JP5407150B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、このような従来の問題点に鑑み、検体と試薬や基質等との接触時間や接触量等の条件の制御が容易であり、被検物質濃度にかかわらず効率よい分析が可能な免疫分析方法の提供を目的とする。一方、測定誤差や作業間違いの原因となる、被検物質濃度を下げる目的で行う希釈溶液を用いた希釈作業を必要とせず、希釈による被検物質の測定結果の誤差を引き起こさない免疫分析方法を提供することも目的とする。
〔1〕 抗原および/または抗体が結合した担体を収容した反応室を有する分析装置を、前記分析装置外の回転軸に対して公転させることにより、検体および試薬を前記反応室に送液して、前記反応室内の被検物質量を測定する免疫分析方法であって、前記分析装置に対し異なる2以上の遠心力を与えることにより、測定範囲の異なる2以上の被検物質の測定結果を得る免疫分析方法。
〔2〕 前記異なる2つ以上の遠心力を与えるにあたり、異なる2つ以上の公転速度により前記分析装置を公転させる、〔1〕に記載の免疫分析方法。
〔3〕 前記異なる2つ以上の遠心力を与えるにあたり、異なる2つ以上の回転半径により前記分析装置を公転させる、〔1〕に記載の免疫分析方法。
〔4〕 前記反応室内の被検物質量を測定するにあたり、被検物質の検出を光学的手段を用いて行うことを特徴とする〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
〔5〕 前記光学的手段が蛍光測定であることを特徴とする〔4〕に記載の免疫分析方法。
〔6〕 前記光学的手段が発光測定であることを特徴とする〔4〕に記載の免疫分析方法。
〔7〕 前記光学的手段が吸光度測定であることを特徴とする〔4〕に記載の免疫分析方法。
〔8〕 前記反応室内の被検物質量を測定するにあたり、放射線検知手段を用いて行うことを特徴とする〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
〔9〕 前記分析装置が、抗原および/または抗体が結合した担体を収容する反応室を有し、遠心分離器のアングルロータおよび/またはスイングロータに装着可能である免疫分析チップであることを特徴とする〔1〕〜〔8〕のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
〔10〕 前記免疫分析チップは、前記反応室に通じ、反応室と反対側に開口部を有する試薬・検体リザーバを更に備えるチップである、〔9〕に記載の免疫分析方法。
〔11〕 前記被検物質が、サイトカインおよび/またはケモカインである〔1〕〜〔10〕のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
〔12〕 前記被検物質が、IL−6、IL−8、またはTNFである〔1〕〜〔11〕のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
1)標識した抗体により目的とする物質を直接認識し検出する直接法、
2)目的とする物質を抗体により認識し、目的物質と結合した抗体を、標識した抗体により認識し検出する間接法、
3)競合法、
4)目的とする物質を固相化した抗体(1次抗体)により捕捉し、さらに別の標識した抗体(2次抗体)により検出する二抗体サンドイッチ法、
5)目的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、さらに別の抗体により目的とする物質を認識し、目的とする物質を認識した抗体を標識した抗体により検出する三抗体サンドイッチ法、
等が挙げられる。
また、ABC法などの、アビジン、ストレプトアビジン等を用いて、被検物質を検出する手法を利用しても良い。
担体のサイズは、反応室のサイズによるが、担体の形状にかかわらず、短径が1〜1000μm、好ましくは10〜200μmの範囲であることが好ましい。
反応室に複数の担体が収納される場合、各担体の形状、サイズ、素材は均一であってもよいし、多様であってもよい。また、反応室に格納する担体のすべてに抗原および/または抗体が結合されている必要はなく、何も結合しない担体が一部含まれていてもよい。
異なる2つ以上の遠心力の具体的な数値は、分析装置、被検物質の種類や被検物質の検体中の濃度、測定方法などの諸条件に応じて適宜選択することができる。また、異なる2つ以上の遠心力の具体的な数値は、異なる測定範囲の測定結果を得られるよう設定する必要がある。
(a) 前記チップを公転させることにより生じる遠心力を用いて検体を前記反応室に通過させ、被検物質を前記抗原および/または抗体が結合した担体に結合せしめる工程、および
(b) 前記チップを公転させることにより生じる遠心力を用いて標識用の試薬を含む溶液を反応室に通過させる工程
(a)工程においては、検体のほか、各種の試薬をあわせて添加することができる。(b)工程においては、標識用の試薬として酵素標識または蛍光標識を有する標識抗体を含む溶液を用いることができる。
(A) 前記チップを公転させることにより生じる遠心力を用いて検体・試薬を、被検物質を前記抗原および/または抗体が結合した担体に結合せしめる工程。
ここでいう試薬とは、酵素標識または蛍光標識を有する標識抗体などの標識試薬などを含む意味である。
尚、試薬・検体リザーバの容積は、一般には30μL〜500mLであり、好ましくは30μL〜1000μL(1mL)である。
本発明において廃液槽は、廃液を蓄積できる空間であればよい。例えば、図1〜図4に示すような遠沈管内部に挿入嵌合が可能なタイプの免疫分析チップの場合、図8のように遠沈管に装着した際に遠沈管GとチップHとの間に形成される空間が廃液槽16となりうる。一方、図1〜4中には図示しないが、第2の開口部11Aに何らかの袋或いは容器を装着して廃液槽とすることも可能である。
また、図5および図6に示すような、アングルローターやスイングローターにそのまま装着できるタイプの免疫分析チップの場合には、チップ内に廃液槽16を設けることができる。
すなわち、遠沈管に着脱自在に嵌合するタイプのチップの場合、チップ本体のサイズは、上述したように遠沈管内部に挿入嵌合可能とすることを考慮して定めることができる。一般的に用いられる遠沈管のサイズは、短径8〜40mm、高さ5〜120mmであるので、これを考慮すると、例えば、チップ本体の短径は通常6〜40mm、高さは通常5〜120mmの範囲で定めることが出来る。遠沈管として好ましく用いることができるエッペンドルフチューブのように、容積が0.5ml〜2.5mlの小型の遠沈管を用いる場合は、そのサイズが、8〜10mmであるので、これを考慮すると、チップ本体のサイズは、短径は通常6〜10mm、高さは通常5〜30mm、より好ましくは5〜15mmの範囲で定めることができる。一方、遠心分離機のアングルローターやスイングローターの遠沈管装着部位にそのまま装着できるタイプのチップの場合には、装着先の遠心分離機のローターのサイズに合わせたサイズであればよい。
工程(a)については、まず、検体・試薬リザーバに検体を注入(図9の(1))した後、検体を遠心力により反応室に移送し(図9の(2))ビーズ上の1次抗体と抗原抗体反応させる(図9の(3))。すなわち、検体注入後の免疫分析チップを遠沈管に挿入し、この遠沈管を遠心機にセットして、回転させる。この処理により、遠心力により検体が検体・試薬リザーバから反応室に移送されると同時に反応が行われる。
一方、本発明の工程(I)を、工程(A)、前記チップを公転させることにより生じる遠心力を用いて検体・試薬を、被検物質を前記抗原および/または抗体が結合した担体に結合せしめる工程のみで実施する場合には、上述の工程(a)の説明において、検体に代えて検体に標識抗体などを添加した液体を注入することにより実施することができる。
(1)1回目の測定
以下のようにして、遠心型ELISAチップを製作した。図4にチップの横断面図を示す。遠心型ELISAチップは円筒形のチップ本体からなり、内部に管状の反応室と円筒形で反応室側が絞り形状の検体・試薬リザーバを備え、両者は連結している。検体・試薬リザーバと反応室はそれぞれ外部への開口部を有し、検体・試薬リザーバの開口部には、外部に突出した耳が設けられている。反応室には一次抗体を結合したビーズ担体が充填されるので、その開口部には、ビーズ堰き止め用のフィルタ圧入穴が設けられている。
ポリスチレンビーズ(Polyscience社、粒径:25μm)をリン酸緩衝液で洗浄し、ポリスチレンビーズと同量の0.1μg/ml抗hIL−8抗体リン酸緩衝液を添加し、4℃で一晩浸透させた。浸透後、ポリスチレンビーズ2μlを150μlの0.05%トゥイーン20含有リン酸緩衝液で懸濁した。この懸濁物を上記遠心型ELISAチップのリザーバに注いだ後に、チップを遠沈管(商品名:エッペンマイクロチューブ、メーカー名:エッペンドルフ、サイズ:1.5mL)に入れ、遠心機にて2000Gで30秒間遠心した。反応室の容積に対する抗体結合ポリスチレンビーズの密度は、9×104個/mm3であった。
(1)と同様の遠心型ELISAチップの反応室に、(1)と同様にビーズ担体を充填した。
遠心型ELISAチップのリザーバに、0.05%トゥイーン20含有リン酸緩衝液100μlを注いで、遠心機にて2000Gで60秒間遠心し、ビーズを洗浄した。その後、0.25%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.05%トゥイーン20含有リン酸緩衝液で溶解させたhIL−8(鎌倉テクノサイエンス社)50μlと、0.25%BSA、0.05%トゥイーン20含有リン酸緩衝液で溶解させた0.6μg/mlのHRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)標識抗hIL−8抗体(鎌倉テクノサイエンス社)50μlとを混合し、上記チップのリザーバに注入した。そしてチップを100Gで600秒間遠心し反応させた。反応後0.05%トゥイーン20含有リン酸緩衝液100μlを上記リザーバに注入し、チップを2000Gで60秒間遠心し再びビーズを洗浄した。洗浄後、20μM過酸化水素水、13μg/ml Amplex Red(Molecular Probes社)を含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)100μlをリザーバに注ぎ2000Gで10秒間遠心して送液した。その後に、反応室内で産生されたレゾルフィンの量を蛍光顕微鏡IX−71(オリンパス社)を用いて測定した。各濃度でのhIL−8の蛍光強度の測定結果を図11に示す(励起波長510−560nm、発光波長575−650nm、露光時間0.5秒)。
(1)と同様の遠心型ELISAチップの反応室に、(1)と同様にビーズ担体を充填した。
(1)1回目の測定
以下のようにして、遠心型ELISAチップを製作した。図4にチップの横断面図を示す。遠心型ELISAチップは円筒形のチップ本体からなり、内部に管状の反応室と円筒形で反応室側が絞り形状の検体・試薬リザーバを備え、両者は連結している。検体・試薬リザーバと反応室はそれぞれ外部への開口部を有し、検体・試薬リザーバの開口部には、外部に突出した耳が設けられている。反応室には一次抗体を結合したビーズ担体が充填されるので、その開口部には、ビーズ堰き止め用のフィルタ圧入穴が設けられている。
ポリスチレンビーズ(Polyscience社、粒径:25μm)をリン酸緩衝液で洗浄し、ポリスチレンビーズと同量の0.1μg/ml抗hIL−6抗体リン酸緩衝液を添加し、4℃で一晩浸透させた。浸透後、ポリスチレンビーズ2μlを150μlの0.05%トゥイーン20含有リン酸緩衝液で懸濁した。この懸濁物を上記遠心型ELISAチップのリザーバに注いだ後に、チップを遠沈管(商品名:エッペンマイクロチューブ、メーカー名:エッペンドルフ、サイズ:1.5mL)に入れ、遠心機にて2000Gで30秒間遠心した。反応室の容積に対する抗体結合ポリスチレンビーズの密度は、9×104個/mm3であった。
(1)と同様の遠心型ELISAチップの反応室に、(1)と同様にビーズ担体を充填した。
(1)と同様の遠心型ELISAチップの反応室に、(1)と同様にビーズ担体を充填した。
11A、11A´ 開口部
12 検体・試薬リザーバ
12A 開口部
13 抗原および/または抗体が結合した担体
14A 耳
14B 足
14C 空間
15 免疫分析チップの側面の角
16 廃液槽
A〜D,E,F,H 免疫分析チップ
G 遠沈管
Claims (11)
- 抗原および/または抗体が結合した担体を収容した反応室を有する分析装置を、前記分析装置外の回転軸に対して公転させることにより、検体および試薬を前記反応室に送液して、前記反応室内の被検物質量を測定する免疫分析方法であって、異なる2つ以上の公転速度により前記分析装置を公転させて前記分析装置に対し異なる2以上の遠心力を与え、前記異なる2以上の遠心力のうち最大の遠心力を最小の遠心力の2.5倍以上とすることにより、被検物質を希釈することによる測定範囲の調整を行わずに、該被検物質について、測定範囲の異なる2以上の測定結果を得る免疫分析方法。
- 前記異なる2つ以上の遠心力を与えるにあたり、異なる2つ以上の回転半径により前記分析装置を公転させる、請求項1に記載の免疫分析方法。
- 前記反応室内の被検物質量を測定するにあたり、被検物質の検出を光学的手段を用いて行うことを特徴とする請求項1又は2のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
- 前記光学的手段が蛍光測定であることを特徴とする請求項3に記載の免疫分析方法。
- 前記光学的手段が発光測定であることを特徴とする請求項3に記載の免疫分析方法。
- 前記光学的手段が吸光度測定であることを特徴とする請求項3に記載の免疫分析方法。
- 前記反応室内の被検物質量を測定するにあたり、放射線検知手段を用いて行うことを特徴とする請求項1又は2に記載の免疫分析方法。
- 前記分析装置が、抗原および/または抗体が結合した担体を収容する反応室を有し、遠心分離器のアングルローターおよび/またはスイングローターに装着可能である免疫分析チップであることを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
- 前記免疫分析チップは、前記反応室に通じ、反応室と反対側に開口部を有する試薬・検体リザーバを更に備えるチップである、請求項8に記載の免疫分析方法。
- 前記被検物質が、サイトカインおよび/またはケモカインである請求項1〜9のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
- 前記被検物質が、IL−6、IL−8、またはTNFである請求項1〜10のいずれか一項に記載の免疫分析方法。
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