WO2007026731A1

WO2007026731A1 - バイオチップ及び免疫分析方法

Info

Publication number: WO2007026731A1
Application number: PCT/JP2006/317044
Authority: WO
Inventors: Yoko Hayashi; Osamu Takehiro
Original assignee: Rohm Co., Ltd; Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2007-03-08
Also published as: US20090233805A1; JP2007064827A; JP4699840B2

Abstract

　本発明は、洗浄工程を省略して分析を簡略化することができ、小型で安価であることに加えて、正確かつ迅速な分析を実現することができるバイオチップ及びこれを用いた免疫分析方法を提供することを目的とする。本発明は、被検物質とそれと反応する標識抗体とを混合するための混合槽と、抗イディオタイプ抗体が固定された固定手段を含む反応槽と、前記被検物質を検出する検出部とを有するバイオチップで、前記混合槽又はその隣接部に標識抗体を含み、該標識抗体は、F（ａｂ’）フラグメント又は還元IgGからなる抗体部分と標識物とが特定の結合比で結合して構成され、前記反応槽と検出部とが、前記固定手段を通過させないチャネル部によって分離され、前記抗イディオタイプ抗体は前記標識抗体に対する抗イディオタイプ抗体で、前記被検物質と標識抗体との反応生成物には結合できない種類の抗体であることを特徴とするバイオチップ。

Description

明細書

バイオチップ及び免疫分析方法

技術分野

[0001] 本発明は、バイオチップ及びこれを用いた免疫分析方法に関する。

背景技術

[0002] 従来から、医療、食品、創薬等の分野で、 DNA、酵素、タンパク質、ウィルス、細胞などの生体物質が種々の方法で分析されており、これらの分析を簡便に行う一手段として、 Lab on Chipと呼ばれる技術が近年注目されている。

[0003] この技術は、分析する対象の種類によって、臨床分析チップ、環境分析チップ、遺伝子分析チップ (DNAチップ）、たんぱく質分析チップ (プロテオームチップ）、糖鎖チップ、クロマトグラフチップ、細胞解析チップ、製薬スクリーニングチップなどと称される数センチの大きさの基板 (バイオチップ)上で混合、反応、分離、測定及び検出等を行うものである。

[0004] 例えば、このマイクロチップ上で、各種の抗原抗体反応による免疫分析を行う方法が特開 2001— 4628号公報に記載されている。この方法で用いるマイクロチップ 8 は、図 9に示したように、反応固相として、固体微粒子 5が、この粒子の径よりも大きい縦断面積を有する反応槽 6に充填されており、その反応槽 6には、固体微粒子 5の径よりも小さい縦断面積を有する分離部 7a、さらに廃液部 7aが連結されている。また、反応槽 6には、抗原、標識抗体、抗体、洗浄液等を反応槽 6へ注入するための注入部 1、 2、 3、 4及び導入部 a、 2a、 3a、 4aがそれぞれ連結されている。

[0005] このようなマイクロチップ 8では、反応槽 6に、抗原注入部 1、標識抗体注入部 2から導入部 la、 2aを通して抗原や標識抗体を順次導入し、反応させる。そして、洗浄液注入部 4から洗浄液を導入して、未反応物を分離部 7aを利用して分離することによつて、最終的に、光熱変換分析により分析することができる。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] しかし、このマイクロチップ 8では、上述したように、分析に付す前に少なくとも 1回、洗浄液により反応槽 6中の固体微粒子 5を洗浄して、未反応物を固体微粒子の周りから除去することが必要となる。また、抗原、標識抗体、洗浄液等をそれぞれ含有する 2以上の溶液を別個に、順次反応槽 6に導入することが必要となり、その工程が煩雑となる。さら〖こ、固体微粒子に抗体溶液を反応させて固定し、これに抗原等を含有する溶液を混合して、反応させると、ぅ不均一反応を 2回以上行わなければならず、長時間を要するという問題がある。カロえて、複数の溶液を反応槽で別個に反応させるために、上述したように、複数の注入部及び導入部を必要とし、チップの占有面積が大きくなり、小型で簡易なマイクロチップとすることができないという問題もある。

[0007] そこで、本発明は、洗浄工程を省略して分析を簡略ィ匕することができ、小型で安価であることに加えて、正確かつ迅速な定量分析が可能なバイオチップ及びこれを用 Vヽた免疫分析方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明のバイオチップは、被検物質とそれと反応する標識抗体とを混合するための混合槽と、抗イディォタイプ抗体が固定された固定手段を含む反応槽と、前記被検物質を検出する検出部とを有するバイオチップであって、前記混合槽又はその隣接部に標識抗体を含んでなり、該標識抗体は、 F (ab' )フラグメント又は還元 IgGからなる抗体部分と標識物とが特定の結合比で結合して構成され、前記反応槽と検出部と力前記固定手段を通過させないチャネル部によって分離されてなり、前記抗ィディォタイプ抗体は、前記標識抗体に対する抗ィディオタイブ抗体で、前記被検物質と標識抗体との反応生成物には結合できない種類の抗体であることを特徴とする。

[0009] このように、混合槽を設けることにより、混合'反応した状態での被検物質及び標識抗体を、反応槽における固定手段と接触させることができる。ここで固定手段に固定された抗イディォタイプ抗体に捕捉されなヽもののみが反応槽を通過し、検出部に導入されることとなり、未反応の標識物は、反応槽に留まる。従って、このバイオチップを用いることにより、被検物質及び標識抗体と固定手段との反応及び被検物質と標識抗体との反応後の洗浄工程を省略することが可能になり、シンプルで簡便な分析方法を実現することができる。さらに、複数の溶液を別々に反応槽に導入する必要がないために、複数の溶液を別個に導入するための注入部、導入部、又は流路を配置する必要がなぐその結果、バイオチップ自体の占有面積を小型化することができる。し力も、固定手段に被検物質を結合させることを要しないため、測定対象となる物質のみを検出部に導入して分析することができ、バックグラウンドを低減することができる。これにより、より精度の高い分析を行うことが可能となる。

[0010] 本発明のバイオチップでは、標識抗体は、被検物質に対して過剰量含ませておくことが好ましいが、適宜増減することができる。また、固定手段に固定された抗イディォタイプ抗体は、標識抗体に対して、過剰量存在することが好ましい。これによつて、被検物質は確実に標識抗体と反応し、被検物質と反応しなかった残余の標識抗体は、固定手段によって確実に除去することができるため、測定ブランクを低下させることができ、その結果、検出下限を低下させ、低濃度側の測定範囲を広げることができる。また、測定ブランクの低下により、実質的な測光範囲が広くなるため、高濃度側についても測定範囲を広げることができる。つまり、低濃度から高濃度までより高精度な分析を実現することができる。

[0011] また、固定手段は抗イディォタイプ抗体を担持する微粒子とすることができる。これにより、反応槽に抗イディォタイプ抗体を簡便かつ確実に固定することができ、被検物質と結合していない、測定対象でない標識抗体を、固定手段によって確実に捕捉することが可能となる。なお、ここでは、被検物質と結合した標識抗体は捕捉されない

[0012] さらに、混合槽、反応槽、チャネル部及び検出部がこの順で直列に連結されてなることが好ましい。このような構成により、測定対象のみを分離し、他の物質に干渉されることなぐより正確な分析を行うための反応を実現することが可能となる。

[0013] 混合槽には、予め、標識抗体を保持させてもよい。また、混合槽の隣接部に保持槽を設けて、そこに標識抗体を保持させてもよい。

[0014] 標識物を検出するための試薬は、検出部に保持させておくことができる。また、この試薬は、検出部の隣接部、例えば、チャネル部と検出部との間に、さらに基質保持槽を設けて、ここに保持させておくこともできる。

[0015] このように、標識物を検出するための試薬を利用することにより、標識抗体と結合した被検物質を、より確実に定量することができ、精度よく被検物質の分析をすることが可能になる。特に、電子伝達メディエータ又は発色物質等を基質として用いる場合には、光学的又は電気化学的手法という通常の方法により、被検物質のより正確な分析を行うことができる。

[0016] 検出部には、さらに、一対の電極が形成されていてもよい。このように、電気化学的手法を採用することにより、従来の光学的検出装置のような大掛かりで、高価かつ大型の装置を用いることなぐ電流又は電圧等の検出という簡便な方法によって、被検物質の分析を行うことができる。従って、分析に力かる費用を低減させることができるとともに、より小型のバイオチップ及びより小型で安価な分析装置の使用を実現することができる。

[0017] 本発明の免疫分析方法は、上述したバイオチップを用いる免疫分析方法である。

即ち、混合槽で被検物質と前記標識抗体とを混合して反応させ、前記被検物質と標識抗体との混合 Z反応生成物を反応槽に導入し、これらを抗イディォタイプ抗体が固定された固定手段と反応させて未反応の標識抗体を捕捉し、チャネル部を利用して前記被検物質と標識抗体の反応生成物を分離して検出部に導入し、該反応生成物を検出部にて分析することにより被検物質を検出することを特徴とする。

[0018] 被検物質の検出は、電気化学的又は光学的に行うものが好ましい。これにより、従来から当該分野で用いられている検出方法に基づく装置を利用することができる。特に電気化学的に被検物質の検出を行う場合には、光学的に検出を行う場合に比較して、簡便、小型かつ安価な測定装置を利用することが可能となる。

発明の効果

[0019] 本発明によれば、洗浄工程を省略して分析を簡略ィ匕することができ、正確かつ迅速な定量分析を可能とする免疫分析方法を提供する。また、シンプルな構造とすることにより、チップの占有面積を低減し、より小型で安価なノィォチップを提供することができる。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1]本発明のバイオチップの一実施形態を示す平面図及び断面図である。

[図 2]本発明のバイオチップの別の実施形態を示す平面図及び断面図である。

[図 3]本発明のバイオチップのさらに別の実施形態を示す平面図である。圆 4]本発明のバイオチップのさらに別の実施形態を示す平面図である。

圆 5]本発明のバイオチップのさらに別の実施形態を示す平面図である。

〇

圆 6]本発明のバイオチップのさらに別の実施形態を示す平面図である。

圆 7]本発明のバイオチップを用いた免疫分析方法を説明するためのフローチャートである。

圆 8]本発明の別のノィォチップを用いた別の免疫分析方法を説明するためのフロ一チャートである。

[図 9]本発明のバイオチップを用いた免疫分析方法を説明するためのバイオチップの平面工程図である。

[図 10]従来のマイクロチップの実施形態を示す平面図である。

符号の説明

20、 30、 40、 50、 60、 70 ノィォチップ

11 混合槽

12 反応槽

13 固定手段

14、 24 検出部

15、 16 チャネル部

17 導入口

18 排出口

19 流路

20a 上部基板

20b 下部基板

21、 61 基質保持槽

25 電極

31 (標識抗体)保持槽

44、 51 色素保持槽

64 混合槽

71 標識抗体 73、 74 混合液

75 凸部

発明を実施するための最良の形態

[0022] 本発明のバイオチップは、少なくとも、混合槽と、反応槽と、チャネル部と、検出部とを含んで構成される。これらは、この順に、直列に連結されていることが好ましぐさらに、これらの各要素の間に流路が直列的に形成されていてもよいし、各構成要件に、流路を介して又は介さないで、別の槽又は部分が直列的に、付加的に又は並列的に接続されていてもよい。

[0023] 混合槽は、被検物質と標識抗体とを混合するための空間であって、後述する反応槽及び検出部とは別個の空間として規定されている。その大きさは、特に限定されるものではなぐこの目的を実現するために十分な大きさを有していることが必要である力これらの物質の種類、量などに応じて適宜設定することができる。その容量は、例えば、 10—²〜： L0³mm³程度である。また、混合槽の形状は混合目的に適切なものであれば特に限定されるものではなぐ平面及び断面形状ともに、例えば、四角形、台形等の多角形及びこれらの角部分が丸みを帯びた形状、円形、だ円形、ドーム形状あるいは左右非対称の不均一形等どのような形状であってもよ!/、。

[0024] なお、混合槽又はその隣接部には、外部から、被検物質を注入する注入口が形成されている力、流路を介して注入口に連結されていることが好ましい。ここでの流路の形状、大きさ等は特に限定されるものでなぐ例えば、断面積が 0. Ol /z m²〜： LOOm m²程度、長さが 1 μ m〜 100mm程度のものが挙げられる。

[0025] 混合槽には、予め、標識抗体を保持させてもよい。また、混合槽の隣接部に保持槽を設けて、そこに標識抗体を保持させてもよい。このような保持槽は、被検物質を保持することもでき、混合槽へ被検物質又は標識抗体を導入する機能を有する。この保持槽は、例えば、混合槽等と同様の形状、大きさ等とすることができる。

[0026] 反応槽は、混合槽及び検出部とは別個の空間として規定され、抗イディォタイプ抗体を固定するための固定手段をその内部に含んでいる。したがって、反応槽は、固定手段を保持するための十分な空間を有していることが必要であるが、固定手段の種類、量等に応じて適宜設定することができる。その容量は、例えば、 10—²〜： L0³mm 3程度である。また、その形状は、混合槽と同様に、種々の形態に設定することができる。

[0027] 反応槽に含まれる固定手段は、抗イディォタイプ抗体、つまり、抗原抗体反応によつて未反応の標識抗体と結合する抗体を固定し得るものであり、抗イディォタイプ抗体等の活性に影響を与えな、ものであれば特に限定されるものではなぐその形状、材質、量等は、被検物質及び標識抗体の種類、用いる抗ィディオタイブ抗体の種類等によって適宜調整することができる。固定の方法は、物理的吸着、共有結合、ィォン結合、架橋、静電相互作用等公知の方法のいずれかを利用することができる。なお、固定の方法は、抗原及び抗体等の活性に影響を与えないものであることが好ましい。

[0028] 固定手段は、反応槽内に収納することができ、フィルター状、織物状、微粒子状、繊維状等の形状の、発泡体、多孔質体等、表面積を増大させ得る種々のもの、一般にバイオリアクター及びクロマトグラフィー等用の担体として使用されているもの等が挙げられる。例えば、微粒子状のものは、ガラスビーズ、ポリスチレン等のポリマービーズ、ァガロース、デキストラン、キトサン、タンパク等の高分子化合物（ゲル)の微粒子、シリカ、金属等のビーズ、さらに市販されている微粒子状の固体担体等のいずれかを用いることができる。その直径は、 1mm程度以下のもの、 10 m〜lmm程度のもの、 100〜800 μ m程度のもの、 200〜600 μ m程度のもの、 200 μ m〜lmm程度のもの等がある。

[0029] なお、固定手段とともに又は固定手段に代えて、反応槽自体が、必要な表面積を確保する（つまり表面積を増大する）ように形成されてヽるものを利用することもできる。例えば、反応槽を構成する壁面表面が粗いもの、壁面自体に凹凸が形成されたものが挙げられる。

[0030] 混合槽と反応槽とは、流路を通して又は流路を介さな!ヽで直接、直列で連結されていることが好ましい。いずれの場合にも、反応槽に含まれる固定手段が、流路側及び Z又は混合槽側に移行しないように、混合槽と反応槽との間に、後述するようなチヤネル部と同様又は類似の構成を含むものが好ましい。 [0031] チャネル部は、反応槽と後述する検出部との間に形成されており、反応槽内に存在する固定手段の径よりも小さい径を有する。ここで、「径」とは、固定手段及び Z又はチャネル部の形状によって、幅、高さ、長さ等とすることができるが、固定手段の「径」においては固定手段 1単位における最大の長さ（幅）、チャネル部の「径」においてはチャネル部の断面における最小の長さ（幅）であることが適当である。つまり、チヤネル部は、反応槽に存在する固定手段を、反応槽内にのみ止めるために、反応槽の出口（好ましくは入口にも）に、固定手段を通過させない機能又は形状を与えている。

[0032] チャネル部が流路自体である場合は、例えば、固定手段の径よりも細!、径の流路であってもよいし、流路の一部において、 1以上の凸部を形成して、その径を狭める部分を含むものでもよい。

[0033] 検出部は、被検物質、標識物又は基質から生成される生成物を検出するための空間であって、混合槽及び反応槽とは別の空間として形成されている。検出部の大きさ及び形状は特に限定されず、例えば、検出方法 (手法)、被検物質の種類及び量等に応じて適宜設定することができる。具体的には、その容量は l〜10³mm³程度である。その形状は、混合槽と同様に、種々の形状に設定することができる。

[0034] 例えば、検出方法が光学的方法である場合には、検出部において、被検物質、標識物又は基質力生成される生成物に光を照射し、その光を検出し得るように、所定長さの光路を確保することができる形状及び大きさであることが必要である。また、電気化学的方法である場合には、検出部において、被検物質を含む溶液の電荷を検出し得るように、導電性材料による一対の電極力 Sこの溶液に接触するように形成されていることが必要である。

[0035] ここで、一対の電極は、通常、電極として機能することができる材料、大きさ及び形状であれば特に限定されることはなぐどのようなものでも用いることができる。例えば、グラフアイト、カーボン、カーボンファブリック等;金、白金、銀、銅、アルミニウム等の金属又は合金、 SnO、 In O、 WO、 TiO等導電性酸化物等の単層又は 2以上の

2 2 3 3 2

積層構造が挙げられる。この電極は、導電材料片をバイオチップに貼り付けるか、一部を埋設するなどして形成してもよいし、導電剤ペーストを用いたスクリーン印刷法等の印刷法を用いて形成してもよ、。 [0036] なお、検出部は、反応槽と、流路を通して又は流路を介さな!、で直接、直列で連結されていることが好ましい。いずれの場合にも、反応槽に含まれる固定手段が流路及び Z又は検出部側に移行しないように、検出部と反応槽との間に、チャネル部が形成されており、両者が分離されていることが適当である。

[0037] また、検出部の隣接部、例えば、チャネル部と検出部との間に、さらに、基質等を保持するための基質保持槽が、直列に又は付加的に、流路を介して又は介さないで、連結されていてもよい。この基質保持槽は、例えば、混合槽等と同様の形状、大きさ等とすることができる。これにより、基質等を、基質保持槽に予め又はその使用直前に、保持させることができ、検出部での被検物質の検出をより確実に及び Z又は簡便に行うことができる。

[0038] ここで、基質等とは、標識物を検出するための試薬類であって、通常使用されているものが適用できる。例えば、色素、染料、蛍光物質等、有機酸又は無機酸、電極と被検物質との間で電子を授受し得る電子移動媒体として機能し得る電子伝導メディエータ等の 1種又は 2種以上の組み合わせが挙げられる。

[0039] なお、色素、染料、蛍光物質としては、 OPD (オルトフヱ-レンジァミン）、 TMBZ (3 , 3',5,5'-テトラメチルビンジジン）、チラミン（Tyramin)、ルミノール、ルシフェリン等が挙げられる。また、有機酸又は無機酸としては、過酸化水素、蟻酸、酢酸等が挙げられる。

[0040] 電子伝達メディエータとしては、例えば、フエ口セン、フェリシアンィ匕アルカリ金属（フエリシアンィ匕カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアンィ匕ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体 (メチル、ェチル、プロピル置換体等）、メチレンブルー、フナジンメトサルフェート、 ρ—ベンゾキノン、 2, 6—ジクロロフェノールインドフエノール、 13 —ナフトキノン一 4—スルホン酸カリウム、フエナジンエトサルフェート、ビオローゲン、ビタミン K等の酸ィ匕還元性の化合物の 1種又は 2種以上の組み合わせが挙げられる。なかでも、フエ口セン、フェリシアンィ匕カリウム等が好ましい。

[0041] これらの基質を保持させる方法としては、基質自体をそのまま、基質の機能を阻害しない溶媒等に溶解又は懸濁等させ、塗布、乾燥する方法、基質を適当な担体 (例えば上述した固定手段)等に混合又は分散させて固定する方法等、当該分野で公知の方法のいずれかを利用することができる。

[0042] 上述したバイオチップは、上述した種々の名称で呼ばれて!/、る従来のチップと同様の材料で形成することができる。例えば、 PET (ポリエチレンテレフタレート）、 PDMS (ポリジメチルシロキサン）、 PMMA (ポリメチルメタタリレート）、 PC (ポリカーボネイト）、 PP (ポリプロピレン）、 PS (ポリスチレン）、 PVC (ポリ塩化ビニル）、ポリエチレン、ポリシロキサン、ァリルエステル榭脂、シクロォレフインポリマーなどの有機化合物、あるいは、ゼォノア、シリコン、石英、ガラス、セラミック等の無機化合物等が挙げられる。

[0043] 本発明のバイオチップは、例えば、主として、一方又は双方に凹部による種々の形状のパターンを有する第 1基板と第 2基板とを、例えば、溶着、接着剤、超音波処理等によって、貼り合わせることによって簡便に製造することができる。具体的には、所望の反応槽等に対応する形状を有する金型を準備する。この金型は、機械的加工により形成することができる。次に、この金型に、榭脂をモールド等して反応槽等の形状が転写された基板を得る。最後に、この基板を、ノターン同士が対向するように、 2枚張り合わせる。なお、混合槽等に対応するパターンを有する基板を一方のみとし、他方を平板基板としてもよい。また、金型を用いたモールディングに代えて、射出成型法又はインプリント法等を利用してもよい。さらに、平板基板の一方又は双方に、フォトリソグラフィー工程、機械的加工等を直接施して、混合槽等に対応するパターンが転写された基板を得てもょヽ。

[0044] なお、本発明のバイオチップは、その取り扱い (例えば、試料等の導入、混合、撹拌、試料等の移行、検出など）を手動で行ってもよいし、自動で行ってもよいし、一部のみ自動で行ってもよい。例えば、撹拌及び混合、試料等の移行は、ポンプを利用する方法、振動又は遠心力を利用する方法を用いることができる。

[0045] 本発明の免疫分析方法にお！ヽては、まず、混合槽で被検物質と標識抗体とを混合して反応させる。混合槽で混合される被検物質としては、これに対する抗体が得られれば分子量等は特に問わない。例えば、細菌、ウィルス、寄生虫、タンパク質、ぺプチド、 DNA、薬物等が挙げられる。

[0046] 標識抗体は、被検物質を検出するための標識物が結合している。標識物としては、酵素、色素、酸化還元物質、蛍光物質、放射性物質、金属粒子、磁性体等、当該分野で通常使用される標識物のいずれをも用いることができる。抗体部分は、 F (ab' ) フラグメント又は還元 IgG力なり、後述する標識物と特定の結合比、例えば、 1 : 1〜 l :n (nは整数で、 1〜5が好ましい）で結合するものである。標識物と、抗体部分は、予め当該分野で通常使用される方法 (抗原抗体反応による結合）によって結合させておくことが適当である。

[0047] 混合槽で、被検物質と標識抗体とを混合して反応させる方法は、例えば、被検物質を含む試料をあらかじめ保持層に保持された標識抗体と混合しながら混合槽に導入する方法、被検物質を含む試料を混合槽に導入し、予め混合槽に保持された標識抗体と混合する方法等、種々の方法が考えられる。この際、被検物質の量に対して、過剰量の標識抗体を反応させることが好ましい。これによつて、被検物質の全てに標識することが可能となる。ここで、被検物質自体の量は、通常は不明であるため、過剰量の標識抗体を導入するために、例えば、予めバイオチップを用いて測定可能な被検物質濃度又はその範囲を設定しておき、その設定した濃度又は範囲上限の 1〜 100倍 (モル比）を過剰量として導入することが適当である。

[0048] 混合して反応させる場合の条件は、特に限定されるものではなぐ測定しょうとする被検物質、標識抗体の種類等により適宜設定することができるが、これらの物質の活性に影響を与えない条件、例えば、 20〜40°C程度の温度で、 30秒間〜 10分間程度が考えられる。

[0049] 次ヽで、被検物質と標識抗体との混合 Z反応生成物を反応槽に導入する。ここで、上述したように、通常は、混合槽に過剰量の標識抗体を導入するために、反応槽には、残余の標識抗体及び被検物質と標識抗体との反応生成物が導入されることになる。このように反応槽に導入された標識抗体及び反応生成物等は、固定手段に固定された抗イディォタイプ抗体と接触することにより、抗原抗体反応によって抗ィディォタイプ抗体に結合する力、あるいは結合しな、で反応槽を通過する。

[0050] 本発明における抗ィディォタイプ抗体は、標識抗体の抗体部分が有する抗原結合部位の固有の構造を認識する抗体である。抗イディォタイプ抗体は、抗原 (被検物質 )により目的とする抗体 (標識抗体の抗体部分)への結合が阻害されるタイプと阻害されな、タイプが存在することが知られて、るが、本発明に使用できる抗ィディオタイブ抗体とは、抗原 (被検物質）によりその結合が阻害されるもの、すなわち抗原 (被検物質）と標識抗体の結合物には結合できな、タイプのものを指す。

[0051] この抗ィディォタイプ抗体は、通常の方法に従って容易に作製することができる。例えば、マウス由来のモノクローナル抗体の抗イディォタイプ抗体を作る場合、抗原となるモノクローナル抗体を KLH複合体としてマウスに投与すれば、あとは通常のモノクローナル抗体の作製方法に従って製造することができる。従って、抗イディォタイプ抗体は、通常のモノクローナル抗体と同様に、容易かつ大量に作製することができる

[0052] 従って、被検物質と標識抗体の混合'反応生成物 (反応液)が反応槽を通過する際、未反応の標識抗体は固定手段に固定された抗イディォタイプ抗体に捕捉されて反応槽から検出部へ移動することができず、一方、標識抗体と結合した被検物質は固定手段に捕捉されないため、チャネル部を通り抜けて検出部に移動することができる。尚、固定手段に固定された抗イディォタイプ抗体は、未反応の標識抗体を捕捉するために十分な量とすべきであり、即ち、標識抗体に対して過剰量とするのが好ましい。このように、反応槽での処理により、不要な標識抗体を測定結果の精度に影響しない程度に抑え、試料中の被検物質のほぼ全てを、測定可能なように標識された状態で分離する、いわゆる BZF分離をすることができる。

[0053] 続いて、反応生成物を検出部にて分析する。ここでの分析は、例えば、標識物の定量を、色素の発色強度を測定する光学的方法、電子の授受による電流値又は電圧値用を測定する電気化学的方法、電気的方法、放射性同位元素の強度を測定するラジオィムノアッセィ法、磁気による方法 (例えば、標識に磁気ビーズを用いた場合）等の当該分野で公知の方法のいずれかによつて行うことができる。

[0054] 実施例 1

本発明のバイオチップ 10は、図 1 (a)及び (b)に示したように、混合槽 11と、反応槽 12と、チャネル部 15と、検出部 14とが直列に配設されて構成されている。

[0055] 混合槽 11は、被検物質と標識抗体とが混合される槽であって、ここで、例えば、被検物質として C反応性タンパク (CRP)と、標識抗体としてホースラディッシュペルォキシダーゼ (HRP)標識抗 CRP抗体とが混合される。この混合槽 11は、例えば、 50m m² (平面積） X 1mm (深さ)程度の空間を有する。なお、標識抗体は、例えば、一般的な架橋剤を用いて調製される。

[0056] 反応槽 12は、例えば、 50mm² (平面積） X 1mm (深さ）程度の空間を有し、その中に、抗イディォタイプ抗体を固定するための固定手段 13が含まれている。固定手段 1 3としては、直径 0. 4mm程度の球状のキトパール（富士紡績製)を、例えば、反応槽 12の 70%程度の空間を占める程度導入されている。この固定手段 13には、標識抗体と抗原抗体反応によって結合し得る物質として、抗 CRP抗体に対する抗ィディオタイブ抗体が固定されている。

[0057] チャネル部 15は、幅が 100 μ m程度で、深さが 0. 2mm程度に設定されており、反応槽 12中の固定手段 13であるキトパールの直径よりも小さい径を有し、キトパールが反応槽 12から他の部位に移動しないように形成されている。また、検出部 14は、例えば、光学的検出として吸光度を測定するために、長さ 100mm程度で、断面積力 S lmm²程度の一定形状を有している。混合槽 11には、被検物質を含む試料を注入するための注入口 17が連結されている。

[0058] 混合槽 11と反応槽 12、反応槽 12 (チャネル部 15)と検出部 14との間には、流路 1 9がそれぞれ連結されており、反応槽 12の入口付近の流路 19には、固定手段 13の直径よりも小さい径を有するチャネル部 16が形成されている。さらに、検出部 14には、流路 19を介して廃出口 18が連結されている。

[0059] このような構成のバイオチップ 10においては、例えば、まず、図 7の S1において、被検物質を含む試料 3 1と、この被検物質に対して過剰量 (予めノィォチップを用いて被検物質濃度を設定し、その設定濃度の 1〜100倍程度のモル比)の標識抗体とを、試料の注入口 17から導入する。導入された試料は、 S2において、混合槽 11に移動して混合され、被検物質と標識抗体とが反応し、ここで、被検物質のほぼ全てが標識抗体と結合し、一部の標識抗体が被検物質と結合しな!ヽまま残存する。

[0060] 続いて、 S3において、バイオチップ 10を回転させて得られる遠心力または加圧等によって反応生成物等を反応槽 12に移動させ、反応槽 12内に充填された固定手段 13の抗体に、標識抗体を結合させる。ここでの固定手段 13の抗体は、被検物質である CRPと競合的に標識抗体における抗 CRP抗体と反応する。従って、標識抗体のうち、被検物質と結合していないもののみが固定手段 13における抗体と結合する。なお、固定手段 13への抗体固定化法は、供給元の推奨方法に従った。これによつて、 S4に示したように、チャネル部 15によって、固定手段 13と結合した標識抗体は反応槽 12内に留まり、標識抗体と結合した被検物質のみが、固定手段 13に結合することなぐ検出部に移動することができ、いわゆる BZF分離が行われる。

[0061] その後、 S5に示したように、検出部に導入された標識抗体と結合した被検物質について、予め検出部に導入しておいた発色物質 (SAT— Blue ( (株）同仁化学研究所)を標識抗体における HRPの活性によって発色させる。そして、例えば、 670nm における試料の吸光度の変化を測定することにより、試料中の被検物質を定量することができる。全ての操作は、室温で行うことができる。

[0062] 実飾 12

この実施例のバイオチップは、図 2 (a)及び (b)に示したように、検出部 24に一対のカーボンブラックによる電極 25が形成され、さらに、チャネル部 15と検出部 24との間に流路 19を介して基質保持槽 21が形成されている以外、図 1のバイオチップとほぼ同様の構成である。

[0063] 電極 25は、例えば、長さ 10mm程度、厚さ 15 μ m程度でカーボンペーストによって形成されている。これらの電極 25は、バイオチップ 20を構成する下部基板 20bの検出部 24に対応する位置に配置され、電極 25の一部を被覆し、一部を露出するように、下部基板 20b上に上部基板 20aが貼り合わせられることにより、検出部 24が密閉状態で、かつ検出部 24内から外部に突出する電極を備えている。

[0064] また、基質保持槽 21は、混合槽 11とほぼ同様の形状及び大きさで形成されており、予め又は使用直前に、基質として、 5mMの過酸化水素と、 3mMのフエ口センとが保持されている。基質の保持は、例えば、所定量の過酸化水素及びフエ口セン (Fc) とを水溶液の状態で基質保持槽に導入することにより行われている。

[0065] このような構成を有するバイオチップ 20においては、例えば、図 8の S1において、実施例 1と同様に、試料と標識抗体とを注入口 17から導入し、 S2において、混合、反応させる。続いて、 S3において、実施例 1と同様に、固定手段 13の抗体に標識抗体を結合させ、 S4において BZF分離を行う。 [0066] その後、 S5に示したように、基質としてカ卩えたフエ口センを、標識物である酵素によつてフエリシ-ゥムイオン (Fc+)に変換し、さらにこれを電極上で還元するという酸ィ匕還元反応を行わせることにより、その際に生じる電流値を測定する。この電流値は、被検物質の量、つまり、被検物質と標識抗体との反応生成物の濃度に比例した値となり、被検物質の測定を定量的に行うことができる。なお、電極電位は OVで、参照電極 (例えば、 Ag/AgCl)を用いてもょヽ。

[0067] 実施例 3

この実施例のバイオチップ 30は、図 3に示したように、混合槽 11に、流路 19を介して標識抗体保持槽 31が形成されている以外は、図 1のノィォチップとほぼ同様の構成である。

[0068] 標識抗体保持槽 31には、標識抗体が予め又は使用直前に導入されており、試料の注入口 17からの導入と同時に、混合槽 11に導入され、混合槽 11で試料 (被検物質)と標識抗体とが混合、反応される。

[0069] このようなバイオチップ 30は、実施例 1にお!/、て、被検物質として抗 CRP抗体、標識抗体としてホースラディッシュペルォキシダーゼ (HRP)標識 CRP、固定手段に固定された抗体が抗 CRP抗体とする場合においても、実施例 1で説明したように、図 7 に示した工程により、免疫分析方法を行うことができる。

[0070] 実飾 14

この実施例のバイオチップ 40は、図 4に示したように、チャネル部 15と検出部 14との間に基質保持槽 44が直列的に形成されている以外は、図 1のバイオチップとほぼ同様の構成である。

[0071] 基質保持槽 44には、予め又は使用直前に、例えば、色素が保持されており、反応槽 12からの、いわゆる BZF分離された被検物質が、ここで色素と混合され、検出部 14に導入されることになる。

[0072] このようなバイオチップ 40は、実施例 1で説明したように、図 7に示した工程により、免疫分析方法を行うことができる。

[0073] 実施例 5

この実施例のバイオチップ 50は、図 5に示したように、チャネル部 15と検出部 14との間に流路を介して、基質保持槽 51が付加的に形成されている以外は、図 4のバイォチップとほぼ同様の構成である。

[0074] 基質保持槽 51には、予め又は使用直前に、例えば、色素が保持されており、反応槽 12からいわゆる BZF分離される際に、同時に色素が注入され、検出部 14に導入されること〖こなる。

[0075] このようなバイオチップ 50は、実施例 1で説明したように、図 7に示した工程により、免疫分析方法を行うことができる。

[0076] 実施例 6

この実施例のバイオチップ 60は、図 6に示したように、チャネル部 15と検出部 14との間に流路を介して、基質保持槽 51が付加的に形成され、さらに、基質保持槽 51 への連結部と検出部 14との間に、混合槽 64が直列的に形成されている以外は、図 4 のバイオチップとほぼ同様の構成である。

[0077] 基質保持槽 61には、予め又は使用直前に、例えば、色素が保持されており、反応槽 12からいわゆる BZF分離される際に、同時に色素が注入され、混合槽 64で、標識抗体と結合した被検物質と色素とが混合され、検出部 14に導入されることになる。

[0078] このようなバイオチップ 60は、実施例 1で説明したように、図 7に示した工程により、免疫分析方法を行うことができる。

[0079] 実飾 17

この実施例のバイオチップ 70は、図 9 (a)に示したように、反応槽 12の入口及び出口のチャネル部 16、 15近傍に、固定手段 13の過度の移動を抑制等するための凸部 75が形成されている以外、実質的に図 1のノィォチップ 10と同様の構成である。

[0080] このバイオチップ 70では、例えば、図 9 (a)に示したように、予め、標識抗体 71が混合槽に導入されており、また、この標識抗体 71を構成する抗体部分に対する抗イディォタイプ抗体が担持された固定手段 13が、緩衝液 72に浸漬される状態で、反応槽 12に保持されている。

[0081] まず、被検物質を含む試料を、試料の注入口 17から導入し、次いで、図 9 (b)に示したように、バイオチップ 70に gaで示す矢印方向に遠心力を負荷し、試料を混合槽 11内部に導入し、標識抗体 71と試料との混合'反応性生物を含有する混合液 73を得る。

[0082] 続いて、図 9 (c)及び (d)に示したように、順に gb及び gaの遠心力をかけて、混合液 73を十分に混合する。その後、図 9 (e)に示したように、バイオチップ 70に gcの遠心力をかけて、混合液 73を反応槽 12に導入し、混合液 73と緩衝液との混合液 74を得る。

[0083] 次、で、図 9 (f)及び (g)に示したように、順に ga及び gcの遠心力をかけて、混合液 74を十分に混合するとともに、混合液 74と固定手段 13とを混合する。これによつて、混合液 74中に含まれる単独の標識抗体が、固定手段 13の抗イディォタイプ抗体と反応し、固定手段に捕捉される。

[0084] その後、図 9 (h)に示したように、バイオチップ 70に gdの遠心力をかける。これにより、チャネル部 15によって、固定手段 13と結合した標識抗体は反応槽 12内に留まり、標識抗体と結合した被検物質のみが、固定手段 13に結合することなぐ検出部 14 に移動することができ、いわゆる BZF分離が行われる。その後、図 7の S5に示したのと同様に、試料中の被検物質を定量する。

[0085] なお、この際、混合液 74を完全に検出部 14に導入してもよいが、図 9 (h)に示すように、一部の混合液 74を反応槽 12内に留めておくことが好ましい。個々の固定手段 13内部に含まれる緩衝液 (例えば、ビーズ内部に含まれる深層内部液)を完全に除去して検出部に導入することによる測定誤差の発生等を防止するためである。

Claims

請求の範囲

[1] 被検物質とそれと反応する標識抗体とを混合するための混合槽と、

抗イディォタイプ抗体が固定された固定手段を含む反応槽と、

前記被検物質を検出する検出部とを有するバイオチップであって、

前記混合槽又はその隣接部に標識抗体を含んでなり、該標識抗体は、 F (ab' )フラグメント又は還元 IgGからなる抗体部分と標識物とが特定の結合比で結合して構成され、

前記反応槽と検出部とが、前記固定手段を通過させないチャネル部によって分離されてなり、

前記抗ィディォタイプ抗体は、前記標識抗体に対する抗ィディォタイプ抗体で、前記被検物質と標識抗体との反応生成物には結合できない種類の抗体であることを特徴とするバイオチップ。

[2] 標識抗体が被検物質に対して過剰量含まれてヽる請求項 1に記載のバイオチップ

[3] 抗イディォタイプ抗体が標識抗体に対して過剰量固定されてヽる請求項 1に記載のバイオチップ。

[4] 固定手段が微粒子である請求項 1に記載のバイオチップ。

[5] 混合槽、反応槽、チャネル部及び検出部がこの順で直列に連結されてなる請求項

1に記載のバイオチップ。

[6] 混合槽の隣接部に、さらに、標識抗体を保持する保持槽が連結されてなる請求項 1 に記載の装置。

[7] 検出部の隣接部に、さらに、標識物を検出するための試薬を保持する基質保持槽が連結されてなる請求項 1に記載の装置。

[8] 基質保持槽に電子伝達メディエータ又は発色物質が保持されてなる請求項 7に記載のバイオチップ。

[9] 検出部に、一対の電極が形成されてなる請求項 1に記載のバイオチップ。

[10] 被検物質とそれと反応する標識抗体とを混合するための混合槽と、抗イディォタイプ抗体が固定された固定手段を含む反応槽と、前記被検物質を検出する検出部とを有し、前記反応槽と検出部とが、前記固定手段を通過させないチャネル部によって分離され、前記抗ィディオタイブ抗体が、前記標識抗体に対する抗ィディオタィプ抗体で、前記被検物質と標識抗体との反応生成物には結合できない種類の抗体であるバイオチップを用いる免疫分析方法であって、

F (ab' )フラグメント又は還元 IgG力なる抗体部分と標識物とが特定の結合比で結合してなる標識抗体を使用して、混合槽で被検物質と前記標識抗体とを混合して反応させ、

前記被検物質と標識抗体との混合 Z反応生成物を反応槽に導入し、これらを抗ィディオタイブ抗体が固定された固定手段と反応させて未反応の標識抗体を捕捉し、チャネル部を利用して前記被検物質と標識抗体の反応生成物を検出部に導入し、該反応生成物を検出部にて分析することにより被検物質を検出することを特徴とする免疫分析方法。

[11] 標識抗体を被検物質に対して過剰量添加して混合する請求項 10に記載の免疫分析方法。

[12] 抗イディォタイプ抗体を標識抗体に対して過剰量使用する請求項 10に記載の免疫分析方法。

[13] 被検物質の検出を電気化学的又は光学的に行う請求項 10に記載の免疫分析方法。