JP2011058956A - 免疫センサ - Google Patents

Abstract

【課題】免疫センサの妨害物の影響を簡便に除くことが出来る。
【解決手段】酵素標識抗体を用いた免疫センサにおいて、前記免疫センサ内に設けられた流路内に、血液溜（１）と、血球分離部（２）と、目的分子と結合する抗体が固定化された抗体修飾領域（１０）と、前記抗体修飾領域に近接した電気化学測定用薄膜電極（６）（７）（８）とを備え、前記血液溜（１）から免疫センサの回転による遠心力の向きに流路（１１）を形成しその先に前記血球分離部（２）が設けられ、当該血球分離部（２）から遠心力の向きとは反対の方向に分岐した流路により血球分離部（２）と前記抗体修飾領域（１０）を繋ぐことを特徴とする免疫センサ。
【選択図】図１

Description

本発明は、目的分子を計測する分析化学に関する。特に、抗原抗体反応を利用して血液中に含まれる生体分子を計測することを目的とした免疫センサに関するものである。

血液などに含まれるタンパク質やペプチドの検出は、疾病診断などの目的から盛んに行われており、その重要性もますます高まってきている。従来、放射性同位体を標識した抗体を用いたラジオイムノアッセイが行われてきた。ラジオイムノアッセイ法は極めて高感度な定量が可能であるものの、放射性同位元素を用いるため安全性に問題がある。そこで、安全性から酵素を標識した酵素免疫測定法が、今日では主流となっている。
近年、ＰＯＣＴ（ポイントオブケアテスティング）と呼ばれる手法が注目されている。これは、携帯できるほどの小型のセンサを用いて血液や尿中に含まれる生体分子、特に疾患マーカーと呼ばれるタンパクやペプチドを計測する手法である。小型センサを用いて生体成分を計測することにより、患者の近くで“その場で”計測可能になり、迅速な診断や治療成績の向上が見込まれる。

現在、迅速・簡便な免疫測定法としては、一般的にイムノクロマトグラフィ法が良く用いられ、各社から市販されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、一般的にイムノクロマトグラフィ法の検出下限界は数十ｎｇ／ｍＬ程度であり、測定対象は比較的高濃度に存在する分子に限られている。
一方、近年、ガラスやシリコンなどの上に分析システムを微小化、集積化する試みが盛んに行われており、操作の簡便化、自動化や分析時間の短縮などに有効であると考えられている。免疫測定法に関してもこれまでバルクで行われてきた手法を微小流路を用いて行うことにより、迅速で簡便な検出が可能になると考えられ、いくつかの報告例がある（例えば特許文献２及び特許文献３参照）。
一般的に、全血試料での免疫測定では、試料内の血球やタンパク質が測定に影響を与えるため、前処理として遠心分離や除タンパク作業を行う必要があり、煩雑であった。そのため、センサ自身は小型・その場で測定可能であっても、実際は前処理を別途行う必要がある。そこで、チップ上で遠心力を利用して血漿成分を分離する試みが報告されている（特許文献４参照）。

特開平５−１３３９５６号公報 特開２００３−１１４２２９号公報 特開２００１−４６２８号公報 特許第３８４７０５３号公報

小型センサを用いて生態成分を計測するには、免疫センサ内に、センサの出力結果に影響が出ないような機能を集積化する必要がある。例えば、流路内のセンサ上流に血球が通過できないようなフィルターを設ける方法が考えられる。フィルターによって血球を濾しとる手法では、ほぼ完全に血球を取り除くことが可能である。しかしながら、直ぐにフィルター部が目詰まりを起こしてしまい、フィルター面積が限定される小型センサには不向きである。加えて、血球を分離できたとしても、フィルター構造のみでは、より小さなナノメートルスケールの妨害分子となるタンパクを除去することはほぼ不可能である。このため、電気化学免疫センサとした場合には、電極表面にタンパクが吸着してしまい、正しい結果を得ることが出来ないという問題点が残る。これは、上記特許文献４に記載の血漿抽出法にも言え、グルコースやイオンなどの計測は可能であるものの、非特異吸着の影響が大きい免疫センサには適用できていない。

本発明の目的は、これまで報告されてきた微小流路を有する免疫センサにおける感度や精度、前処理にかかる時間と煩雑さに鑑み、血液中に含まれる微量な生体分子においても、Ｓ／Ｎ比良く、迅速、簡便に精度良く測定可能な、免疫センサを提供することである。

本発明の免疫センサには流路が形成されている。さらにこの流路の目的分子を捕捉する抗体修飾領域の上流には血球を除去する血球分離部を、さらに上流には血液を導入する血液溜が備わっている。血球溜に全血と酵素標識抗体混合液を滴下後、免疫センサを回転することで前記混合液を遠心力で外部へ押し出す際に、血球分離部で血球を捕捉し、この捕捉部分からあふれ出る血漿成分のみを、微細加工技術で集積化されているフィルター（５μｍ程度に流路を浅くした領域）を通して取り出す。フィルター構造に全血をそのまま通過させた場合には直ぐに目詰まりを起こすが、本構造では、血球成分が目詰まりする方向とは逆に遠心力により移動する力が働くように設計されているおり、あふれ出た血漿のみをフィルターに通過させるため目詰まり無く完全な血球除去が可能である。
さらに、前記フィルターを透過した血漿は、薄膜電極上或いは薄膜電極の近傍の流路内に配置された抗体修飾領域上へ導入されることにより、抗原抗体複合体が形成される。その後、標識酵素の基質溶液を基質溜に滴下し、さらに回転させて基質を免疫センサ内に導入する。ここで、抗原抗体複合体が形成されていた際には、標識酵素により基質が変換される。その後、酵素反応により変換された分子の量を電気化学的に測定することにより、目的分子濃度を高感度に計測する。ここで、血球は分離されているものの、血漿内にはアルブミン等のタンパクが高濃度で存在している。このため、電極表面にタンパクが吸着し、電気化学活性化低下するため正確な値を得ることが難しいが、本発明では、薄膜電極をタンパクの非特異吸着を抑制する単分子膜によって保護しているため、高濃度にタンパクを含む血漿中でも精度良く測定可能である。
このように、試料中に含まれるマイクロメールオーダーのサイズの妨害分子である血球を遠心力によって血球溜に捕捉することで、電気化学測定を行う薄膜電極上には一切血球が流れ込まないことと、ナノメーターサイズの妨害分子であるタンパクは、薄膜電極表面に修飾された単分子膜によって電極表面へ透過できない様にすることで、精度の良い免疫センサを提供できる。

本発明に依れば、免疫センサの妨害物の影響を簡便に除くことが出来るために、小型センサにおいても、精度の良い出力結果を得ることが可能である。具体的には、全血や尿などの生体試料を、別途前処理を行うことなく簡便に測定可能である。

本発明により作製した、免疫センサの構造を示す模式図である。 本発明の免疫センサを構成する、各部材の構造を示す模式図である。 本発明の免疫センサを用いて測定を行う際の、手順や各溶液の流れ、血球分離の状態、測定原理を示す模式図である。 実施例１において得られた、免疫センサの検量線である。横軸は目的分子であるＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）の濃度を、縦軸は免疫センサの応答信号となる酸化電流値のピーク電流密度を示す。 本発明の免疫センサを用いてヒツジ全血を測定した際の、血球分離部の顕微鏡写真である。 実施例２において得られた、ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_３−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＨ（nは２から１１の整数）で作用電極を修飾した際の、免疫センサの応答電流の変化を表で示す。

本発明において、流路を形成する材料としては特に制限はなく、ポリジメチルシロキサンや、ポリアクリル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどが考えられる。また、薄膜電極を形成する基板材料としては、絶縁性基板が適しており、ガラスや非導電性プラスチック、酸化膜付きシリコン基板が考えられる。薄膜電極の材料としては、チオール化合物と吸着する金、銀、銅などが考えられるが、電気化学特性を鑑み、特に金が適していると考えられる。
本発明の免疫センサでは、単一の部材から構成されていても良いが、流路となる溝を有する部材と薄膜電極を有する部材とを貼り合わせて基板を構成しても良い。下記の実施例では、貼り合わせにより作製しているが、これに限定されるものではない。

本発明の代表的な免疫センサ内の流路形状について、図１に示す。本免疫センサは、薄膜電極を有するガラス基板、ポリジメチルシロキサン基板、ポリビニルクロライド基板を貼り合わせることにより作製しており、おのおのの部材の形状を図２に示す。
ポリジメチルシロキサン上に形成する流路のサイズは特に限定されないが、あまりに大きいと試料量や基質、抗体が多量に必要となり不利である。また、あまりに小さいと、遠心力のみでは液が流通しにくくなるため、流路の幅は通常、０．０５ｍｍ〜５ｍｍ程度であり、好ましくは１ｍｍ程度である。流路の深さも特に限定されないが、上述した理由から、０．０１ｍｍ〜０．１ｍｍ程度であり、好ましくは、０．０２ｍｍ程度である。

流路内には、血液を導入するための血液溜が設けられている。この血液溜に血液を滴下（図３、測定手順−２参照）し、免疫センサを回転させることにより血液溜から遠心力方向に設けられた流路で血液を送液する。血液が流れた先には、血球分離部が設けられている。ここで、血球は比重が重いために遠心力方向に押しつけられるが、比重の軽い血漿は遠心力の向きとは反対の方向に設けられた流路に流れ込む（図３、測定手順−３参照）。
なお流路の内壁は、流路を形成する材質のままでも良いが、アルブミン等のタンパクを塗布することによって、より良好にセンサが動作する。これは、流路内が親水化されることにより、スムーズに溶液が流れること、並びに酵素標識抗体が流路内に非特異的に吸着することを防ぐ働きがあるためである。

血漿が流れ込む流路の一部を、赤血球が通過できない程度に浅くしている。好ましくは０．００５ｍｍ程度に流路を浅くしている。このフィルターにより、万一血球が流路方向に流れてきても、前記フィルターにより流れ込むことを防ぐことが出来る。
血漿が流れ込んだ流路内には目的物質に対する抗体を固定化した領域が設けられている。ここで目的物質は、抗原として抗原抗体反応をし得るものであれば何ら限定されない。目的物質として好ましくは、生体内のペプチドやタンパク、多糖類等の生体関連物質であるが、環境物質等でもよい。本発明の免疫センサは、試料中に含まれる血球やタンパクの影響を受け難いことから、測定対象は血液試料や尿試料を測定したときに威力を発揮する。しかしながら、飲料水や河川等の測定も可能である。

抗体修飾領域は、電気化学測定用薄膜電極上に直接形成しても良いし、電気化学測定用薄膜電極の近傍の流路上に形成しても良い。なお抗体の修飾方法としては、物理的な吸着を利用した方法やカルボジイミドカップリングなどの共有結合を利用した方法、アビジン−ビオチン結合などの生体分子間の相互作用を利用した手法などが考えられるが、修飾した抗体の活性が維持出来れば、これらに限定されない。また、抗体修飾領域のサイズは、安定して修飾できれば特に限定されないが、好ましくは、１ｍｍ〜１０ｍｍ程度である。
前記の薄膜電極は、好ましくは３つの電極が流路内に形成されている。これらの３つの電極を作用電極、参照電極、対向電極として用いることで、流路内での電気化学測定を行うことが出来る。また、参照電極と対向電極を同一の電極として用いることも可能であるため、流路内に２つの電極が配置された構造でも使用可能である。薄膜電極の形成方法は、スパッタリング法や蒸着法、スクリーン印刷法が考えられるが、これらに限定されない。電極材料としては、金や銀、銅などが考えられるが、好ましくは金である。電極の大きさについても特に限定されないが、好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度である。
薄膜電極の表面は、そのままでも測定可能であるが、血液など目的試料にタンパクが多量に含まれている場合には、一般式 ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）₃−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＨ (ｎ＝２〜１１)で表される単分子膜で修飾した方が好ましい。前記単分子膜が電極表面に形成されていることにより、タンパクの電極表面への吸着を抑制できるため、精度の良いセンサ結果を得ることが可能である。

血漿が抗体修飾領域に流れ込んだ後、基質溜に基質を含む液を導入し（図３、測定手順−４参照）、さらに回転させることにより、基質を抗体修飾領域に導入する（図３、測定手順−５参照）。基質は、用いる標識酵素によって変更する必要がある。例えば、標識酵素をアルカリフォスファターゼとした場合には、ｐ−アミノフェノールフォスフェートを基質として用いる。標識酵素を西洋わさびペルオキシターゼとした場合には、過酸化水素を基質として用いる。これらの組み合わせについては、既知の酵素と基質の組み合わせを、本発明の免疫センサに適用可能である。

基質溶液を抗体修飾領域に導入した後、一定時間を放置することで、標識酵素により基質が一部反応する。例えば、標識酵素をアルカリフォスファターゼとし、ｐ−アミノフェノールフォスフェートを基質として用いた場合には、酵素反応によりｐ−アミノフェノールが生成する。ここで生成されるｐ−アミノフェノールの量は、抗体修飾領域に捕捉された目的分子の濃度が上昇するに従い上昇する。このため、ｐ−アミノフェノールを流路内に配置された前記薄膜電極により検出することにより、目的物質の濃度を知ることが可能である。

前記では、従来サンドイッチイムノアッセイと呼ばれる手法で測定しているため、目的物質濃度の上昇に伴い抗体修飾領域に捕捉される目的物質の量は上昇する。しかしながら、従来、競合法とよばれる手法では目的物質濃度の上昇に伴い抗体修飾領域に捕捉される目的物質の量は減少する。競合法においても、検量線が右下がりになるだけで本発明の免疫センサは利用可能である。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
＜免疫センサの作製＞
免疫センサは、流路を形成したポリジメチルシロキサン基板と電気化学測定用薄膜金電極を有するガラス基板を貼り合わせることにより作製した。流路の鋳型となる基板にポリジメチルシロキサン（ＰＭＤＳ）のオリゴマー（コーニング社製）と硬化剤を混合し、６０℃で２時間放置することにより硬化させた。その後、鋳型からはずし、流路を有するＰＭＤＳ基板を得た。薄膜金電極基板は、ガラス基板上にスパッタリング法により金薄膜を１００ｎｍ堆積させた。その後、フォトリソグラフィ加工によりレジストパターンで流路を積層した。さらに、ウエットエッチング法により３つの薄膜電極パターンを得た。

薄膜電極への捕捉抗体の固定化と、ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_３−（ＣＨ_２）_２−ＳＨ（以下ＴＥＧと表記）の固定化は以下のように行った。まず、エタノールにカルボン酸デカンチオール（Ｃ１０ＣＯＯＨ）とＴＥＧをそれぞれ溶解させて１ｍＭとし、これらをＣ１０ＣＯＯＨ：ＴＥＧ＝１：９の体積比で混合した溶液を準備した。次に、Ｃ１０ＣＯＯＨとＴＥＧ混合溶液に金電極を１時間浸漬させることで、電極上にＣ１０ＣＯＯＨとＴＥＧの混合された膜を形成した。その後、１．１ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスルフォスクシンイミドと０．４ｎｇ／ｍＬの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを含んだ２０ｍＭ酢酸緩衝液１０μＬを電極上に滴下することで、Ｃ１０ＣＯＯＨ上のカルボキシル基を活性化した。電極を酢酸緩衝液で洗浄後し、１００μｇ／ｍＬの抗ＴＮＦ−α抗体を含んだ酢酸緩衝液１０μＬを電極上に添加することで、活性化したＣ１０ＣＯＯＨのカルボキシル基と抗体のアミノ基をアミド結合させ、電極に抗腫瘍壊死因子抗体（ＴＮＦ−α抗体）を化学固定した。

ＰＤＭＳで形成した流路には、まず、１ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んだ超純水を塗布することでＢＳＡを物理吸着させ、流路に対する抗ＴＮＦ−α抗体やアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等の非特異吸着の抑制を行った。その後、ＰＤＭＳ基板と上記の薄膜電極を有するガラス基板を貼り合わせることで、免疫センサを作製した。

＜免疫センサを用いた測定手順＞
先ず、免疫センサの血液溜に、目的試料と測定溶液の混合溶液を滴下する。目的試料は０，０．１，１，１０ｎｇ／ｍＬの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を含む試料を準備した。測定溶液は、１μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＴＮＦ−α抗体、ストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、１ｍｇ／ｍＬのアルブミン（ＢＳＡ）を含んだトリス緩衝液（２０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、０．１５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４）である。これらの混合溶液を免疫センサの血液溜に８５μＬ導入した。次に、４０００ｒｐｍで免疫センサを１０分間回転させることで、混合試料溶液を送液した。この送液によって、電極上に固定化された抗ＴＮＦ−α抗体に対して、ＴＮＦ−α、ビオチン化抗ＴＮＦ−α抗体、ストレプトアビジン化ＡＬＰが結合される。次に、１０ｍＭのｐ−アミノフェニルフォスフェート（ＰＡＰＰ）を含んだトリス緩衝液を基質導入孔へ１０μＬ導入し、４０００ｒｐｍで免疫センサを３０秒間回転させることで、電極上へＰＡＰＰを搬送した。その後、５分間免疫センサを静止することで電極上のＡＬＰの酵素反応によってＰＡＰＰをｐ−アミノフェノール（ＰＡＰ）に変換した。さらに、サイクリックボルタンメトリー法によって薄膜電極電位を−０．３Ｖから＋０．３Ｖへと上昇させた際の、ＰＡＰの酸化電流を測定した。分析結果を図４に示す。ＴＮＦ−αの濃度が上昇するに伴って、ＰＡＰ由来の酸化電流値も上昇することが確認された。これは、電極上に存在するＡＬＰの濃度が増加している、すなわち、ＴＮＦ−αの濃度の増大を意味していることから、本免疫センサを用いた免疫測定が可能であることを示している。

（実施例２）
実施例１に記載の免疫センサ内の作用電極は、ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_３−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＨ（ｎは２から１１の整数）で表される分子で修飾することで、タンパク質が多量に含まれる試料溶液においても、選択的に目的分子を検出可能である。これは、上記分子で電極を保護することにより、タンパク質の電極表面への非特異吸着を抑制できるためである。長さの異なる上記分子で測定した際の結果を以下に示す。

作用電極を、それぞれｎが２，４，６，８，１１の上記分子で修飾し、標識酵素の生成分子であるｐ−アミノフェノールを測定した際の電流値を測定した。図６に、電流値の変化を示す。アルキル鎖長であるｎが大きくなるに従い、電流値が小さくなる。これは単分子の膜厚が上昇するため、標識酵素の生成物（ｐ−アミノフェノール）の電極表面への拡散が阻害されるためである。このため、大きな電流値、すなわち免疫センサとして大きな応答を得るにはｎの小さな分子で修飾した方が良い。しかしながら、ｎが大きくなるに従いアルブミンのようなタンパク質の非特異吸着が大きくなることも確認されている。例えば、ｎ＝２の上記分子で修飾した電極上に吸着するアルブミンは、ｎ＝８のそれに比べ、およそ２倍のアルブミンが吸着する。このため、対象試料中に含まれるタンパクの含有量にあわせて、最適なセンサの応答を得られる上記分子のアルキル鎖長を選択することが望ましい。例えば、河川の分析などは、ほとんどタンパク質を含まないと考えられるため短鎖の上記分子を用いた方が、より大きなセンサの応答を得られるため有利であると考えられる。一方、血液の測定では、長鎖の上記分子で作用電極を修飾した方が、ノイズとなる非特異吸着を抑制でき、高選択的に測定可能である。

（実施例３）
試料溶液中に血球が含まれている際には、血球が血球分離部に捕捉される。このため薄膜電極上には血球が流れ込まないため、正確に免疫測定の結果を得ることが可能である。図５にヒツジの全血を用いて測定した際の、血球分離部の顕微鏡写真を示す。本センサを用いることにより効果的に血球を分離でき、薄膜電極上では血球は観測されなかった。

本発明は、免疫センサの妨害物の影響を、免疫センサの回転による遠心力を利用して簡便に除くことが出来るために、小型センサにおいても、精度の良い出力結果を得ることが可能であり、全血以外にも尿などの生体試料に適用可能であり、さらには、生体試料以外のものについても適用が可能である。

１ 血液溜
２ 血球分離部
３ 基質溜
４ 血漿溜
５ 空気穴
６ 作用電極
７ 参照電極
８ 対向電極
９ フィルター部（深さ５μｍ）
１０ 抗体修飾領域
１１ 流路
１２ ガラス基板
１３ ＰＤＭＳ基板
１４ ポリビニルクロライド基板

Claims (7)

1. 酵素標識抗体を用いた免疫センサにおいて、前記免疫センサ内に設けられた流路内に、血液溜と、血球分離部と、目的分子と結合する抗体が固定化された抗体修飾領域と、前記抗体修飾領域に近接した電気化学測定用薄膜電極とを備え、前記血液溜から免疫センサの回転による遠心力の向きに流路を形成しその先に前記血球分離部が設けられ、当該血球分離部から遠心力の向きとは反対の方向に分岐した流路により血球分離部と前記抗体修飾領域とを繋ぐことを特徴とする免疫センサ。
2. 前記薄膜電極が、一般式ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_３−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＨ、ただしnは２から１１の整数、で表される単分子膜構造を電極表面に有することを特徴とする、請求項１記載の免疫センサ。
3. 前記流路の材質が、ポリジメチルシロキサンであることを特徴とする、請求項１又は２記載の免疫センサ。
4. 前記流路の表面が、アルブミンにより親水化されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の免疫センサ。
5. 前記薄膜電極の材質は、金であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項記載の免疫センサ。
6. 前記血球分離部から遠心力の向きとは反対の方向に分岐した流路の、当該流路が遠心力の向きとは反対の向きに向いた流路部分にフィルターを設けたことを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項記載の免疫センサ。
7. 請求項１から６のいずれか１項記載の免疫センサを用い、該免疫センサを回転させて遠心力により送液し電気化学測定用薄膜電極で測定を行うことを特徴とする免疫センサの測定方法。