WO2007072922A1 - 免疫測定装置及び方法 - Google Patents

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WO2007072922A1
WO2007072922A1 PCT/JP2006/325539 JP2006325539W WO2007072922A1 WO 2007072922 A1 WO2007072922 A1 WO 2007072922A1 JP 2006325539 W JP2006325539 W JP 2006325539W WO 2007072922 A1 WO2007072922 A1 WO 2007072922A1
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WO
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antibody
antigen
site
avidin
binding
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/325539
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yoko Hayashi
Osamu Takehiro
Original Assignee
Rohm Co., Ltd.
Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rohm Co., Ltd., Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. filed Critical Rohm Co., Ltd.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay device used in the field of clinical tests and the like, and more particularly to an immunoassay device capable of quantitatively measuring a measurement object in a sample with ease, speed and sensitivity.
  • the above-described microchip requires a washing operation or a complicated process such as supplying a plurality of solutions to the reaction site and reacting them, and takes a long time for measurement. There is a problem. Furthermore, there is a problem that a plurality of injection parts and introduction parts are required, and the occupied area of the chip becomes large, and a small and simple microchip cannot be obtained.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and an object of the present invention is to provide advantages of a simple immunoassay device, that is, a simple method of use, one-step operation, and measurement in a short time. It is an object of the present invention to provide an immunoassay device that has properties such as performance as it is, can handle various antigens, and can realize accurate and rapid quantitative analysis.
  • the present invention is capable of measuring the amount of antigen by specifically binding an antigen, which is a measurement object in a sample, to the first antibody, and measuring the label of the conjugate.
  • An immunoassay device comprising: (1) a first site for reacting an antigen in a sample with a first antibody that is a labeled antibody capable of specifically binding to the antigen; (2) A second site where the first antibody that is not bound to the antigen is reacted with the second antibody, which is an antibody bound to piotin or avidin. (3) Avidin strength when the second antibody is a piotin-binding antibody.
  • the third site is fixed to the immobilizing means so that the piotine cannot move to the fourth site, and the second antibody is supplemented with the immobilized avidin or piotin, and (4) Four parts of the fourth site for detecting the label of the first antibody bound to the antigen
  • the first antibody has an F (ab,) fragment or reduced IgG, and the F (ab ') fragment or reduced IgG and a labeling substance.
  • the second antibody is an antibody to which piotin or avidin is bound, and is an anti-idiotype antibody against the first antibody.
  • the immunoassay device is an anti-idiotype antibody of a kind that cannot bind to the conjugate of the antigen and the first antibody, and is contained in the second site or its adjacent part.
  • the first antibody contains an excessive amount with respect to the measurement target, and the second antibody preferably includes an excessive amount with respect to the first antibody.
  • the first antibody can be labeled with, for example, an enzyme. Further, the first antibody may be held by providing an antibody holding part adjacent to the first part.
  • the reagent for detecting the labeling substance can be held at the fourth site.
  • the reagent can be held by providing a substrate holding part adjacent to the fourth part.
  • the reagent include an electron transfer mediator or Z and a chromogenic substrate.
  • the substrate holding part is a part for holding all or part of the reagent for detecting the label in advance or immediately before use.
  • the immunoassay device of the present invention may be a biochip-like device.
  • Each of the two parts is composed of a minute space.
  • fine particles can be used as the fixing means, and the third part and the fourth part are separated by a channel part that does not allow the fine particles as fixing means to pass through. It can be set as a form to do.
  • a pair of electrodes can be formed at the fourth site, and the label can be detected by an electrochemical method.
  • the present invention also reacts an antigen as a measurement target in a sample with a first antibody that is a labeled antibody that specifically binds to the antigen, and then converts the unreacted first antibody into piotin or After reacting with a second antibody, which is an antibody to which avidin is bound, the second antibody is avidin when the second antibody is a piotin-binding antibody, and piotin when the second antibody is an avidin-binding antibody.
  • An immunoassay method for detecting a binding between an antigen that has been captured and has not been captured and a first antibody wherein the first antibody is an F (ab ′) fragment or reduced IgG, and F ( ab ′) a labeled antibody in which a fragment or reduced IgG and a labeled substance are bound at a specific binding ratio, and the second antibody is an anti-idiotype antibody to the first antibody and the bound substance between the antigen and the first antibody
  • Immunoassay a class of anti-idiotypic antibodies that cannot bind Also according to the law.
  • the immunoassay method of the present invention it is also preferable to use an excessive amount of the second antibody, which is preferably used in an excessive amount with respect to the measurement object. It is preferable. Moreover, it is preferable to detect the measurement object electrochemically or optically. The invention's effect
  • the immunoassay device of the present invention enables quantitative measurement quickly and with high sensitivity by a simple operation.
  • measurement can be performed in a shorter time by utilizing the binding property of piotin-avidin. Therefore, it can be used for emergency examinations and bedside examinations, and is extremely useful in the medical field.
  • it can be easily applied to various antigens to be measured and is highly versatile.
  • FIG. 1 is a plan view showing an embodiment of a test strip-like device of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view showing another embodiment of the test strip-like device of the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view and a cross-sectional view showing an embodiment of a biochip-like device of the present invention.
  • FIG. 4 is a plan view and a cross-sectional view showing another embodiment of the biochip-shaped device of the present invention.
  • FIG. 5 is a plan view and a sectional view showing still another embodiment of the biochip-shaped device of the present invention.
  • FIG. 6 is a calibration curve showing the relationship between the reflectance obtained in Test Example 1 and the concentration of human CRP.
  • FIG. 7 is a calibration curve showing the relationship between the absorbance change rate obtained in Test Example 2 and the concentration of human CRP.
  • FIG. 8 is a diagram briefly showing the measurement principle of the present invention.
  • the present invention relates to an immunity capable of measuring the amount of an antigen by specifically binding an antigen, which is a measurement target in a sample, to the first antibody and measuring a label of the conjugate.
  • This measuring device has the following four parts and is configured so that the solution can move in order through each part.
  • the first site is a site where the antigen in the sample reacts with the first antibody that can specifically bind to the antigen.
  • the sample solution can be added directly to the site, or a sample addition unit can be installed upstream and the sample solution can be moved to the first site.
  • the first antibody and the conjugate of the antigen and the first antibody move to the second part without being retained.
  • the first antibody is an F (ab ') fragment of a monoclonal antibody against a target antigen in a sample, or reduced IgG, which is used in ordinary immunoassay methods to bind various labels.
  • F (ab ') fragment or reduced IgG and labeled substance are bound at a specific binding ratio, ie, 1 : 1 to 1:11 (11 is an integer, but 1 to: LO is preferred)
  • This antibody is contained in the first site or its adjacent part.
  • a well-known method can be utilized for the binding of the labeled substance to the F (ab,) fragment of the monoclonal antibody.
  • the use of such a first antibody in the present apparatus is very advantageous for improving sensitivity and quantification.
  • Monoclonal antibodies are generally used for the preparation of the first antibody, and IgG is usually used. If IgG is used as it is as the first antibody, IgG usually has a bivalent binding property. Therefore, when reacted with the antigen that is the measurement target, except for the unreacted one, A conjugate with an antigen binding ratio of 1: 1 or 1: 2 will be present. This is because not all antigens always bind to the binding site contained in one molecule of IgG antibody. When a conjugate with a mixed binding ratio passes through the second site, in addition to the unreacted one, the 1: 1 conjugate is also captured, reducing sensitivity and quantification.
  • a monovalent F (ab ') fragment or a half-molecule IgG obtained by reducing IgG is used. Only the conjugate with an antigen binding ratio of 1: 1 is present, which makes it possible to improve sensitivity and quantification.
  • the first antibody may be retained in advance at the first site. Further, an antibody holding part may be provided adjacent to the first part and held there.
  • the antibody holding part can have the same shape, size, etc. as the first part, for example.
  • This antibody holding part can be a sample addition part that adds sample solution and can hold the sample solution temporarily. The sample solution and Z or the first antibody are introduced into the first part. It has a function.
  • the labeling substance of the first antibody is an enzyme, a dye, a redox substance, a colored particle, a magnetic particle, a fluorescent substance, a luminescent substance, or a substance used for general immunoassay. It can be selected as appropriate according to the required measurement sensitivity.
  • an enzyme it is preferable to use an enzyme that is hardly affected by Matritta and hardly exists in the living body or sample.
  • peroxidase, oxidase enzyme and the like are preferable.
  • the oxidase enzyme glucose oxidase, pyranosoxidase, alcohol oxidase and the like can be used.
  • Examples of other enzymes include dehydrogenase enzymes, but there are few that are not present in the living body and are inexpensively available.
  • an enzyme derived from a microorganism or bacterium having the same action as a biologically derived enzyme an antibody against the enzyme is included in the first site or the second site, and the human-derived enzyme is used. It can be used if it is configured to be removed. It is also possible to utilize the specificity of the enzyme for the substrate or coenzyme.
  • a force measurement range can be set in advance, and an amount suitable for it can be used. For example, it is appropriate to set an antigen concentration or its range that can be measured in advance and use a molar ratio of 1 to L00 times the set concentration or upper limit of the range.
  • the reaction conditions are not particularly limited, and can be set as appropriate depending on the sample solution to be measured, the type of the first antibody, and the like.
  • the temperature is preferably a condition that does not affect the activity of these substances, for example, about 20 to 40 ° C.
  • the time may be a force that can be appropriately set according to the form of the apparatus, and may be about 30 seconds to 10 minutes.
  • the second site is a site where the first antibody that is not bound to the antigen reacts with the second antibody.
  • the solution that has moved the force of the first site and the second antibody are mixed and reacted to move to the third site as they are.
  • the second antibody is an antibody conjugated with piotin or avidin, is an anti-idiotype antibody against the first antibody, and is a kind of anti-idiotype antibody that cannot bind to the conjugate of the antigen and the first antibody. It is contained in the part or its adjacent part.
  • a known method is used to bind piotin to the antibody.
  • N-hydroxysuccinimide-piotin may be used.
  • SH group obtained by reducing IgG or digesting it with pepsin to form an F (ab ′) fragment and further reducing it is used.
  • maleimide-piotin may be used.
  • a Piotini reagent introduced with a spacer in order to increase the reactivity with avidin.
  • a known method is used. For example, reducing IgG or digesting pepsin to F (ab ') fragmentation, and further reducing SH and the avidin into which the maleimide group has been introduced react.
  • a commercially available introduction reagent such as 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid-N-hydroxysuccinimide ester can be used to introduce the maleimide group into avidin.
  • introduction reagent such as 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid-N-hydroxysuccinimide ester can be used to introduce the maleimide group into avidin.
  • the anti-idiotype antibody used herein is a monoclonal antibody that recognizes the unique structure of the antigen-binding site of the antibody portion of the first antibody.
  • Anti-idiotype antibodies are known to exist in types that can and cannot inhibit the binding of an antigen to an antibody.
  • the anti-idiotype antibody that can be used in the present invention is the former, That is, it refers to a type that cannot bind to the conjugate of the antigen and the first antibody.
  • the anti-idiotype antibody can be easily prepared according to a usual method. For example, when an anti-idiotype antibody of a mouse-derived monoclonal antibody is produced, the monoclonal antibody to be used as an antigen can be administered to a mouse as a KLH complex, and then can be produced according to a conventional method for producing a monoclonal antibody. In addition, a hybridoma that produces an anti-idiotype antibody of the target type can be easily obtained by screening by ELISA. Therefore, anti-idiotype antibodies that can be used in the present invention can be easily and in large quantities produced in the same manner as ordinary monoclonal antibodies.
  • the amount of the second antibody used in the second site needs to capture the unreacted first antibody almost completely, so that an excessive amount is required relative to the amount of the first antibody. Specifically, it is preferable to use an amount 10 times or more in terms of mole.
  • an antigen can be used in place of the anti-idiotype antibody. In this case, however, from a practical standpoint, the antigen is limited to a highly stable antigen and an antigen that can be prepared in large quantities at low cost. Because of this limitation, no antigen is used in the device of the present invention.
  • the reaction conditions at the second site are not particularly limited and can be set as appropriate.
  • the temperature is preferably a condition that does not affect the activity of these substances, for example, about 20 to 40 ° C.
  • the time can be appropriately set according to the form of the apparatus, but it may be about 30 seconds to 10 minutes.
  • the third site is fixed to the fixing means so that avidin is not able to move to the fourth site when the second antibody is a piotin-binding antibody, and when the second antibody is an avidin-binding antibody, A site where the second antibody is supplemented with the immobilized avidin or piotin.
  • the second antibody bound to the unreacted first antibody and the unreacted second antibody are captured by the immobilizing means and the third site force moves.
  • the conjugate of the antigen and the first antibody does not contain avidin or piotin, it will move to the fourth site without being captured by the fixing means.
  • the avidin used in the present invention can be used regardless of its origin. For example, avidin derived from egg white, streptavidin derived from actinomycetes, and the like can be used.
  • the immobilization means is capable of immobilizing avidin or piotin. As long as it does not affect the reaction and is not particularly limited, it can be appropriately adjusted depending on the measurement object, the type of labeled antibody, the type of anti-idiotype antibody, and the like.
  • the shape include carriers in the form of filters, fabrics, fine particles, fibers, and the like.
  • the material include glass, filter paper, nylon, polystyrene, and the like.
  • porous materials such as glass fiber membranes, porous membranes, filter papers, and nylon membranes are preferable.
  • the fine particle carrier glass beads, polymer beads such as polystyrene, and porous carriers such as agarose and chitosan are preferable.
  • a method for immobilizing avidin or piotin any of publicly known methods such as physical adsorption, covalent bond, ionic bond, cross-linking and electrostatic interaction can be used.
  • the fixing method is avidin.
  • the use of avidin or piotin as the substance to be immobilized on the immobilizing means is useful for shortening the reaction time.
  • This effect of shortening the reaction time is particularly remarkable when the fixing means is fine particles and is present in a dispersed state in a solution such as a buffer solution.
  • the second antibody bound to the unreacted first antibody and the unreacted second antibody are kept for 30 seconds to 5 minutes, and under optimum conditions, 30 seconds to It became clear that it could be completely captured in 1 minute. This is a factor that greatly contributes to shortening the measurement time in the present invention.
  • the fourth site is a site for detecting the labeled product of the first antibody bound to the antigen, and a known detection method can be used for detecting the labeled product depending on the labeled product.
  • Reagents for detecting the label can be included in the fourth site. These reagents can be contained entirely in the fourth site, or some reagents can be contained in the third site, the second site, the first site, or another site. It is also possible to leave.
  • a substrate holding part can be provided adjacent to the fourth part and included therein. The substrate holding part is connected to the fourth part in series or in addition, with or without a flow path, and has the same shape, size, etc. as the first part. can do.
  • a reflectance meter It is carried out using a spectrophotometer, a fluorescence detector or the like.
  • Reagents for detecting the label are appropriately selected according to the label.
  • the labeling substance is an enzyme, a chromogenic substrate, a fluorescent substrate, a luminescent substrate, an organic acid or an inorganic acid, an electron conduction mediator that can function as an electron transfer medium that can exchange electrons between the electrode and the measurement object, etc.
  • the labeling substance is an enzyme, a chromogenic substrate, a fluorescent substrate, a luminescent substrate, an organic acid or an inorganic acid, an electron conduction mediator that can function as an electron transfer medium that can exchange electrons between the electrode and the measurement object, etc.
  • a dehydrogenase-based enzyme a combination of NAD or NADP, enzyme substrate, diaphorase, and chromogenic substrate can be used.
  • peroxidase a combination of an organic acid or an inorganic acid and a chromogenic substrate can be used.
  • an oxidase-based enzyme a combination of an enzyme substrate, a color substrate, and a per
  • Examples of the chromogenic substrate, fluorescent substrate, and luminescent substrate include 1,2-phenylenediamine (OPD), 3, 3 ', 5, 5, monotetramethylbenzidine (TMBZ), 2, 2, monoazinobis-1, 3 -Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (8-chome 3), 3- (4-hydroxyphenol) propionic acid (HPPA), tyramine, luminol, luciferin and the like.
  • Examples of the organic acid or inorganic acid include hydrogen peroxide, formic acid, acetic acid and the like.
  • reagents generated in the apparatus can be used.
  • glucose and glucose oxidase can be used as reagents for generating hydrogen peroxide in the apparatus.
  • it can be achieved by preparing two holding points at the holding part and mixing them after starting the measurement. It is also possible to hold it at an outside site.
  • Examples of the electron transfer mediator include Huaisen, Ferricyan ⁇ alkali metal (Felicyan ⁇ potassium, ferricyanide lithium, ferricyan ⁇ sodium, etc.) or alkyl substitutes thereof (methyl, ethyl, propyl substitutes, etc.). ), Methylene blue, phenazine methosulfate, ⁇ -benzoquinone, 2,6-dichlorophenol indophenol, 13-potassium naphthoquinone-4-sulfonate, phenazine etsulfate, viologen, vitamin K, etc.
  • Huekousen, ferricyanium potassium and the like are preferable.
  • the measurement target in the present invention refers to a test target in a general clinical test or the like, and specifically includes various components contained in blood, urine, saliva, secretion, etc., tissue, feces, etc. These are various components contained in the extract from the solid product.
  • a low molecular weight substance capable of binding only a single monoclonal antibody with only a substance having a large molecular weight capable of binding a plurality of monoclonal antibodies.
  • hapten capable of binding only a single monoclonal antibody with only a substance having a large molecular weight capable of binding a plurality of monoclonal antibodies.
  • FIG. 8 briefly shows the measurement principle of the present invention.
  • the upper part (a) in the figure shows the entire device 5 in a perspective view.
  • the arrow X in the figure indicates the direction of sample flow.
  • the first antibody B that did not react with the antigen A is bound to the second piotin-binding antibody C, and further to the third site avidin, and the third site 3 to the fourth site. Cannot move to 4.
  • the first antibody B that has reacted with the antigen A passes through the second part 2 and the third part 3 and reaches the fourth part 4.
  • the fourth site 4 only the first antibody B that has reacted with the antigen A is detected.
  • the immunoassay method of the present invention can be easily carried out using the immunoassay apparatus of the present invention, and therefore further explanation is omitted.
  • a test strip-like device called a test piece and a nanochip-like device will be described in detail.
  • FIG. 1 and FIG. 2 illustrate a test strip-shaped apparatus.
  • the device 5 is composed of a first part 1, a second part 2, a third part 3, and a fourth part 4 force.
  • Each of these parts can be composed of various materials and morphological forces, and among these, it is preferable that the parts are composed of a porous carrier such as a glass fiber membrane, a porous membrane, a filter paper, and a nylon membrane.
  • the sample solution or a part of the sample solution provided to the first part is sequentially developed or sent, passes through the second part, and further passes through the third part to reach the fourth part.
  • a filter-like, woven or fibrous porous body As a means to fix the third part.
  • the fixing means When fine particles are used as the fixing means, it is preferable to use particles whose size is larger than the pore size of the porous carrier constituting the third part! /.
  • a blood cell separation membrane, an ion exchange membrane or the like can be used.
  • the size of each part is not particularly limited. The force that is necessary to have a sufficient size to realize this purpose is appropriately determined according to the type, amount, reaction time, etc. of these substances.
  • FIG. 2 shows an example of such an apparatus in which each part is preferably arranged on a support made of plastic sheet or the like.
  • the first part 1, the second part 2, the third part 3, and the fourth part 4 are arranged on the support 6, and these constitute the device 5. Yes.
  • FIGS. 3 and 4 illustrate a biochip-like device.
  • Each of the first part 1, the second part 2, the third part 3 and the fourth part 4 is composed of a minute space, and each is connected via a flow path or a flow path. Not directly connected in series.
  • the microchannel 31 is connected.
  • the sample solution provided to the first part or a part thereof is sequentially transferred, passes through the second part, passes through the third part, and reaches the fourth part.
  • a volume of 0.5 to 1.5 is provided between each of the first site, the second site, the third site, and the fourth site.
  • An L weighing unit can also be provided.
  • the fixing means is the fine particle 41
  • the third portion 3 and the fourth portion 4 are separated by the channel portion 32 that does not allow the fixing means to pass.
  • sites antibodies holding unit 42, substrate holding unit 43
  • Each site, antibody holding part and Z or substrate holding part flow in series or additionally. They are connected with or without a path.
  • the substrate holding part it can have the same shape and size as the first part. Thereby, the reagents can be held in the substrate holding part in advance or immediately before use.
  • the cross-sectional area is about 0. Ol / zm 2 ⁇ : about LOOmm 2 and the length is about 1 ⁇ m ⁇ 100 mm. Is mentioned.
  • the first site, the other site is defined as a separate space, its size 10- 2 ⁇ : L0 3 mm 3 is preferably about.
  • the shape is not particularly limited as long as it is suitable for mixing purposes.
  • the shape of the plane and the cross-section are polygons such as a rectangle and a trapezoid, and the corners are rounded. Any shape such as a circular shape or a non-symmetrical shape that is asymmetrical to the left and right may be used.
  • An inlet 33 for injecting a sample solution from the outside is formed in the first part or its adjacent part.
  • the first antibody may be held in advance in the first site.
  • the antibody holding part when the antibody holding part is installed in the adjacent part of the first part, the antibody holding part may be formed instead of or in addition to the injection port for injecting the sample solution described above.
  • This antibody holding part can have, for example, the same shape and size as the first part.
  • the second site, the other site is defined as a separate space, its size 10- 2 ⁇ : L0 3 mm 3 is preferably about.
  • the shape can be set in various forms, similar to the first part.
  • the second antibody may be held in advance in the second site.
  • an antibody holding part may be installed adjacent to the second part to hold the second antibody.
  • the antibody holding part can have the same shape and size as the second part and the like.
  • the third part is defined as a space separate from the other parts, and includes a fixing means therein. Therefore, the third part needs to have a sufficient space for holding the fixing means, but can be appropriately set according to the type and amount of the fixing means. For example, about 10- 2 ⁇ 10 3 mm 3 are preferred. Moreover, the shape can be set to various forms like the 1st site
  • the fixing means is housed in the third part, and it is preferable to use fine particles.
  • the diameter is preferably about 10 m to lmm.
  • the channel portion has a diameter smaller than the diameter of the fixing means existing in the third region.
  • the “diameter” can be a width, a height, a length, etc. depending on the shape of the fixing means and the Z or the channel portion, but the “diameter” of the fixing means is one unit of the fixing means. It is appropriate that the maximum length (width) and the “diameter” of the channel portion be the minimum length (width) in the cross section of the channel portion.
  • the channel portion has a function not to allow the fixing means to pass through the outlet (preferably also at the inlet) of the third part in order to stop the fixing means existing in the third part only within the third part. Or give a shape.
  • the channel portion is the flow channel itself, for example, the channel may be a flow channel having a diameter smaller than the diameter of the fixing means, or one or more convex portions may be formed in a part of the flow channel, It may include a portion that narrows the diameter.
  • the fourth part is defined as a space separate from other parts, and the size and shape of the fourth part can be appropriately set according to the detection method (method), the type and amount of the sample solution, and the like. .
  • 10- 2 ⁇ : in L0 3 mm 3 about the size can be set to various shapes.
  • the detection method is an optical method
  • the sample solution, the target substance, or the substrate force is irradiated with light at the fourth site so that the generated product can be detected. It is necessary to have a shape and size that can ensure an optical path of a predetermined length.
  • a pair of electrodes 51 made of a conductive material is provided at the fourth site so that the charge of the solution containing the sample solution can be detected. It must be formed so that it comes into contact with the solution.
  • any material can be used as long as it is not particularly limited as long as it is a material, size, and shape that can normally function as electrodes.
  • graphite, carbon, carbon fabric, etc., metal or alloy such as gold, platinum, silver, copper, aluminum, etc., single layer or two or more such as conductive oxides such as SnO, InO, WO, TiO, etc.
  • This electrode may be formed by attaching a conductive material piece to a biochip or by embedding a part thereof, or by using a printing method such as a screen printing method using a conductive agent paste.
  • the biochip can be formed of the same material as the conventional chip called by various names described above.
  • PET polyethylene terephthalate
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • PC polycarbonate
  • PP polypropylene
  • PS polystyrene
  • PVC polyvinyl chloride
  • polyethylene polysiloxane
  • organic compounds such as aryl ester resin and cycloolefin polymer, or inorganic compounds such as zeonore, silicon, quartz, glass and ceramic.
  • This biochip is obtained, for example, by bonding a first substrate and a second substrate having patterns of various shapes due to recesses on one or both sides, for example, by welding, an adhesive, ultrasonic treatment, or the like. It can be easily manufactured. Specifically, a mold having a shape corresponding to a desired first to fourth portion, holding portion, flow path, and the like is prepared. This mold can be formed by mechanical processing. Next, a substrate on which the shape of each part is transferred is obtained by molding a resin into the mold. Finally, two substrates are laminated so that the patterns face each other. In addition, it is good also considering the board
  • the biochip of the present invention may be handled manually (for example, sample introduction, mixing, stirring, sample transfer, detection, etc.), mechanically, or only partly. It may be done mechanically. For example, a method using a pump or a method using vibration or centrifugal force can be used for stirring and mixing and transferring of a sample and the like.
  • a 0.5 mg ZmL solution of the above immunogen (1 mL) and complete Freund's adjuvant (1 mL) were mixed and emulsified, and 200 L was intraperitoneally administered to 8-week-old BALB / c mice. Thereafter, 200 L of the above immunogen-incomplete Freund's adjuvant mixed emulsion was intraperitoneally administered three times every two weeks. Furthermore, 100 weeks of the above-mentioned 0.5 mgZmL immunogen was intravenously injected 2 weeks after the third administration.
  • mice-powered spleen was removed, and the spleen cells were suspended in DMEM medium and washed.
  • a mouse myeloma cell line P3X63Ag8 (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was cultured in a logarithmic growth phase in accordance with cell fusion and collected by centrifugation. Cell fusion was performed using the PEG method (P EG4000).
  • Neubridoma was cultured in DMEM medium containing 10% FCS and HAT medium and screened by the following method.
  • the primary screening of the hyperidoma culture supernatant consists of a purified F (ab,) fragment obtained by digestion with anti-human CRP mouse monoclonal antibody pepsin as a solid phase antigen, and a commercially available HRP-labeled goat anti-mouse IgG ( Fc) antibody (ICN
  • 13D was expanded and anti-idiotypic antibodies were collected.
  • the supernatant of the culture supernatant was purified using a protein A column (Amersham Biosa Carried out by Jiens).
  • F (ab ') fragment solution was diluted with 0.1M phosphate buffer containing 5mM EDTA by ultrafiltration membrane.
  • HRP horseradish rust peroxidase
  • 0.1 M phosphate buffer ( ⁇ 7.0) 750 / ⁇ phosphate buffer ( ⁇ 7.0) 750 / ⁇ .
  • Dissolve 2 mg of 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane 1-carboxylic acid-N-hydroxysuccinimide ester (G-ben Chemical Tokyo) in DMF120 / z L add 75 L of HRP solution and add 1 at 30 ° C. Reacted for hours. After the reaction, it was purified by gel filtration to obtain 2.6 mg of maleimidine HRP.
  • BSA (10 mg) and sucrose (10 mg) were dissolved in 10 mL of PBS buffer.
  • a 20 g / mL solution of the piotin-labeled anti-idiotype antibody prepared in Example 1 was prepared using this solution.
  • This solution is impregnated with filter paper (manufactured by Whatman Japan), dried, and then cut into 10 mm x 5 mm.
  • a double-sided adhesive tape with a width of 25 mm from the upper end was attached to a plastic plate (60 mm X 5 mm) as a support.
  • the upper end of this plastic plate was left about 5 mm, and the membrane (3) was pasted and fixed.
  • the filter paper of (4) was pasted and fixed so as to overlap the upper end of the membrane of (3) by about 2 mm.
  • the filter paper of (2) was affixed and fixed so that the lower end of the membrane of (3) overlapped by about 2 mm.
  • the filter paper of (1) was affixed and fixed so that the lower end of the filter paper of (2) overlapped by about 2 mm.
  • Test Example 1 CRP quantitative measurement using a test strip-shaped device
  • Example 2 Production of CRP measuring device in biochip form
  • a biochip is manufactured by arranging a first part, a second part, a third part, and a fourth part in series with a recess on one side, between the third part and the fourth part.
  • the first substrate and the second substrate having a pattern with a channel were bonded to each other.
  • a measuring unit having a volume of 0.5 to 1.5 L was provided between the first part, the second part, the third part, and the fourth part.
  • the first part was a space of about 50 mm 2 (planar area) X 1 mm (depth).
  • 10 L of the 0.05 mg ZmL solution of the HRP-labeled anti-human CRP antibody prepared in Example 2 was injected.
  • the second region was a space of about 50 mm 2 (planar area) X 1 mm (depth).
  • the anti-idiotype antibody solution 4.2 mgZdL solution prepared in Example 1 was injected.
  • the third region was a space of about 50 mm 2 (planar area) X 1 mm (depth). 10 ⁇ L of avidin-immobilized Sepharose gel (Avidin binding amount: lOmg / mL gel) was introduced therein. Avidin-immobilized Sepharose gel was prepared using NHS-activated Sepharose (manufactured by Amersham Biosciences), and the method of immobilizing avidin on the gel was in accordance with the supplier's recommended method.
  • the fourth part was shaped to have a length of about 100 mm and a cross-sectional area of about 1 mm 2 in order to measure absorbance as an optical detection.
  • a coloring reagent 20 L of SAT-Blue (manufactured by Dojin University) was injected.
  • a channel portion that does not allow the fixing means to pass is provided between the third part and the fourth part, and the width is set to about 100 m and the depth is set to about 200 m.
  • the first part, the second part, the third part, and the fourth part were connected in series with a microchannel.
  • Test Example 2 CRP quantitative measurement using the biochip-like device of Example 2
  • a solution containing 0, 2.5, 5, 7.5, lOmgZdL CRP was used as a specimen.
  • 1.5 L of the sample was added to the first part of the biochip produced in Example 2, 1.5 L of the sample was added.
  • the solution was sequentially passed through the first part, the second part, and the third part.
  • a generally well-known method was used for measuring the solution between the sites.
  • centrifugal force was used for liquid feeding, and mixing was performed by causing turbulent flow by centrifugal force.
  • the rate of change in absorbance at 670 nm was measured at the fourth site.
  • Calibration curve showing the relationship between the obtained rate of change in absorbance and the concentration of human CRP This is shown in Fig. 7. According to this, a good calibration curve was shown from a low concentration, and it was found that CRP can be quantified with a biochip.
  • the biochip of this example is composed of a pair of carbon black electrodes on a fourth part. 25, and the same configuration as the biochip of Example 2 except that a redox substance was further filled.
  • the electrode was about 10 mm long and about 15 m thick and was made of carbon paste. These electrodes were arranged at positions corresponding to the fourth part of the lower substrate constituting the biochip. When the upper substrate is bonded to the lower substrate, a part of the electrode is located inside the biochip and a part is exposed. Also, instead of SAT-Blue, 5 mM hydrogen peroxide and 3 mM feces were injected into the fourth site as a substrate.
  • Test Example 3 CRP quantitative measurement using the biochip-like device of Example 3

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Abstract

  使用方法が簡便、１段階操作、短時間に測定可能で、様々な抗原に対応可能であり、正確かつ迅速な定量分析を実現できる免疫測定装置を提供する。本発明は、（１）試料中の抗原と、前記抗原に特異的に結合できる標識抗体である第１抗体とを反応させる第１の部位、（２）抗原と結合していない第１抗体とビオチン又はアビジンを結合させた抗体である第２抗体とを反応させる第２の部位、（３）第２抗体がビオチン結合抗体の場合はアビジンが、第２抗体がアビジン結合抗体の場合はビオチンが第４の部位に移動できないように固定手段に固定され、第２抗体を前記固定されたアビジン又はビオチンで補足する第３の部位、及び、（４）抗原と結合した第１抗体の標識物を検出する第４の部位　の４つの部位を有し、第１抗体は、抗体部分がＦ（ａｂ’）フラグメント又は還元IgGで、Ｆ（ａｂ’）フラグメント又は還元IgGと標識物とが特定の結合比で結合した標識抗体で、第２抗体は、ビオチン又はアビジンを結合させた抗体で、第１抗体に対する抗イディオタイプ抗体でかつ抗原と第１抗体との結合物には結合できない種類の抗イディオタイプ抗体である、免疫測定装置。

Description

明 細 書
免疫測定装置及び方法
技術分野
[0001] 本発明は、臨床検査等の分野で利用される免疫測定装置に関するものであり、簡 便、迅速かつ高感度に、検体中の測定対象物を定量的に測定できる免疫測定装置 に関する。
背景技術
[0002] 血液、尿などの生体試料中に含まれる物質を測定する方法として、使用方法が簡 便で短時間で測定できる簡易型の免疫測定装置が開発されている。近年、この装置 は、緊急検査、ベッドサイド等での検査などに広く使用されるようになって、その重要 性、有用性が増大してきた。
[0003] 簡易型の免疫測定装置としては、ィムノクロマト法、フロースルー法、免疫センサ法 等を原理とした測定装置が知られている。これらの装置に用いられている方法は、試 料を添加後、抗原抗体反応を行 、つつ溶液が担体上を上下又は左右に移動して、 最終的に測定対象物量に相当するシグナルが得られるという原理に基づいており、 その構造も比較的簡単である。シグナルの検出法は、抗体に金コロイドや着色ラテツ タスに代表される着色粒子を標識して、検出ラインや検出面の呈色を読みとる方法が 一般的に用いられている。この他にも、測定操作が複雑になるが、酵素反応による呈 色等も利用されている。
[0004] これらの簡易型の免疫測定装置は、基本的に測定対象物の有無を判定するため の定性用として利用されている。しかし、近年、より有益な診断を実施するために、こ れらの装置を利用した定量ィ匕の試みがなされている。これらの試みは、測定後の検 出ラインの色調が、測定対象物の量 (濃度）に依存して変化することに基づいている 。具体的には、検出ラインの色調を判読する方法として、反射率計で測定する方法、 CCDイメージセンサで画像解析する方法 (特開平 8— 334511、特開 2000— 2667 51)、電気伝導度による方法 (特開 2001— 337065)などが開発されている。
[0005] また、同様の免疫測定装置において、全標識抗体のうち、未反応の標識抗体を捕 捉し、捕捉されなカゝつた標識抗体 (すなわち、反応した標識抗体)を測定するという方 法に関する装置を開示する先行技術がある。例えば、 US5705338号、特開平 4— 16745号、特開 2003— 262636号等である。し力し、これらの測定装置は、十分な 定量性を備えていない。更に、同様の先行技術で、抗イディォタイプ抗体の使用に ついては、特開平 7— 151757に開示されている。
[0006] 近年、さらに Lab on Chipと呼ばれる技術が注目されている。この技術は、分析する 対象の種類によって、臨床分析チップ、環境分析チップ、遺伝子分析チップ (DNA チップ）、たんぱく質分析チップ (プロテオームチップ）、糖鎖チップ、クロマトグラフチ ップ、細胞解析チップ、製薬スクリーニングチップなどと称される数センチの大きさの 基板 (バイオチップ)上で混合、反応、分離、測定及び検出等を行うものである。例え ば、このマイクロチップ上で、各種の抗原 抗体反応による免疫分析を行う方法が特 開 2001— 4628【こ記載されて!ヽる。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 上述した定量ィ匕の試みは、定性用の装置力 得られた検出結果を機器で測定して 定量ィ匕しょうと応用検討したものである。そのため、呈色の色調又は強度差が微妙で あり、定量範囲が狭ぐ十分な定量性が確保されているとは言い難い。検出方法に酵 素反応を利用した場合は、定量化や高感度化に対して有効であるが、洗浄操作や 試液の添加等の操作が必要になり、ノックグラウンド上昇等の課題もある。
[0008] また、上述したマイクロチップでは、洗浄操作が必要であったり、反応を行う部位に 複数の溶液を供給して反応させる等の煩雑な工程が必要で、測定に長時間を要す るという問題がある。さらに、複数の注入部及び導入部を必要とし、チップの占有面 積が大きくなり、小型で簡易なマイクロチップとすることができないという問題もある。
[0009] 本発明は上記した問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、簡易型 の免疫測定装置の長所、すなわち、使用方法が簡便、 1段階操作、短時間に測定可 能等の性質をそのまま有すると共に、様々な抗原に対応可能であり、正確かつ迅速 な定量分析を実現できる免疫測定装置を提供することにある。
課題を解決するための手段 [0010] 本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、装置内に 4つの異なる部位を有した装置と して構成することによって、正確かつ迅速な定量分析を実現できる免疫測定を行うこ とができることに想到し、本発明を完成させた。
[0011] すなわち本発明は、試料中の測定対象物である抗原と第 1抗体を特異的に結合さ せて、その結合体の標識物を測定することにより抗原量を測定することが可能な免疫 測定装置であって、 1つの装置内に、（1)試料中の抗原と、前記抗原に特異的に結 合できる標識抗体である第 1抗体とを反応させる第 1の部位、（2)抗原と結合していな い第 1抗体とピオチン又はアビジンを結合させた抗体である第 2抗体とを反応させる 第 2の部位、（3)第 2抗体がピオチン結合抗体の場合はアビジン力 第 2抗体がアビ ジン結合抗体の場合はピオチンが第 4の部位に移動できないように固定手段に固定 され、第 2抗体を前記固定されたアビジン又はピオチンで補足する第 3の部位、及び 、 （4)抗原と結合した第 1抗体の標識物を検出する第 4の部位 の 4つの部位を有し、 それぞれの部位を順に溶液が移動できるように構成され、第 1抗体は、抗体部分が F (ab， )フラグメント又は還元 IgGで、 F (ab ' )フラグメント又は還元 IgGと標識物とが特 定の結合比で結合した標識抗体であって、第 1の部位又はその隣接部に含まれ、第 2抗体は、ピオチン又はアビジンを結合させた抗体で、第 1抗体に対する抗ィディォ タイプ抗体でかつ抗原と第 1抗体との結合物には結合できない種類の抗ィディオタィ プ抗体であって、第 2の部位又はその隣接部に含まれて 、る免疫測定装置である。
[0012] 本発明の免疫測定装置では、第 1抗体は測定対象物に対して過剰量含まれている ことが好ましぐ第 2抗体も第 1抗体に対して過剰量含まれていることが好ましい。第 1 抗体は、例えば、酵素で標識することができる。また、第 1抗体は、第 1の部位の隣接 部に抗体保持部を設けて、そこに保持させてもよい。
[0013] 標識物を検出するための試薬は、第 4の部位に保持させておくことができる。また、 当該試薬は、第 4の部位の隣接部に基質保持部を設けて、ここに保持させておくこと もできる。当該試薬としては、電子伝達メディエータ又は Z及び発色基質等を例示す ることができる。基質保持部とは、標識物を検出するための試薬の全部又は一部を、 予め又はその使用直前に保持させておく部位である。
[0014] 本発明の免疫測定装置は、バイオチップ状の装置とすることもできる。この場合、 4 つの部位はそれぞれ微小空間から構成され、固定手段としては例えば微粒子を使 用することができ、第 3の部位と第 4の部位とを、固定手段である微粒子を通過させな いチャネル部によって分離する形態とすることができる。このようなバイオチップ状の 装置においては、第 4の部位に一対の電極を形成して、電気化学的方法で標識物を 検出することができる。
[0015] 本発明はまた、試料中の測定対象物である抗原と、前記抗原に特異的に結合する 標識抗体である第 1抗体とを反応させ、次に未反応の第 1抗体をピオチン又はアビジ ンを結合させた抗体である第 2抗体と反応させた後、前記第 2抗体を前記第 2抗体が ピオチン結合抗体の場合はアビジンで、前記第 2抗体がアビジン結合抗体の場合は ピオチンで捕捉し、捕捉されな力つた抗原と第 1抗体との結合物を検出する免疫測 定方法であって、前記第 1抗体は、抗体部分が F (ab' )フラグメント又は還元 IgGで、 F (ab' )フラグメント又は還元 IgGと標識物とが特定の結合比で結合した標識抗体で あり、前記第 2抗体は、第 1抗体に対する抗ィディオタイブ抗体でかつ抗原と第 1抗体 との結合物には結合できない種類の抗ィディオタイブ抗体である免疫測定方法にも 係る。
[0016] 本発明の免疫測定方法においては、やはり、第 1抗体を測定対象物に対して過剰 量添加使用することが好ましぐ第 2抗体も第 1抗体に対して過剰量使用することが好 ましい。また、測定対象物の検出は、電気化学的又は光学的に行うのが好ましい。 発明の効果
[0017] 本発明の免疫測定装置は、簡便な操作で迅速かつ高感度に定量的な測定を可能 にする。特に、ピオチン—アビジンの結合性を利用することにより、より短時間での測 定が可能である。従って、緊急検査やベッドサイド検診に利用でき、医療分野に於け る有用性は極めて高い。また、様々な測定対象抗原に対して容易に応用でき、汎用 '性が高い。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]本発明のテストストリップ状の装置の一実施形態を示す平面図である。
[図 2]本発明のテストストリップ状の装置の別の実施形態を示す平面図である。
[図 3]本発明のバイオチップ状の装置の一実施形態を示す平面図及び断面図である [図 4]本発明のバイオチップ状の装置の別の実施形態を示す平面図及び断面図で ある。
[図 5]本発明のバイオチップ状の装置のさらに別の実施形態を示す平面図及び断面 図である。
[図 6]試験例 1で得られた反射率とヒト CRPの濃度との関係を示す検量線である。
[図 7]試験例 2で得られた吸光度変化率とヒト CRPの濃度との関係を示す検量線であ る。
[図 8]本発明の測定原理を簡潔に示す図である。
符号の説明
1 第 1の部位
2 第 2の部位
3 第 3の部位
4 第 4の部位
5 装置
6 支持体
11 抗原
12 第 1抗体 (標識抗体）
13 第 2抗体
14 第 2抗体がピオチン結合抗ィディオタイブ抗体の場合はアビジン、第 2抗体 がアビジン結合抗ィディォタイプ抗体の場合はピオチン
15 第 2抗体がピオチン結合抗ィディオタイブ抗体の場合はピオチン、第 2抗体 がアビジン結合抗ィディォタイプ抗体の場合はアビジン
31 微小流路
32 チヤネノレ咅
33 注入口
41 微粒子
42 抗体保持部 43 基質保持部
51 電極
発明を実施するための最良の形態
[0020] 以下に本発明を更に詳細に説明する。
[0021] 本発明は、試料中の測定対象物である抗原と第 1抗体を特異的に結合させて、そ の結合体の標識物を測定することにより抗原量を測定することが可能な免疫測定装 置であって、以下の 4つの部位を有し、それぞれの部位を順に溶液が移動できるよう に構成されている。
[0022] 第 1の部位は、試料中の抗原と、前記抗原に特異的に結合できる第 1抗体とを反応 させる部位である。試料溶液は、直接当該部位に添加することもできるし、上流部に 試料添加部を設置して、第 1の部位に試料溶液が移動するように構成することもでき る。この第 1の部位では、試料溶液添加後、第 1抗体及び抗原と第 1抗体の結合物は 、保持されることなく第 2の部位へ移動する。第 1抗体は、試料中の測定対象物であ る抗原に対するモノクローナル抗体の F (ab' )フラグメント又は還元 IgGに、通常の免 疫測定法に利用されて 、る様々な標識物を結合させたもので、 F (ab' )フラグメント 又は還元 IgGと標識物とが特定の結合比、即ち、 1 : 1乃至1 : 11 (11は整数、ただし、 1 〜： LOが好ましい）のいずれかで結合した抗体であり、第 1の部位又はその隣接部に 含まれている。尚、モノクローナル抗体の F (ab，）フラグメントィ匕ゃ F (ab，）フラグメント への標識物の結合は、公知の方法が利用できる。さらに、最終結合物に混入する未 反応の酵素又は未標識の抗体は、精製によって完全に除去しておくことが好ましい。
[0023] 本装置においてこのような第 1抗体を用いることは、感度の向上や定量性の向上に 対して非常に有利である。第 1抗体の調製には一般的にモノクローナル抗体が用い られ、通常 IgGが使用される。第 1抗体として IgGをそのまま用いると、 IgGは通常 2価 結合性を有しているので、測定対象物である抗原と反応させた場合には、未反応の ものを除くと、第 1抗体と抗原の結合比が 1： 1または 1： 2の結合物が混在することに なる。これは、 IgG抗体 1分子に含まれる結合部位には、常に抗原がすべて結合する わけではないためである。結合比が混在した結合物が第 2の部位を通過すると、未反 応のものに加えて、 1 : 1の結合物も捕捉されることになり、感度や定量性を低下させ る要因となる。これに対し、本発明では、 1価結合性の F (ab ' )フラグメント又は IgGを 還元して得られる半分子の IgGを使用しているため、未反応のものを除くと、第 1抗体 と抗原の結合比が 1： 1の結合物しか存在しないことになり、感度や定量性を向上させ ることが可能となる。
[0024] 第 1抗体は、第 1の部位に予め保持させてもよい。また、第 1の部位の隣接部に抗体 保持部を設けて、そこに保持させてもよい。この抗体保持部は、例えば、第 1の部位 等と同様の形状、大きさ等とすることができる。この抗体保持部は、試料溶液を添カロ する試料添加部とすること、また、一時的に試料溶液を保持することもでき、第 1の部 位へ試料溶液及び Z又は第 1抗体を導入する機能を有する。
[0025] 第 1抗体の標識物は、酵素、色素、酸化還元物質、着色粒子、磁性粒子、蛍光物 質、発光物質、フエ口セン等の一般的な免疫測定に用いられているものが使用可能 であり、必要な測定感度等に応じて適宜選択できる。酵素を使用する場合は、マトリ ッタスの影響を受けにく 、酵素、生体内又は試料にほとんど存在しな 、酵素を使用 するのが好ましい。例えば、パーォキシダーゼ、ォキシダーゼ系酵素等が好ましいも のとして挙げられる。ォキシダーゼ系酵素としては、グルコースォキシダーゼ、ピラノ ースォキシダーゼ、アルコールォキシダーゼ等を用いることが出来る。その他の酵素 としては、デヒドロゲナーゼ系酵素が挙げられるが、生体内に存在しないもので安価 に入手可能なものはほとんどない。生体由来の酵素と同じ作用を有する微生物或い は細菌等由来の酵素を用いる場合は、第 1の部位又は第 2の部位に当該酵素に対 する抗体等を含ませて、ヒト由来の酵素を除去するよう構成すれば利用可能である。 また、酵素の基質又は補酵素に対する特異性を利用することも可能である。例えば、 Leuconostoc mesenteroides由来のグノレコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼでネ甫酵素 に NADを用 V、た場合では、ヒト由来の本酵素は NADP依存性なのでヒト由来の酵 素は作用しな!ヽため、試料中に存在しても問題はな!/ヽ。
[0026] 第 1抗体は、通常、試料溶液に含まれる抗原に対して過剰量用いることが好ましい 力 測定範囲を予め設定して、それに適した量を用いることもできる。例えば、予め測 定可能な抗原濃度又はその範囲を設定しておき、モル比でその設定した濃度又は 範囲上限の 1〜： L00倍量を使用することが適当である。試料溶液と第 1抗体を混合し て反応させる場合の条件は、特に限定されるものではなぐ測定しょうとする試料溶 液、第 1抗体の種類等により適宜設定することができる。温度は、これらの物質の活 性に影響を与えない条件、例えば、 20〜40°C程度が好ましい。時間は、適宜装置 の形態により設定することができる力 30秒間〜 10分間程度であれば良い。
[0027] 第 2の部位は、抗原と結合していない第 1抗体と第 2抗体とを反応させる部位である 。この第 2の部位では、第 1の部位力 移動してきた溶液と第 2抗体とが混合され反応 し、そのまま第 3の部位へ移動する。第 2抗体は、ピオチン又はアビジンを結合させた 抗体で、第 1抗体に対する抗ィディオタイブ抗体でかつ抗原と第 1抗体との結合物に は結合できな 、種類の抗ィディオタイブ抗体であり、第 2の部位又はその隣接部に含 まれている。
[0028] 抗体へピオチンを結合させるには、公知の方法が用いられる。例えば抗体のァミノ 基を利用する場合は、 N—ヒドロキシスクシンイミドーピオチンを使用すればよい。ま た、 IgGを還元、又はペプシン消化して F (ab' )フラグメント化し、さらに還元して得ら れる SH基を利用する場合には、マレイミド—ピオチンを使用すればよい。この場合、 アビジンとの反応性を高くするために、スぺーサ一を導入したピオチンィ匕試薬を使用 するのが好ましい。また、最終結合物に混入する未反応のピオチン化試薬又は未標 識の抗体は、精製によって完全に除去しておくことが好ま 、。
[0029] 抗体へアビジンを結合させるには、公知の方法が用いられる。例えば IgGを還元、 又はペプシン消化して F (ab' )フラグメントィ匕し、さらに還元して得られる SH基と、マ レイミド基を導入したアビジンを反応させればょ 、。この場合のアビジンへのマレイミド 基の導入は、 4— (N—マレイミドメチル）シクロへキサン— 1—カルボン酸— N—ヒドロ キシスクシンイミドエステル等の市販の導入試薬が利用できる。また、最終結合物に 混入する未反応のアビジンィ匕試薬又は未標識の抗体は、精製によって完全に除去 しておくことが好ましい。
[0030] ここで用いる抗イディォタイプ抗体とは、第 1抗体の抗体部分が有する抗原結合部 位の固有の構造を認識するモノクローナル抗体のことである。抗イディォタイプ抗体 は、抗原とそれに対する抗体の結合を阻害できるタイプと阻害できな 、タイプが存在 することが知られている。本発明に使用できる抗ィディォタイプ抗体は、前者であり、 すなわち抗原と第 1抗体の結合物には結合できないタイプのものを指す。
[0031] 抗イディォタイプ抗体は、通常の方法に従って容易に作製することができる。例え ば、マウス由来のモノクローナル抗体の抗イディォタイプ抗体を作る場合、抗原となる モノクローナル抗体を KLH複合体としてマウスに投与して、あとは通常のモノクロ一 ナル抗体の作製方法に従って製造することができる。また、目的とするタイプの抗ィ ディォタイプ抗体を産生するハイブリドーマは、 ELISA簦によるスクリーニングによつ て容易に得ることができる。従って、本発明に使用できる抗ィディォタイプ抗体は、通 常のモノクローナル抗体と同様に、容易かつ大量に作製することができる。
[0032] 本発明において、第 2の部位に用いる第 2抗体の量は、未反応の第 1抗体をほぼ完 全に捕捉する必要があるため、第 1抗体の量に対して過剰量必要で、具体的には、 モル換算で 10倍以上の量を使用するのが好ましい。ここで、抗イディォタイプ抗体の 代わりに抗原を使用することもできるが、この場合、実用的な見地から、安定性の良 い抗原、低コストで大量に用意できる抗原に限られ、測定対象物が限定されてしまう ので、本発明装置においては、抗原は使用しない。
[0033] 第 2の部位での反応条件は、特に限定されるものではなぐ適宜設定することがで きる。温度は、これらの物質の活性に影響を与えない条件、例えば、 20〜40°C程度 が好ましい。時間は、適宜装置の形態により設定することができるが、 30秒間〜 10分 間程度であれば良い。
[0034] 第 3の部位は、第 2抗体がピオチン結合抗体の場合はアビジンが、第 2抗体がアビ ジン結合抗体の場合はピオチンが第 4の部位に移動できないように固定手段に固定 され、第 2抗体を前記固定されたアビジン又はピオチンで補足する部位である。この 第 3の部位では、ピオチンとアビジンとの結合性により、未反応の第 1抗体と結合した 第 2抗体及び未反応の第 2抗体は固定手段に捕捉されて第 3の部位力 移動するこ とが出来ないが、一方、抗原と第 1抗体との結合物は、アビジン又はピオチンを含ま ないため、固定手段に捕捉されることなく第 4の部位へ移動することになる。尚、本発 明に用いるアビジンは、由来は問わず用いることが出来る。例えば卵白由来のァビジ ン、放線菌由来のストレプトアビジン等を用いることが出来る。
[0035] 固定手段は、アビジン又はピオチンを固定し得るものであり、アビジン ピオチンの 反応に影響を与えな 、ものであれば特に限定されるものではなぐ測定対象物及び 標識抗体の種類、抗イディォタイプ抗体の種類等によって適宜調整することができる 。その形状は、フィルター状、織物状、微粒子状、繊維状等の形状の担体が挙げら れる。材質としては、ガラス、濾紙、ナイロン、ポリスチレン等が挙げられる。フィルター 状、織物状、繊維状の担体としては、ガラス繊維膜、多孔性メンブレン、濾紙、ナイ口 ン膜等の多孔質体が好ましい。微粒子状の担体としては、ガラスビーズ、ポリスチレン 等のポリマービーズ、ァガロース、キトサン等の多孔質担体が好ましい。アビジン又は ピオチンの固定の方法は、物理的吸着、共有結合、イオン結合、架橋、静電相互作 用等公知の方法のいずれかを利用することができる。なお、固定の方法は、アビジン
-ピオチンの反応に影響を与えな 、ものであることが好ま U、。
[0036] 本発明のように、固定手段に固定ィ匕する物質にアビジン又はピオチンを用いること は、反応時間の短縮に有用である。この反応時間短縮効果は、固定手段が微粒子 で緩衝液等の溶液に分散状態で存在しているとき、特に著しいものとなる。反応様式 上、このような固定手段に直接ピオチン又はアビジン未標識の第 2抗体を結合させて 未反応の第 1抗体を補足することも可能であつたが、この場合、 10分間〜 1時間程度 反応させる必要があった。これに対して、本発明のようにアビジン又はピオチンを利 用すると、未反応の第 1抗体と結合した第 2抗体及び未反応の第 2抗体を 30秒間〜 5分間、最適条件では 30秒間〜 1分間で完全に捕捉できることが明らかになった。こ のことは、本発明における測定時間の短縮に多大な貢献をもたらす要因となっている
[0037] 第 4の部位は、抗原と結合した第 1抗体の標識物を検出する部位で、標識物の検 出には、標識物に応じて公知の検出方法を用いることができる。標識物を検出するた めの試薬は、第 4の部位に含ませることができる。これらの試薬類は、第 4の部位に全 て含ませることも可能であるし、一部の試薬を第 3の部位、第 2の部位又は第 1の部位 若しくは更に別の部位に含ませておくことも可能である。また、第 4の部位の隣接部に 基質保持部を設け、ここに含ませることもできる。尚、基質保持部は、第 4の部位とは 、直列に又は付加的に、流路を介して又は介さないで、連結されていて、第 1の部位 等と同様の形状、大きさ等とすることができる。標識物の検出は、例えば反射率計、 分光光度計、蛍光検出器等を用いて実施される。
[0038] 標識物を検出するための試薬類は、標識物に従って適宜選択される。標識物が酵 素の場合は、発色基質、蛍光基質、発光基質、有機酸又は無機酸、電極と測定対象 物との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能し得る電子伝導メディエータ 等の 1種又は 2種以上の組み合わせが挙げられる。例えば、デヒドロゲナーゼ系の酵 素の場合は、 NAD又は NADP、酵素基質、ジァホラーゼ、及び発色基質の組み合 わせが使用できる。パーォキシダーゼの場合は、有機酸又は無機酸、及び発色基質 の組み合わせが使用できる。さらにォキシダーゼ系の酵素の場合は、酵素基質、発 色基質、及びパーォキシダーゼの組み合わせが使用できる。
[0039] 発色基質、蛍光基質、発光基質としては、 1, 2—フ 二レンジァミン (OPD)、 3, 3' , 5, 5，一テトラメチルベンジジン (TMBZ)、 2, 2，一アジノビス一 3—ェチルベンゾ チアゾリンー6—スルホン酸(八 丁3)、 3—（4ーヒドロキシフエ-ル）プロピオン酸（H PPA)、チラミン（Tyramin)、ルミノール、ルシフェリン等が挙げられる。
[0040] 有機酸又は無機酸としては、過酸化水素、蟻酸、酢酸等が挙げられる。或いは、装 置内で発生させる試薬類も使用できる。例えば、過酸化水素を装置内で生成させる ための試薬類として、グルコースとグルコースォキシダーゼが使用できる。使用例とし ては、保持部を 2力所用意しておき、測定開始後、両者を混合させることにより達成で きる。また、外の部位に保持させておくことも可能である。
[0041] 電子伝達メディエータとしては、例えば、フエ口セン、フェリシアンィ匕アルカリ金属（フ エリシアンィ匕カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアンィ匕ナトリウム等）又はこれら のアルキル置換体 (メチル、ェチル、プロピル置換体等）、メチレンブルー、フ ナジ ンメトサルフェート、 ρ—ベンゾキノン、 2, 6—ジクロロフェノールインドフエノール、 13 —ナフトキノン一 4—スルホン酸カリウム、フエナジンエトサルフェート、ビオローゲン、 ビタミン K等の酸ィ匕還元性の化合物の 1種又は 2種以上の組み合わせが挙げられる 。なかでも、フエ口セン、フェリシアンィ匕カリウム等が好ましい。
[0042] なお、これらの試薬等を保持させる方法としては、試薬自体をそのまま、自身の機 能を阻害しない溶媒等に溶解又は懸濁等させ、塗布、乾燥する方法、或いは担体（ 例えば上述した固定手段)等に混合又は分散させて固定する方法等、当該分野で 公知の方法のいずれかを利用することができる。
[0043] 本発明における測定対象物とは、一般的な臨床検査等における検査対象物を指し 、具体的には、血液、尿、唾液、分泌液等に含まれる各種成分や、組織、便等の固 形物からの抽出液等に含まれる各種成分等のことである。本発明では、測定対象物 に対して 1種類の抗体しか必要としないため、複数のモノクローナル抗体が結合でき るような分子量の大きい物質だけでなぐ 1つのモノクローナル抗体しか結合できない 低分子物質 (ハプテン)も測定対象物となりうる。
[0044] 以上、本発明の免疫測定装置について説明した。図 8には、本発明の測定原理を 簡潔に図示した。図中の上段 (ァ）は、装置 5全体を斜視図で示したものである。図中 の矢印 Xは、試料の流れる方向を示している。また、図中の下段 (ィ）は、装置中で起 こる反応の様子を経時的に示したものである。すなわち、 T=tOでは、抗原 Aと第 1抗 体 Bとが、第 1の部位 1で混合された状態を示している。適当な時間が経過し、 T=tl になると、試料が第 2の部位 2を経て第 3の部位 3、第 4の部位 4を通過する。このとき 、抗原 Aと反応しな力つた第 1抗体 Bは、第 2のピオチン結合抗体 Cに結合され、さら に第 3の部位のアビジンに結合され、第 3の部位 3から第 4の部位 4に移動することが できない。一方、抗原 Aと反応した第 1抗体 Bは、第 2の部位 2、第 3の部位 3を通過し 、第 4の部位 4に至る。こうして、第 4の部位 4では、抗原 Aと反応した第 1抗体 Bのみ が検出される。
[0045] 一方、本発明の免疫測定方法については、本発明の免疫測定装置を使用して容 易に実施することができるので、更なる説明は割愛する。以下に、本発明装置の一例 として、試験片とも称されるテストストリップ状の装置、ノィォチップ状の装置について 詳細に説明する。
[0046] まず、図 1及び図 2にテストストリップ状の装置を例示する。装置 5は、第 1の部位 1、 第 2の部位 2、第 3の部位 3及び第 4の部位 4力 構成されている。これらの各部位は 、多様な材質、形態力 構成することが可能であり、中でも、ガラス繊維膜、多孔性メ ンブレン、濾紙、ナイロン膜等の多孔質担体で構成することが好ましい。第 1の部位 に提供された試料溶液又はその一部は、順次展開或いは送液され、第 2の部位を通 り、さらに第 3の部位を通って第 4の部位に到達する。第 3の部位の固定手段としては 、フィルター状、織物状、繊維状の多孔質体を使用するのが好ましい。固定手段とし て微粒子状のものを使用する場合は、粒子の大きさは第 3の部位を構成する多孔質 担体のポアサイズより大きな粒子を使用することが好まし!/、。第 1の部位の上流部に 試料添加部を設置する場合には、例えば、血球分離膜、イオン交換膜等が利用でき る。ここでは、一つの多孔質担体上に各部位を構成することも可能である力 各部位 ごとに最適な担体を選んで使用することもできる。各部位ごとに材質を変える場合は 、各部位が互 、に接触するように配置して、溶液の流れを阻害しな 、ようにする必要 がある。各部位の大きさは特に限定されるものではなぐこの目的を実現するために 十分な大きさを有していることが必要である力 これらの物質の種類、量、反応時間 などに応じて適宜設定することができる。各部位の担体の組み合わせとしては、第 1 の部位をガラス繊維膜、第 2の部位及び第 3の部位を-トロセルロース膜、第 4の部 位を濾紙とするような実施態様が例示できる。また、各部位は、プラスチック製シート 等力 なる支持体上に配置するのが好ましぐそのような装置例が図 2である。図 2で は、支持体 6の上に、第 1の部位 1、第 2の部位 2、第 3の部位 3、および第 4の部位 4 が配置されており、これらが装置 5を構成している。
次に、図 3および図 4にバイオチップ状の装置を例示する。第 1の部位 1、第 2の部 位 2、第 3の部位 3及び第 4の部位 4は、それぞれの部位が微小な空間で構成され、 それぞれ、流路を介して、又は流路を介さないで直接、直列に連結されている。図 3 〜5においては、微小流路 31で繋がった構成としている。第 1の部位に提供された試 料溶液又はその一部は、順次送液され、第 2の部位を通り、さらに第 3の部位を通つ て第 4の部位に到達する。次の部位へ移る反応液の量を調節又は計量するために、 第 1の部位、第 2の部位、第 3の部位および第 4の部位の各間には、容積 0. 5〜1. 5 Lの計量部を設けることもできる。固定手段が微粒子 41である場合には、第 3の部 位 3と第 4の部位 4とが固定手段を通過させないチャネル部 32で分離されている。こ こで、第 2の部位と第 3の部位との間にもまた、チャネル部 32と同様の構成物を設け ることが好ましい。第 1の部位、第 2の部位及び第 4の部位の隣接部には、反応に必 要な試薬等を保持する部位 (抗体保持部 42、基質保持部 43)を設置することもでき る。この各部位と抗体保持部及び Z又は基質保持部は、直列に又は付加的に、流 路を介して又は介さないで、連結されている。基質保持部を設ける場合は、第 1の部 位等と同様の形状、大きさ等とすることができる。これにより、試薬類を、基質保持部 に予め又はその使用直前に、保持させることができる。各部位を連結する流路の形 状、大きさ等は特に限定されるものでなぐ例えば、断面積が 0. Ol /z m2〜： LOOmm2 程度、長さが 1 μ m〜 100mm程度のものが挙げられる。
[0048] 第 1の部位は、他の部位とは別個の空間として規定され、その大きさは 10—2〜： L03m m3程度が好ましい。また、形状は混合目的に適切なものであれば特に限定されるも のではないぐ平面及び断面形状ともに、例えば、四角形、台形等の多角形及びこ れらの角部分が丸みを帯びた形状、円形又は左右非対称の不均一形等どのような 形状であってもよい。第 1の部位又はその隣接部には、外部から試料溶液を注入す る注入口 33が形成されている。第 1の部位には、予め、第 1抗体を保持させてもよい 。また、第 1の部位の隣接部に抗体保持部を設置する場合、その抗体保持部は、上 述した試料溶液を注入する注入口の代わりに又は注入口に加えて形成されて ヽても よい。この抗体保持部は、例えば、第 1の部位等と同様の形状、大きさ等とすることが できる。
[0049] 第 2の部位は、他の部位とは別個の空間として規定され、その大きさは 10—2〜： L03m m3程度が好ましい。また、その形状は、第 1の部位と同様に、種々の形態に設定する ことができる。また、第 2の部位に予め、第 2抗体を保持させても良い。或いは、第 2の 部位の隣接部に抗体保持部を設置し、第 2抗体を保持させてもよい。この抗体保持 部は、例えば、第 2の部位等と同様の形状、大きさ等とすることができる。
[0050] 第 3の部位は、他の部位とは別個の空間として規定され、固定手段をその内部に含 んでいる。したがって、第 3の部位は、固定手段を保持するための十分な空間を有し ていることが必要であるが、固定手段の種類、量等に応じて適宜設定することができ る。例えば、 10— 2〜103mm3程度が好ましい。また、その形状は、第 1の部位又は第 2 の部位と同様に、種々の形態に設定することができる。
[0051] 固定手段は、第 3の部位内に収納され、微粒子状のものを使用するのが好ましぐ その直径は、 10 m〜lmm程度のものが好ましい。
[0052] チャネル部は、第 3の部位内に存在する固定手段の径よりも小さい径を有するのが 好ましい。ここで、「径」とは、固定手段及び Z又はチャネル部の形状によって、幅、 高さ、長さ等とすることができるが、固定手段の「径」においては固定手段 1単位にお ける最大の長さ（幅）、チャネル部の「径」においてはチャネル部の断面における最小 の長さ（幅)であることが適当である。つまり、チャネル部は、第 3の部位に存在する固 定手段を、第 3の部位内にのみ止めるために、第 3の部位の出口（好ましくは入口に も）に、固定手段を通過させない機能又は形状を与えている。なお、チャネル部が流 路自体である場合は、例えば、固定手段の径よりも細い径の流路であってもよいし、 流路の一部において、 1以上の凸部を形成して、その径を狭める部分を含むものでも よい。
[0053] 第 4の部位は、他の部位とは別個の空間として規定され、その大きさ及び形状は、 検出方法 (手法)、試料溶液の種類及び量等に応じて適宜設定することができる。具 体的には、 10—2〜： L03mm3程度の大きさで、種々の形状に設定することができる。例 えば、検出方法が光学的方法である場合には、第 4の部位において、試料溶液、標 識物又は基質力 生成される生成物に光を照射し、その光を検出し得るように、所定 長さの光路を確保することができる形状及び大きさであることが必要である。また、電 気化学的方法である場合には、図 5に示すように、第 4の部位において、試料溶液を 含む溶液の電荷を検出し得るように、導電性材料による一対の電極 51がこの溶液に 接触するように形成されて ヽることが必要である。
[0054] ここで、前記一対の電極は、通常、電極として機能することができる材料、大きさ及 び形状であれば特に限定されることはなぐどのようなものでも用いることができる。例 えば、グラフアイト、カーボン、カーボンファブリック等、金、白金、銀、銅、アルミニウム 等の金属又は合金、 SnO、 In O、 WO、 TiO等導電性酸化物等の単層又は 2以
2 2 3 3 2
上の積層構造が挙げられる。この電極は、導電材料片をバイオチップに貼り付けるか 、一部を埋設するなどして形成してもよいし、導電剤ペーストを用いたスクリーン印刷 法等の印刷法を用いて形成してもよ!/、。
[0055] このように、電気化学的手法を採用することにより、従来の光学的検出装置のような 、大掛かりで高価かつ大型の装置を用いることなぐ電流又は電圧等の検出という簡 便な方法によって、被検物質の分析を行うことができる。従って、分析にカゝかる費用 を低減させることができるとともに、より小型のバイオチップ及びより小型で安価な分 析装置の使用を実現することができる。
[0056] 上記バイオチップは、上述した種々の名称で呼ばれている従来のチップと同様の 材料で形成することができる。例えば、 PET (ポリエチレンテレフタレート）、 PDMS ( ポリジメチルシロキサン）、 PMMA (ポリメチルメタタリレート）、 PC (ポリカーボネイト）、 PP (ポリプロピレン）、 PS (ポリスチレン）、 PVC (ポリ塩化ビニル）、ポリエチレン、ポリ シロキサン、ァリルエステル榭脂、シクロォレフインポリマーなどの有機化合物、或い は、ゼォノア、シリコン、石英、ガラス、セラミック等の無機化合物等が挙げられる。
[0057] このバイオチップは、例えば、一方又は双方に凹部による種々の形状のパターンを 有する第 1基板と第 2基板とを、例えば、溶着、接着剤、超音波処理等によって、貼り 合わせることによって簡便に製造することができる。具体的には、所望の第 1〜第 4の 部位、保持部、流路等に対応する形状を有する金型を準備する。この金型は、機械 的加工により形成することができる。次に、この金型に、榭脂をモールド等して各部位 の形状が転写された基板を得る。最後に、この基板を、パターン同士が対向するよう に、 2枚張り合わせる。なお、第 1〜第 4の部位、保持部、流路等に対応するパターン を有する基板を一方のみとし、他方を平板基板としてもよい。また、金型を用いたモ 一ルディングに代えて、射出成型法又はインプリント法等を利用してもよい。さらに、 平板基板の一方又は双方に、フォトリソグラフィー工程、機械的加工等を直接施して 、第 1〜第 4の部位、保持部、流路等に対応するパターンが転写された基板を得ても よい。なお、本発明のバイオチップは、その取り扱い (例えば、試料等の導入、混合、 撹拌、試料等の移行、検出など)を手動で行っても、機械的に行ってもよいし、一部 のみ機械的に行ってもよい。例えば、撹拌及び混合、試料等の移行は、ポンプを利 用する方法、振動又は遠心力を利用する方法を用いることができる。
実施例
[0058] 以下に、本発明の実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明する。しかし ながら、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
[0059] 1.ピオチン標識抗ィディオタイブ抗体の作製
(1)免疫源の作製 市販の抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗体 (オリエンタル酵母製） 5mgと KLH (メ ルク製) 4mgを含む 0.1Mリン酸緩衝液 (pH6.7) 2mLにダルタルアルデヒド（70%) 3 L添加して、室温で 1時間反応させた。反応後、 PBS緩衝液で透析して免疫源とし た。
[0060] (2)免疫化
上記免疫原の 0.5mgZmL溶液 lmLと完全フロイントアジュバント lmLとを混合し て乳化したものを 8週令の BALB/cマウスに 200 L腹腔内投与した。その後 2週間 おきに 3回、上記免疫原—不完全フロイントアジュバント等量混合乳化液 200 Lを 腹腔内投与した。更に、 3回目の投与から 2週間後に、上記 0.5mgZmLの免疫原 1 00 Lを静脈注射した。
[0061] (3)脾細胞の細胞融合
3日後、上記マウス力 脾臓を摘出し、脾細胞を DMEM培地に懸濁し、洗浄を行 つた。一方、マウスミエローマ細胞株 P3X63Ag8 (大日本製薬製)を、細胞融合に合わ せて対数増殖期になるように培養し、遠心分離により集めた。細胞融合は PEG法 (P EG4000)を用いて実施した。
[0062] (4)ハイプリドーマの作製とスクリーニング
ノヽイブリドーマは、 10%FCS入り DMEM培地と HAT培地により培養し、以下の方 法によりスクリーニングした。ハイプリドーマ培養上清の一次スクリーニングは、固相抗 原として抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗体力 ペプシン消化して得た精製 F (ab， ) フラグメント、二次抗体として市販の HRP標識ャギ抗マウス IgG (Fc)抗体 (ICN社
2
製)を用いたサンドイッチ ELISA法により実施した。さらに、二次スクリーニングとして 上記固相抗原に CRPをあら力じめ反応させて同様に操作することにより、 CRPにより 結合阻害を起こすタイプかどうか判定した。陽性ゥエルのクロー-ングとスクリーニン グの結果、抗ヒト CRPモノクローナル抗体を特異的に認識し、さらに CRPにより結合 阻害を起こす抗体を産生するハイプリドーマとして、 13Dと 14Aの 2クローンを得た。
[0063] (5)抗体の調製
上記で得られたノ、イブリドーマ細胞株のうち、 13Dを拡大培養して抗ィディオタイブ 抗体の採取を行った。培養上清の精製は、プロテイン Aカラム (アマシャムバイオサ ィエンス製）により実施した。
[0064] (6)ピオチン標識体の作製
NHS -Biotin (Pierce社製）を用い、プロトコールに従って（5)で得た抗体のピオ チン標識を実施した。なお、未反応のピオチンィ匕試薬はゲル濾過により除去した。
[0065] 2. HRP標識抗ヒト CRP抗体の作製
(1)ペプシン消化
0.1M酢酸緩衝液（pH4.0) lmLに抗ヒト CRPマウスモノクローナル抗体 5mgとぺ プシン (シグマアルドリッチ製) 0.3mgを混合し、 37°Cで 24時間反応させた。反応後 、ゲル濾過にて精製し、 F (ab' ) フラグメントを 1.8mg得た。なお、抗ヒト CRPマウス
2
モノクローナル抗体は、前記同様の市販品を使用した。
[0066] (2)還元
F (ab' ) フラグメント溶液は、限外濾過膜により 5mM EDTAを含む 0.1Mリン酸緩
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衝液 (PH6.5)に置換した。この抗体液に 0.1Mシステアミン溶液を加えて 37°Cで 2時 間反応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し、 F (ab' )フラグメントを l.Omg得た。
[0067] (3) HRPのマレイミドィ匕
西洋ヮサビパーォキシダーゼ（HRP、ロシュ'ダイァグノスティックス製） 5mgを 0.1 Mリン酸緩衝液（ρΗ7.0) 750 /ζ Ι^に溶解した。 DMF120 /z Lに 4— (N マレイミドメ チル）シクロへキサン 1—カルボン酸 -N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ジー ベンケミカル東京） 2mgを溶解し、 HRP溶液〖こ 75 L加えて、 30°Cで 1時間反応さ せた。反応後、ゲル濾過にて精製し、マレイミドィ匕 HRPを 2.6mg得た。
[0068] (4)コンジュゲートの調製
F (ab，）フラグメント 1. Omgとマレイミドィ匕 HRP1. Omgを混合し、冷蔵で 24時間反 応させた。反応後、ゲル濾過にて精製し濃縮操作後、 1.2mgZmLの HRP標識抗ヒ ト CRP抗体液を得た。
[0069] 実施例 1 テストストリップ状の CRP測定装置の作製
(1)標識エリア用濾紙 (第 1の部位)の調製
PBS緩衝液 lOmLで BSA10mg、グルコース 1 Omgを溶解させた。次に、この溶液 で実施例 2で作製した HRP標識抗ヒト CRP抗体を 5000倍希釈した。さらにこの溶液 に濾紙 (ワットマンジャパン製）を含浸させて乾燥後、 12mm X 5mmに裁断した。
[0070] (2)ピオチン標識抗体含有濾紙 (第 2の部位)の調製
PBS緩衝液 10mLに BSA10mg、ショ糖 lOmgを溶解させた。次に、この溶液を用 いて実施例 1で作製したピオチン標識抗ィディオタイブ抗体の 20 g/mL溶液を調製 した。さらにこの溶液に濾紙 (ワットマンジャパン製)を含浸させて乾燥後、 10mm X 5 mmに裁断し 7こ。
[0071] (3)捕捉エリア用メンブレン (第 3の部位)の調製
PBS緩衝液でアビジン lmg/mL溶液を調製した。次に、この溶液に 15mm X 150m mに裁断したノヽィフローメンプレン (ミリポア製)を含浸させて乾燥させた。さらに、 3m gZmLカゼイン溶液に入れて 30分放置後、取り出して乾燥し、 15mm X 5mmに裁 断した。
[0072] (4)検出エリア用濾紙 (第 4の部位)の調製
TMBZ 5mg、ビラノースォキシダーゼ 30単位を PBS緩衝液 lmLに溶解した。この 溶液に濾紙 (ワットマンジャパン製)を含浸させて乾燥後、 7mm X 5mmに裁断した。
[0073] (5)試験片の組み立て
支持体であるプラスチック板（60mm X 5mm)に上端から 25mm幅で両面粘着テ ープを貼った。次に、このプラスチック版の上端を 5mmほど空けて上記（3)のメンブ レンを貼り付けて固定した。次に、（3)のメンブレンの上端と 2mmほど重なり合うよう に（4)の濾紙を貼り付けて固定した。さらに、（3)のメンブレンの下端が 2mmほど重 なり合うように（2)の濾紙を貼り付けて固定した。さらに、（2)の濾紙の下端が 2mmほ ど重なり合うように（1)の濾紙を貼り付けて固定した。
[0074] 試験例 1 テストストリップ状の装置を用いた CRP定量測定
0、 7.5、 15、 30、 60、 120ng/mLの CRPを含有する溶液を検体として用!ヽた。 実施例 3で作製した試験片の第 1の部位に、検体 30 Lを添加して反応を開始し、 5 分後に色差計により第 4の部位の 690nmにおける反射率を測定した。得られた反射 率とヒト CRPの濃度との関係を示す検量線を図 6に示した。これによれば、低濃度か ら良好な検量線を示しており、 CRPが定量可能であることが判明した。
[0075] 実施例 2 バイオチップ状の CRP測定装置の作製 バイオチップの作製は、一方に凹部により、第 1の部位、第 2の部位、第 3の部位お よび第 4の部位を直列に配設し、第 3の部位と第 4の部位との間には、チャネルを設 けた形状のパターンを有する第 1基板と第 2基板とを貼り合わせることによって行った 。第 1の部位、第 2の部位、第 3の部位および第 4の部位の各間には、容積 0. 5〜1. 5 Lの計量部を設けた。
[0076] 第 1の部位は、 50mm2 (平面積） X 1mm (深さ)程度の空間とした。第 1抗体として は、実施例 2で作製した HRP標識抗ヒト CRP抗体液 0. 05mgZmL溶液を 10 L注 入した。
[0077] 第 2の部位は、 50mm2 (平面積） X 1mm (深さ)程度の空間とした。第 2抗体として は、実施例 1で作製した抗イディォタイプ抗体液 4. 2mgZdL溶液を 注入した。
[0078] 第 3の部位は、 50mm2 (平面積） X 1mm (深さ）程度の空間とした。その中に、アビ ジン固定化セファロースゲル（アビジン結合量 lOmg/mLゲル）を 10 μ L導入した。ァ ビジン固定化セファロースゲルの調製は、 NHS活性化セファロース（アマシャムバイ ォサイエンス製)を使用し、ゲルへのアビジンの固定ィ匕方法は供給元の推奨方法に 従った ο
[0079] 第 4の部位は、光学的検出として吸光度を測定するために、長さ 100mm程度で、 断面積が lmm2程度の形状とした。発色試液として SAT— Blue (同仁ィ匕学研究所製 )を 20 L注入した。
[0080] 第 3の部位と第 4の部位との間には、固定手段を通過させないチャネル部を設け、 幅を 100 m程度、深さを 200 m程度に設定した。また、第 1の部位、第 2の部位、 第 3の部位および第 4の部位は、微小流路で直列に繋げた。
[0081] 試験例 2 実施例 2のバイオチップ状の装置を用いた CRP定量測定
0、 2. 5、 5、 7. 5、 lOmgZdLの CRPを含有する溶液を検体として用いた。実施例 2で作製したバイオチップの第 1の部位に、検体 1. 5 Lを添加した。次に、溶液を、 第 1の部位、第 2の部位、第 3の部位と順次通過させた。部位間で行う溶液の計量は 一般的に周知の手法を用いた。この際、送液には遠心力を用い、混合は遠心力によ り乱流を起こすことにより行った。最後に第 4の部位で 670nmにおける吸光度の変化 速度を測定した。得られた吸光度変化速度とヒト CRPの濃度との関係を示す検量線 を図 7に示した。これによれば、低濃度から良好な検量線を示しており、バイオチップ で CRPが定量可能であることが判明した。
[0082] 実施例 3 電気化学的検出方法を用いたバイオチップ状の CRP測定装置の作製 この実施例のバイオチップは、図 5に示したように、第 4の部位に一対のカーボンブ ラックによる電極 25を形成し、さらに酸化還元性物質を充填した以外、実施例 2のバ ィォチップと同様の構成とした。電極は、長さ 10mm程度、厚さ 15 m程度でカーボ ンペーストによって形成した。これらの電極はバイオチップを構成する下部基板の第 4の部位に対応する位置に配置した。下部基板上に上部基板を貼り合わせると、電 極の一部はバイオチップ内側に位置し、かつ一部は露出するように設計された。また 、第 4の部位には SAT— Blueの代わりに、基質として、 5mMの過酸化水素と、 3m Mのフエ口センを注入した。
[0083] 試験例 3 実施例 3のバイオチップ状の装置を用いた CRP定量測定
このバイオチップに CRPを含む検体 1. 5 Lを添加し、第 1の部位、第 2の部位、 第 3の部位と順次送液させた。第 4の部位では、フエ口センを、標識物である酵素によ つてフエリシ-ゥムイオン (Fc+)に変換し、さらにこれを電極上で還元するという酸ィ匕 還元反応を行わせることにより、その際に生じる電流値を測定した。この電流値は、 C RPと標識抗体との複合体の濃度に比例した値となり、 CRPを定量的に測定すること ができた。

Claims

請求の範囲 [1] 試料中の測定対象物である抗原と標識抗体を特異的に結合させて、その結合体の 標識物を測定することにより抗原量を測定することが可能な免疫測定装置であって、1つの装置内に、
(1)試料中の抗原と、前記抗原に特異的に結合できる標識抗体である第 1抗体とを 反応させる第 1の部位、
(2)抗原と結合して 、な 、第 1抗体とピオチン又はアビジンを結合させた抗体であ る第 2抗体とを反応させる第 2の部位、
(3)第 2抗体力 Sピオチン結合抗体の場合はアビジンが、第 2抗体がアビジン結合抗 体の場合はピオチンが第 4の部位に移動できないように固定手段に固定され、第 2抗 体を前記固定されたアビジン又はピオチンで補足する第 3の部位、及び、
(4)抗原と結合した第 1抗体の標識物を検出する第 4の部位の 4つの部位を有し、 それぞれの部位を順に溶液が移動できるように構成され、第 1抗体は、抗体部分が F (ab， )フラグメント又は還元 IgGで、 F (ab ' )フラグメント又は還元 IgGと標識物とが特 定の結合比で結合した標識抗体であって、第 1の部位又はその隣接部に含まれ、第 2抗体は、ピオチン又はアビジンを結合させた抗体で、第 1抗体に対する抗ィディォ タイプ抗体でかつ抗原と第 1抗体との結合物には結合できない種類の抗ィディオタィ プ抗体であって、第 2の部位又はその隣接部に含まれている、免疫測定装置。
[2] 第 1抗体が測定対象物に対して過剰量含まれている、請求項 1に記載の免疫測定 装置。
[3] 第 2抗体が第 1抗体に対して過剰量含まれている、請求項 1に記載の免疫測定装 置。
[4] 第 1抗体が酵素で標識されている、請求項 1に記載の免疫測定装置。
[5] 第 1の部位の隣接部に、第 1抗体を保持する抗体保持部が連結されてなる、請求 項 1に記載の免疫測定装置。
[6] 第 4の部位に標識物を検出するための試薬が保持されている、請求項 1に記載の 免疫測定装置。
[7] 第 4の部位の隣接部に、標識物を検出するための試薬を保持する基質保持部が連 結されてなる、請求項 1に記載の免疫測定装置。
[8] 基質保持部に電子伝達メディエータ又は発色基質が保持されてなる、請求項 6〖こ 記載の免疫測定装置。
[9] ノィォチップ状の装置であって、 4つの部位がそれぞれ微小空間から構成され、固 定手段が微粒子であり、第 3の部位と第 4の部位とが、固定手段である微粒子を通過 させな 、チャネル部によって分離されて 、る、請求項 1に記載の免疫測定装置。
[10] 第 4の部位に、一対の電極が形成されてなる、請求項 9に記載の免疫測定装置。
[11] 試料中の測定対象物である抗原と、前記抗原に特異的に結合する標識抗体である 第 1抗体とを反応させ、次に未反応の第 1抗体をピオチン又はアビジンを結合させた 抗体である第 2抗体と反応させた後、前記第 2抗体を前記第 2抗体がピオチン結合抗 体の場合はアビジンで、前記第 2抗体がアビジン結合抗体の場合はピオチンで捕捉 し、捕捉されな力つた抗原と第 1抗体との結合物を検出する免疫測定方法であって、 前記第 1抗体は、抗体部分が F (ab' )フラグメント又は還元 IgGで、 F (ab' )フラグメ ント又は還元 IgGと標識物が特定の結合比で結合した標識抗体であり、前記第 2抗 体は、第 1抗体に対する抗ィディオタイブ抗体でかつ抗原と第 1抗体との結合物には 結合できな!、種類の抗ィディォタイプ抗体である、免疫測定方法。
[12] 第 1抗体を測定対象物に対して過剰量使用する、請求項 11に記載の免疫測定方 法。
[13] 第 2抗体を第 1抗体に対して過剰量使用する、請求項 11に記載の免疫測定方法。
[14] 測定対象物の検出を電気化学的又は光学的に行う、請求項 11に記載の免疫測定 方法。
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