WO2014083666A1 - サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法及びマイクロ流路チップ - Google Patents

サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法及びマイクロ流路チップ Download PDF

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WO2014083666A1
WO2014083666A1 PCT/JP2012/081000 JP2012081000W WO2014083666A1 WO 2014083666 A1 WO2014083666 A1 WO 2014083666A1 JP 2012081000 W JP2012081000 W JP 2012081000W WO 2014083666 A1 WO2014083666 A1 WO 2014083666A1
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antibody
antigen
reaction
labeled antibody
channel
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PCT/JP2012/081000
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English (en)
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Inventor
政也 上原
宣行 笠間
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ミライアル株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring an antigen-antibody reaction by a sandwich method and a microchannel chip.
  • a solid phase antibody is previously modified on the wall surface of a container such as a microplate or the surface of a large-diameter spherical bead of about 10 ⁇ m to 40 ⁇ m. Then, the solid phase antibody is reacted with the antigen in the specimen containing the antigen to be measured. Thereafter, the labeled antibody and the solid phase antibody are bound in a state where the antigen is sandwiched by reacting the antibody with a labeled antibody modified with a hydrogen peroxide-degrading enzyme or a fluorescent substrate as a label. At this time, the labeled antibody that is not bound to the antigen remains dispersed in the reaction solution.
  • the labeled antibody not bound to the antigen is washed away by a washing step.
  • the antigen, the solid-phase antibody, and the labeled antibody are bound together so that the antigen is sandwiched (sandwiched) between the solid-phase antibody and the labeled antibody.
  • the labeled antibody in such a state is subjected to a treatment for detecting the label, whereby the number of antigens or the concentration of antigen in the specimen can be measured.
  • HRP hydrogen peroxide-degrading enzyme
  • a luminescent substrate containing luminol and hydrogen peroxide can be used to generate luminescence by the luminol reaction and to obtain luminescence with an intensity proportional to the antigen concentration.
  • fluorescence with an intensity proportional to the antigen concentration can be obtained by irradiating the labeled antibody with excitation light.
  • the solid phase antibody modified on the bottom of the microplate or the bead surface is not necessarily precisely modified, and the antibody is often further modified by the modified solid phase antibody.
  • a solid phase antibody is formed on the wall surface of a microplate or the like, it is possible to increase the surface modification density of the modified antibody by increasing the antibody concentration, but there is a problem that a large amount of expensive antibody must be used. ing.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring an antigen-antibody reaction by a sandwich method capable of measuring a low concentration antigen, and a microchannel chip used in the method.
  • the present invention binds the solid phase antibody and the labeled antibody so that the antigen is sandwiched between the solid phase antibody and the labeled antibody having an antibody with a modified identification label in a medium containing a specimen having the antigen.
  • An antigen-antibody reaction measurement method using a sandwich method comprising: an antigen-antibody reaction step to be performed; and an antigen concentration measurement step for measuring the concentration of the antigen by identifying the identification label, wherein
  • the solid-phase antibody is modified on a particle dispersible in a medium containing the sample before the antigen-antibody reaction step.
  • a labeled antibody particle fixing step wherein in the antigen-antibody reaction step, the solid-phase antibody is sandwiched between the solid-phase antibody and the labeled antibody modified on the dispersible particles. And the labeled antibody To bind to a method for antigen-antibody reaction measured by the sandwich method.
  • spherical beads having an average particle diameter of 30 nm or more and 1000 nm or less as the dispersible particles.
  • magnetic fine particles are used as the spherical beads, or as the spherical beads, a magnetic material having an outer portion of a non-magnetic material and a magnetic material disposed inside the outer portion. It is preferable to use beads.
  • the antigen-antibody reaction step it is preferable to use particles having a specific gravity greater than the specific gravity of the medium as the dispersible particles.
  • the present invention also provides a microchannel chip that is used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to claim 1 and that is rotationally driven so that a centrifugal force acts, comprising at least one reagent solution tank, A reagent solution delivery path extending from the reagent solution tank in a direction in which centrifugal force acts in the reagent solution tank when the microchannel chip is driven to rotate, and an extended end portion of the reagent solution delivery path A reaction unit connected to the reagent solution tank via the reagent solution delivery path, and the reaction unit in a direction in which centrifugal force acts in the reaction unit when the microchannel chip is rotationally driven.
  • a reaction part delivery path extending from the reaction part, and a detection part connected to the extension end part of the reaction part delivery path and communicating with the reaction part via the reaction part delivery path.
  • the labeled antibody and the antigen Is bound by an antigen-antibody reaction, the solid phase antibody is retained in the detection unit, and the solid phase antibody flows into the detection unit via the reaction unit delivery path, and is bound to the labeled antibody.
  • the present invention relates to a micro-channel chip that is coupled to the.
  • an antigen-antibody reaction measurement method by a sandwich method capable of measuring a low concentration antigen, and a microchannel chip used in the measurement method.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a state where spherical beads 11 are modified with a labeled antibody 23 in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment.
  • the antigen antibody reaction measuring method by the sandwich method concerning this embodiment it is a mimetic diagram showing signs that antigen 24 bound to labeled antibody 23 which modifies spherical bead 11.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a state in which an antigen 24 bound to a labeled antibody 23 is bound to a solid phase antibody 32 in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment. It is a perspective view which shows 96-well microplate 3 used with the antigen antibody reaction measuring method by the sandwich method based on 1st Example. It is a top view which shows the microchannel chip
  • FIG. 1 is a flowchart showing an antigen-antibody reaction measuring method by the sandwich method according to this embodiment.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing spherical beads 11 used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment.
  • FIG. 2B is a schematic diagram showing how beads 11 are modified with a labeled antibody 23 in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an antigen-antibody reaction measuring method by the sandwich method according to this embodiment.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing spherical beads 11 used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment.
  • FIG. 2B is a schematic diagram showing how beads 11 are modified with a labeled antibody 23 in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an antigen-antibody reaction measuring method by the sandwich method according
  • FIG. 2C is a schematic diagram showing a state in which the antigen 24 is bound to the labeled antibody 23 that modifies the spherical bead 11 in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment.
  • FIG. 2D is a schematic diagram showing a state in which the antigen 24 bound to the labeled antibody 23 is bound to the solid phase antibody 32 in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the present embodiment.
  • the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method includes a preparation step, an antigen-antibody reaction step, and an antigen concentration measurement step.
  • a solid phase antibody step ST11
  • a specimen having an antigen to be measured and a step (ST31) are prepared.
  • the antibody 21 is modified with the identification label 22 (see FIG. 2B and the like) to prepare a labeled antibody 23 having the antibody 21 modified with the identification label 22 (step ST21).
  • the preparation step includes a solid phase antibody fixing step and a labeled antibody particle fixing step.
  • the prepared solid phase antibody 32 is modified on a predetermined base material (96-well microplate 3) (step ST12).
  • a predetermined base material 96-well microplate 3
  • FIG. 2C shows a 96-hole microplate 3 described later as a base material.
  • the substrate is not limited to the 96-hole microplate 3.
  • large-diameter spherical beads having an average particle diameter of about 10 ⁇ m to 40 ⁇ m may be used.
  • the prepared labeled antibody 23 is modified on the particles (spherical beads 11) as shown in FIG. 2A as shown in FIG. 2B (step ST22).
  • the particles used are particles that can be dispersed in a medium containing a specimen in the antigen-antibody reaction step.
  • spherical beads 11 are illustrated as particles.
  • the dispersible particles particles having a specific gravity larger than the specific gravity of the medium are preferably used, but are not limited thereto.
  • the spherical beads 11 having an average particle diameter of 30 nm or more and 1000 nm or less, the present invention is not limited to this.
  • the reason why the spherical beads 11 are used is that the shape and the surface state are well controlled, so that the dispersion force with respect to the solvent is stable. As a result, the dispersion force can be defined by the average particle diameter of the spherical beads 11 to be used.
  • the average particle size is set to 30 nm or more is that when the average particle size is smaller than this, spherical beads 11 that are relatively smaller than the labeled antibody molecule are formed.
  • the size of the labeled antibody molecule is about 30 nm. For this reason, the modification efficiency of the labeled antibody 23 on the bead surface is extremely deteriorated.
  • the average particle size is set to 1000 nm or less because the particles have a sufficient dispersion force even in a relatively fast flow medium of about 0.1 to 1 m / s in a narrow channel such as a microchannel. Because. In such a relatively fast flow medium, it is desirable that the Reynolds number be sufficiently smaller than 1 in order for the particles to have a sufficient dispersion force.
  • the Reynolds number is defined as a value obtained by dividing the product of the flow velocity of the medium and the representative length of the particle by the kinematic viscosity coefficient of the medium.
  • the Reynolds number is 1 when the average particle diameter of the spherical beads 11 is 1000 nm and water at 20 ° C. with a flow rate of 1 m / s is used as the medium. .
  • the kinematic viscosity coefficient of the medium is as small as about 1/3 of water, and that most of the speed of the medium is used at about 0.1 m / s or less, the spherical beads 11 This is because it is sufficient that the average particle diameter is 1000 nm or less.
  • the spherical beads 11 having an average particle diameter of about 100 nm or less, but is not limited thereto.
  • the dispersible particles are not limited to the spherical beads 11.
  • the normal fine particles since the surface shape has large irregularities, the normal fine particles have a larger surface energy than the spherical beads 11. For this reason, many fine particles having the same average particle diameter as the spherical beads 11 have a larger dispersion force than the spherical beads 11.
  • the porous spherical beads 11, hollow beads, and the like have a larger dispersion force than the general spherical beads 11.
  • the spherical beads 11 are preferably made of magnetic fine particles, or the spherical beads 11 are preferably magnetic beads having a non-magnetic outer part and a magnetic substance arranged inside the outer part.
  • the present invention is not limited to this. The above is the preparation process.
  • an antigen-antibody reaction step is performed.
  • an antigen-antibody reaction between the antigen 24 and the labeled antibody 23 is caused in a medium containing a specimen having the antigen to be measured (step ST23).
  • the antigen 24 is bound to the labeled antibody 23 (step ST24).
  • the solid phase antibody 32 and the labeled antibody 23 are sandwiched between the solid phase antibody 32 and the labeled antibody 23 having the antibody with the identification label 22 modified. Are combined (step ST13).
  • the above is the antigen-antibody reaction step.
  • the antigen concentration measurement step includes a washing step that removes other than the labeled antibody 23 bound to the solid phase antibody 32 in the antigen antibody reaction step, and identifies the labeled antibody 23 bound to the solid phase antibody 32 (step ST14). Thereby, the concentration of the antigen 24 is measured.
  • the above is the antigen concentration measurement step.
  • the following effects can be exhibited.
  • the labeled antibody 23 In the antigen-antibody reaction step, since the solid-phase antibody 32 and the labeled antibody 23 are bound so that the antigen 24 is sandwiched between the solid-phase antibody 32 and the labeled antibody 23 modified on the dispersible particles, the labeled antibody 23 In the process of binding the antigen 24 between the antibody and the solid phase antibody 32, the labeled antibody 23 at the molecular level can be prevented from being mixed into the binding reaction with the solid phase antibody. For this reason, it can suppress that only the unnecessary labeled antibody 23 couple
  • the concentration of the labeled antibody 23 bound to the antigen 24 is also decreased, and as a result, the label concentration to be detected is also decreased. Removal technology is required.
  • the labeled representation substantially amplified with respect to the antigen 24 at a low concentration. Therefore, even if a less sensitive and inexpensive detector is used, measurement can be performed with sensitivity equal to or higher than that of the conventional method.
  • the solid phase antibody 32 when preparing the solid phase antibody 32, it is not necessary to modify a large amount of antibody on the solid phase base material in order to improve the surface modification density or eliminate the surface modification defect, and use of an expensive antibody The amount can be reduced.
  • the average particle diameter of the dispersible particles is 30 nm or more and 1000 nm or less, the particles can be dispersed in the medium containing the specimen. Further, as the particles, by using spherical beads 11 prepared by adjusting by a sol-gel method or the like, particles having a sharp particle size distribution can be obtained, and the dispersion in the medium can be made uniform. Become. When the viscosity of the medium is high, particles having a larger average particle diameter can be used.
  • the shape of the particles is not necessarily limited to a spherical shape, and the particle surface is not limited to being smooth.
  • resin beads such as styrene and acrylic, glass beads, metal oxide ultrafine particles, carbon ultrafine particles, metal ultrafine particles, and the like can be used.
  • magnetic fine particles as the spherical beads 11 or by using magnetic beads having a non-magnetic outer part and a magnetic substance arranged inside the outer part as the spherical beads 11, a solid phase antibody The movement of the spherical beads 11 to which 32 is fixed can be controlled.
  • FIG. 3 is a perspective view showing a 96-well microplate 3 used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the first embodiment.
  • a 96-well microplate 3 is used as a base material on which the solid phase antibody 32 is fixed.
  • particles dispersible in the medium containing the specimen polyethylene spherical beads 11 having an average particle diameter of 100 nm are used. The specific gravity of the spherical beads 11 is greater than the specific gravity of the medium containing the specimen.
  • HRP hydrogen peroxide degrading enzyme
  • luminol is used as a luminescent substrate.
  • VEGF is used. Details are as follows.
  • the necessary reagents in this example are as follows.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • an anti-VEGF polyclonal antibody with an HRP label is prepared (step ST21), and the anti-VEGF polyclonal antibody with an HRP label is modified to carboxyl group-modified polystyrene beads having an average particle size of 100 nm (step ST22).
  • WSC 1 mg / ml, pH 5.0
  • HCl pH 5.0
  • bead suspension 50 ⁇ L of bead suspension are mixed and stirred at room temperature for 1 hour. Then, centrifuge, remove the supernatant, and wash twice with HCl solution.
  • the supernatant is removed, 20 ⁇ L of the anti-VEGF antibody solution (20 ⁇ g / mL) is suspended in 500 ⁇ L of CB, and incubated with stirring at 4 ° C. for 18 hours to immobilize. After the incubation, washing is performed and the labeled antibody-modified beads 10 are dispersed and stored in a phosphate buffer.
  • the surface of the bead is subjected to a blocking treatment to prevent the antibody from attaching with a blocking agent.
  • the labeled antibody modified bead 10 in which the labeled antibody 23 is modified on the surface of the bead is generated on the bead as the particle.
  • an anti-VEGF monoclonal antibody is prepared (step ST11), and the anti-VEGF monoclonal antibody is modified on the bottom surface of each well 31 of the 96-well microplate 3 (step ST12).
  • anti-VEGF monoclonal antibody 100 ⁇ g / ml, reconstituted with PBS
  • 20 ⁇ g / ml of anti-VEGF antibody solution (20 ⁇ g / mL) was added to each of 96-well microplate 3.
  • a blocking process is performed to prevent the antibody from adhering to the bottom surface of each well 31.
  • an antibody modified plate in which the solid phase antibody 32 is modified on the bottom surface of each well 31 of the 96-well microplate 3 is generated.
  • VEGF antigen vascular endothelial growth factor
  • the specimen is diluted twice with a diluent.
  • a phosphate buffer containing 0.1% BSA is used as a diluent.
  • the diluted specimen and the labeled antibody-modified bead 10 are allowed to undergo an antigen-antibody reaction in a vial (step ST23).
  • the reaction time is 2 hours.
  • the vial is centrifuged to separate the labeled antibody-modified bead 10 and the supernatant, and only the supernatant is taken out.
  • the labeled antibody-modified bead 10 is washed with a washing solution.
  • a washing solution a phosphate buffer containing 0.05% Tween is used as a washing solution.
  • the vial is centrifuged to separate the labeled antibody-modified bead 10 and the supernatant, and only the supernatant is taken out.
  • a phosphate buffer is added to the vial to obtain a dispersion solution in which the labeled antibody-modified beads 10 are dispersed (step ST24).
  • the dispersion solution is put into each well 31 of the 96-well microplate 3 which is an antibody-modified plate and reacted (step ST13).
  • the reaction time is 2 hours.
  • the 96-well microplate 3 is washed with a phosphate buffer, and all the solution is discarded. Thereafter, an antigen concentration measurement step is performed.
  • a luminescent substrate is put into each well 31 of the 96-well microplate 3 to emit light, and the luminescence intensity is detected by a highly sensitive photodetector such as a photomultiplier tube (step ST14).
  • FIG. 4 is a plan view showing the microchannel chip 101 used in the antigen-antibody reaction measuring method by the sandwich method according to the second embodiment.
  • FIG. 5 is a plan view showing a microchannel 110 used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the second embodiment.
  • the microchannel chip 101 is constituted by a disk-shaped front disk-shaped plate in which a plurality of microchannels 110 having the same shape through which a fluid can flow are formed.
  • the microfluidic chip 110 has a first input port 111 which will be described later closest to the center of the microfluidic chip 101, and a second liquid reservoir 116 which will be described later of the microfluidic chip 110
  • the microchannels 110 are arranged radially from the center of the microchannel chip 101 so as to be farthest from the center of the microchannel chip 101 in the radial direction.
  • the back side disk-like plate 103 is affixed to the surface of the front side disk-like plate on which the micro flow path 110 is formed, and these constitute a two-layer inspection disk.
  • the microchannel chip 101 is composed of silicone resin and glass
  • the microchannel 110 is composed of a front disk-shaped plate 102 made of silicone resin
  • the back disk-shaped plate 103 is composed of glass. ing.
  • the disc-shaped inspection disk can be driven to rotate about the axis of the inspection disk as a rotation axis so that centrifugal force acts.
  • the plurality of micro flow channels 110 include a first input port 111 as a reagent solution tank, a second input port 112 as a reagent solution tank, and a bead reaction region as a reaction unit. 113, the detection unit 114, the first liquid reservoir 115, the second liquid reservoir 116, the first valve 117, the second valve 118, the first flow path 121, and the second flow The channel 122, the third channel 123, the fourth channel 124, the fifth channel 125, the sixth channel 126, the seventh channel 127, and the eighth channel 128. And a ninth flow path 129.
  • the first input port 111 is configured by a chamber formed at a position closest to the center of the microchannel chip 101 in the microchannel chip 101 in which the microchannel 110 is formed. As shown in FIG. 5, the first input port 111 has a circular shape in a plan view, and passes through a hole (not shown) formed in the front disk-like plate 102 (see FIG. 6A and the like) and externally. Communicate.
  • the first flow path 121 is a radial direction of the micro flow path chip 101 as a direction in which centrifugal force acts on the first input port 111 when the inspection disk is driven to rotate and the micro flow path chip 101 is rotated. Extending outward from the first input port 111.
  • the second input port 112 is formed by a chamber formed at a position radially outward of the microchannel chip 101 from the first input port 111 in the microchannel chip 101 in which the microchannel 110 is formed. It is configured. As shown in FIG. 5, the second input port 112 has a circular shape in plan view, and communicates with the outside through a hole (not shown) formed in the front disk-like plate 102.
  • the second flow path 122 extends from the first input port 111 in parallel to the first flow path 121. And it bends in the middle and is connected to the extended end of the first flow path 121.
  • One end of the third channel 123 is connected to the extending end of the first channel 121 and the extending end of the second channel 122.
  • the third channel 123 extends from one end of the third channel 123 outward in the radial direction of the microchannel chip 101.
  • the first channel 121 and the third channel 123 constitute a reagent solution delivery channel. Therefore, the reagent solution delivery path extends from the reagent solution tank in a direction in which centrifugal force acts in the reagent solution tank when the microchannel chip 101 having the microchannel 110 is driven to rotate.
  • the second flow path 122 and the third flow path 123 constitute a reagent solution delivery path. Therefore, the reagent solution delivery path extends from the reagent solution tank in a direction in which centrifugal force acts in the reagent solution tank when the microchannel chip 101 having the microchannel 110 is driven to rotate.
  • the bead reaction region 113 is located at a position radially outward of the microchannel chip 101 with respect to the first input port 111 and the second input port 112. It is composed of a formed chamber. As shown in FIG. 5, the bead reaction region 113 widens as it goes outward in the radial direction of the microchannel chip 101 in plan view. The bead reaction region 113 is connected to the extended end of the first flow channel 121 and the extended end of the second flow channel 122 via the third flow channel 123. That is, the bead reaction region 113 communicates with the first input port 111 and the second input port 112 via the first flow path 121, the second flow path 122, and the third flow path 123.
  • the fourth flow path 124 is configured such that when the micro flow path chip 101 is driven to rotate, the bead reaction area 113 extends outward in the radial direction of the micro flow path chip 101 as a direction in which centrifugal force acts in the bead reaction area 113. Extend from. Then, it bends and gently bends 90 °.
  • the fifth flow path 125 extends from the extended end of the fourth flow path 124 outward in the radial direction of the micro flow path chip 101.
  • the fifth flow path 125 bends 90 ° at the reversing portion 125 ⁇ / b> A and extends in a direction perpendicular to the radial direction of the micro flow path chip 101. Further, the fifth flow path 125 bends 90 ° inward in the radial direction of the micro flow path chip 101.
  • the fifth flow path 125 bends 90 ° and extends in a direction perpendicular to the radial direction of the micro flow path chip 101.
  • the first valve 117 is connected to the extending end of the fifth flow path 125.
  • the first valve 117 has a valve 117A made of rubber.
  • the valve 117A can block the micro flow path 110 as shown in FIG. 6A, or can open the micro flow path 110 as shown in FIG. 6B.
  • FIG. 6A is a side view showing a state where the first valve 117 of the microchannel used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the second embodiment is closed.
  • FIG. 6B is a side view showing a state where the first valve 117 of the microchannel used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the second embodiment is open.
  • the eighth flow path 128 is connected to the first valve 117.
  • the eighth flow path 128 extends in a direction perpendicular to the radial direction of the micro flow path chip 101 and bends 90 ° outward in the radial direction of the micro flow path chip 101.
  • the eighth channel 128 extends outward in the radial direction of the microchannel chip 101.
  • the 4th flow path 124, the 5th flow path 125, and the 8th flow path 128 comprise the reaction part delivery path. Therefore, when the microchannel chip 101 is driven to rotate, the reaction part delivery path extends from the reaction part in a direction in which centrifugal force acts in the reaction part.
  • the detection unit 114 is configured of a chamber formed in a position radially outward of the microchannel chip 101 from the bead reaction region 113 in the microchannel chip 101 in which the microchannel 110 is formed. As shown in FIG. 5, the detection unit 114 has an oval shape in plan view. The detection unit 114 is connected to the extended end of the eighth channel 128. The detection unit 114 communicates with the bead reaction region 113 via the fourth channel 124, the fifth channel 125, and the eighth channel 128.
  • the ninth flow path 129 extends in the direction in which the centrifugal force acts on the detection unit 114 when the micro flow path chip 101 is driven to rotate, that is, outward in the radial direction of the micro flow path chip 101.
  • the second liquid reservoir 116 is configured by a chamber formed at a position radially outward of the microchannel chip 101 from the detection unit 114 in the microchannel chip 101 in which the microchannel 110 is formed. Yes. As shown in FIG. 5, the second liquid reservoir 116 has a rectangular shape in plan view. The second liquid reservoir 116 is connected to the extending end of the ninth flow path 129. The second liquid reservoir 116 communicates with the detection unit 114 via the ninth flow path 129.
  • the sixth channel 126 is connected to a branching portion 124A that is an extended end of the fourth channel 124.
  • the sixth channel 126 is gently curved and extends inward in the radial direction of the microchannel chip 101, and is further curved and extends outward in the radial direction of the microchannel chip 101.
  • the second valve 118 is connected to the extended end of the sixth flow path 126. Similar to the first valve, the second valve 118 has a valve made of rubber. Similar to the first valve, the valve can block the micro flow path 110 or open the micro flow path 110.
  • the seventh flow path 127 extends outward in the radial direction of the micro flow path chip 101, and bends 90 ° in a direction perpendicular to the radial direction of the micro flow path chip 101.
  • the seventh flow path 127 bends 90 ° radially outward of the micro flow path chip 101 and extends outward in the radial direction of the micro flow path chip 101.
  • the first liquid reservoir 115 is configured by a chamber formed at a position radially outward of the microchannel chip 101 from the bead reaction region 113 in the microchannel chip 101 in which the microchannel 110 is formed. ing. As shown in FIG. 5, the first liquid reservoir 115 has a rectangular shape in plan view. The first liquid reservoir 115 is connected to the extending end of the seventh flow path 127. The first liquid reservoir 115 communicates with the bead reaction region 113 through the fourth channel 124, the sixth channel 126, and the seventh channel 127.
  • the channel widths of the first channel 121, the second channel 122, and the third channel 123 that is, the width in the direction parallel to the paper surface of FIG. 5, is 100 ⁇ m to 500 ⁇ m. Further, the channel depths of the first channel 121, the second channel 122, and the third channel 123, that is, the depth in the normal direction of the paper surface of FIG. 5, is 100 ⁇ m.
  • the channel widths of the fourth channel 124, the fifth channel 125, the eighth channel 128, the sixth channel 126, and the seventh channel 127 are 50 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the path depth is 50 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the channel height of the ninth channel 129 is 5 ⁇ m. This flow path height is the value of the minimum dimension of the cross section of the ninth flow path 129. Therefore, the labeled antibody-modified beads 10 having an average particle diameter of less than 1 ⁇ m can pass through the ninth flow path 129, but the solid-phase antibody-modified beads having an average particle diameter of 40 ⁇ m described later cannot pass through.
  • the microchannel chip 101 includes a bead reaction region 113 as a reaction unit, a fourth channel 124, a fifth channel 125, and an eighth channel 128 as a reaction unit delivery path, and a detection unit 114.
  • a detection unit 114 Is provided. Therefore, in the bead reaction region 113, the labeled antibody 23 and the antigen 24 can be bound by the antigen-antibody reaction.
  • the detection unit 114 can hold the solid phase antibody 32. For this reason, in the detection unit 114, the antigen 24 bound to the labeled antibody 23 flowing into the detection unit 114 via the fourth flow path 124, the fifth flow path 125, and the eighth flow path 128 is fixed. Phase antibody 32 can be bound.
  • the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method using the microchannel chip 101 described above is as follows.
  • the labeled antibody 23 is prepared as in the first embodiment (step ST21).
  • the labeled antibody 23 is modified on the surface of the spherical bead 11 as a particle to generate the labeled antibody-modified bead 10 (step ST22).
  • the spherical beads 11 those having an average particle diameter of 100 nm are used as in the first embodiment.
  • the specific gravity of the spherical beads 11 is larger than that of a reaction solution as a medium composed of a labeled antibody-modified bead 10 and a specimen in a bead reaction region 113 described later.
  • the same anti-VEGF monoclonal antibody as in the first example is prepared (step ST11), and modified to the surface of large-diameter spherical beads having an average particle diameter of 40 ⁇ m (step ST12). If necessary, blocking treatment for preventing the antibody from adhering to the surface of the large-diameter spherical beads is performed on the surface of the large-diameter spherical beads. As a result, solid-phase antibody-modified beads in which the solid-phase antibody 32 is modified on the surface of large-diameter spherical beads having an average particle diameter of 40 ⁇ m are generated. The solid phase antibody-modified beads are filled in the detection unit 114 in the preparation step. In the preparation step, the same luminescent substrate as in the first embodiment is prepared. In the preparation step, a specimen having the antigen 24 (VEGF antigen) to be measured is prepared (step ST31).
  • a specimen containing the antigen 24 is diluted twice with a diluent.
  • a diluent a phosphate buffer containing 0.1% BSA is used.
  • a dispersion solution in which the labeled antibody-modified beads 10 are dispersed (hereinafter referred to as “dispersion solution”) is injected from the first input port 111 and the microchannel chip 101 is rotated, whereby the dispersion solution is The first reaction channel 121 and the third flow channel 123 are inserted into the bead reaction region 113.
  • a specimen containing the antigen 24 is injected from the second input port 112 and guided to the bead reaction region 113 through the second channel 122 and the third channel 123.
  • the dispersion solution and the sample are mixed in the third flow path 123 and the bead reaction region 113, and are mixed in the bead reaction region 113. It is held in the accumulated state.
  • step ST23 the rotation of the microchannel chip 101 is stopped, and the dispersion solution and the specimen are reacted at room temperature for 15 minutes in the bead reaction region 113 (step ST23).
  • step ST24 the antigen 24 contained in the specimen and the labeled antibody 23 modified on the labeled antibody-modified bead 10 are bound by the antigen-antibody reaction (step ST24).
  • the first valve 117 is opened, the microchannel chip 101 is rotated again, and a reaction solution as a medium composed of the labeled antibody-modified bead 10 in the bead reaction region 113 and the specimen is passed through the fourth channel 124 and the first channel. 5 is passed through the flow path 125 to the reversal part 125A. Then, before the reaction solution reaches the first valve 117, the first valve 117 is closed.
  • the second valve 118 is opened after the rotation speed of the microchannel chip 101 is increased to 5000 rpm or more, preferably 12000 rpm.
  • the reaction solution remaining in the bead reaction region 113 is guided to the first liquid reservoir 115 through the fourth channel 124, the sixth channel 126, and the seventh channel 127.
  • the reaction solution is about to pass through the branch portion 124A.
  • most of the labeled antibody-modified beads 10 are guided to the reversing part 125 A of the fifth flow path 125 by receiving a large centrifugal force.
  • the labeled antibody-modified bead 10 is separated and collected in the fifth channel 125, particularly in the inversion part 125A.
  • the labeled antibody-modified bead 10 that has flowed toward the sixth flow path 126 without being branched at the branching portion 124A receives a strong centrifugal force in the direction opposite to the flow direction at the reversing portion 125A, and flows backward. Eventually, it is separated and recovered from the branch part 124A to the fifth flow path 125. Then, after all of the reaction liquid in the fourth flow path 124, the sixth flow path 126, and the seventh flow path 127 is collected in the first liquid reservoir 115, the rotation of the micro flow path chip 101 is finished. To do.
  • the reaction solution in which the labeled antibody-modified bead 10 and the sample are mixed is in the fifth channel 125, the fifth channel 125 is washed and remains.
  • the sample component is removed (first washing of the labeled antibody-modified beads 10).
  • a phosphate buffer is injected from the second input port 112, and the microchannel chip 101 is rotated at 5000 to 12000 rpm.
  • the injected phosphate buffer includes the second channel 122, the third channel 123, the bead reaction region 113, the fourth channel 124, the sixth channel 126, the seventh channel 127, and the 1 liquid reservoir 115 flows in this order.
  • a part of the injected phosphate buffer flows into the fifth path at the branching portion 124A, circulates inside the fifth flow path 125, and flows into the sixth flow path 126 again. Wash out any sample components remaining inside the pathway.
  • the phosphate buffer remaining in the second channel 122, the third channel 123, the bead reaction region 113, the fourth channel 124, the sixth channel 126, and the seventh channel 127 is removed. When all are discharged into the first liquid reservoir 115, the first washing of the labeled antibody-modified beads 10 is completed.
  • the injection of the phosphate buffer is repeated twice in the same manner, the washing of the labeled antibody-modified beads 10 is repeated twice, and the labeled antibody-modified beads 10 are washed a total of three times.
  • the second valve 118 is closed and the first valve 117 is opened. Then, by injecting a phosphate buffer from the first input port 111 and rotating the microchannel chip 101, the labeled antibody-modified beads 10 remaining in the fifth channel 125 are pushed to the detection unit 114, and the microchannel chip 101 is rotated. The flow path chip 101 is rotated and stopped, the first valve 117 is closed again, and left at room temperature for 15 minutes.
  • the detection unit 114 is filled with solid phase antibody-modified beads, and the labeled antibody-modified beads 10 that have flowed in are modified with the labeled antibody 23 bound to the antigen 24. For this reason, in the detection part 114, the solid phase antibody 32 and the labeled antibody 23 fixed to the spherical bead 11 are combined so as to sandwich the antigen 24 (step ST13). As a result, the solid-phase antibody-modified bead and the labeled antibody-modified bead 10 are bound via the antigen 24.
  • the first valve 117 is opened to rotate the micro-channel chip 101, and the labeled antibody-modified bead 10 of the detection unit 114 flows into the second liquid reservoir 116 through the ninth channel 129.
  • the flow path height of the ninth flow path 129 is 5 ⁇ m, the labeled antibody-modified beads 10 smaller than the average particle diameter of 1 ⁇ m can pass through the ninth flow path 129, but the average particle diameter The 40 ⁇ m solid phase antibody modified beads cannot pass through.
  • a phosphate buffer is injected from the first input port 111, and the microchannel chip 101 is rotated.
  • the injected phosphate buffer includes the first channel 121, the bead reaction region 113, the fourth channel 124, the fifth channel 125, the eighth channel 128, the detection unit 114, and the ninth channel. It flows into the second liquid reservoir 116 via 129. In this process, all of the labeled antibody-modified beads 10 remaining in the detection unit 114 are washed out in the second liquid reservoir 116.
  • a luminescent substrate is inserted from the first input port 111, and the microchannel chip 101 is rotated to cause the luminescent substrate to flow through the detection unit 114, and the luminescence intensity of the detection unit 114 is measured. Thereby, the amount of the antigen 24 is measured (step ST14).
  • FIG. 7 is a plan view showing a microchannel 210 used in the antigen-antibody reaction measurement method by the sandwich method according to the third embodiment.
  • the micro flow path 210 in the third embodiment has a bead reaction flow path 213 as a reaction unit instead of the bead reaction area 113 of the second embodiment, and the fifth flow path 125 is a bead storage area 225B. It differs from the microchannel 110 in the second embodiment in that it has Except for these points, the microchannel 110 is the same as that of the second embodiment. Therefore, the same components are denoted by the same reference numerals and description thereof is omitted.
  • the bead reaction channel 213 is composed of a zigzag channel that reciprocates three times in a direction perpendicular to the radial direction of the microchannel chip 101.
  • the channel width and the channel height of the first channel 121, the second channel 122, and the third channel 123 are the fourth channel 124, the fifth channel 125, and the eighth channel, respectively.
  • the channel width, the channel height, and the channel height of the first channel 128, the sixth channel 126, and the seventh channel 127 are the same, and specific values are 50 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the channel length of the bead reaction channel 213 depends on the average particle diameter of the spherical beads 11 constituting the labeled antibody-modified bead 10, the flow rate of the fluid in the channel, and the diffusion coefficient of the fluid. If the average particle diameter of the labeled antibody-modified beads 10 to be used is 100 nm, the flow rate is 0.1 m / s, and the fluid diffusion coefficient is about the same as that of water, the bead reaction flow when the channel width is 50 ⁇ m The flow path length of the path 213 is sufficient if it is about 250 mm or more. When the flow rate is as low as 0.01 m / s, it is sufficient that the bead reaction channel 213 has a channel length of 25 mm or more.
  • the bead storage area 225 ⁇ / b> B is a part of the portion of the fifth channel 125, and the portion that extends from the extending end of the fourth channel 124 outward in the radial direction of the microchannel chip 101. A part of is widened.
  • the reaction solution containing the labeled antibody-modified bead 10 is branched at the branching portion 124A, the flow rate is reduced by half, and the labeled antibody-modified bead 10 is effectively separated toward the fifth channel 125 by the action of centrifugal force. To do. At this time, since the bead storage area 225B is provided, the flow rate inside the bead storage area 225B can be further reduced.
  • the reaction time can be shortened because the antigen-antibody reaction is caused by reacting the labeled antibody-modified beads 10 with the specimen. That is, the reaction can be terminated simply by flowing the reaction solution through the bead reaction channel 213, and the reaction yield can be improved.
  • the flow path height of the ninth flow path 129 is 5 ⁇ m, but is not limited thereto. Since the minimum dimension of the cross section in the direction orthogonal to the extending direction of the ninth flow path 129 does not pass through the solid-phase antibody-modified beads, it is sufficient that the labeled antibody-modified beads pass through. When used, it may be, for example, 10 ⁇ m or less.
  • the label of the labeled antibody 23 is a luminescent label, but is not limited thereto.
  • a fluorescent label may be used.
  • the label is a fluorescent protein such as an APC protein
  • the amount of the antigen can be measured by irradiating the detection unit 114 with excitation light and measuring the fluorescence.
  • the cleaning solution is not limited to the phosphate buffer.

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Abstract

　サンドイッチ法を用いた抗原抗体反応測定方法は、抗原２４を有する検体を含む媒質中で、固相抗体３２と、識別標識２２が修飾された抗体を有する標識抗体２３とで抗原２４を挟むように、固相抗体３２と標識抗体２３とを結合させる抗原抗体反応工程と、識別標識２２を識別することによって抗原２４の濃度を測定する抗原濃度測定工程とを有する。また、抗原抗体反応工程の前に、固相抗体３２を所定の基材３上に修飾させる固相抗体固定工程と、検体を含む媒質中で分散可能な粒子１１上に、標識抗体２３を修飾させる標識抗体粒子固定工程とを有する。抗原抗体反応工程では、固相抗体３２と、分散可能な粒子１１上に修飾された標識抗体２３とで抗原２４を挟むように、固相抗体３２と標識抗体２３とを結合させる。

Description

サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法及びマイクロ流路チップ
　本発明は、サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法及びマイクロ流路チップに関する。
　サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法では、予めマイクロプレートなどの容器の壁面や１０μｍ～４０μｍ程度の大径球形ビーズの表面に固相抗体をあらかじめ修飾させて準備する。そして、固相抗体と、測定対象となる抗原を含んだ検体中の当該抗原とを反応させる。
　その後、抗体に過酸化水素分解酵素や蛍光基質を標識として修飾した標識抗体を反応させることによって、抗原をサンドイッチした状態で標識抗体と固相抗体とを結合させる。このとき、抗原と結合していない標識抗体は、反応液中に分散したままの状態となっている。
　その後、洗浄工程により、抗原と結合していない標識抗体を洗い流す。このようにして、抗原を固相抗体と標識抗体とで挟む（サンドイッチする）ように、抗原と固相抗体と標識抗体とが結合されている状態となる。
　そして、このような状態の標識抗体に、標識を検出するための処理を施すことによって、抗原の数を測定したり、検体中の抗原濃度を測定したりすることができる。
　具体的には、標識抗体の標識として過酸化水素分解酵素（ＨＲＰ：Horseradish
Peroxidase）とルミノールと過酸化水素を含む発光基質とを用いて、ルミノール反応による発光を起こさせ、抗原濃度に比例した強度の発光を得ることができる。また、標識抗体の標識として蛍光基質を用いている場合には、標識抗体に励起光を照射することによって抗原濃度に比例した強度の蛍光を得ることができる。これらにより、抗原の数を測定したり、検体中の抗原濃度を測定したりすることができる（特許文献１、特許文献２参照）。
特開２００９－１５６７６５号公報 特開２０１０－２１６９４７号公報
　しかしながら、マイクロプレートの底面やビーズ表面に修飾された固相抗体は、必ずしも緻密に修飾されている訳ではなく、修飾された固相抗体に、更に抗体が修飾されることが多い。マイクロプレートなどの壁面に固相抗体を形成する場合には、抗体濃度を高めて修飾抗体の表面修飾密度を高めることができるが、高価な抗体を大量に用いなければならないという問題点を有している。
　また、大径球形ビーズの表面に固相抗体を形成する場合には、抗体濃度を高めて修飾抗体の表面修飾密度を高めようとすると、固相抗体が修飾された大径球形ビーズ同士が凝集してしまい、大径球形ビーズそのものの取り扱いが難しくなる。
　また、固相抗体の表面修飾密度が充分でない場合に、上記のサンドイッチ法による抗原抗体反応を行おうとすると、固相抗体の抗体が修飾されていない場所に抗原と反応しているかいないかに拘わらず標識抗体が修飾されてしまい、検体中の抗原濃度よりも高い抗原濃度が検出される。検体中の抗原濃度が低い場合には、この現象が顕著に現れて、低濃度抗原に対して測定値が上昇して、実質的には低濃度抗原の測定はできない。特に、初期の癌患者を早期発見したい場合には、低濃度抗原の測定ができないことは、大きな問題である。
　本発明は、低濃度抗原の測定が可能なサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法、及び当該測定方法で用いられるマイクロ流路チップを提供することを目的とする。
　本発明は、抗原を有する検体を含む媒質中で、固相抗体と、識別標識が修飾された抗体を有する標識抗体とで前記抗原を挟むように、前記固相抗体と前記標識抗体とを結合させる抗原抗体反応工程と、前記識別標識を識別することによって前記抗原の濃度を測定する抗原濃度測定工程とを有するサンドイッチ法を用いた抗原抗体反応測定方法であって、前記抗原抗体反応工程の前に、前記固相抗体を所定の基材上に修飾させる固相抗体固定工程と、前記抗原抗体反応工程の前に、前記検体を含む媒質中で分散可能な粒子上に、前記標識抗体を修飾させる標識抗体粒子固定工程とを有し、前記抗原抗体反応工程では、前記固相抗体と、前記分散可能な粒子上に修飾された前記標識抗体とで前記抗原を挟むように、前記固相抗体と前記標識抗体とを結合させる、サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法に関する。
　また、前記標識抗体粒子固定工程では、前記分散可能な粒子として平均粒径が３０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の球形ビーズを用いることが好ましい。
　また、前記標識抗体粒子固定工程では、前記球形ビーズとして磁気微粒子を用いるか、又は、前記球形ビーズとして、非磁性体の外郭部と、前記外郭部の内部に配置された磁性体とを有する磁気ビーズを用いることが好ましい。
　また、前記抗原抗体反応工程では、前記分散可能な粒子として媒質の比重よりも大きい比重を有する粒子を用いることが好ましい。
　また、本発明は、請求項１に記載のサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法に用いられる、遠心力が作用するように回転駆動されるマイクロ流路チップであって、少なくとも１つの試薬液槽と、前記マイクロ流路チップが回転駆動されるときに前記試薬液槽において遠心力が作用する方向に、前記試薬液槽から延出する試薬液送出路と、前記試薬液送出路の延出端部に接続され、前記試薬液送出路を介して前記試薬液槽に連通する反応部と、前記マイクロ流路チップが回転駆動されるときに前記反応部において遠心力が作用する方向に、前記反応部から延出する反応部送出路と、前記反応部送出路の延出端部に接続され、前記反応部送出路を介して前記反応部に連通する検出部と、を備え、前記反応部においては、前記標識抗体と抗原とが抗原抗体反応により結合し、前記検出部には、前記固相抗体が保持され、前記固相抗体は、前記反応部送出路を介して前記検出部に流入する、前記標識抗体と結合した抗原と結合するマイクロ流路チップに関する。
　本発明によれば、低濃度抗原の測定が可能なサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法、及び当該測定方法で用いられるマイクロ流路チップを提供することができる。
本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法を示すフローチャートである。 本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるビーズ１１を示す模式図である。 本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法において、球形ビーズ１１が標識抗体２３により修飾された様子を示す模式図である。 本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法において、球形ビーズ１１を修飾する標識抗体２３に抗原２４が結合した様子を示す模式図である。 本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法において、標識抗体２３に結合した抗原２４が、固相抗体３２に結合した様子を示す模式図である。 第１実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられる９６穴マイクロプレート３を示す斜視図である。 第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路チップ１０１を示す平面図である。 第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路１１０を示す平面図である。 第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路の第１の弁１１７が閉じている状態を示す側方図である。 第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路の第１の弁１１７が開いている状態を示す側方図である。 第３実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路２１０を示す平面図である。
　本発明の実施形態によるサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法について、図面を参照しながら説明する。
　図１は、本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法を示すフローチャートである。図２Ａは、本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられる球形ビーズ１１を示す模式図である。図２Ｂは、本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法において、ビーズ１１が標識抗体２３により修飾された様子を示す模式図である。図２Ｃは、本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法において、球形ビーズ１１を修飾する標識抗体２３に抗原２４が結合した様子を示す模式図である。図２Ｄは、本実施形態に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法において、標識抗体２３に結合した抗原２４が、固相抗体３２に結合した様子を示す模式図である。
　サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法は、準備工程と抗原抗体反応工程と、抗原濃度測定工程とを有する。
　準備工程では、固相抗体と（ステップＳＴ１１）、測定対象である抗原を有する検体と（ステップＳＴ３１）を用意する。また、識別標識２２（図２Ｂ等参照）で抗体２１を修飾して、識別標識２２で修飾された抗体２１を有する標識抗体２３を用意する（ステップＳＴ２１）。
　また、準備工程は、固相抗体固定工程と標識抗体粒子固定工程とを有する。固相抗体固定工程では、図２Ｃに示すように、用意した固相抗体３２を所定の基材（９６穴マイクロプレート３）上に修飾させる（ステップＳＴ１２）。説明の便宜上、図２Ｃにおいては、基材として後述の９６穴マイクロプレート３を図示する。基材としては、９６穴マイクロプレート３に限定されない。例えば、平均粒径が１０μｍ～４０μｍ程度の大径球形ビーズを用いてもよい。
　また、標識抗体粒子固定工程では、図２Ａに示すような粒子（球形ビーズ１１）上に、図２Ｂに示すように、用意した標識抗体２３を修飾させる（ステップＳＴ２２）。用いられる粒子は、抗原抗体反応工程において、検体を含む媒質中で分散可能な粒子である。説明の便宜上、図２Ｂにおいては、粒子として、球形ビーズ１１を図示する。
　分散可能な粒子としては、媒質の比重よりも大きい比重を有する粒子を用いることが好ましいが、これに限定されない。
　また、平均粒径が３０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の球形ビーズ１１を用いることが好ましいが、これに限定されない。球形ビーズ１１を用いる理由は、形状や表面状態が良くコントロールされているため、溶媒に対する分散力が安定している。この結果、使用する球形ビーズ１１の平均粒径で分散力を規定することができるからである。
　平均粒径を３０ｎｍ以上としたのは、これよりも平均粒径が小さいと、標識抗体分子よりも相対的に小さな球形ビーズ１１となる。標識抗体分子の大きさは３０ｎｍ程度である。
このため、ビーズ表面への標識抗体２３の修飾効率が極めて悪くなるからである。
　また、平均粒径を１０００ｎｍ以下としたのは、マイクロ流路などの細い流路中で、０．１～１ｍ／ｓ程度の比較的速い流れの媒質においても、粒子に充分な分散力を有するためである。
　このように比較的速い流れの媒質において、粒子が充分な分散力を有するためには、レイノルズ数が１よりも充分小さな値になっていることが望ましい。レイノルズ数は、媒質の流速と粒子の代表長さとの積を媒質の動粘性係数で割り算した値として定義される。粒子の代表長さとして球形ビーズ１１の平均粒径を採ると、球形ビーズ１１の平均粒径を１０００ｎｍとし、流速が１ｍ／ｓの２０℃の水を媒質として用いる場合、レイノルズ数は１となる。媒質の動粘性係数は、小さくても水の１／３程度の大きさとなること、及び、媒質の速度の多くは、０．１ｍ／ｓ程度以下で用いられることを考えると、球形ビーズ１１の平均粒径は、１０００ｎｍ以下であれば充分だからである。
　媒質の粘性抗力に逆らって、より確実に固相抗体３２との結合を行うためには、平均粒径１００ｎｍ程度以下の球形ビーズ１１を用いることが好ましいが、これに限定されない。
　分散可能な粒子としては、球形ビーズ１１に限定されない。通常の微粒子を用いる場合には、その表面形状に大きな凹凸を有するため、通常の微粒子は、球形ビーズ１１よりも大きな表面エネルギーを有する。このため、球形ビーズ１１と同じ平均粒径を有する微粒子は、球形ビーズ１１よりも大きな分散力を有するものが多い。更に、同じ球形ビーズ１１であっても、多孔性の球形ビーズ１１や中空ビーズなどは、一般の球形ビーズ１１よりも大きな分散力を有する。
　また、球形ビーズ１１としては、磁気微粒子を用いるか、または、球形ビーズ１１として、非磁性体の外郭部と、外郭部の内部に配置された磁性体とを有する磁気ビーズを用いることが好ましいが、これに限定されない。以上が準備工程である。
　次に、抗原抗体反応工程を行う。抗原抗体反応工程では、先ず、測定対象である抗原を有する検体を含む媒質中で、抗原２４と標識抗体２３との抗原抗体反応を生じさせる（ステップＳＴ２３）。これにより、抗原２４を標識抗体２３に結合させる（ステップＳＴ２４）。次に、抗原２４を有する検体を含む媒質中で、固相抗体３２と、識別標識２２が修飾された抗体を有する標識抗体２３とで抗原２４を挟むように、固相抗体３２と標識抗体２３とを結合させる（ステップＳＴ１３）。以上が抗原抗体反応工程である。
　次に、抗原濃度測定工程を行う。抗原濃度測定工程では、抗原抗体反応工程において
固相抗体３２に結合した標識抗体２３以外を除去する洗浄工程を含み、固相抗体３２に結合した標識抗体２３を識別する（ステップＳＴ１４）。これにより、抗原２４の濃度を測定する。以上が抗原濃度測定工程である。
　本実施形態よれば以下のような効果を発揮することができる。
　抗原抗体反応工程では、固相抗体３２と、分散可能な粒子上に修飾された標識抗体２３とで抗原２４を挟むように、固相抗体３２と標識抗体２３とを結合させたため、標識抗体２３と固相抗体３２とで抗原２４を挟むようにして結合するプロセスにおいて、分子レベルの標識抗体２３が固相抗体との結合反応に混ざり込むことを抑制することができる。このため、９６穴マイクロプレート３上に不要な標識抗体２３のみが結合することを抑制でき、低濃度の抗原２４の測定精度を著しく向上させることができる。
　また、従来の方法で低濃度の抗原２４を検出する場合、抗原２４と結合している標識抗体２３の濃度も低くなり、その結果検出すべき標識濃度も低くなるため、高い標識検出感度とノイズ除去技術が必要となる。これに対して、本発明の方法では抗原２４の１つに対して複数の標識抗体２３が粒子上に修飾されているために、低濃度の抗原２４に対して実質的に増幅された標識表象が可能となり、より低感度で安価な検出器を用いても従来の方法と同等以上の感度で測定することができる。
　また、固相抗体３２を作製する場合に、表面修飾密度向上させるため、又は、表面修飾欠陥をなくするために、大量の抗体を固相基材に修飾させる必要がなくなり、高価な抗体の使用量を低減させることができる。
　また、分散可能な粒子（球形ビーズ１１）の平均粒径を３０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下としたため、検体を含む媒質中で、当該粒子を分散可能とすることができる。
　また、粒子としては、ゾルゲル法等で調整して作製された球形ビーズ１１を用いることによって、シャープな粒度分布を有する粒子を得ることができ、媒質中への分散を均一とすることが可能となる。媒質の粘度が高い場合には、さらに大きな平均粒径の粒子を用いることが可能となる。粒子の形状は、必ずしも球形に限られず、また粒子表面は、滑らかであることに限られない。
　また、粒子の材質としては、スチレンやアクリルなどの樹脂ビーズや、ガラスビーズ、金属酸化物超微粒子、カーボン超微粒子、金属超微粒子などを用いることができる。
　また、球形ビーズ１１として磁気微粒子を用いるか、又は、球形ビーズ１１として、非磁性体の外郭部と、外郭部の内部に配置された磁性体とを有する磁気ビーズを用いることで、固相抗体３２を固定した球形ビーズ１１の移動を制御することができる。
　即ち、中心にフェライトなどの磁性体を核として含んだ樹脂ビーズやガラスビーズや、磁性体微粒子そのものなどの磁性粒子を用いることによって、外部磁場によってこれらの粒子の流れを規制したり制御したりすることができるため、迅速な反応を促したり、複雑なプロセスを制御したりするのに便利である。
また、分散可能な粒子として媒質の比重よりも大きい比重を有する粒子を用いることにより、固相抗体３２を固定したビーズと溶質とを容易に分離することができる。
（第１実施例）
　本実施例では、抗原抗体反応工程において、癌マーカーＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）に対するＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）の基本的方法（バイアル中での操作）を、図３に示す９６穴マイクロプレート３での抗原抗体反応として行う。図３は、第１実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられる９６穴マイクロプレート３を示す斜視図である。
　本実施例では、固相抗体３２を固定する基材として、９６穴マイクロプレート３を用いる。また、検体を含む媒質中で分散可能な粒子としては、平均粒径が１００ｎｍのポリエチレン製の球形ビーズ１１を用いる。球形ビーズ１１の比重は、検体を含む媒質の比重よりも大きい。また、標識としてＨＲＰ（過酸化水素分解酵素：Horseradish peroxidase）を用い、発光基質としてルミノールを用いる。また、抗原２４としては、ＶＥＧＦを用いる。詳細には以下のとおりである。
　本実施例において必要な試薬は以下の通りである。
Water soluble carbodiimide (ＷＳＣ)　　　ＷＳＣ1mg+HCl水溶液(pH5)1mL
カルボキシル基修飾ビーズ
カーボネートバッファー（ＣＢ）　　　　25mM NaHCO3, 25mM Na2C3
(ph9.7)
リン酸バッファー（ＰＢＳ）　　　　　　0.02Mリン酸緩衝液(ph7.0)
トリスバッファー（ＴＢ）　　　　　　　0.1M Tris-HCl(ph8.6),
0.1M NaCl
(Wash Buffer)　ＷＢ　　　　　　　　　0.05％ Tween in ＰＢＳ
ブロッキング剤　ブロックエース　　　400ng/mL (イオン交換水)
ＶＥＧＦ抗原　　　100μg/ml　0.1％ＢＳＡ(Bovine Serum Albumin) ＰＢＳ中で復元。
　　　　　　　　　　　　　使用時には、0.1％ＢＳＡ　in　ＰＢＳで必要濃度に希釈。
酵素標識抗ＶＥＧＦ ＨＲＰ(Horseradish Peroxidase)標識付き抗ＶＥＧＦポリクロナール抗体（1mg/mLにイオン交換水で復元）　　　　　　　　希釈液0.1％ＢＳＡ in ＰＢＳ in 0.15MnaClで1000～5000倍希釈。
希釈溶液　　　　　　　　　　　　　　0.1％ ＢＳＡ in ＰＢＳ
　準備工程では、ＨＲＰ標識付き抗ＶＥＧＦポリクロナール抗体を用意し（ステップＳＴ２１）、ＨＲＰ標識付き抗ＶＥＧＦポリクロナール抗体を、平均粒径１００ｎｍのカルボキシル基修飾ポリスチレンビーズに修飾させる（ステップＳＴ２２）。具体的には、ＷＳＣ（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０）７５０μＬ、ＨＣｌ（ｐＨ５．０）２００μＬ、ビーズ懸濁液５０μＬを混合して、１時間室温で攪拌する。その後遠心分離し、上澄液を除去し、ＨＣｌ溶液で２回洗浄する。更に遠心分離し、上澄液を除去して、抗ＶＥＧＦ抗体溶液（２０μｇ／ｍＬ）２０μＬをＣＢ５００μＬで懸濁し、４℃１８時間攪拌しながらインキュベートして、固定化する。インキュベート後、洗浄しリン酸バッファー中に標識抗体修飾ビーズ１０を分散保存させる。
　必要に応じて当該ビーズの表面には、抗体が付かないようにするためのブロッキング処理をブロッキング剤で行う。これにより、粒子としてのビーズ上に、ビーズの表面に標識抗体２３が修飾された標識抗体修飾ビーズ１０が生成される。
　また、準備工程では、抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体を用意し（ステップＳＴ１１）、抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体を、９６穴マイクロプレート３の各ウエル３１の底面に修飾させる（ステップＳＴ１２）。具体的には、抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体（１００μｇ／ｍｌ、ＰＢＳで再構成したもの)をＣＢで希釈し、２０μｇ／ｍｌにした抗ＶＥＧＦ抗体溶液（２０μｇ／ｍＬ）を９６穴マイクロプレート３の各ウエル３１の底面に注入する。
　必要に応じて、各ウエル３１の底面に抗体が付かないようにするためのブロッキング処理を行う。これにより、９６穴マイクロプレート３の各ウエル３１の底面に固相抗体３２が修飾された抗体修飾プレートが生成される。
　また、準備工程では、発光基質を用意する。具体的には、Ｌｕｍｉｎｏｌ （Ｃ８Ｈ７Ｎ３Ｏ２＝１７７．１６）　８．９ｍｇ　をＴＢ４．８ｍＬ、
ＮａＯＨ ０．２ｍＬに溶かして液体１とする（１０ｍＭ　Ｌｕｍｉｎｏｌ）。また、Ｐ－ｐ－ｉｏｐｈｅｎｏｎｏｌ （ＰＩＰ＝Ｃ６Ｈ６Ｏ２＝２２０．１）１１ｍｇをエタノール５ｍＬに溶かして液体２とする（１０ｍＭ　ＰＩＰ）。そして、ＴＢ１８４２μＬに液体１を７５μＬ、液体２を８０μＬ加えて、更に３０％Ｈ２Ｏ２の１２倍希釈溶液３μＬを加えて調整することにより発光基質が生成される。また、準備工程では、測定対象として、抗原２４（ＶＥＧＦ抗原）を有する検体を用意する（ステップＳＴ３１）。
　抗原抗体反応工程では、先ず、検体を希釈液で２倍に希釈する。希釈液としては、０．１％ＢＳＡ入りリン酸バッファーを用いる。次に、希釈した検体と標識抗体修飾ビーズ１０を、バイアル中で抗原抗体反応させる（ステップＳＴ２３）。反応時間は２時間である。反応後に、バイアルを遠心分離機にかけて、標識抗体修飾ビーズ１０と上澄み液とに分離して、上澄み液のみを取り出す。次に、標識抗体修飾ビーズ１０を洗浄液で洗浄する。洗浄液としては０．０５％のＴｗｅｅｎ入りリン酸バッファーを用いる。
　次に、バイアルを遠心分離機にかけ、標識抗体修飾ビーズ１０と上澄み液とに分離して、上澄み液のみ取り出す。次に、バイアルにリン酸バッファーを加えて、標識抗体修飾ビーズ１０が分散した分散溶液とする（ステップＳＴ２４）。次に、分散溶液を、抗体修飾プレートである９６穴マイクロプレート３の各ウエル３１に入れて、反応させる（ステップＳＴ１３）。反応時間は２時間である。反応後に、９６穴マイクロプレート３をリン酸バッファーで洗浄し、溶液をすべて捨てる。その後、抗原濃度測定工程を行う。
　抗原濃度測定工程では、発光基質を９６穴マイクロプレート３の各ウエル３１に入れて発光させ、発光強度を光電子増倍管などの高感度光検出器で検出する（ステップＳＴ１４）。
（第２実施例）
　本実施例では、上述の抗原抗体反応工程において、９６穴マイクロプレート３に代えて、図４に示すマイクロ流路チップ１０１を用いる。図４は、第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路チップ１０１を示す平面図である。図５は、第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路１１０を示す平面図である。
　マイクロ流路チップ１０１は、流体が流通可能な同一形状の複数のマイクロ流路１１０が形成された円盤状の表側ディスク状プレートにより構成されている。マイクロ流路１１０の後述の第１の入力ポート１１１がマイクロ流路チップ１０１の中央に最も近くなるように、且つ、マイクロ流路１１０の後述の第２の液溜１１６が、マイクロ流路チップ１０１の半径方向において、マイクロ流路チップ１０１の中央から最も遠くなるように、マイクロ流路１１０は、マイクロ流路チップ１０１の中央から放射状に配置されている。
　マイクロ流路１１０が形成された表側ディスク状プレートの面には、裏側ディスク状プレート１０３が、貼り付けられており、これらにより二層構造の検査ディスクが構成される。マイクロ流路チップ１０１は、シリコーン樹脂とガラスにより構成されており、マイクロ流路１１０はシリコーン樹脂で作製された表側ディスク状プレート１０２に構成されており、裏側ディスク状プレート１０３は、ガラスにより構成されている。円盤状の検査ディスクは、遠心力が作用するように、検査ディスクの軸心を回転軸心として回転駆動可能である。
　図５に示すように、複数のマイクロ流路１１０は、それぞれ、試薬液槽としての第１の入力ポート１１１と、試薬液槽としての第２の入力ポート１１２と、反応部としてのビーズ反応領域１１３と、検出部１１４と、第１の液溜１１５と、第２の液溜１１６と、第１のバルブ１１７と、第２のバルブ１１８と、第１の流路１２１と、第２の流路１２２と、第３の流路１２３と、第４の流路１２４と、第５の流路１２５と、第６の流路１２６と、第７の流路１２７と、第８の流路１２８と、第９の流路１２９とを有する。
　第１の入力ポート１１１は、マイクロ流路１１０が形成されたマイクロ流路チップ１０１において、最もマイクロ流路チップ１０１の中心に近い位置に形成された室により構成されている。図５に示すように、第１の入力ポート１１１は、平面視で円形を有しており、表側ディスク状プレート１０２（図６Ａ等参照）に形成された穴（図示せず）を通して、外部と連通している。
　第１の流路１２１は、検査ディスクが回転駆動されてマイクロ流路チップ１０１が回転させられるときに、第１の入力ポート１１１において遠心力が作用する方向としてのマイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ、第１の入力ポート１１１から延出する。
　第２の入力ポート１１２は、マイクロ流路１１０が形成されたマイクロ流路チップ１０１において、第１の入力ポート１１１よりも、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方の位置に形成された室により構成されている。図５に示すように、第２の入力ポート１１２は、平面視で円形を有しており、表側ディスク状プレート１０２に形成された穴（図示せず）を通して、外部と連通している。
　第２の流路１２２は、第１の流路１２１に対して平行に第１の入力ポート１１１から延出する。そして、途中で折れ曲がり、第１の流路１２１の延出端部に接続されている。
　第３の流路１２３の一端は、第１の流路１２１の延出端部及び第２の流路１２２の延出端部に接続されている。第３の流路１２３は、第３の流路１２３の一端からマイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ延出する。
　第１の流路１２１及び第３の流路１２３は、試薬液送出路を構成する。従って、試薬液送出路は、マイクロ流路１１０を有するマイクロ流路チップ１０１が回転駆動されるときに試薬液槽において遠心力が作用する方向に、試薬液槽から延出する。
　また、第２の流路１２２及び第３の流路１２３は、試薬液送出路を構成する。従って、試薬液送出路は、マイクロ流路１１０を有するマイクロ流路チップ１０１が回転駆動されるときに試薬液槽において遠心力が作用する方向に、試薬液槽から延出する。
　ビーズ反応領域１１３は、マイクロ流路１１０が形成されたマイクロ流路チップ１０１において、第１の入力ポート１１１及び第２の入力ポート１１２よりも、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方の位置に形成された室により構成されている。図５に示すように、ビーズ反応領域１１３は、平面視でマイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へゆくに従って拡幅する。ビーズ反応領域１１３は、第３の流路１２３を介して、第１の流路１２１の延出端部及び第２の流路１２２の延出端部に接続されている。即ち、ビーズ反応領域１１３は、第１の流路１２１、第２の流路１２２、及び第３の流路１２３を介して、第１の入力ポート１１１及び第２の入力ポート１１２に連通する。
　第４の流路１２４は、マイクロ流路チップ１０１が回転駆動されるときに、ビーズ反応領域１１３において遠心力が作用する方向としてのマイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ、ビーズ反応領域１１３から延出する。そして、湾曲し、緩やかに９０°湾曲する。
　第５の流路１２５は、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ、第４の流路１２４の延出端部から延出する。そして、第５の流路１２５は、反転部１２５Ａにおいて９０°折れ曲がり、マイクロ流路チップ１０１の半径方向に直交する方向へ延出する。更に、第５の流路１２５は、マイクロ流路チップ１０１の半径方向内方へ９０°折れ曲がる。そして、第５の流路１２５は、９０°折れ曲がり、マイクロ流路チップ１０１の半径方向に直交する方向へ延出する。
　第１のバルブ１１７は、第５の流路１２５の延出端部に接続されている。第１のバルブ１１７は、ゴムにより構成される弁１１７Ａを有する。弁１１７Ａは、図６Ａに示すようにマイクロ流路１１０を塞いだり、図６Ｂに示すようにマイクロ流路１１０を開いたりすることができる。
　図６Ａは、第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路の第１の弁１１７が閉じている状態を示す側方図である。図６Ｂは、第２実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路の第１の弁１１７が開いている状態を示す側方図である。
　第８の流路１２８の一端部は、第１のバルブ１１７に接続されている。第８の流路１２８は、マイクロ流路チップ１０１の半径方向に直交する方向へ延出し、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ９０°折れ曲がる。そして、第８の流路１２８は、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ延出する。第４の流路１２４、第５の流路１２５、及び第８の流路１２８は、反応部送出路を構成する。従って、マイクロ流路チップ１０１が回転駆動されるときに、反応部において遠心力が作用する方向に、反応部送出路は、反応部から延出する。
　検出部１１４は、マイクロ流路１１０が形成されたマイクロ流路チップ１０１において、ビーズ反応領域１１３よりも、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方の位置に形成された室により構成されている。図５に示すように、検出部１１４は平面視で長円形状を有している。検出部１１４は、第８の流路１２８の延出端部に接続されている。検出部１１４は、第４の流路１２４、第５の流路１２５、及び第８の流路１２８を介して、ビーズ反応領域１１３に連通する。
　第９の流路１２９の一端部は、検出部１１４に接続されている。第９の流路１２９は、マイクロ流路チップ１０１が回転駆動されるときに検出部１１４において遠心力が作用する方向へ、即ち、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ延出する。
　第２の液溜１１６は、マイクロ流路１１０が形成されたマイクロ流路チップ１０１において、検出部１１４よりも、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方の位置に形成された室により構成されている。図５に示すように、第２の液溜１１６は、平面視で長方形を有している。第２の液溜１１６は、第９の流路１２９の延出端部に接続されている。第２の液溜１１６は、第９の流路１２９を介して、検出部１１４に連通する。
　第６の流路１２６の一端部は、第４の流路１２４の延出端部である分岐部１２４Ａに接続されている。第６の流路１２６は、緩やかに湾曲してマイクロ流路チップ１０１の半径方向内方へ延出し、更に、緩やかに湾曲してマイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ延出する。
　第２のバルブ１１８は、第６の流路１２６の延出端部に接続されている。第２のバルブ１１８は、第１の弁と同様に、ゴムにより構成される弁を有する。弁は、第１の弁と同様に、マイクロ流路１１０を塞いだり、マイクロ流路１１０を開いたりすることができる。
　第７の流路１２７の一端部は、第２のバルブ１１８に接続されている。第７の流路１２７は、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ延出し、マイクロ流路チップ１０１の半径方向に直交する方向へ９０°折れ曲がる。そして、第７の流路１２７は、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ９０°折れ曲がり、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ延出する。
　第１の液溜１１５は、マイクロ流路１１０が形成されたマイクロ流路チップ１０１において、ビーズ反応領域１１３よりも、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方の位置に形成された室により構成されている。図５に示すように、第１の液溜１１５は、平面視で長方形を有している。第１の液溜１１５は、第７の流路１２７の延出端部に接続されている。第１の液溜１１５は、第４の流路１２４、第６の流路１２６、及び第７の流路１２７を介して、ビーズ反応領域１１３に連通する。
　第１の流路１２１、第２の流路１２２、及び第３の流路１２３の流路幅、即ち、図５の紙面に平行な方向における幅は、１００μｍ～５００μｍである。また、第１の流路１２１、第２の流路１２２、及び第３の流路１２３の流路深さ、即ち、図５の紙面の法線方向における深さは、１００μｍである。また、第４の流路１２４、第５の流路１２５、第８の流路１２８、第６の流路１２６、及び第７の流路１２７の流路幅は、５０μｍ～１００μｍであり、流路深さは、５０μｍ～１００μｍである。これにより、これらの流路においてレイノルズ数を小さくして層流を形成すると共に、流路抵抗を大きくして、第４の流路１２４から第５の流路１２５と第６の流路１２６とに分岐する分岐部１２４Ａにおける標識抗体修飾ビーズ１０の分離性能を向上させる。
　また、第９の流路１２９の流路高さは５μｍである。この流路高さは、第９の流路１２９の断面の最小寸法の値である。従って、平均粒径１μｍよりも小さい標識抗体修飾ビーズ１０は第９の流路１２９を通り抜けることができるが、後述の平均粒径４０μｍの固相抗体修飾ビーズは通り抜けることができない。
　以上のような構成のマイクロ流路チップ１０１によれば、以下のような効果を得ることができる。
　マイクロ流路チップ１０１は、反応部としてのビーズ反応領域１１３と、反応部送出路としての第４の流路１２４、第５の流路１２５、及び第８の流路１２８と、検出部１１４とを備える。このため、ビーズ反応領域１１３において、標識抗体２３と抗原２４とが抗原抗体反応により結合することができる。
　また、検出部１１４には、固相抗体３２を保持することができる。このため、検出部１１４において、第４の流路１２４、第５の流路１２５、及び第８の流路１２８を介して検出部１１４に流入する、標識抗体２３と結合した抗原２４と、固相抗体３２とを結合させることができる。
　上述のマイクロ流路チップ１０１を用いる、サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法は以下の通りである。
　準備工程では、第１実施例と同様に標識抗体２３を用意する（ステップＳＴ２１）。次に、粒子としての球形ビーズ１１の表面に標識抗体２３を修飾して、標識抗体修飾ビーズ１０を生成する（ステップＳＴ２２）。球形ビーズ１１としては、第１実施例と同様に、平均粒径が１００ｎｍのものを用いる。球形ビーズ１１の比重は、後述するビーズ反応領域１１３の標識抗体修飾ビーズ１０と検体とからなる媒質としての反応液よりも大きい。
　また、準備工程では、第１実施例と同様の抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体を用意し（ステップＳＴ１１）、平均粒径４０μｍの大径球形ビーズの表面に修飾させる（ステップＳＴ１２）。必要に応じて、大径球形ビーズの表面に抗体が付かないようにするためのブロッキング処理を、大径球形ビーズの表面に行う。これにより、平均粒径４０μｍの大径球形ビーズの表面に固相抗体３２が修飾された固相抗体修飾ビーズが生成される。この固相抗体修飾ビーズは、この準備工程において、検出部１１４に充填される。また、準備工程では、第１実施例と同様の発光基質を用意する。また、準備工程では、測定対象である抗原２４（ＶＥＧＦ抗原）を有する検体を用意する（ステップＳＴ３１）。
　抗原抗体反応工程では、先ず、抗原２４を含んだ検体を希釈液で２倍に希釈する。希釈液としては、０．１％ＢＳＡ入りリン酸バッファーを用いる。
　次に、第１のバルブ１１７と第２のバルブ１１８とを閉じた状態とする。次に、標識抗体修飾ビーズ１０が分散した分散溶液（以下「分散溶液」とする）を、第１の入力ポート１１１から注入して、マイクロ流路チップ１０１を回転させることで、分散溶液を第１の流路１２１と第３の流路１２３を通してビーズ反応領域１１３に入れる。これと同時に、第２の入力ポート１１２から抗原２４を含んだ検体を注入して、第２の流路１２２と第３の流路１２３を介してビーズ反応領域１１３に導く。このとき、第１のバルブ１１７と第２のバルブ１１８とは閉じた状態にあるため、分散溶液と検体とは、第３の流路１２３とビーズ反応領域１１３で混合され、ビーズ反応領域１１３に溜まった状態で保持される。
　その後、マイクロ流路チップ１０１の回転を止め、ビーズ反応領域１１３において、分散溶液と検体とを室温で１５分反応させる（ステップＳＴ２３）。これにより、検体中に含まれていた抗原２４と、標識抗体修飾ビーズ１０上に修飾されている標識抗体２３とを抗原抗体反応によって結合させる（ステップＳＴ２４）。
　その後、第１のバルブ１１７を開き、再びマイクロ流路チップ１０１を回転させてビーズ反応領域１１３の標識抗体修飾ビーズ１０と検体とからなる媒質としての反応液を、第４の流路１２４と第５の流路１２５を通して反転部１２５Ａまで流す。そして、反応液が第１のバルブ１１７に達する前に第１のバルブ１１７を閉じる。
　次に、マイクロ流路チップ１０１の回転数を５０００ｒｐｍ以上、好ましくは１２０００ｒｐｍまで上げてから、第２のバルブ１１８を開く。これにより、ビーズ反応領域１１３に残存している反応液を、第４の流路１２４、第６の流路１２６、および第７の流路１２７を通して第１の液溜１１５へと導く。
　このとき、この反応液に分散されている標識抗体修飾ビーズ１０を構成する球形ビーズ１１の比重は、媒質としての反応液の比重よりも大きいため、反応液が分岐部１２４Ａを通過しようとするときに、大きな遠心力を受けて標識抗体修飾ビーズ１０の大部分が第５の流路１２５の反転部１２５Ａに導かれる。このとき、第１のバルブ１１７は閉じられているため、標識抗体修飾ビーズ１０は、第５の流路１２５に、特に反転部１２５Ａに分離されて溜まる。また、分岐部１２４Ａで分岐されずに第６の流路１２６の方に流れた標識抗体修飾ビーズ１０は、反転部１２５Ａにおいて流れの向きとは反対の向きに強い遠心力を受けて逆流し、結局分岐部１２４Ａから第５の流路１２５に分離回収される。そして、第４の流路１２４、第６の流路１２６、および第７の流路１２７内の反応液が全て第１の液溜１１５に回収された後に、マイクロ流路チップ１０１の回転を終了する。
　この時点では、第５の流路１２５には、標識抗体修飾ビーズ１０と検体とが混合した反応液が溜まった状態になっているので、第５の流路１２５を洗浄して残留している検体成分を除去する（１回目の標識抗体修飾ビーズ１０の洗浄）。
　先ず、第２の入力ポート１１２からリン酸バッファーを注入し、マイクロ流路チップ１０１を５０００ｒｐｍ～１２０００ｒｐｍで回転させる。注入されたリン酸バッファーは、第２の流路１２２、第３の流路１２３、ビーズ反応領域１１３、第４の流路１２４、第６の流路１２６、第７の流路１２７、及び第１の液溜１１５の順に流れる。このとき、注入されたリン酸バッファーの一部は、分岐部１２４Ａで第５の経路に流れ込み、第５の流路１２５の内部を循環して再び第６の流路１２６に流れ込み、第５の経路の内部に残留していた検体成分を洗い出す。そして、第２の流路１２２、第３の流路１２３、ビーズ反応領域１１３、第４の流路１２４、第６の流路１２６、第７の流路１２７に残留しているリン酸バッファーが全て第１の液溜１１５に排出されたときに、１回目の標識抗体修飾ビーズ１０の洗浄を終了する。
　その後、同様にしてリン酸バッファーの注入を２回繰返して行い、標識抗体修飾ビーズ１０の洗浄を２回繰返して、合計３回、標識抗体修飾ビーズ１０の洗浄を行う。
　次に、第２のバルブ１１８を閉じ、第１のバルブ１１７を開く。そして第１の入力ポート１１１からリン酸バッファーを注入してマイクロ流路チップ１０１を回転させることで、第５の流路１２５に残留していた標識抗体修飾ビーズ１０を検出部１１４に押し流し、マイクロ流路チップ１０１を回転と停止させ、第１のバルブ１１７を再び閉じて、そのまま常温で１５分放置する。
　検出部１１４には、固相抗体修飾ビーズが充填されており、流入してきた標識抗体修飾ビーズ１０には、抗原２４と結合した標識抗体２３が修飾されている。このため、検出部１１４では固相抗体３２と球形ビーズ１１に固定された標識抗体２３とが、抗原２４を挟むようにして結合する（ステップＳＴ１３）。この結果、固相抗体修飾ビーズと標識抗体修飾ビーズ１０とが抗原２４を介して結合されることになる。
　次に、第１のバルブ１１７を開いてマイクロ流路チップ１０１を回転させ、検出部１１４の標識抗体修飾ビーズ１０を、第９の流路１２９を通して第２の液溜１１６に流す。このとき、第９の流路１２９の流路高さは５μｍであるため、平均粒径１μｍよりも小さい標識抗体修飾ビーズ１０は、第９の流路１２９を通り抜けることができるが、平均粒径４０μｍの固相抗体修飾ビーズは、通り抜けることができない。
　次に、第１の入力ポート１１１からリン酸バッファーを注入し、マイクロ流路チップ１０１を回転させる。注入されたリン酸バッファーは、第１の流路１２１、ビーズ反応領域１１３、第４の流路１２４、第５の流路１２５、第８の流路１２８、検出部１１４、第９の流路１２９を経て第２の液溜１１６に流入する。この過程で、検出部１１４に残留していた標識抗体修飾ビーズ１０は、全て第２の液溜１１６に洗い出される。
　次に、第１の入力ポート１１１から、発光基質を入れて、マイクロ流路チップ１０１を回転させることで発光基質を検出部１１４に流し、検出部１１４の発光強度を測定する。これにより、抗原２４の量を測定する（ステップＳＴ１４）。
（第３実施例）
　本実施例では、抗原抗体反応工程において、図７に示すマイクロ流路２１０を有するマイクロ流路チップを用いる。図７は、第３実施例に係るサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法で用いられるマイクロ流路２１０を示す平面図である。
　第３実施例におけるマイクロ流路２１０は、第２実施例のビーズ反応領域１１３に代えて、反応部としてのビーズ反応流路２１３を有する点、及び第５の流路１２５は、ビーズ貯蔵域２２５Ｂを有する点において、第２実施例におけるマイクロ流路１１０とは異なる。これらの点以外は、第２実施例のマイクロ流路１１０と同一であるため、同一の構成については、同一の符号を付して、説明を省略する。
　図７に示すように、ビーズ反応流路２１３は、マイクロ流路チップ１０１の半径方向に直交する方向へ３往復するような、つづら折り状の流路により構成されている。また、第１の流路１２１、第２の流路１２２および第３の流路１２３の流路幅及び流路高さは、それぞれ第４の流路１２４、第５の流路１２５、第８の流路１２８、第６の流路１２６、第７の流路１２７の流路幅及び流路高さと同一であり、具体的な値は、５０μｍ～１００μｍである。
　ビーズ反応流路２１３の流路長は、標識抗体修飾ビーズ１０を構成する球形ビーズ１１の平均粒径と、流路内の流体の流速と、流体の拡散係数とに依存する。使用する標識抗体修飾ビーズ１０の平均粒径を１００ｎｍとし、流速を０．１ｍ／ｓとし、流体の拡散係数を水と同程度であるとすると、流路幅を５０μｍとした場合のビーズ反応流路２１３の流路長は、２５０ｍｍ程度以上あれば充分である。流速が０．０１ｍ／ｓと遅い場合には、ビーズ反応流路２１３の流路長は２５ｍｍ以上あれば充分である。
　また、ビーズ貯蔵域２２５Ｂは、第５の流路１２５の部分の一部であって、マイクロ流路チップ１０１の半径方向外方へ第４の流路１２４の延出端部から延出する部分の一部が拡幅することにより構成されている。
　標識抗体修飾ビーズ１０を含んだ反応液は分岐部１２４Ａで分岐されて流速が半減すると共に、遠心力が作用することによって効果的に標識抗体修飾ビーズ１０を第５の流路１２５の方へ分離する。このとき、ビーズ貯蔵域２２５Ｂを有するため、ビーズ貯蔵域２２５Ｂ内部の流速をさらに低減させることができる。
　この結果、分離された標識抗体修飾ビーズ１０が第６の流路１２６の方に流れ出すことを妨げることができると共に、より多くの標識抗体修飾ビーズ１０を分離して貯蔵することが可能となる。このような構成によって、標識抗体修飾ビーズ１０と検体とを反応させて抗原抗体反応を起こさせるために、反応時間を短くすることができる。即ち、ビーズ反応流路２１３に反応液を流すだけで反応を終了させることが可能となり、反応収率を向上させることが可能となる。
　本発明は、上述した実施形態及び実施例に限定されることはなく、特許請求の範囲に記載された技術的範囲において変形が可能である。
　例えば、第２実施例では、第９の流路１２９の流路高さは５μｍであったが、これに限定されない。第９の流路１２９の延出方向に直交する方向における断面の最小寸法は固相抗体修飾ビーズが通らず、標識抗体修飾ビーズが通ればよいので、固相抗体修飾ビーズとして直径２０μｍのものを使用する場合には、たとえば１０μｍ以下であればよい。
　また、標識抗体２３の標識は発光標識であったが、これに限定されない。例えば、蛍光標識であってもよい。標識がＡＰＣたんぱく質等の蛍光タンパク質である場合には、検出部１１４に励起光を照射して蛍光を測定することによって、抗原の量を測定することができる。また、洗浄液は、リン酸バッファーに限られない。
１１　球形ビーズ（粒子）
２２　識別標識
２３　標識抗体
２４　抗原
３２　固相抗体
１０１　マイクロ流路チップ
１１０　マイクロ流路
１１１　第１の入力ポート（試薬液槽）
１１２　第２の入力ポート（試薬液槽）
１１３　ビーズ反応領域（反応部）
１１４　検出部
１２１　第１の流路（試薬液送出路）
１２２　第２の流路（試薬液送出路）
１２３　第３の流路（第１試薬液送出路）
１２４　第４の流路（反応部送出路）
１２５　第５の流路（反応部送出路）
１２８　第８の流路（反応部送出路）

Claims (5)

  1. 　抗原を有する検体を含む媒質中で、固相抗体と、識別標識が修飾された抗体を有する標識抗体とで前記抗原を挟むように、前記固相抗体と前記標識抗体とを結合させる抗原抗体反応工程と、
    　前記識別標識を識別することによって前記抗原の濃度を測定する抗原濃度測定工程とを有するサンドイッチ法を用いた抗原抗体反応測定方法であって、
    　前記抗原抗体反応工程の前に、前記固相抗体を所定の基材上に修飾させる固相抗体固定工程と、
    　前記抗原抗体反応工程の前に、前記検体を含む媒質中で分散可能な粒子上に、前記標識抗体を修飾させる標識抗体粒子固定工程とを有し、
    　前記抗原抗体反応工程では、前記固相抗体と、前記分散可能な粒子上に修飾された前記標識抗体とで前記抗原を挟むように、前記固相抗体と前記標識抗体とを結合させる、サンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法。
  2. 　前記標識抗体粒子固定工程では、前記分散可能な粒子として平均粒径が３０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下の球形ビーズを用いる請求項１に記載のサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法。
  3. 　前記標識抗体粒子固定工程では、前記球形ビーズとして磁気微粒子を用いるか、又は、前記球形ビーズとして、非磁性体の外郭部と、前記外郭部の内部に配置された磁性体とを有する磁気ビーズを用いる請求項２に記載のサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法。
  4. 　前記抗原抗体反応工程では、前記分散可能な粒子として媒質の比重よりも大きい比重を有する粒子を用いる請求項１～請求項３のいずれかに記載のサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法。
  5. 　請求項１に記載のサンドイッチ法による抗原抗体反応測定方法に用いられる、遠心力が作用するように回転駆動されるマイクロ流路チップであって、
    　少なくとも１つの試薬液槽と、
    　前記マイクロ流路チップが回転駆動されるときに前記試薬液槽において遠心力が作用する方向に、前記試薬液槽から延出する試薬液送出路と、
    　前記試薬液送出路の延出端部に接続され、前記試薬液送出路を介して前記試薬液槽に連通する反応部と、
    　前記マイクロ流路チップが回転駆動されるときに前記反応部において遠心力が作用する方向に、前記反応部から延出する反応部送出路と、
    　前記反応部送出路の延出端部に接続され、前記反応部送出路を介して前記反応部に連通する検出部と、
    を備え、
    　前記反応部においては、前記標識抗体と抗原とが抗原抗体反応により結合し、
    　前記検出部には、前記固相抗体が保持され、前記固相抗体は、前記反応部送出路を介して前記検出部に流入する、前記標識抗体と結合した抗原と結合するマイクロ流路チップ。
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