JPS6184561A - 抗原に依存しないイムノアツセイシステム - Google Patents

抗原に依存しないイムノアツセイシステム

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JPS6184561A
JPS6184561A JP60208576A JP20857685A JPS6184561A JP S6184561 A JPS6184561 A JP S6184561A JP 60208576 A JP60208576 A JP 60208576A JP 20857685 A JP20857685 A JP 20857685A JP S6184561 A JPS6184561 A JP S6184561A
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antibody
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ネイル、アイ、ゴールドスタイン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本衾皿支！量 本発明は、抗原に代わって抗イディオタイプ抗体を使用
し、そのため抗原に依存しないイムノアッセイシステム
に関する。本発明はまた、抗イディオタイプ抗原の産生
方法に関する。
競合イムノアッセイは、サンプル中の遊離抗原による、
典型的には一方が結合され他方が標識されている標準抗
原抗体複合体形成の阻害を測定することにより、サンプ
ル中の抗原の存在を測定するために古くから使用されて
いる。加えて、典型的な定量的イムノアッセイキットは
純粋な抗原の標準化サンプルを含み、そのためサンプリ
ング誤差を最小にし、そして精度を確保するため、サン
プルと並列して参照溶液についても実施し得るようにな
っている。多くの場合、抗原はＲ離しそして精製するこ
とが極めて困難であり、そして限られた安定性のもので
あることがある。
ある抗原の高可変性もしくはイディオタイプ領域を認識
する抗体はその免疫系の調節中に含まれている。それら
は抗イディオタイプ（ａ　−Ｉｄ）として知られている
。このように、特定の抗原（ａ−Ａｇ）を特異的に結合
する抗体は、またその相補的ａ−Ｉｄを特異的に結合す
る。サンプル中の抗原が標識されたａ−Ａｇに対しａ−
Ｉｄと競合し、そのためａ−Ｉｄ／ａＡｇ複合体形成の
程度がサンプル中の抗原濃度に対し逆比例する競合的イ
ムノアッセイに、相補的ａ−Ａｇ／ａ　　Ｉｄ抗体ペア
を使用し得ることが示唆されている。
例えば、Ｐｏｔｏｃｎｊａｋ　ｅｔ　ａＬ、　５ｃｉｅ
ｎｃｅ＋　２１５＋　１６３７（１９８２）　　　；　
　　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ、　　八ｕｓｔ
、　Ｊ、　　ｕｘ　　、　　Ｂｉｏ１Ｍｅｄ工」劇よ、
１１．２７　　（１９８３）を見よ。しかしながら、抗
原に依存しない正確な定量的イムノア・ノセイを許容す
る競合的イムノアッセイキ・ノドの参照成分のためのａ
Ｓした抗原の代替品として、ａ　−ｉｄを使用する示唆
は存在しない。
典型的には、ａ−Ｉｄはａ−Ａｇを抗原的に活性な形に
おいて動物へ投与し、挑戦し、抗血清を採取するか、ま
たはリンパ球を採取しそれらをミエローマ細胞と融合し
てハイブリドーマをつくることによって生産される。ａ
−Ｉｄのソースとして、ハイブリドーマ腫瘍が生育しつ
つあり、そしてモノクロナールａ−Ａｇを分泌している
動物からのリンパ球を使用する示唆は存在しない。
本衾皿皇旦み 本発明の一目的は、その日常的な使用において精製した
抗原の必要性に依存しない競合的イムノアッセイ方法を
提供することである。
本発明の他の目的は、在来方法よりも簡単で有利な抗イ
ディオタイプ抗体を製造する方法を提供することである
。
本明細書および特許請求の範囲をさらに検討するとき、
本発明のさらに他の目的および利益は当業者に明らかに
なるであろう。
本立皿久貝翌 これらの目的は、液体サンプル中の抗原（Ａｇ）の存在
を測定する方法であって、 （ａｌ　　前記液体サンプルと、前記抗原上のエビ）−
プを特異的に結合する抗体（ａ−Ａｇ）とを、該ａ−Ａ
ｇの高可変性領域上のエピトープを特異的に結合する抗
イディオタイプ抗体（ａ−Ｉｄ）の与えられた量の存在
下にインキュベートし、そしてａ−Ａｇ−ａ−Ｉｄ複合
体形成の程度を測定する工程にして、前記ａ−Ａｇおよ
びａ−Ｉｄの少なくとも一方は標識されているものを使
用する前記工程と、 （ｂ）　　標識されていないａ−Ｉｄの標準液を、工程
（ａ）におけるように標識された前記ａ’−Ａｇおよび
ａ−Ｉｄの前記量とインキュベートし、そしてａ−Ａｇ
−ａ−Ｉｄ複合体形成の程度の標準値を測定する工程と
を含み、 それによって工程（ａ）および（ｂ）におけるａ−Ａｇ
・ａ−Ｉｄ複合体形成の相対的程度から前記抗原の存在
を測定することを特徴とする前記方法を提供することに
よって達成される。
本発明はさらに、（ａ）イディオタイプ抗体を分泌し得
るａｌ瘍が生育している動物からのリンパ球をミエロー
マ細胞と融合する工程と、そして（ｂｌ前記イディオタ
イプ抗体の高可変性領域上のエピトープを特異的に結合
するモノクロナール抗体を分泌する得られたハイブリド
ーマを単離し、そしてクローニングする工程とを含む、
モノクロナール抗イディオタイプ抗体の製造方法を提供
する。
韮１星通論 競合的イムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ　
（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアトソーパントアッセイ　
（ＥＬＩＳＡ）等は、抗原／抗体反応の阻止の程度を測
定することによって、サンプル中の抗原の存在を検出し
、そして定量するために慣用的に使用されている。典型
的には、抗原または抗体のどちらかが固相支持体へ結合
され、該ペアの他の成分はそれを検出可能と、するため
に何らかの態様で標識される。そのような標識は、しば
しば、例えばラジオアイソトープ、酵素、螢光マーカー
等を含み、それらのすべては当業者には良く知られてい
る。
標識は該成分へ直接結合するか、または例えば抗原／抗
体ペアの一成分を認識することができる他の分子へ標識
を結合することにより、間接的に該成分へ結合し得る。
例えば、ある抗体は、抗原特異性抗体の非可変性領域を
認識するイソタイプ特異性抗体へ、酵素、螢光マーカー
またはラジオアイソトープを結合することによって間接
的に標識することができる。その代わりに、抗原が特異
性抗体へ結合した後該抗原の利用できるエピトープを認
識する抗体へ標識を結合することができる。
この広い着想の多数の他の変法が可能であり、そして当
業者には既知であることが認められるであろう。
競合的イムノアッセイにおいて、抗原の代わりに抗イデ
ィオタイプ抗体を代替することによって多数の利益が実
現される。しかしながら、そのような代替に対する先行
技術の示唆は、アッセイの主競合反応において標識した
抗原の代わりに標識したａ−Ｉｄを代替することを含ん
でいた。未標識抗原が常に阻止をテストするために使用
されていた。しかしながら、日常的なアッセイにおいて
、どの点でも精製した抗原を必要とすることは不利であ
る。抗原はしばしば単離および精製が困難であり、そし
てしばしば安定性が限られる。本発明は、参照測定が未
標識ａ−Ｉｄを使用して実施され、全体の日常的測定を
抗原非依存性とするそれ以上の利益を提供する。
ａ−Ａｇ／ａ−Ｉｄ複合体のインヒビターとしての抗原
およびａ−Ｉｄの相対的有効性の特徴化を最初に実施し
なければならないが、しかし抗体、特にモノクロナール
抗体の均一性および安定性はａ−Ｉｄの連続的較正およ
び／または標準化の必要性をなくすことが理解されるで
あろう。
本発明方法のい（つかの具体例が適当であるが、しかし
当業者には代替具体例が容易に明らかであるので、本発
明はここに特定的に記載された具体例に限定されないで
あろう。これら例証具体例がこれから詳細に記載される
。
第１の好ましい具体例において、測定しようとする抗原
を特異的に結合する抗体、好ましくは対象抗原に対し高
い特異性を有するモノクロナール抗体が分離を容易にす
るため固相支持体へ結合されるであろう。これは多数の
方法で、例えばポリ塩化ビニル試験管をａ−Ａｇで処理
し、放射標識したａ−Ｉｄの与えられた量をサンプルの
測定した容積と共に導入し、そして標識したａ−Ｉｄの
ａ−Ａｇをコートした試験管への結合を阻止する程度を
測定することによって１１例的に実施される。
参照測定は、そのａ　　Ａｇ／ａ−Ｉｄ複合体形成を阻
止する能力が前もって定量化され、そして抗原の既知量
と相関されている未標識ａ−Ｔｄを使用して行われる。
別の好ましい具体例は、ａ−Ｉｄを固相支持体へ結合し
、そして特異性ａ−Ａｇを標識することを含む。再び、
サンプル中の抗原の濃度は標識した成分の固相への結合
を阻止し、そして阻止の程度は米櫃Ｑａ−Ｉｄおよび標
識したａ−Ａｇを使った標準曲線と相関するであろう。
ここで使用する“抗体”なる術語は、すべてのイディオ
タイプ、例えばＩ　ｇＭ、Ｉ　ｇＧ、Ｉ　ｇＡ。
ＩｇＤおよびＩｇＥ、それらのイソタイプ、例えばＩｇ
Ｃｌ、ＩｇＣ，２等、およびそれらのフラグメント、例
えばＦ　（ａｂ’）ｚ、　Ｆａ　ｂ、　Ｆａ　ｂ’等を
含むことが理解されるであろう。ａ−Ａｇおよびａ−Ｉ
ｄの一方または両方が全抗体または抗体フラグメントで
あってよい。
本発明の方法は、腫瘍関連抗原のための競合的イムノア
ッセイに特に有用である。種々のタイプの腫瘍および／
またはガン関連病理によって産生もしくは関連する抗原
に対する抗体、特にモノクロナール抗体が近年開発され
ている。ガンの放射免疫検出にも有用である多数のその
ような抗体は、特に米国特許第４，３４８，３７６．４
　、３６２　、５４４．４，３３１゜６４７．４，４６
８，４５７．４，４４４，７４４．４．４６０．５５９
および４，４６０，５６１に開示されている。加えて、
その他の抗体が１９８４年５月１４日に出願された米国
特許出願６０９，６０７、および１９８４年７月２４日
に出願された６３３．９９９に開示されている。以上の
特許および特許出願の開示を全体としてここに参照とし
て取り入れる。種々の感染病変に関連する抗原も本発明
方法によって検出することができ、そのような抗原に対
する抗体は、特に前記米国特許出願６３３．９９９に開
示されている。
前記のように、ａ−Ｉｄは動物を免疫学的に活性な形の
特異性ａ−Ａｇをもって挑戦することによって慣例的に
生産される。ある場合には、これは単に慣用のアジュバ
ント中の抗体を適当を動物例えばマウス、ヒツジ、ヤギ
、ウサギ等に注射することによって達成することもでき
る。抗体のブースターショットが周期的に投与され、そ
して適度な高免疫状態が得られた後抗血清が採取される
。
抗体は、＋０Ｍした抗原が結合されているカラム上のア
フィニティークロマトグラフィーを含む、慣用の精製操
作によって抗血清から回収することができる。交差反応
性抗体は、他の交差反応性抗原を結合したカラム上のク
ロマトグラフィーによって達成することができる。
代わりに、モノクロナール抗体を製造するための慣用の
技術を使用することができる。これは適当な動物、例え
ばマウスを免疫学的に活性な形の特異性抗体で挑戦し、
適当な高免疫レスポンスが得られた後リンパ球、例えば
脾細胞を取り出し、脾細胞を適当なミエローマ細胞ライ
ンと融合することを含む。ハイブリドーマクローンが慣
例的に生産され、そして特異性抗イディオタイプ抗体に
ついてスクリーニングされる。
ヒトハイブリドーマは、米国特許４，４６４，４６５お
よび、Ｋｏｓｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　’　Ｔｈｅ　ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌ　
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅｓ″。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　４　：　７２−７９．
１９８３　　；　Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、＋“Ｈｕ
ｍａｎ　ｈｙｄｒｉｄｏｍａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅ
ｄ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ−ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｅｄ　ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ　　＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７９　　：　６６５
１−６６５５＋　１９８２　；　　Ｋｏｚｂｅｒ　ｅｔ
　ａｌ、、　　”　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔｉｍｕ−Ｉ
ａｔｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｓ　ａ　５ｏｕ
ｒｃｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｙｂｒｉ−ｄｏｍａｓ　
”　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉａｍｕｎｏｌ、　１９８４
　　；　（１１ｓｓｏｎ　ｅｔａｔ、、　’　Ｈｕｍａ
ｎ　ｈｙｂｒｉｄｏａ＋ａｓ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒ
ｅｄｅｆｉｎｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　５ｐｅｃｉｆ
ｉ−ｃｉｔｙ”　、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ　）　７７　：５４２９−５
４３４．１９８０　　；　　Ｃｒｏｃｅ　ｅｔ　ａｌ、
、　”　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａｓ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ　ｔ。
ｍｅａｓｌ　ｅｓ　ｖｉｒｕｓ　”　、　Ｎａｔｕｒｅ
　２８８　：　　４８８−４８９．１９８０に開示され
た技術を含む、種々の既知の技術によって製造すること
ができる。上記のすべてを参照としてここに取り入れる
。
これら参照文献はヒトモノクロナール抗体の製造方法を
開示する。それら方法をａ−Ｉｄを分泌するヒトハイブ
リドーマの製造に適応させるため、最初の工程は、患者
の免疫系がそれに対する抗体を産生じている例えば特定
の腫瘍および／または感染病変を持っている患者から末
梢血液を採取することである。該抗体はイディオタイプ
ａ−Ａｇに対するａ−Ｉｄを伴っていなければならない
。
リンパ球は次に例えばＦｉｃｏｌｌ勾配上に分離され、
回収される。代わりに、脾細胞および／またはリンパ球
は患者の肺臓および／またはリンパ腺もしくはリンパ管
から取り出すことができる。リンパ球はａ−Ｉｄ産生に
ついて例えばａ−Ｉｄによりおよび／またはＡｇ／ａ−
Ａｇ複合体形成の競合的阻止によってテストされる。
リンパ球は次にヒトミエローマ細胞、例えはＬＩＣＲヒ
トミエローマ細胞ラインと融合され、そしてａ−Ｉｄを
産生ずるハイブリドーマ細胞が採取され、クローニング
される。代わりに、リンパ球はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ
ｒビールス（ＥＢＶ）で不滅化されそしてクローニング
され、ａ−Ｉｄを産生ずるクローンが選定される。ＥＢ
Ｖ不滅化細胞もヒトミエローマ細胞と融合することがで
き、そしてａ−Ｉｄ−産生ハイブリドーマを次に単離し
、クローニングすることができる。
最後に、単離されたリンパ球は、胸腺細胞で調節した培
地中またはマクロファージのフィーダ一層上で、例えば
ａ−Ａｇおよびミトゲン、例えばアメリカやまごぼうミ
トゲンにより試験管内で感作および刺激することができ
、次に細胞は融合および／または上記のように不滅化さ
れる。
モノクロナールａ−Ｉｄを製造するための好ましい代替
方法が本発明者によって開発された。該方法は、ハイブ
リドーマ細胞が同質遺伝子的動物。
最も多（はマウスへ注射され、そして一種または二種以
上の腹水腫瘍が動物の適切な部位で生育されるミモノク
ロナール抗体の代替製造法から発している。ｌｌ１ｍを
確立するため数日の生育の後、腹水が取り出され、モノ
クロナール抗体はそれから容易に単離される。
驚くべきことにそして予期に反し、腹水ハイブリドーマ
を生育させた動物から切除したリンパ球。
特に脾細胞は、腹水腫瘍によって分泌される抗体に対す
る抗イディオタイプ抗体を分泌するハイブリドーマを形
成するようにミエローマ細胞と融合できることが中１明
した。このように、ａ−Ａｇ／ａ−Ｉｄペアの両成分が
製造できる便利な方法が提供される。この方法は、宿主
動物を通過できる任意のハイブリドーマによって分泌さ
れる抗体を特異性に結合するａ−Ｉｄクローンの製造に
使用することができる。該ハイブリドーマは腹水１！瘍
、皮下腫瘍またはａ−Ａｇを分泌できる任意の他のタイ
プの生きた増殖ハイブリドーマとして通過させることが
できる。
この方法のそれ以上の改善は、抗イディオタイプクロー
ンの試験管内刺激によって得られる。これは、例えば腹
水症が生育された動物から単離された脾細胞へ腹水を加
え、さらにＢ細胞生産の刺激剤の存在によって得られる
。適当なそのような刺激剤は既知であり、そして例えば
アメリカやまごぼうミトゲンを含む。この試験管内刺激
は、好ましくは組織培養培地中で行われる。その効果は
、抗イディオタイプ抗体を産生ずるＢ細胞の生育を選択
的に集中および刺激することである。得られた刺激し、
培養した細胞はミエローマ細胞と融合され、ａ−Ｉｄハ
イブリドーマの増加した収量が観察される。
抗イディオタイプモノクロナール抗体は、競合的結合ア
ッセイにおいて慣用の抗原を上進る技術的および商業的
利益を提供する。ハイブリドーマから得られるａ−Ｉｄ
は、限られた特異性および高い安定性をもって無限量製
造することができる。
ａ−Ｉｄを産生ずるハイブリドーマ細胞ラインは液体窒
素中に冷凍でき、そして永久に貯蔵できる。
ａ−Ｉｄは、テストキットの性能特性を改善することを
意図した生物学的および化学的修飾のための独特の機会
を提供する。例えば、全免疫グロブリンを上進る利益を
提供できるａ−Ｉｄ抗体フラグメントを使用することが
できる。例えば米国特許４，３３Ｌ６４７に開示された
二官能性ハイブリッド、または類似する二重特異性スペ
シスを使用することができる。イソタイプスイッチング
は、インタイブ特異性抗体へ結合した標準化またはユニ
バーサル標識の使用の利益を実現し、および／または許
容するために、ａ−Ｉｄをもって実施することができる
。
また、免疫グロブリンは、免疫グロブリンのための標識
技術は高度に発達しそして容易に１＝準化されるので、
抗原よりも標識および／または固相支持体への結合がし
ばしば一層容易であろう。
組織培養培地または腹水からのａ−Ｉｄモノクロナ一ル
抗体の製造および精製の容易性もそれらの使用を有利に
する。さらに、精製したａ−Ｉｄモノクロナール抗体は
、多くの場合、特に腫瘍マーカーの場合、精製した抗原
よりも製造するのが安価である。
単−ａ−Ｉｄの特異性が狭すぎて抗原のａ　−ｆｉ。
ｇへの結合を完全に阻止できない場合には、適当な阻止
を得るため、ａ−Ａｇに対して区画された阻止性を有す
るライブラリーから二種以上のａ−Ｉｄを選択すること
ができる。前記したように、複合体のａ−Ａｇまたはａ
−Ｉｄ成分として、および／または標準曲線をつくるた
めに使用するａ−Ｉｄとして、免疫グロブリンフラグメ
ントを使用することもできる。
本発明に従ったａ−Ｉｄの製造法と、アッセイキットの
構成および使用の例証として、以下の好ましい具体例が
詳細に説明される。ａ−Ｉｄの産生を刺激する抗原とし
て使用された抗体は、その製造が１９８４年５月１４日
に出願された米国特許６０９，６０７に記載されている
ＮＰ−２と命名された精製した抗ガン胎児性抗原モノク
ロナーク抗体である。この抗体はリン酸緩衝化食塩水（
ＰＢＳ。
ｐ　Ｈ７，２’）中に１■／淑の濃度で懸濁され、アッ
セイのための免疫化まで一２０℃で貯蔵される。
ハイブリドーマビのための　　ヒブロトコールＮＰ−２
抗イディオタイプを形成するため二つの免疫化スケジュ
ールが使用される。６ないし８週令のＢａ１ｂ／ｃＪ雌
マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｂａｒ　ＩＩａｒｂｏｒ＋　ＭＥ）へ完全フロインドア
ジュバント（１：　１）中の精製ＮＰ　−２１００ｍｃ
ｇを腹腔内（ｉ、ｐ、）注射する。動物は１週間後ＰＢ
Ｓ中５０ｍｃｇのＮＰ−２の２回目のｉ、ｐ、注射を与
えられ、その後８週目にＰＢＳ中５０ｍｃｇのＮＰ−２
の最終ｉ、ｐ、注射を受ける。最終免疫化後３日目に動
物は融合のためと殺される。
代替免疫化プロトコールは、親ハイブリドーマ細胞ライ
ンＰＬ−Ａ６を注射した動物がら抗ＮＰ−２活性化牌細
胞を単離することを含む。この操作において、雌Ｂａ１
ｂ／ｃＪマウスは０．５ｄプリスタ：／　（２，６，１
０，１４−テトラメチルペンタデカン；Ａｌｄｒｉｃｈ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、
　Ｗｌ　）の注射でプライミングされる。動物は１〜２
Ｘ１０６個（７）ＰＬ−Ａ６細胞が接種される。マウス
は通常７−１４日後に腹水腫瘍を発生し、そして腹水を
ｉ、ｐ、穿刺によって集める。動物を２１１回目と殺し
、脾細胞を融合工程のために取り出す。予備観察は、こ
れら動物はイディオタイプに対し免疫レスポンスを発生
することが示された。
ハイブリドーマの５１ ハイプリドーマ製造のための操作は、Ｋｅｎｎｅｔｔｅ
ｔ　ａｌ、、　　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　８１＋７７　（
１９７８）　　；　　５ｔｒｉｋｅ　ｅｔ　ａｌ、＋　
　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、二祁又。
１７９Ｂ　（１９８４）に開示された以前に記載された
技術の変法である。免疫化した動物を頚部脱臼によりと
殺し、肺臓を無菌的に除去し、血清不合ダルベツコ修飾
イーグル培地（ＤＭｕＭ　；　Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ＋Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ＋　ＮＹ）
中の脾細胞の単細胞懸濁液を開裂するために引き裂く。
細胞を遠心によって集め、ＤＭＥＭ中で一回洗う。総細
胞数をトリパンブルー排除技術を使用して血球計カウン
トによって測定する。
約１０８個の脾細胞が２．５Ｘ１０７個のＰ３Ｘ６３−
ＡＣ８，６５３ネズミミエローマ細胞（６５３、ＡＴＣ
Ｃ）と混合される。上清が除去され、ペレットがゆるや
かな穿刺によって再懸濁される。
ポエチレングリコール（ＰＥＧ　４０００　；　Ｇｉｂ
ｃｏ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ）　　１　ｒｔｄｌ
が試験管へ加えられ、そして細胞が室温で９０秒インキ
ュベートされる。ＤＭｕＭ５獣が６０秒にわたって添加
され、次に２０％ウシ胎児血清（Ｄ−２０）を補強した
ＤＭＥＭＳ成が６０秒にわたって加えられる。次に融合
した細胞が５００Ｘｇにおいて１０分間遠心される。最
終細胞ペレットは、１：Ｉ　Ｄ−２０＋ＨＡＴ　（Ｄ−
ＨＡＴ）（ＨＡＴ　：ヒポキサンテンーアミノプテリン
ーチミジン）を含有するＤ−２０の５０ｄ中に再懸濁さ
れ、そして６枚の９６個のウェルを持ったマイクロリッ
トルプレートへ、ウェル当たり約２．３Ｘ１０’個の濃
度で加えられる。細胞は１、　３．　７および１０日目
にＤ−ＨＡＴを、そしてその後コロニーが出現しそして
アッセイされるまで（約２−３週間）毎週Ｄ−２０が供
給される。
ＮＰ−２ａ−Ｉｄの存在についての最初のスクリーニン
グは、コーティング抗原としてＮＰ−２モノクロナ一ル
抗体（ＭＡＢ）を使用したＲＩＡを使用して実施される
。ポリ塩化ビニルマイクロタイタープレートが０．０５
Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）中に懸濁したヤギ抗マウ
スＦｃ　（Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚｅ。
Ｒｏｇｅｒｓ　＋　＾Ｒ）の１ｍｃｇ／ウェルで被覆さ
れる。
ＮＰ−２の１ないし２　ｍｃｇが１時間を要して各ウェ
ルへ加えられ、次にハイプリドーマ上清の５０μ２が加
えられる。Ｌ２５Ｉ標識したＣＥＡが加えらし、各ウェ
ルがパンカードオートガンマシンチレーション分光計（
モデル５２３０　”）中でカウントされる。陽性コロニ
ーはＣＥＡのＮＰ−′２へ結合の阻止によって同定され
る。
これら陽性コロニーの部分標本を一１３５℃において冷
凍した後、多数のハイブリドーマが制限希釈法によって
クローニングされる。陽性コロニーの系統的希釈液が威
光たり細胞１０個の最終濃度までに￥Ａ製される。１０
０μ１部品標本が同質遺伝子的脾細胞のフィーダ一層を
含んでいる９６（固ウェルのマイクロリ・ントルブレー
トの各ウェルへ加えられる。約１０ないし２１日で巨視
的コロニーが観察される。一つのクローンを含んでいる
ウェル（巨視的に観察される）のみが前述したＲＩＡで
再アッセイされる。
陽性クローンが除去され、そして組織培養で拡大される
。クローンは将来の使用のため冷凍され、そして細胞０
．５ないし１１固／ウエルの濃度における制限希釈によ
って管理し得る数にサブクローニングされる。ザブクロ
ーニングは競合的ラジオイムノアッセイ　（ＲＩ　Ａ）
を使用してＮＰ−２へのＣＥＡの結合に対するそれらの
効果についてテストされる。
ａ−Ｉｄ’ｌ　　・１　　る−ジオイムノア・・セ土 ＮＰ−２へのＣＥＡの結合に対するａ−Ｉｄモノクロナ
一ル抗体濃度の影響を決定することが必要である。これ
は競合的ＲＩＡを使用して実施される。試験管のシリー
ズが準備され、そして各自へ０．（１１Ｍ酢酸アンモニ
ウムとＮＰ−２（１：　１００）の２０ｄとが加えられ
る。ａ−Ｉｄの変化する濃度プラスｌ−１２５標識ＣＥ
Ａの５０μｍ（約１０’ｃｐｍ／ｍ）が加えられ、そし
て試験管は４５℃で３０分間インキュベ゛−トされる。
各インキュベーション期間４１ｔ　、Ｚ−ゲル（ジルコ
ニルフォスフェート）の２獣が加えられ、試験管ば１０
００×ｇにおいて５分間遠心される。ゲルは酢酸アンモ
ニウムで１回洗浄され、そして試験管がガンマカウンタ
ー中でカウントされる。
結果の精度を確実にするため、適当な陽性および陰性対
照テスト（不適切なＭＡＢを含む）が実施される。ＮＰ
−２ＭＡＢへのＣＥＡの結合を結果的に阻止するａ−Ｉ
ｄサブクローンのみが保存される。多数のサブクローン
が阻止活性を示すことが期待される。これら細胞は組織
培養によって拡大され、−１３５℃で冷凍される。所望
ＭＡＢの大規模生産はＢａ１ｂ／ｃＪマウスからの腹水
のｉ）！ｉＩＭを含むであろう。
モノクロ　−ル　　　　んでいる　７の−１ハイブリド
ーマは１０％ウシ胎児血清を補強したＤＭＥＭ中で生育
される。細胞は５００ｘｇにおいて４℃において１０分
間沈降され、そして血清不合培地中に再患濁される。細
胞密度が血球計中において懸濁した細胞をカウントする
ことによって測定され、そして生存性がトリバンプルー
排除によって測定される。
８−１θ週令のＢａ１ｂ／ｃＪマウスが、接種前３ない
し４日にプリスタン１威の腹腔内注射によってプライミ
ングされる。接種は１〜２Ｘ１０６個の生きた細胞の腹
腔内注射によって達成される。腹水を得るため、マウス
をメトファン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ。
Ｉｎｃ、、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｃｒｏｓｓｉｎｇ
、　ＮＪ　）で麻酔し、そして２０ゲージ皮下針によっ
て無菌キャンプしたプラスチック培養チェーブ中へ腹水
を穿刺する。
細胞を除くため、腹水は５００Ｘｇにおいて１５分間４
℃にて遠心され、腹水を含んでいる上滑を無菌容器へ移
し、必要とするまで一２０℃ないし−３０’Ｃにおいて
冷凍保存する。
ａ−ＩｄＭＡｙＢのイソ　イブヒ 抗ＮＰ−２ａ−Ｉｄのマウス抗体イソタイプは、アフィ
ニティー精製した重鎮特異性抗マウス１ｇ（ｃａｐｐｅ
ｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｍａｌｖｅｒｎ＋　
ＰＡ）を使用し、コーティング抗原としてａ−Ｉｄｓを
使用する改変ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて測定される。抗イ
ディオタイプＩｇＧモノクロナール抗体は以後記載する
ように精製される。
か゛のモノクロ　−ル　　の　１１ モノクロナ一ル抗体の精製は主要な３工程、すなわち（
１）粗ガンマグロブリンを得るための粗腹水の硫安分画
；　（２１Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロース上のイオン交換
クロマトグラフィー（ＩＥＧ）；および（３）ヒドロキ
シアパタイトカラム上のクロマトグラフィーおよびリン
酸カリウムの直線勾配による展開によるＩｇＧ分画の最
終精製とを含む。
班皮丘■ 腹水を解凍し、もし必要ならばプールし、そして１８０
０Ｘｇにおいて１５分間環境温度で遠心し、上清をグラ
スウールで口過する。（ＮＨ４）ｚｓＯ４の飽和溶液の
部分標本を濃水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨ７，
５に調節する。ビューレットを使用し、（Ｎ）＋４）２
ＳＯ４の飽和溶液を４０％飽和度の最終濃度になるよう
にかきまぜながら腹水へ滴下する。滴下後懸濁液を室温
で１２０分間かきまぜる。１ヒ濁液をキャップした遠心
チューブへ移し、１８００Ｘｇで１５分間室温において
遠心することによって沈澱を採取する。上滑を棄て、ペ
レットを少容禎のＰＢＳに溶解する。溶解したベレット
を各回１０００容積のＯ，ＯＩＭリンリン酸カリウム　
Ｈ８，０の６回交換に対して４°Ｃにおいて透析する（
３ないし４時間毎に１日３回交換）。透析　　　′中介
体した濁りは１８００Ｘｇで１５分間室温で遠心するこ
とによって除去する。
７５ｇのＤ　Ｅ　５２　（Ｗｈａｔｍａｎ＋　Ｃ１１ｆ
ｔｏｎ、　ＮＪ）を室温においてときどきかきまぜなが
ら０．５　Ｍリン酸ナトリウムｐ　Ｈ８，０で平衡化す
る。イオン交換セルロース（ＩＥＣ）のこの量は腹水１
００ないし１２０ｄから得た材料を処理するのに十分で
ある。２ないし３時間後、ＩＥＣを０．　ＯＩ　Ｍリン
酸ナトリウムｐＨ８，０で流出液および圧加液のｐ）（
および電導塵が等しくなるまで洗浄する。ＩＥＣは少な
くとも０．ＯＩＭリンリン酸カリウムｐ　８．０の１ベ
ツド容積で洗浄される。
１ｇサンプルをカラムに負荷し、流出液の２８Ｑｎｍの
吸収がベースラインへ戻るまでクロマトグラフし、緩衝
液を０．０２５Ｍリン酸ナトリウムｐ　Ｈ８，０へ変え
、そしてｆ４離を同じ流量で継続する。この濃度のリン
酸塩濃度で溶離するタンパク分画はマウスＩｇＧを含有
し、そしてそれはＩｇＧと、そして免疫電気泳動で移動
を示す少量の他のタンパク　（多分トランスフェリン）
とよりなる。
この夾雑物はヒドロキシルアパタイト上のクロマトグラ
フィーで容易に除去される。もし必要ならＩｇＧ分画を
アミコンＹＭ−３０膜を使用する限外口過によって濃縮
し、そして毎回アジ化ナトリウム０．０２％を含有する
０、ＯＩＭリン酸カリウムｐ　Ｈ６，８を２０００淑に
対して４回・ビＣで透析する。免疫電気泳動およびＰＡ
ＧＥによる分析のためサンプルを採取する。
ヒドロキシルアバ　イト　のクロマトブーツ　−ＩＥＣ
精製したＩ　ｇＧ２０■に対し１ｇのヒドロキシルアパ
タイト　（ＨＡ　；　ｂｉｏｒａｄ、　Ｒｉｃｔ＋ｍｏ
ｎｄ、　ＣΔ）を６容積（成／ｇ）の０．（１１Ｍリン
酸カリウムｐＨ６，８中に分散する。ＨＡベッドを太く
て短いカラム（２，５Ｘ２０ｃｍ＞中のセファデックス
Ｇ−２５フアイン（ファルマシア）の約０．５　ｃｍの
上にパ、７りする。セファデックス層およびＨＡの両方
を１２戚Ｘｈ　ｒ’Ｘｃｍ−２の流速でパックする。Ｉ
［Ｇ分画を粒状物を除くためｉｓｏｏｘｇにおいて遠心
しく１５分間、室温）、次に減らした流速６戚×ｈ　ｒ
　’　Ｘ　ｃｎ−２でカラムへ適用する。カラムは＠重
液の少なくとも１ベツド容積で、または流出液の”Ｅｌ
収（２８０ｎｍ）がベースラインになるまで溶離する。
カラムを勾配フォーマ−へ接続し、そしてリン酸カリウ
ムの０．（１１　Ｍから０．０３　Ｍまでの直線勾配（
勾配の総容積は１０ベツド容積に等しい）でｉ　ｇｔｔ
する。
流出液の吸収を２８０ｎｍにおいて追跡し、ＩｇＧ分画
を無菌のパイロ−ジエン不含容器に集める。ＩｇＧ製剤
をアミコンＹＭ−３（１１１Ａを使用する限外口過によ
って１０ｎｗ／ｍへ濃縮し、無菌的に４℃で貯蔵する。
このモノクロナール抗体型剤は、（ａｌｌ全全血清よび
抗マウスＩｇＧに対する免疫電気泳動；（ｂ）非変性ゲ
ル中のポリアクリルアミドゲル電気泳動により、純度お
よび免疫反応性についてテストするか、または（ｃ１該
１ｇＧｇ剤をＩ２５１で比活性１２〜１５μＣｉ／ｍｃ
ｇへ標識し、そして以下のアフィニティーマトリックス
を使用して免疫反応性および純度について分析する。セ
ファロースへ結合したＣＥＡおよびセファロースへ結合
した抗マウスＩｇＧ、前記は免疫反応性をステトするた
め、そして後者は製剤中のＩｇＧのパーセントをテスト
するために使用される。
一般にこのキットは、放射標識した抗イディオタイプモ
ノクロナール抗体の標準濃度と患者の血ｔｎとが、抗Ｃ
ＥＡを被覆したポリ塩化ビニル試験管（ａ−ＣＥＡ−Ｐ
ＶＣ）へ加えられる競合的イムノアッセイである。血清
中のＣＥＡの濃度は、患者の血清による、抗イディオタ
イプのａ−ＣＥＡ−ＰＶＣへの結合の阻止を相関させる
ことにより、標準曲線から誘導される。
１、　　ａ−ＣＥＡ−ＰＶＣの８．１ ポリ塩化ビニル試験管を炭酸塩緩衝液ｐ　Ｈ９，６中に
÷が濁した抗ＣＥＡモノクロナール抗体で被覆する。試
験管上の未反応部位（これは非特異性結合を生じ得る）
は同じ緩衝液中の３％ウシ血清アルブミンでブロックす
る。これら試験管は４°Ｃにおいて６〜１２ケ月貯蔵し
得る（Ｋｅｎｎｅｔ、　Ｒ，１１，。
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　；　
　Ｒ，Ｉ（、Ｋｅｎｎｅｌ、　Ｔ、Ｊ。
ＭｃＫｅａｒｎ＋　Ｋ、Ｂ、　Ｂｅｃｈｔｏｌ＋　ｅｄ
ｓ、、　Ｃｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。
Ｎ、Ｙ、、　ｐ、３７６、１９８１　）。
抗ＣＥＡモノクロナール抗体へのＣＥＡの結合を完全に
阻止するａ−Ｉｄモノクロナ一ル抗体の濃度を決定する
ことが必要である。テストキット開発のこの面を達成す
るため、変化する濃度の１２５Ｉ標識ａ−Ｉｄモノクロ
ナール抗体をＣＥＡの既知濃度と共にａ−ＣＥＡ−ＰＶ
Ｃへ加える。ａ−Ｉｄの阻止活性をＣＥＡタンパク濃度
と関連させる阻止曲線が得られる。ａ−Ｉｄは次に診断
テストキットにおいて標準曲線を得るために使用される
。
３−　　ＭＵ−ストキ・　トにおいて　イー゛イオ　イ
プモノクロ　−ル　　の このテストキットは、ａ−Ｉｄがヒト血清中のＣＥ　Ａ
　濃度の測定のための代用抗原として作用する能力の利
点を利用する。
以下の成分がキットで供給されなければならない。
前記に記載したように調製したａ−ＣＥＡ−ＰＶＣ０ 慣例的に標識した、例えばクロラミンＴ法によって標識
したＩＢ工標識抗イディオタイプモノクロナール抗体。
非標識ａ−ＩｄＭＡＢ（標準阻止曲線作成用）。
リン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｃ）緩衝剤錠剤。
テスト操作は以下のように構成される。
１、ａ−ｒｄＭＡＢの既知濃度を用いて標準阻止曲線を
作成せよ。曲線はＣＥＡｊＩ度１〜１００■／ｄに相当
するａ−Ｉｄ９ｉ度範囲にわたって作成される。このス
テップにおいて、ａ−ＩｄＭＡＢはＰＢＳ３ｄ中のａ−
ＣＥＡ−ＰＶＣへ加えられる。
２、患者の血清をａ−ＣＥＡ−ＰＶＣへ加えよ。
モノクロナール抗体の高い特異性のため、多くの市販キ
ットにおいて必要な、餌・漬からタンパクを抽出するこ
とは通常不必要である。
３、試験管を４５°Ｃで２０分間インキュベートせよ。
４、試験管をＰＢＳで３回洗浄せよ。これは各試験管へ
ＰＢＳ３ｄを加え、液体を廃液ボトル中へ注ぐことを含
む。試験管はその後乾燥される。
５、各試験管へ圀Ｉ標識ａ−Ｉｄモノクロナール抗体を
加え、４５℃で３０分間インキュベートせよ。
６、試験管をＰＢＳで３回洗い、乾燥せよ。
７、試験管をガンマシンチレーション分光計中でカウン
トせよ。
８、標準阻止曲線から患者の血清中のＣＥＡ濃度を決定
せよ。すなわち血清中のＣＥＡの量は、ａ−ＣＥＡ−Ｐ
ＶＣへのａ−Ｉｄの結合に対する阻止効果に関係する。
現在市場に出廻っているものを上進る多数の利益が上の
キットに存在する。このテストはより高い感度を有する
。これは標準阻止曲線がａ−Ｉｄモノクロナール抗体の
量を加減することによって広い範囲のＣＥＡ濃度にわた
って作成できるからである。このキットはまたより高い
精度を有する。
特異性ａ−Ｉｄモノクロナール抗体はクローン化したハ
イブリドーマ培養物から無限に入手し得るので、アッセ
イはロフト毎に変化しない。加えて、ＣＥＡの継続的生
化学的単離を必要とせず、それによりコストを切り下げ
、そしてロット間の変動がなくなる。
抗原としてａ−ＩｄＭＡＢを用いる非アイソトープ診断
キットも容易に構成することができる。
このキットは、圀Ｉで放射標識したａ−ＩｄＭＡＢＯ代
わりに、ペルオキシダーゼ結合ａ−ＩｄＭＡＢを代用抗
原として使用することを除いて、上に記載したキットと
類似である。操作は上のＲＩＡについて記載した操作と
同じであるが、しかしＨ２Ｏ２の存在下クロモゲン（オ
ルソフェニレンジアミンのような）を添加することと、
そしてＣＥＡ結合の測定に分光光度計を使用することを
含む点が異なる。ペルオキシダーゼ結合ａ−［ｄは、例
えばグルタルアルデヒドで結合することにより、慣用方
法で結合することができる。
上記例証は、抗ＣＥＡに代えて、他の腫瘍関連抗原、例
えばアルファフェトタンパク（ＡＦＰ＞、ヒト絨毛膜ゴ
ナドトロピン（ＨＣＧ）、結腸特異性抗原−ｐ　（ｃ３
Ａｐ）、前立腺酸性フォスファターゼ（Ｐ　Ａ　Ｐ）そ
の他を特異的に結合する特異性抗体、好ましくはモノク
ロナール抗体を使用するように修飾し得ることが認めら
れるであろう。
その代わりに、特異性抗体は、感染病変に関連するマー
カーを特異性に結合する抗体、例えはビールス、バクテ
リアまたは他の感染性微生物、ホルモン、酵素その他に
対する抗体であってもよい。
本発明方法は、抗体とその相補的抗イディオタイプ抗体
との反応を阻止することによって抗原が検出される任意
のアッセイに使用することができる。
もっと一般的には、抗原／抗体複合体の形成を阻止する
能力によって抗原を検出する任意の競合的イムノア、セ
イは、典型的にはａ−Ｉｄまたはａ−／ｌのどちらかが
固相へ結合され、他方の成分が標識された形において、
抗原に代えて抗イディオタイプ抗体を使用するように修
飾することができる。
以上の一般的説明および実施例は例証目的のみのためで
あり、そして当業者は特許請求の範囲に規定した本発明
の精神から逸脱することなく種々の改変および修飾をな
し得ることを認識するであろう。
特許出願人　　　イミュノメディンクス、インコーポレ
イテソド

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）液体サンプル中の抗原（Ａｇ）の存在を測定する
    方法であって、 （ａ）前記液体サンプルと、前記抗原上のエピトープを
    特異的に結合する抗体（ａ−Ａｇ）とを、該ａ−Ａｇの
    高可変性領域上のエピトープを特異的に結合する抗イデ
    ィオタイプ抗体（ａ−Ｉｄ）の与えられた量の存在下に
    インキュベートし、そしてａ−Ａｇ・ａ−Ｉｄ複合体形
    成の程度を測定する工程にして、前記ａ−Ａｇおよびａ
    −Ｉｄの少なくとも一方は標識されているものを使用す
    る前記工程と、 （ｂ）標識されていないａ−Ｉｄの標準液を、工程（ａ
    ）におけるように標識された前記ａ−Ａｇおよびａ−Ｉ
    ｄの前記量とインキュベートし、そしてａ−Ａｇ・ａ−
    Ｉｄ複合体形成の程度の標準値を測定する工程とを含み
    、 それによって工程（ａ）および（ｂ）におけるａ−Ａｇ
    ・ａ−Ｉｄ複合体形成の相対的程度から前記抗原の存在
    を測定することを特徴とする前記測定方法。
  2. （２）前記ａ−Ａｇは固相支持体へ直接または間接的に
    結合されており、前記ａ−Ｉｄが標識されている第１項
    の方法。
  3. （３）前記ａ−Ａｇは前記固相支持体へ共有結合によっ
    て結合されている第２項の方法。
  4. （４）工程（ａ）または工程（ｂ）において使用する前
    記ａ−Ａｇの全部を結合するのに十分な量の、前記ａ−
    Ａｇの高可変性領域以外上のエピープを特異的に結合す
    るイソタイプ特異性抗体が前記固相支持体へ結合されて
    いる第２項の方法。
  5. （５）前記標識は放射性核種、酵素、螢光染料、または
    それに対して特異性な抗体によって結合し得るハプテン
    である第２項の方法。
  6. （６）前記ａ−Ｉｄは固相支持体へ直接または間接的に
    結合されており、前記ａ−Ａｇが標識されている第１項
    の方法。
  7. （７）（ａ）イディオタイプ抗体を分泌し得る腫瘍が生
    育している動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合
    する工程と、そして （ｂ）前記イディオタイプ抗体の高可変性領域上のエピ
    トープを特異的に結合するモノクロナール抗体を分泌す
    る得られたハイブリドーマを単離し、そしてクローニン
    グする工程 とを含むモノクロナール抗イディオタイプ抗体の製造方
    法。
  8. （８）前記リンパ球は脾細胞である第７項の方法。
  9. （９）前記動物はマウスである第７項の方法。
  10. （１０）前記ミエローマ細胞はネズミミエローマ細胞で
    ある第７項の方法。
  11. （１１）前記抗原は腫瘍関連マーカーである第１項の方
    法。
  12. （１２）前記抗原はガン胎児性抗原、アルファフェトタ
    ンパク、ヒト絨毛膜ゴナドロピンもしくはそのベーター
    サブユニット、結腸特異性抗原ｐ、または前立腺酸性フ
    ォスファターゼである第１１項の方法。
  13. （１３）前記抗原は感染病変によって産生または関連マ
    ーカーである第１項の方法。
  14. （１４）前記抗原はビールス、バクテリア、かびもしく
    はその他の微生物、またはそれらの抗原性フラグメント
    である第１３項の方法。
  15. （１５）液体サンプル中の抗原（Ａｇ）のイムノアッセ
    イに使用するためのキットであって、 （ａ）前記抗原上のエピトープを特異的に結合する抗体
    （ａ−Ａｇ）と、 （ｂ）前記ａ−Ａｇの高可変性領域上のエピトープを特
    異的に結合する抗イディオタイプ抗体（ａ−Ｉｄ）と、 （ｃ）前記ａ−Ａｇに対して前記Ａｇと競合する能力が
    定量化されている未標識ａ−Ｉｄスタンダードとを含み
    、前記ａ−Ａｇおよびａ−Ｉｄの少なくとも一方は標識
    されており、そして前記抗体の溶液を調製するための手
    段を備えている前記キット。
JP60208576A 1984-09-25 1985-09-19 抗原に依存しないイムノアツセイシステム Pending JPS6184561A (ja)

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US654273 1984-09-25
US06/654,273 US4699880A (en) 1984-09-25 1984-09-25 Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody

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AU (1) AU589907B2 (ja)
IL (1) IL76459A (ja)
ZA (1) ZA857321B (ja)

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