾燥させ、生成物０．２４ｇ（理論値
の８６％）を得た。
【００３１】フルオレセイン化アミノＰＥＧ（ＭＷ：３
４００）カルボン酸（５０mg／１２．８μmol）、及び
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．９mg（１６．５μmo
l）を合わせた。塩化メチレン中のジシクロヘキシルカ
ルボジイミド２０．６mg/mlの溶液を調製し、合わせた
固体に０．１６ml（３．３mg、１６μmol）を添加し
た。その混合物を一晩撹拌放置し、その後、そこでろ過
し、ろ液を濃縮し、次いでヘキサン２mlを添加し、蒸発
させて、橙色の固体を得た。
４００）カルボン酸（５０mg／１２．８μmol）、及び
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．９mg（１６．５μmo
l）を合わせた。塩化メチレン中のジシクロヘキシルカ
ルボジイミド２０．６mg/mlの溶液を調製し、合わせた
固体に０．１６ml（３．３mg、１６μmol）を添加し
た。その混合物を一晩撹拌放置し、その後、そこでろ過
し、ろ液を濃縮し、次いでヘキサン２mlを添加し、蒸発
させて、橙色の固体を得た。
【００３２】０．２MのＨＯＡｃ中の２．５５mg/mlのＤ
ＰＤの０．１９mlの溶液を、緩衝液として０．１M、pH
８のＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ1−
（３プロパンスルホン酸）（ＥＰＰＳ）０．４７５mlと
撹拌した。これに、ＤＭＦ０．５ml中のフルオレセイン
化アミノＰＥＧ（ＭＷ：３４００）Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル５mgを添加した。その反応を一晩撹
拌放置し、その後、Pierce Kwik Sep（商標）ポリアク
リルアミド１８００の５ml脱塩化カラムでクロマトグラ
フィーに付した。画分（それぞれ２ml）を回収し、３２
６nmでヒューレットパッカード８４５２Aダイオードア
レー分光光度計を用いて遊離ＤＰＤを調べた。試料内の
ＤＰＤを検出するには、フルオレセイン基のバックグラ
ウンド吸光度は強すぎた。その後に画分にＤＰＤが観察
されなくなるまで、クロマトグラフィーを繰り返した。
それぞれのクロマトグラフィーの間に、生成物含有画分
を、４５℃でSavant Speed Vac Concentrator（商標）
で容積０．５mlまで濃縮した。更に２回のクロマトグラ
フィーが必要であった。
ＰＤの０．１９mlの溶液を、緩衝液として０．１M、pH
８のＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ1−
（３プロパンスルホン酸）（ＥＰＰＳ）０．４７５mlと
撹拌した。これに、ＤＭＦ０．５ml中のフルオレセイン
化アミノＰＥＧ（ＭＷ：３４００）Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル５mgを添加した。その反応を一晩撹
拌放置し、その後、Pierce Kwik Sep（商標）ポリアク
リルアミド１８００の５ml脱塩化カラムでクロマトグラ
フィーに付した。画分（それぞれ２ml）を回収し、３２
６nmでヒューレットパッカード８４５２Aダイオードア
レー分光光度計を用いて遊離ＤＰＤを調べた。試料内の
ＤＰＤを検出するには、フルオレセイン基のバックグラ
ウンド吸光度は強すぎた。その後に画分にＤＰＤが観察
されなくなるまで、クロマトグラフィーを繰り返した。
それぞれのクロマトグラフィーの間に、生成物含有画分
を、４５℃でSavant Speed Vac Concentrator（商標）
で容積０．５mlまで濃縮した。更に２回のクロマトグラ
フィーが必要であった。
【００３３】実施例II 試薬を、下記の方法でニトロセルロース膜（１６cm×６
cm）の上に付着させた。
cm）の上に付着させた。
【００３４】抗マウスＩｇＧ抗体〔ホスフェートで緩衝
したサリン（ＰＢＳ）中の１mg/ml〕の２本のバンド
を、ニトロセルロース膜の底から約３cm及び約３．５cm
のところで、それぞれ２μL/cm及び１μL/cmの量で付着
させた。
したサリン（ＰＢＳ）中の１mg/ml〕の２本のバンド
を、ニトロセルロース膜の底から約３cm及び約３．５cm
のところで、それぞれ２μL/cm及び１μL/cmの量で付着
させた。
【００３５】抗ＦＩＴＣ抗体（１９．２mg/ml、ＰＢＳ
の８ml）をＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＤＰＤ（０．５５mg/ml
ＰＢＳ）２００μLと混合し、そのＩｇＧ抗ＦＩＴＣ−
ＰＥＧ−ＤＰＤの複合体の３本のバンドを、ニトロセル
ロース膜の上に試料塗付ゾーン１２（図１）と反対の端
から約１cm、約１．５cm及び約２cmのところで、それぞ
れ２μL/cm、１μL/cm及び１μL/cmの量で付着させた。
その膜を乾燥させ、カゼイン溶液（ＰＢＳ中１％）でブ
ロッキングし、水洗し、その後、周囲条件下に乾燥し
た。
の８ml）をＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＤＰＤ（０．５５mg/ml
ＰＢＳ）２００μLと混合し、そのＩｇＧ抗ＦＩＴＣ−
ＰＥＧ−ＤＰＤの複合体の３本のバンドを、ニトロセル
ロース膜の上に試料塗付ゾーン１２（図１）と反対の端
から約１cm、約１．５cm及び約２cmのところで、それぞ
れ２μL/cm、１μL/cm及び１μL/cmの量で付着させた。
その膜を乾燥させ、カゼイン溶液（ＰＢＳ中１％）でブ
ロッキングし、水洗し、その後、周囲条件下に乾燥し
た。
【００３６】アクリルベースの接着剤を用いて、そのニ
トロセルロース膜をポリスチレン裏当てに取り付けた。
金ゾル／抗ＤＰＤ抗体パッドを、その後、ゾーン１３
（図１）に集め、続けてゾーン１２中の吸収パッドを添
加して、その細片まで試験溶液を達する（wick）のを補
助した。このアセンブリを、その後、４．２inch（１
０．５cm）×０．２inch（０．５cm）細片に裁断した。
トロセルロース膜をポリスチレン裏当てに取り付けた。
金ゾル／抗ＤＰＤ抗体パッドを、その後、ゾーン１３
（図１）に集め、続けてゾーン１２中の吸収パッドを添
加して、その細片まで試験溶液を達する（wick）のを補
助した。このアセンブリを、その後、４．２inch（１
０．５cm）×０．２inch（０．５cm）細片に裁断した。
【００３７】試験のために、試験溶液の試験管にその細
片を浸漬した。試験溶液は、ＤＰＤを様々な量で添加し
た、下記の成分を有する貯蔵溶液からなる。
片を浸漬した。試験溶液は、ＤＰＤを様々な量で添加し
た、下記の成分を有する貯蔵溶液からなる。
【００３８】
【表１】
【００３９】試験溶液がニトロセルロース膜の頂部に達
したのち、細片を試験管から取り出し、CLINITEK（登録
商標）５０反射分光光度計を用いて応答を走査した。捕
捉ゾーン及び検出ゾーンの反射率を測定し、記録した。
図２に示すように、用量／応答曲線を生成した。この用
量／応答曲線は、本発明の方法により固定化したＤＰＤ
が、この抗ＤＰＤ抗体に免疫応答性であることを示す。
したのち、細片を試験管から取り出し、CLINITEK（登録
商標）５０反射分光光度計を用いて応答を走査した。捕
捉ゾーン及び検出ゾーンの反射率を測定し、記録した。
図２に示すように、用量／応答曲線を生成した。この用
量／応答曲線は、本発明の方法により固定化したＤＰＤ
が、この抗ＤＰＤ抗体に免疫応答性であることを示す。
【図１】本発明に係る細片フォーマットを示す。
【図２】本発明による、ＰＥＧ固定ＤＰＤの容量応答曲
線を示す。
線を示す。
１０ 細片 １２ 塗付ゾーン １４ 捕捉ゾーン １６ 検出ゾーン
Claims (16)
- 【請求項１】 固体支持体上に分析対象物（又はその類
似物）を固定化する方法であって、その捕捉ゾーン内に
結合性試薬を有する固体支持体を、結合性標識−アミノ
酸−分析対象物（又はその類似物）複合体と接触させ、
その結果、結合性試薬及び複合体が固体支持体と相互作
用して、分析対象物が存在する流体試験試料に接触させ
ると、フリーの分析対象物（又はその類似物）が標識さ
れた抗−分析対象物抗体と競合的に結合できるようにそ
れに複合体を結合させることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 結合性試薬を、結合性標識−アミノ酸−
分析対象物複合体と接触させる前に、固体支持体と接触
させる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 結合性試薬を、それを固体支持体と接触
させる前に、結合性標識−アミノ酸−分析対象物複合体
と接触させて、結合性試薬−結合性標識された−アミノ
酸−ＤＰＤコンプレックスを得、次いで、これを固体支
持体と接触させる、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 固体支持体が、ニトロセルロースであ
り、結合性標識が、フルオレセイン構造を有し、そして
結合性試薬が、抗フルオレセイン抗体である、請求項１
記載の方法。 - 【請求項５】 結合性標識が、下記式： 【化１】 （式中、Ｒ1又はＲ2は、アミノ酸と共有的に結合するこ
とができる反応性基であり、他のものは水素である）で
示されるフルオレセイン構造を有し、そして結合性標識
が、抗−フルオレセイン抗体である、請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】 Ｒ1又はＲ2が、イソチオシアネート、ジ
クロロトリアジニルアミノ、ヨードアセチル、若しくは
ジクロロトリアジニル、又はＲ1又はＲ2の活性化エステ
ル（ここで、Ｒ1又はＲ2はカルボキシ基を含んでいる）
である、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 活性化エステルが、フルオレセインをＮ
−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、
ペンタフルオロフェノール、又はペンタクロロフェノー
ルと反応させることにより形成される、請求項６記載の
方法。 - 【請求項８】 抗−分析対象物−抗体が、光学的に標識
されている、請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 デオキシピリジノリンの特定のエピトー
プに特異的な標識された抗体を、流体試験媒体と合わ
せ、その流体試験媒体をその上にデオキシピリジノリン
が固定化されている固体支持体と接触させることによ
り、流体試験媒体中でデオキシピリジノリンと反応して
いない標識された抗体が、固定化されたデオキシピリジ
ノリンと反応し、次いで固定化されたデオキシピリジノ
リンにより結合させられる、流体試験媒体中のデオキシ
ピリジノリンの免疫検定方法において、 抗−抗原抗体を不可逆的に結合させることができる固体
支持体、及び抗−抗原抗体を介してデオキシピリジノリ
ンを固体支持体に結合させる抗原−アミノ酸−デオキシ
ピリジノリン複合体の使用を特徴とする方法。 - 【請求項１０】 抗原が、フルオレセイン構造を有し、
そしてアミノ酸が、カルボン酸及び第１級アミンで誘導
体化されたポリ（エチレングリコール）である、請求項
９記載の方法。 - 【請求項１１】 固体支持体が、ニトロセルロースを含
む、請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】 標識された抗体が、光学的に標識され
ている、請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】 結合性標識−アミノ酸−分析対象物複
合体が、捕捉ゾーンとは別の固体支持体のある部分に位
置し、それにより、固体支持体を流体試験試料と接触さ
せると、それが捕捉ゾーンにおいて結合性試薬により結
合させられる前に、試料中に含有されている分析対象物
及び標識された抗−分析対象物−抗体と自由に相互作用
する、請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】 流体試験媒体中の分析対象物を検出す
るための試験具であって、毛管現象により流体試験媒体
が通ることができる多孔質材料の固体支持体を含み、該
固体支持体は、結合性試薬が結合される区別された捕捉
ゾーンを有し、そして該固体支持体内に、結合性標識−
アミノ酸−分析対象物（又は分析対象物誘導体）複合体
及び標識された抗−分析対象物−抗体に対して特異的に
反応性である結合性標識を含むことを特徴とする試験
具。 - 【請求項１５】 複合体が、捕捉ゾーン上の結合性標識
を介して、その補足ゾーン中の結合性試薬に結合され
る、請求項１４記載の試験具。 - 【請求項１６】 複合体が、捕捉ゾーンとは別の試験具
中のあるゾーン内にあり、かつ、流体試験媒体と試験具
を接触させると、捕捉ゾーンに自由に流れ、その結果、
複合体上の分析対象物（又は分析対象物誘導体）が標識
された抗−分析対象物抗体について、流体試験媒体中の
分析対象物と競合的に相互作用することができ、かつ複
合体は捕捉ゾーン内の結合性試薬との相互作用で固定化
される、請求項１４記載の試験具。
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