MXPA02011130A

MXPA02011130A - Metodos y composiciones de materia que se refieren a april/g70, bcma, blys/agp-3, y taci.

Info

Publication number: MXPA02011130A
Application number: MXPA02011130A
Authority: MX
Inventors: Lars Eyde Theill
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2003-03-10
Also published as: US20020081296A1; US6774106B2; AU2001263114A1; US20020086018A1; EP1280826B1; AU2001261557B2; AU6155701A; DE60128216T2; WO2001087977A2; WO2001087979A2; ATE361318T1; ES2287130T3; WO2001087979A3; DE60128216D1; CA2408617A1; JP2003533218A; WO2001087977A3; EP1280826A2

Abstract

Esta invencion se refiere a interacciones entre APRIL/G70, AGP-3/BLYS, BCMA, y TACI y a metodos relacionados de uso y a composiciones de materia. Se ha encontrado que (1) sAPRIL/G70 se aglutina a los receptores BCMA y TACI de la superficie celular sobre las celulas del linfoma T y B, conduciendo a la estimulacion de la proliferacion de las celulas B y T del raton y del ser humano, primarias, tanto in vitro como in vivo; (2) APRIL compite con la aglutinacion de AGP3 a TACI y BCMA; (3) sBCMA inhibe la aglutinacion de APRIL y AGP3 a sus receptores; (4) sBCMA mejora las respuestas inmunes humorales de la celula T y dependientes de la celula T, in vivo; (5) sTACI inhibe la aglutinacion de APRIL y AGP3 a sus receptores y mejora las respuestas inmunes humorales dependientes de la celula T e independientes de la celula T in vivo; y (6) BCMA exhibe una semejanza con TACI dentro de un dominio rico en cisteina unico localizado N-terminal con respecto a un dominio potencial de la transmembrana. Estos descubrimientos proporcionan una estrategia para el desarrollo de metodos terapeuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, y cancer, para la prevencion del rechazo de trasplantes. Los estados de enfermedad y los parametros de enfermedad asociados con APRIL y AGP-3 pueden ser afectados por la modulacion de BCMA o TACI; los estados de enfermedad y los parametros asociados con TACI pueden ser afectados por la modulacion de APRIL; los estados de enfermedad y los parametros pueden ser afectados por la modulacion de TACI, BCMA, APRIL y AGP-3 por un agente terapeutico unico o dos o mas agentes terapeuticos conjuntamente.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE MATERIA QUE SE REFIEREN A APRIL/G70, BCMA, BLYS/AGP-3, Y TACI Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas que están involucradas en la inflamación e inmunomodulación, la supervivencia, o la activación ,o en trastornos linfoproliferativos u otros cánceres. La invención se refiere además a proteínas relacionadas con la superfamilia del factor de necrosis del tumor (TNF) /factor de crecimiento de los nervios (NGF) y ácidos nucleicos relacionados, a los vectores de expresión, a las células huésped, y a los ensayos de aglutinación. La especificación también describe composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con factores inmune e inflamatorios, autoinmunes y otros factores inmune, tales como la artritis reumatoide (RA) , la enfermedad de Crohn (CD) , lupus, y la enfermedad del huésped contra el injerto (GvHD) así como para el tratamiento de enfermedades linfoproliferativas y otros cánceres .

Antecedentes de la Invención Después de años de estudio en la necrosis de los tumores, los factores de necrosis del tumor (TNFs) a y ß Ref.143348 fueron clonados finalmente en 1984. Los años siguientes confirmaron el surgimiento de una superfamilia de citocinas de TNF, incluyendo el ligando fas (FasL) , ligando CD27 (CD27L), ligando CD30 (CD30L) , ligando CD40 (CD40L) , ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL, también designado AGP-1), proteína de aglutinación de osteoprotegerina (ligando OPG-BP u OPG) , ligando 4-1BB, LIGHT, APRIL, y TALL7I. Smith et al, (1994), Cell, 76:959-962; Lacey et al, (1998), Cell, 93:165-176; Chichepotiche et al, (1997), J. Biol. Chem., 272:32401-32410 ; Mauri et al, (1998), Immunity, 8:21-30 ; Hahne et al, (1998), J. Exp .

Med., 188:1185-90 ; Shu et al, (1999), J. Leukocite Biology, 65:680-3. Esta familia está unificada por su estructura, particularmente en la terminación C. Además, la mayoría de los miembros conocidos hasta la fecha son expresados en compartimientos inmune, aunque algunos miembros también están expresados en otros tejidos y órganos. Smith et al, Cell 76:959-62. Todos los miembros del ligando, con la excepción de LT-a, son de proteínas de la transmembrana del tipo II, caracterizados por una región de 150 aminoácidos conservados dentro del dominio extracelular C-terminal. Aunque restringida a solamente 20-25% de identidad, el dominio de 150 aminoácidos conservados se pliega en un sandwich de hoja doblada en ß y se trimeriza. Esta región conservada puede ser liberada proteolíticamente, generando así una forma funcional soluble. Banner et al, (1993), Cell 73:431-445. Muchos miembros dentro de esta familia del ligando son expresados en los tejidos ricos en linfoide y desempeñan papeles importantes en el desarrollo y la modulación del sistema inmune. Smith et al, (1994) . Por ejemplo, el TNFa es sintetizado principalmente por los macrófagos y es un mediador importante para las respuestas inflamatorias y las defensas inmune. Tracey & Cerami (1994) , Annu. Rev.Med. , 45:491-503. Fals-L, expresado predominantemente en la célula T activada, modula la apoptosis mediada por TCR de los timocitos. Nagata, S. & Suda, T. (1995) Immunology Today, 16:39-43; Castri et al, (1996), Im unity, 5:617-27. CD40L, también expresado por las células T activadas, proporciona una señal esencial para la supervivencia de la célula B, la proliferación y el cambio de isotipo de la inmunoglobulina. Noelle (1996), Immunity, 4:415-9. Los receptores semejantes para la mayoría de los miembros de la familia del ligando de TNF han sido identificados. Estos receptores comparten repeticiones ricas en cisteína, múltiples, características, dentro de sus dominios extracelulares, y no poseen porciones catalíticas dentro de las regiones citoplásmicas . Smith et al, (1994). La señal de los receptores a través de las interacciones directas con las proteínas del dominio muerto (por ejemplo TRADD, FADD, y RIP) o con las proteínas TARF (por ejemplo TRAF2, TRAF3, TRAF5, y TRAF6) , que activan las rutas de señalización divergentes y de superposición, por ejemplo la apoptosis, activación de ÑF-kB, o la activación de JNK. Wallach et al (1999), Annual Review of Immunology 17:331-67. Estos eventos de señalización conducen a la muerte celular, proliferación, activación o diferenciación. El perfil de expresión de cada miembro receptor varía. Por ejemplo, THFR1 es expresado sobre un espectro amplio de tejidos y células, mientras que el receptor de la superficie celular de OPGL está restringido principalmente a los osteoclastos. Hsu et al, (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96:3540-5. Tales proteínas se cree que desempeñan un papel en los procesos inflamatorios e inmunes, sugiriendo su utilidad en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios. Un número de grupos de investigación ha identificado recientemente los ligandos de la familia de TNF con la misma secuencia o una secuencia substancialmente semejante, pero ellos no han identificado el receptor asociado. El ligando ha sido llamado de varias maneras neutrokina-a (WO 98/18921, publicada el 7 de mayo de 1998), 63954 (WO 98/27114, publicada el 25 de junio de 1998), TL5 (EP 869 180, publicada el 7 de octubre de 1998), NTN-2 (WO 98/55620 y WO 98/55621, publicada 10 de diciembre de 1998), TNRLl-alfa (WO 9911791, publicada el 11 de marzo de 1999), ligando kay (W099/12964, publicada el 18 de marzo de 1999) , y AGP-3 (Solic. Prov. U.S. No. 60/119,906, presentada el 12 de febrero de 1999 y 60/166,271, presentada el 18 de noviembre de 1999, respectivamente) . Cada una de estas referencias es incorporada por el presente para referencia. Aquí posteriormente, esta secuencia de proteína es referida como "AGP-3". Un artículo reciente ha identificado dos proteínas conocidas previamente como receptores para AGP-3. Gross et al, (2000), Nature 404:995-9. El primer receptor fue identificado previamente como un receptor de la superficie del linfocito llamado Activador de la Transmembrana e Interaccionador de CAML (TACI) . Véase WO 98/39361, publicada el 11 de septiembre de 1998, y von Bulow & Bra (1997) , Science, 278:138-140, cada uno de los cuales es incorporado por el presente para referencia en su totalidad. De acuerdo con estas referencias, TACI se aglutina a un ligando de ciclofilina intracelular designado CAML, el cual modula la ruta de señalización del calcio en los linfocitos. El segundo receptor identificado para AGP-3 es la así llamada proteína de maduración de la célula B (BCMA) . El gen de BCMA humana fue descubierto por el análisis molecular de una translocación t(4;16), la cual es característica de un linfoma de la célula T humana. Laabi et al (1993), EMBO J. 11:3897-3904. El ARNm de BCMA se reportó que va a ser encontrado principalmente en los tejidos linfoides. El ADNc de BCMA humano codifica una proteína de 184 aminoácidos (185 residuos para el ratón) , y la literatura no reporta una semejanza obvia con ninguna proteína o porción conocida, y su función permanece desconocida. La proteína se reportó que radica en el aparato de Golgi (Gras et al (1995), Intl. Immunol. 7:1093-1106). La especulación reciente sugirió que BCMA puede ser un miembro lejano de la superfamilia de TNFR. Madry et al, (1998), Intl . Immunol . 10:1693-1702. Un ligando llamado APRIL o G70 es un ligando de la familia de TNF que permanece sin un receptor reportado en la literatura. De acuerdo con la literatura, APRIL está asociado con el cáncer de la próstata, cáncer del pecho, enfermedad de Alzheimer, trastornos inmune, trastornos inflamatorios, y anormalidades gestacionales . Véase WO 99/00518 (junio 26, "l997); WO 99/11791 (5 de septiembre de 1997); WO 99/12965 (12 de septiembre de 1997) ; .EP 911 633 (8 de octubre de 1997); EP 919 620 (26 de noviembre de 1997); WO 99/28462 (3 de diciembre de 1997); WO 99/33980 (30 de diciembre de 1997); WO 99/35170 (5 de enero de 1998); y Hahne et al, (1998), J. Exp. Med. 188: 1185-90. (Cada una de las referencias precedentes es incorporada aquí para referencia en su totalidad) . Un artículo reciente describió las isoformas de APRIL y sugirió que APRIL provoca la muerte celular. Kelly et al, (2000), Cáncer Res. 60:1021-7. El artículo podría beneficiarse de la identificación de un receptor para APRIL y una aclaración de su actividad.

Breve Descripción de la Invención Ahora se ha encontrado que sG70 (APRIL) se aglutina a los receptores de la superficie de la célula sobre las células del linfoma T y B conduciendo a la estimulación de la proliferación de las células B y T del ratón y humanas primarias tanto in vitro como in vivo. Ahora se ha encontrado que BCMA y TACI son receptores de la superficie de la célula para APRIL . También se ha encontrado que APRIL compite con la aglutinación de AGP3 a TACI y BCMA. Además, se mostró aquí que sBCMA inhibe la aglutinación de APRIL y AGP3 a sus receptores. sBCMA mejora las respuestas inmune humorales dependientes de la célula T e independientes de la célula T ' in vivo. Además ahora se ha encontrado, que sTACI inhibe la aglutinación de APRIL y AGP3 a sus receptores y mejora las respuestas inmune humorales dependientes de la célula T e independientes de la célula T in vivo. Además ahora se ha encontrado que sBCMA reduce el linfoma y el crecimiento del tumor de la célula de carcinoma del colon in vivo. También se ha encontrado que sBCMA incrementa la supervivencia y reduce la incidencia de proteinurea, y el desarrollo de anticuerpos anti-dsDNA en un modelo de animal de lupus . También se ha encontrado que el BCMA exhibe una semejanza con TACI dentro de un dominio rico en cisteína único localizado N-terminal con respecto a un dominio de la transmembrana potencial. También se ha encontrado que APRIL estimula el crecimiento de las células B y la producción de inmunoglobulina in vitro e in vivo. Además, el tratamiento con un anticuerpo anti-APRIL de bloqueo mejora la generación de la inmunoglobulina específica para el antígeno, sugiriendo que el APRIL endógeno es requerido para la inmunidad humoral in vivo . Esta invención se refiere a métodos novedosos de uso y composiciones de materia que explotan estos descubrimientos. Los descubrimientos proporcionan una estrategia para el desarrollo de métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, y cáncer, para la prevención del rechazo del trasplante. Estos descubrimientos muestran que la actividad, estados de enfermedad, y parámetros de enfermedad asociados con APRIL y AGP-3 pueden ser afectados por la modulación de BCMA. De manera semejante, los estados de enfermedad y los parámetros asociados con TACI pueden ser afectados por la modulación de APRIL . Además, tales estados de enfermedad y parámetros de enfermedad pueden ser afectados por la modulación de cualquier de TACI, BCMA, APRIL y AGP-3 conjuntamente. Este descubrimiento sugiere además moléculas y métodos de tratamiento por los cuales más de uno de TACI, BCMA, APRIL y AGP-3 pueden ser modulados por una molécula única.

Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la secuencia de APRIL humana (SEC ID NOS: 1 y 2) . Los codones de inicio y detención están subrayados. Las Figuras 2A y 2B muestran el ADN y las secuencias de aminoácidos de APRIL/G70 del ratón (SEC ID NOS: 3 y 4, respectivamente) . Los codones de inicio y detención están subrayados._ La secuencia de aminoácidos de APRIL del ratón soluble etiquetado con FLAG (SEC ID NO: 19) también es provista. La Figura 3 muestra una alineación de APRIL humano (SEC ID NO: 2) y del ratón (SEC ID NO: 23) . La línea media de cada hilera muestra la secuencia de consenso (SEC ID NO: 24) . Las Figuras 4A y 4B muestran que G70/APRIL es un estimulador potente para el linfoma de las células B y T. La Figura 4A muestra la estimulación dependiente de la dosis de la proliferación de las células Jurkat (células T leucémicas humanas), células de Raji (linfoma de Burkitt humano) y células K562 (células de leucemia mielogenosas crónicas humanas) . La proliferación de las células fue determinada incubando 3 x 104 células/cavidad en 100 µl del medio con la concentración indicada de SG70/APRIL recombinante y solución salada amortiguada con fosfato (PBS, sin ligando) como un control. Después de 48 horas, el número de células viables fueron medidas por el ensayo de proliferación Celltiter 96 AQ (Promega, Madison, Wl) . En la Figura 4B, la célula U937 (células de leucemia semejantes al monocito), NIH/3T3 (línea celular del embrión de ratón) y 293 (línea celular del riñon embrional primaria humana transformada) no responden a la estimulación de sG70/APRIL. Las Figuras 5A y 5B muestran el análisis de FACS de la aglutinación del receptor G70/APRIL. La expresión del receptor G70/APRIL fue evaluada sobre la línea celular indicada utilizando el anticuerpo monoclonal anti-Flag seguido por el anticuerpo de cabra conjugado con FITC al IgG del ratón. Un anticuerpo monoclonal CD16/CD32 anti-ratón (Bloque de Fc) fue utilizado para bloquear la unión no específica a las células. La Figura 6 muestra el efecto de SG70/APRIL sobre la proliferación de los granulocitos, célula B, y célula T de la sangre periférica humana. La célula T periférica humana (CD4+ y CD8+) , las células B y los granulocitos fueron purificados de tres diferentes donadores utilizando los anticuerpos de cóctel de RossetteSep (Stem Cell Tech. Vancouver) . Las células purificadas fueron cultivadas en las cavidades de plástico tratadas con el cultivo del tejido (Becton-Dickinson, Lincoln park, NJ) durante 6 días en el medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero de bovino fetal, L-glutamina 2 mM y 2-ME (50uM) en la concentración diferente presente de SG70/APRIL. Para el ensayo de proliferación de la célula B, las cavidades de plástico fueron recubiertas con anticuerpo monoclonal Ig M anti-humano de ratón purificado (3 µg/ml, Pharmingen, San Diego, CA) . El control positivo para la estimulación de la célula T es IL-2. La Figura 7 muestra el efecto de G70/APRIL sobre la proliferación de las células T y B in vitro. Las células T y B de los bazos de los ratones C57B1 fueron purificadas por la selección a través de columnas de enriquecimiento de la célula T y la célula B de murino. IxlO5 células por cavidad fueron cultivadas en la ausencia o presencia de varios G70/APRIL durante 48 horas, pulsadas durante las últimas 18 horas con 0.5 µCi 3H timidina y se colectaron para contar la radioactividad incorporada. La Figura 8 muestra el efecto de G70/APRIL sobre la proliferación de la célula T de murino coestimulada por medio de anticuerpo anti-CD28. Las células T de los bazos de los ratones C57B1 fueron purificadas por selección a través de una columna de enriquecimiento de la célula T de murino. lxlO5 células T por cavidad fueron tratadas con G70/APRIL en la presencia o ausencia de una concentración subliminal del anticuerpo anti-CD28 (0.9 µg/ml) durante 48 horas, pulsadas durante las últimas 18 horas con 0.5 µCi 3H timidina y se colectaron para contar la radioactividad incorporada. La Figura 9 muestra el efecto de G70/APRIL sobre la proliferación de la célula T de murino coestimulada por medio del anticuerpo anti-CD3. Las células T de los bazos de los ratones C57B1 fueron purificadas por selección a través de una columna de- enriquecimiento de la célula T de murino. IxlO5 células T por cavidad fueron tratadas con G70/APRIL en la presencia o ausencia de una concentración subliminal del anticuerpo anti-CD3 (0.9 µg/ml) durante 48 horas, pulsadas durante las últimas 18 horas con 0.5 µCi 3H timidina y se colectaron para contar la radioactividad incorporada. La Tabla 1 muestra el análisis de FACS del bazo (Tabla ÍA) , y los nodos linfáticos mesentéricos (Tabla IB) después de la administración sistémica in vivo de los miembros de la familia de TNF. Varios miembros de la familia de TNF han sido probados in vivo, cada grupo tiene 5 ratones (BDF-1, de 8 semanas de edad, Dosis: 1 mg/kg/día 0.2 ml durante 5 días) . El bazo, el timo y los nodos linfáticos mesentéricos de tres ratones de cada grupo han sido aislados por análisis FACS utilizando un panel de anticuerpos de marcación de la superficie de la célula T y la célula B. Los resultados del análisis de FACS han sido resumidos como las tablas siguientes. Las Figuras 10A y 10B muestran la secuencia de BCMA humano (SEC ID NO: 5) . El dominio extracelular de BCMA (SEC ID NO: 6) se extiende desde aa 1 hasta aa 51 y está identificado por flechas. La región de consenso rica en cisteína (SEC ID NO: 7, descrita adicionalmente aquí posteriormente) es mostrada en negritas. La región de la transmembrana (SEC ID NO: 8) está subrayada. huBCMA-Fc (SEC ID NO: 9) . mBCMA-Fc (SEC ID NO: 10) . La Figura 11 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de BCMA humano y la secuencia de aminoácidos de BCMA de murino (SEC ID NO: 11) . La secuencia humana es mostrada sobre la línea superior, la de murino sobre la línea inferior en cada hilera. La secuencia de consenso de humano- urino (SEC ID NO: 12) aparece como la. línea media de cada hilera. Un "+" en la secuencia de consenso indica una substitución conservadora. La porción rica en cisteína de la secuencia de consenso (SEC ID NO: 13) parece en negritas. Las Figuras 12A y 12B muestran la secuencia de hTACI (SEC ID NO: 14) . El dominio extracelular de TACI (SEC ID NO: 15) se extiende desde aa 1 hasta aa 166. La región de consenso rica en cisteína (SEC ID NO: 16) es mostrada en negritas, y la región de la transmembrana (SEC ID NO: 17) está subrayada. hTACI-Fc (SEC ID NO: 18) . La Figura 13 muestra una alineación de las regiones extracelulares ricas en cisteína de TACI humana y BMCA humana. La región de consenso rica en cisteína de BCMA (SEC ID NO: 20) aparece en la línea superior, la región de consenso rica en cisteína de TACI (SEC ID NO: 21) aparece en la línea inferior de cada hilera. Los residuos de aminoácidos conservados están indicados por una barra vertical (I) . Los residuos de aminoácidos relacionados están indicados con dos puntos ( : ) . Las Figuras ?4A, 14B y 14C muestran la aglutinación de G70/APRIL de ratón soluble a las células 293 que expresan el gen BCMA. Las células 293 humanas transfectadas con los vectores p BCMA y pcDNA3 fueron incubadas con G70/APRIL-Flag, seguido por teñido con el anticuerpo anti-Flag conjugado de FITC para el análisis de FACS. A. Las células 293 transfectadas con el vector pcD?A3 solamente. B. Las células 293 transfectadas con el vector pmBCMA antisentido. La Tabla 2 muestra el análisis de BIACore de las características cinéticas de aglutinación estequiométrica de APRIL y AGP-3 a BCMA y TACI. Flag-APRIL se aglutina específicamente al BMCA de murino y humana con afinidades de 0.25 nM y 0.29 nM, respectivamente, y a TACI humana con una afinidad de 1.48 nM. También una versión más larga de APRIL etiquetado con Flag (aa 50-240) se aglutina a BCMA y TACI con una afinidad elevada semejante a aquella de Fc-AGP-3 (Tabla 2) . En experimentos separados, se determinó que ni el APRIL ni AGP-3 se aglutinan a OPG y también que T?Fa, OPGL, LIGHT, TWEAK, y TRAIL no se aglutinan a BCMA o TACI . Por consiguiente, APRIL y AGP-3 se aglutinan específicamente tanto a BCMA como TACI con afinidad elevada. Las Figuras 15A y 15B muestran G70/APRIL que se aglutina a las células 293 que se expresan en el gen hTACI . Las células 293 humanas transfectadas con los vectores phTACI y pcDNA3 fueron incubadas con G70/APRIL-Flag, seguido por teñido del anticuerpo anti-Flag conjugado con FITC para el análisis de FACS. En la Figura 15A, las células 293 fueron transfectadas con el vector phTACI. En la Figura 15B, las células 293 fueron transfectadas con el vector pcDNA3 únicamente. Las Figuras 16 A, B, C y D muestran que G70/APRIL bloquea completamente la aglutinación de AGP3 a su receptor. Las células A20 del linfoma B del ratón fueron teñidas con AGP3-FC o un exceso de más de 10 veces de G70/APRIL, el ligando CD40, el ligando TRAIL y Tweak. Después de lavado 3 veces, las células fueron incubadas con anticuerpo secundario de IgG-Fc anti-humano de cabra conjugado con FITC. En la Figura 16A, 10 veces de G70/APRIL bloquearon completamente la aglutinación de AGP3 a las células A20. en las Figuras 16B, C y D, 10 veces del ligando CD40, Tweak y TRAIL no tienen este efecto sobre la aglutinación de AGP3. Las Figuras 17 A, B y C muestran que la aglutinación del receptor TACI soluble (sTACI) compite con la aglutinación de G70/APRIL a las células A20. Las células A20 fueron incubadas con G70/APRIL o al mismo tiempo más 10 veces TACI soluble, el receptor TRAIL R2 y TRAIL R3, seguido por el teñido del anticuerpo anti-Flag conjugado con FITC para el análisis de FACS. En la Figura 17A, el receptor TACI soluble compitió parcialmente en la aglutinación de G70/APRIL que se aglutina a las células A20. En las Figuras 17B y C, los receptores TRAIL R2 y TRAIL R3 solubles no interfirieron con la aglutinación de G70/APRIL. Lá Figura 18 muestra que la proteína de fusión del receptor de BCMA-Fc humano soluble (shBCMA-Fc) y la proteína de fusión del receptor TACI-Fc humano soluble (shTACI-Fc) bloquea completamente la aglutinación de la proteína de fusión del receptor AGP-3-Fc humano soluble (shAGP3-Fc) a las células A20. Las células A20 fueron incubadas con shAGP3-Fc o al mismo tiempo 10 veces más de shBCMA-Fc o shTACI-Fc seguido por teñido con anticuerpo anti-Flag conjugado con FITC para análisis de FACS. La Figura 19A muestra que el shBCMA-Fc bloquea completamente la aglutinación de shAGP3-Fc a las células A20. Las células A20 fueron incubadas con shAGP3-Fc con o sin 10 veces del hBCMA-Fc soluble seguido por teñido con anticuerpo anti-Flag conjugado con FITC para análisis de FACS. La Figura 19B muestra que el shBCMA-Fc bloquea la aglutinación de AJPRIL de murino soluble (smAPRIL) a las células A20. Las células A20 fueron incubadas con smAPRIL con o sin 10 veces del shBCMA-Fc soluble seguido por teñido con anticuerpo anti-Flag conjugado con FITC para análisis de FACS. La Figura 20 muestra los niveles en el suero de IgG anti-KLH e IgM e IgM anti-Pneumovax en ratones tratados con proteínas de fusión de TACI-Fc o BCMA-Fc o Fc no . fusionado como un control. Los valores de p se refieren a la comparación con el grupo tratado con Fc. n = 7. Véase la sección de Materiales y Métodos aquí posteriormente. La Figura 21 muestra la secuencia de Fc-APRIL humana. La Figura 22 muestra el efecto de Fc-APRIL humana y AGP3 humana/BlyS/Tall-1 humana soluble sobre la proliferación de las células B de murino primarias. Las células B del bazo del murino purificadas fueron cultivadas en la presencia de varias cantidades de Fc humana-APRIL y AGP3 sin etiquetar más 2 µg/ml de anti-lgM. Los datos muestran la incorporación de 3H timidina como cpm, y representa el promedio de las cavidades por triplicado. La Figura 23 muestra que el hBMCA-Fc y hTACI-Fc inhiben la proliferación de las células B del ratón mediadas por mAPRIL-Flag. Las células B del bazo del murino purificadas fueron cultivadas con las cantidades indicadas de BCMA-Fc soluble y TACI-Fc en la presencia de 10 ng/ml de Flag-mAPRIL y 2 µg/ml de un anti-lgM durante 72 h. La incorporación de 3H timidina está indicada como cpm. Los datos mostrados representan el promedio de las cavidades por triplicado. La Figura 24 muestra que la administración de hBCMA-Fc (15 mg/kg intraperitonealmente (ip_ el día 0, 3, y 6) reduce los niveles de las células B de la sangre periférica del ratón en el día siete. Los ratones normales (n=7) fueron tratados con BCMA-Fc humana y Fc no fusionada como un control en el día 0, 3, y 6 (15 mg/kg) . Los niveles de la célula B de la sangre periférica fueron medidos el día 7. La Figura 25 muestra que la administración de shBCMA-Fc (15 mg/kg ip el día 0, 3, y 6) reduce los niveles de las células B del bazo del ratón medidos en el día siete. La Figura 26 muestra que la producción de IgA mediada por Flag-mAPRIL y hAGP3 es inhibida por hBCMA-Fc y hTACI-Fc in vitro. Las células B del bazo del murino purificadas fueron cultivadas con LPS (100 ng/ml), AGP3 (10 ng/ml), Flag-APRIL (10 ng/ml) o más BCMA-Fc (100 ng/ml) y TACI-Fc (100 ng/ml) durante 12 días. Los sobrenadantes del cultivo fueron colectados el día 7 y el día 12 para detectar el nivel de IgA. La Figura 27 muestra que la producción de IgG mediada por Flag-mAPRIL y hAGP3 es inhibida por hBCMA-Fc y hTACI-Fc in vi tro . La Figura 28 muestra los niveles de IgA e IgE totales reducidos en los ratones normales tratados con mBCMA-Fc y hTACI-Fc truncado (5 mg/kg ip el día 0, 3, y 6) . Los ratones normales (n=7) fueron tratados con BCMA-Fc humana, TACI-Fc truncada y Fc no fusionada como un control en el día 0, 3, y 6 (5 mg/kg) . Los niveles de inmunoglobulina en el suero fueron medidos el día 7. La Figura 29 muestra que el tratamiento con hBCMA-Fc o hTACI-Fc truncada reduce los niveles de IgM específicos anti-Pneu ovaxs en los ratones normales. Los ratones normales (n=7) fueron tratados con BCMA-Fc humana, TACI-Fc truncada y Fc no fusionada como un control a las dosis diarias de 0.5 mg/kg a 15 mg/kg durante 7 días. En la preinmunización anti-KLH y anti-Pneumovax fueron indetectables . Los anticuerpos fueron medidos el día 7 y el día 14. La Figura 30 muestra que el anticuerpo monoclonal #cl9 específico de anti-mAPRIL inhibe la proliferación de las células B del ratón mediadas por Flag-mAPRIL . Las células B del bazo del murino purificadas fueron cultivadas en la presencia de 10 ng/ml de mFlag-APRIL más 2 ug/ml de anti-IgM. Los controles de IgG de la rata y del anticuerpo c-19 monoclonal anti-Flag-APRIL fueron agregados en el cultivo al mismo tiempo. Los datos muestran la incorporación de 3H timidina como cpm, y representan el promedio de las cavidades por triplicado. La Figura 31 muestra que el tratamiento con el anticuerpo monoclonal #cl9 específico de anti-mAPRIL inhibe la generación de anticuerpos específicos anti-Pneumovacs in vivo. La Figura 32 muestra que el tratamiento con hBCMA-Fc incrementa la supervivencia en el modelo del ratón NZB/NZWF1 de SLE . La Figura 33 muestra que el tratamiento con hBCMA- Fc reduce la incidencia de la proteinurea en el modelo de ratón de NZB/NZWF1 de SLE. La Figura 34 muestra que el tratamiento con hBCMA- Fc reduce los niveles de anticuerpos específicos anti-dsDNA en el modelo del ratón de NZB/NZWF1 de SLE. La Figura 35 muestra que el tratamiento con hBCMA-Fc reduce el porcentaje de las células B en la sangre periférica en el modelo del ratón de NZB/NZWF1 de SLE. La Figura 36 muestra que APRIL se aglutina a varias líneas celulares del tumor. La aglutinación de APRIL a las lineas de la célula del tumor humano fue determinada incubando la célula con lug/ml de Fc-APRIL o Flag-APRIL a continuación del teñido del anticuerpo secundario con FITC y análisis de FACS. La Figura 37 muestra que APRIL estimula el crecimiento de las células U266-B1 y que esto puede ser inhibido por BCMA-Fc o TACI-Fc. Las células U266 fueron cultivadas en la presencia de lOng/ml de Fc-APRIL humano o más 50 ng/ml de BCMA-Fc soluble, TACI-Fc truncada durante 48 h. La incorporación de 3H timidina está indicada como cpm. Los datos mostrados representan el promedio de las cavidades por triplicado. La Figura 38 muestra que APRIL estimula el crecimiento de las células A20 del linfoma B del ratón y que esto puede ser inhibido por BCMA-Fc o TACI-Fc. El linfoma de las células B del ratón A20 fueron cultivadas en la presencia de 50 ng/ml de Flag-APRIL de ratón, Flag Humana-AGP3 o más 100 ng/ml de BCMA-Fc soluble durante 48 h. La incorporación de 3H timidina está indicada como cpm. Los datos mostrados representan el promedio de las cavidades por triplicado. La Figura 39 muestra que el tratamiento con BCMA-Fc reduce el crecimiento de las células del tumor del linfoma B de A20 en los ratones Balb/c. Las células A20 (0.2 millones) fueron implantadas, id, el día 0. Los tratamientos con PBS, CHO-Fc, BCMA-Fc, hBCMA-Fc, mTACI-Fc, hTACI-Fc fueron provistos (10 mg/kg, ip) en los días 0, 7, 10, 13, 16, 19, 22. Las mediciones del tumor fueron hechas dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados los días 27-31, los tumores fueron congelados rápidamente para aislamiento del ARN, la sangre fue colectada y las muestras del suero fueron congeladas . La Figura 40 muestra que el tratamiento con hBCMA-Fc reduce el crecimiento del volumen del tumor de la línea celular HT29 del carcinoma del colon humano en los ratones. 2xl06 células más 50% de matrigel se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos. Rx: BCMA-Fc humana a 2, 5, y 15 mg/kg de Q2D, iniciando el día 0 (n=10 /grupo). Control 1: CHO-Fc a 15 mg/kf Q2D. Control 2: 0.2 ml de PBS Q2D IP. Volumen del tumor: 3/semana, desde el día 7. El tumor se pesó al final del estudio. Peso corporal 2/semana. La Figura 41 muestra que el tratamiento con BCMA-Fc reduce el crecimiento del volumen del tumor de la línea celular HT29 del carcinoma del colon humano en los ratones. 2xl06 células más 50% de matrigel se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos. Rx: BCMA-Fc de ratón a 2, 5, y 15 mg/kg de Q2D, iniciando el día 0 (n=10 /grupo) . Control 1: CHO-Fc a 15 mg/kg Q2D. Control 2: 0.2 ml de PBS Q2D IP. Volumen del tumor: 3/semana, desde el día 7. El tumor se pesó al final del estudio. Peso corporal 2/semana.

Descripción Detallada de la Invención Definición de los Términos Los términos utilizados de principio a fin de esta especificación están definidos como sigue, a menos que estén limitados de otra manera en casos específicos. El término "que comprende" significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales sobre cualquiera o ambas de las terminaciones N o C de la secuencia dada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir significativamente con la actividad del compuesto.

"Actividad de AGP-3" se refiere a la modulación del crecimiento de la célula, la supervivencia, o la activación que resulta de la aglutinación por el AGP-3 humano natural a TACI o BCMA, particularmente en las células B. Por el contrario, "actividad antagonista de AGP-3" se refiere a la actividad en oposición a la actividad de AGP-3, como podría resultar, por ejemplo, por la inhibición de la aglutinación de AGP-3 a TACI o BCMA. Tal actividad puede ser determinada, por ejemplo, por ensayos tales como los descritos en "Actividad biológica de AGP-3" en la sección de Materiales y Métodos de PCT/US00/03653, la cual es incorporada aquí para referencia. Los ensayos adicionales por los cuales pueden ser identificada la actividad de AGP-3 aparecen en las referencias W098/18921 (7 de mayo de 1998); WO 98/27114 (25 de junio de 1998); EP 869 180 (7 Octubre 1998); WO 98/55620 y WO 98/55621 (10 de diciembre de 1998); WO 99/11791 (11 de marzo de 1999) ; W099/12964 (18 de marzo de 1999) ; y Gross et al, (2000), Nature 404:995-9. Cualquiera de los ensayos descritos allí pueden ser modificados cuando sea necesario por los métodos conocidos por las personas que tienen experiencia ordinaria en el arte. "Actividad de APRIL" se refiere a la modulación del crecimiento, supervivencia, o activación de la célula, que resulta de la aglutinación de APRIL humana natural a TACI o BCMA, particularmente en las células T. Por el contrario, "actividad antagonista de APRIL" se refiere a la actividad en oposición a la actividad de APRIL, como podría resultar, por ejemplo, por la inhibición de la aglutinación de APRIL a TACI o BCMA. Tal actividad puede ser determinada, por ejemplo, por ensayos tales como los descritos en la Sección de Materiales y Métodos aquí posteriormente. Los ensayos adicionales por los cuales la actividad de APRIL puede ser identificada, aparecen en las referencias WO 99/00518 (26 de junio de 1997); WO 99/11791 (5 de septiembre de 1997); WO 99/12965 (12 de septiembre de 1997); EP 911 633 (8 de octubre de 1997); EP 919 620 (26 de noviembre de 1997); WO 99/28462 (3 de diciembre de 1997); WO 99/33980 (30 de diciembre de 1997); WO 99/35170 (5 de enero de 1998); y Hahne et al, (1998), J. Exp. Med. 188: 1185-90. Cualquiera de los ensayos descritos allí y aquí pueden ser modificados cuando sea necesario por los métodos conocidos por las personas que tienen experiencia ordinaria en el arte. La "actividad de BCMA" se refiere a la modulación del crecimiento, la supervivencia, o la activación de la célula que resulta de la aglutinación por APRIL humana natural o AGP-3 humana natural a BCMA. Por el contrario, "actividad antagonista de BCMA" se refiere a la actividad en oposición a la actividad de BCMA, como podría resultar, por ejemplo, por la inhibición de la aglutinación de AGP-3 o APRIL a BCMA. Tal actividad puede ser determinada, por ejemplo, por ensayos tales como los descritos en la Sección de Materiales y Métodos aquí posteriormente. Los ensayos adicionales por los cuales la actividad de BCMA puede ser identificada aparecen en las referencias WO 99/00518 (26 de junio de 1997); WO 99/11791 (5 de septiembre de 1997); WO 99/12965 (12 de septiembre de 1997); EP 911 633 (8 de octubre de 1997); EP 919 620 (26 de noviembre de 1997); WO 99/28462 (3 de diciembre de 1997); WO 99/33980 (30 de diciembre de 1997); WO 99/35170 (5 de enero de 1998); Hahne et al, (1998), J. Exp. Med. 188: 1185-90; WO 98/18921 (7 de mayo de 1998); WO 98/27114 (25 de junio de 1998); EP 869 180 (7 Octubre 1998); WO 98/55620 y WO 98/55621 (10 de diciembre de 1998); WO 99/11791 (11 de marzo de 1999); W099/12964 (18 de marzo de 1999); y Gross et al, (2000), Nature 404:995-9. Cualquiera de los ensayos descritos allí y aquí pueden ser modificados cuando sea necesario por los métodos conocidos por las personas que tienen experiencia ordinaria en el arte. "Actividad de TACI" se refiere a la modulación, supervivencia, o activación de la célula, que resulta de la aglutinación por AGP-3 humana natural o APRIL humana natural a TACI. Por el contrario, "actividad antagonista de TACI" se refiere a la actividad en oposición a la actividad de TACI, como podría resultar, por ejemplo, por la inhibición de la aglutinación de AGP-3 o APRIL a TACI. Tal actividad puede ser determinada, por ejemplo, por ensayos tales como los descritos en la Sección de Materiales y Métodos de PCT/USOO/03653, WO 98/18921 (7 de mayo de 1998), WO 98/27114 (25 de junio de 1998); EP 869 180 (7 Octubre 1998); WO 98/55620 y WO 98/55621 (10 de diciembre de 1998); WO 99/11791 (11 de marzo de 1999); W099/12964 (18 de marzo de 1999); WO 98/39361 (11 de septiembre de 1998), von Bulow & Bra (1997), Science, 278:138-140, y Gross et al, (2000), Nature 404:995-9. Cualquiera de los ensayos descritos allí y aquí pueden ser modificados cuando sea necesario por los métodos conocidos por las personas que tienen experiencia ordinaria en el arte. El término "participe de aglutinación especifica" se refiere a cualquier molécula que se aglutina preferentemente a una proteína de interés, sin importar la actividad antagonista o agonista de la molécula hacia la proteína de interés. Los partícipes de aglutinación específica ejemplares incluyen los anticuerpos, receptores solubilizados, péptidos, péptidos modificados como se describen aquí posteriormente, y semejantes. El término "vehículo" se refiere a una molécula que previene la degradación y/o incrementa la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o incrementa la actividad biológica de una proteína terapéutica. Los vehículos ejemplares incluyen un dominio de Fc (el cual es preferido) así como un polímero lineal (por ejemplo polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrano, etc.); un polímero de cadena ramificada (véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 4,289,872 de Denkenwalter et al, expedida el 15 de septiembre de 19~81; 5,229,490 de Tam, expedida el 20 de julio de 1993; WO 93/21259 por Frechet et al, publicada el 28 de octubre de 1993) ; un lípido; un grupo de colesterol (tal como un esteroide) ; un carbohidrato u oligosacárido; o cualquier proteína, polipéptido o péptido, natural o sintético, que se aglutina a un receptor de salvamento. Los vehículos son descritos adicíonalmente aquí posteriormente. El término "Fc natural" se refiere a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de aglutinación sin antígeno que resulta de la digestión del anticuerpo completo, ya sea en la forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original del Fc natural es preferentemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque IgGl e IgG2 son preferidas. Los Fc naturales están compuestos de polipéptidos monoméricos que pueden ser enlazados en formas di éricas o multiméricas por asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) y no covalente. El número de enlaces de disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas de Fc naturales varía desde 1 hasta 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, I A, IgE) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2) . Un ejemplo de un Fc natural es un dímero unido al disulfuro que resulta de la digestión de papaína de un IgG (véase Ellison et al, (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9). El término "Fc natural" como se utiliza aquí es genérico para las formas monoméricas, di éricas, y multiméricas . El término "variante de Fc" se refiere a una molécula o secuencia que es modificada a partir de un Fc natural pero todavía comprende un sitio de aglutinación para el receptor de salvamento, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34631 (publicada el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32478 describe variantes de Fc ejemplares, así como una interacción con el receptor de salvamento, y por el presente son incorporadas para referencia. Por consiguiente, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que es humanizada a partir de un Fc natural no humano. Además, un Fc natural comprende sitios que pueden ser removidos a causa de que los mismos proporcionan características estructurales o una actividad biológica que no son requeridos para las moléculas de fusión de la presente invención. Por consiguiente, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fc naturales que afectan o están involucrados en (1) la formación de un enlace de disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula huésped seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal durante la expresión en una célula huésped seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) aglutinación a un receptor de Fc diferente de un receptor de salvamento, o (7) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Las variantes de Fc son descritas con detalle adicional en WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000, la cual es incorporada por el presente para referencia en su totalidad. . El término "dominio de Fc" abarca moléculas y secuencias de Fc natural y de variantes de Fc como se definieron anteriormente. Como con las variantes de Fc y los Fes naturales, el término "dominio de Fc" incluye moléculas en la forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas con el anticuerpo completo o producidas por otros medios. El término "multímero" como se aplica a los dominios de Fc o moléculas que comprenden los dominios de Fc, se refieren a moléculas que tienen dos o más cadenas de poiipéptidos asociadas covalentemente, no covalentemente, o por interacciones tanto covalente como no covalentes. Las moléculas de IgG típicamente forman dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros, o tetrámeros. Los multímeros pueden ser formados explotando la secuencia y de la actividad resultante de la fuente de Ig natural del Fc o por derivación (como se define posteriormente) de tal Fc natural. El término "dímero" cuando se aplica a los dominios de Fc o moléculas que comprenden los dominios de Fc, se refiere a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptidos asociadas covalente o no covalentemente. Los términos "derivación" y "derivado" o "que es derivado" comprenden procesos y compuestos resultantes respectivamente en los cuales (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, la reticulación entre los residuos de cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto es reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo de cisteinilo y por consiguiente forma dímeros reticulados en el cultivo o in vivo; (3) uno o más enlaces de peptidilo son reemplazados por un enlace diferente del peptidilo; (4) la terminación N es reemplazada por -NRR1, NRC OJR1, -NRCÍOJOR1, - RSfO^R1, -NHC (O) NHR, un grupo succinimida, un benciloxicarbonil-NH-substituido o no substituido, en donde R y R1 y los substituyentes del anillo son como se definen aquí posteriormente; (5) la terminación C es reemplazada por -C(0)R2 o -NR3R4 en donde R2, R3 y R4 son como se definen aquí posteriormente; y (6) compuestos en los cuales las porciones de aminoácidos individuales son modificadas a través de tratamiento con agentes capaces de reaccionar con las cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Los derivados son descritos aquí posteriormente de manera adicional . El término "péptido" se refiere a moléculas de 2 a 40 aminoácidos con las moléculas de 3, a 20 aminoácidos que son preferidas y aquellas de 6 a 15 aminoácidos más preferidas. Los péptidos ejemplares pueden ser generados al azar por cualquiera de los métodos citados anteriormente, llevados en un banco de péptidos (por ejemplo, un banco de exhibición del fago) , o derivados por digestión de las proteínas . El término "al azar" como es utilizado se refiere a las secuencias de péptidos que se refieren a las secuencias al azar completas (por ejemplo, seleccionadas por los métodos de exhibición del fago) y las secuencias en las cuales uno o más residuos de una molécula que están presentes de manera natural son reemplazados por un residuo de aminoácido que no aparece en esta posición en la moléculas que está presente de manera natural. Los métodos ejemplares para la identificación de las secuencias de péptidos incluyen la exhibición del fago, la exhibición de E. coli, la exhibición del ribosoma, la selección a base de levadura, la sección del péptido de ARN, la selección química, el diseño racional, el análisis estructural de la proteína, y semejantes. Los péptidos y los métodos de generación de los mismos aparecen en WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000, la cual es incorporada por el presente para referencia. El término "farmacológicamente activo" significa que una substancia así descrita se determinó que tiene una actividad que afecta un parámetro médico (por ejemplo, la proliferación de la célula T) o un estado de enfermedad (por ejemplo, cáncer, trastornos autoinmunes) . Por consiguiente, los compuestos activos farmacológicamente comprenden compuestos agonistas o miméticos o antagonistas como se definen posteriormente. Los términos "-mimético" y "agonista" se refieren a una molécula que tiene actividad biológica comparable con una proteína (por ejemplo, APRIL, AGP-3) que interactúa con una proteína de interés. Estos términos incluyen además moléculas que indirectamente imitan la actividad de una proteína de interés, tales como por la potenciación de los efectos del ligando natural de la proteína de interés. Los términos "antagonista" o "inhibidor" se refieren a una molécula que bloquea o de alguna manera interfiere con la actividad biológica de la proteína asociada de interés, o tiene una actividad biológica comparable con un antagonista o inhibidor conocido de la proteína de interés. Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención también están abarcados aquí. Por "sales fisiológicamente aceptables" es entiende cualesquiera sales que sean conocidas o que se descubra posteriormente que van a ser farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos específicos son: acetato; trifluoroacetato; hidrohaluros, tales como clorhidrato y bromhidrato; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato, Métodos de tratamiento La presente invención se refiere a un método de inhibición de la proliferación de la célula T en un mamífero, el cual comprende la administración de un agente terapéutico que comprende: a. un partícipe de aglutinación específica para TACI, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad antagonista de TACI; b. un partícipe de aglutinación específica para BCMA, en donde el partícipe de aglutinación especifica tiene una actividad antagonista de BCMA; c. ambos de a y b; o d. un partícipe de aglutinación específica para TACI y BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad antagonista de TACI, una actividad antagonista de BCMA o ambos . La presente invención también se refiere a un método de inhibición de la actividad de APRIL en un mamífero, el cual comprende administrar un agente terapéutico que comprende a a d anteriores. La invención también se refiere a un método de inhibición de la actividad de TACI, la actividad de BCMA, o ambos en un mamífero, el cual comprende administrar un partícipe de aglutinación específica para APRIL . Este método puede comprender además la administración de un partícipe de aglutinación específica para AGP-3. Algunas indicaciones se benefídan de un incremento en la respuesta inmune. En consecuencia, la invención se refiere además a un método para incrementar la proliferación de la célula T en un mamífero, el cual comprende administrar un agente terapéutico que comprende: a. un partícipe de aglutinación especifica para TACI, en donde el participe de aglutinación específica tiene una actividad agonista de TACI; b. un partícipe de aglutinación específica para BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad agonista de BCMA; c. ambos de a y b; o d. un partícipe de aglutinación específica para TACI y BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad agonista de TACI, una actividad agonista de BCMA o ambos. La invención también se refiere a un método para incrementar la actividad de APRIL en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende a a d anteriores. Los inventores contemplan llevar a cabo los métodos precedentes de tratamiento con cualquiera de varios tipos de moléculas diferentes, incluyendo moléculas pequeñas, anticuerpos, y péptidos diseñados y moléculas de fusión descritos aquí posteriormente. Estas moléculas también pueden ser utilizadas en ensayos para identificar las células y tejidos que expresan AGP-3, TACI, APRIL, o BCMA. La invención se refiere además a ácidos nucleicos, vectores, y células huésped útiles en la preparación de tales moléculas. La invención se refiere además a métodos de identificación de los compuestos que son útiles en los métodos de uso mencionados anteriormente. Tales compuestos incluyen ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos o moléculas orgánicas de peso molecular pequeño y pueden actuar ya sea como agonistas o antagonistas de la actividad de la proteína de BCMA, TACI, AGP-3 o APRIL . AGP-3, APRIL, BCMA, y TACI se cree que desempeñan un papel en la regulación de la función inmune. En consecuencia, estas moléculas, sus formas solubles, y agonistas y antagonistas de los mismos pueden ser útiles para el diagnóstico y/o tratamiento de la inflamación y las enfermedades de la función inmune. Las indicaciones para las antagonistas incluyen, pero no están limitadas a las siguientes: infecciones tales como infecciones bacterianas, fungosas, de protozoarios y virales, especialmente VTH-1 o VIH- 2 ; diarrea; psoriasis ; inflamación; alergias; dermatitis atópica; enfermedades alérgicas respiratorias tales como el asma, rinitis alérgica, enfermedad de hipersensibilidad de los pulmones, neumonitis hipersensible, neumonía eosinofílica (por ejemplo el síndrome de Loeffler, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad del pulmón intersticial (ILD), tales como la fibrosis pulmonar idiopática o ILD asociada con la artritis xeumatoide, lupus erythematosus sistémico, espondilitis anquilosante, escleroris sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis) ; anafilaxis sistémica o respuestas de hipersensibilidad; alergia a los fármacos; alergia por picadura de insecto; enfermedad inflamatoria del intestino, tal como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa; espondiloartropatía; escleroderma; psoriasis; dermatosis inflamatoria tal como dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica, urticaria, vasculitis (por ejemplo vasculitis necrotizante, cutánea e hipersensible) , miositis eosinofílica y fasciitis eosinofílica; las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide, artritis psoriática, esclerosis múltiple, lupus erythematosus sistémico, myasthenia gravis, diabetes de inicio juvenil, glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune y enfermedad de Behcet; rechazo de injerto, incluyendo el rechazo de aloinjerto o la enfermedad del huésped contra el injerto; cánceres con infiltración de leucocitos de la piel o los órganos; lesiones por reperfusión; aterosclerosis; . ciertas malignidades hematológicas; choque, incluyendo choque séptico y choque endotóxico. Los agonistas pueden ser utilizados para el tratamiento de: . inmunosupresión por ejemplo en los pacientes con SIDA o indviduos que padecen terapia por radiación, quimioterapia, terapia para enfermedad autoinmune u otra terapia de fármaco, e inmunosupresión debida a deficiencia congénita en la función del receptor u otras causas; y enfermedades infecciosas tales como enfermedades parasíticas, incluyendo infecciones por helmintos, tales como nemátodos (gusanos redondos) .

Composiciones de Materia Cualquier número de moléculas pueden servir como partícipes de aglutinación específica dentro de la presente invención. Son de interés particular los anticuerpos, péptidos, y moléculas de fusión del Fc-péptido.

Anticuerpos La invención también proporciona un anticuerpo o dominio de aglutinación del antígeno del mismo, o un fragmento, variante, o derivado del mismo, el cual se aglutina a un epítope sobre cualquiera de las moléculas objetivo (APRIL, AGP-3; TACI, o BCMA) y tiene una actividad agonista o antagonista parcial o completa. Preferentemente, la molécula objetivo es de mamífero, más preferentemente de ser humano, y puede ser soluble o en las formas asociadas de la superficie de la célula, o fragmentos, derivados y variantes de los mismos. Ya se conocen en el arte varios métodos para la generación de anticuerpos. La totalidad de tales métodos son útiles en la generación de moléculas útiles de acuerdo con la presente invención. Convencionalmente, un anticuerpo puede ser preparado inmunizando un animal con la molécula objetivo (por ejemplo BCMA o TACI de murino o de ser humano) o con un fragmento inmunogénico, derivado o variante del mismo. Además, un animal puede ser inmunizado con células transfectadas con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula objetivo de tal modo que la molécula objetivo sea expresada y asociada con la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, los partícipes de aglutinación específica que son anticuerpos pueden ser obtenidos por la selección de un banco que comprende las secuencias del dominio de aglutinación del anticuerpo o del antígeno para aglutinación a la molécula de objetivo. Tal banco es preparado convenientemente en el bacteriófago como las fusiones de la proteína o péptido a una proteína recubierta con el bacteriófago, las cuales son expresadas sobre la superficie de las partículas del fago ensambladas y la secuencias de ADN de codificación contenidas dentro de las partículas del fago (así llamado "banco de exhibición del fago") . En un ejemplo, un banco de exhibición del fago contiene secuencias de ADN que codifican anticuerpos humanos, tales como cadenas ligeras y pesadas variables. Las secuencias que se aglutinan a la molécula objetivo pueden ser evolucionadas adicionalmente por rondas múltiples de mutagénesis y selección. Los partícipes de aglutinación específica que son antígenos o dominios de aglutinación del antígeno pueden ser glicoproteínas tetraméricas semejantes a los anticuerpos naturales, o los mismos pueden ser anticuerpos de cadena sencilla; por ejemplo, fragmentos Fc, Fab, Fab' o F(ab)', anticuerpos biespecíficos, heteroanticuerpos, u otros fragmentos, variantes, o derivados de los mismos, los cuales son capaces de aglutinación a la molécula objetivo y neutralizar parcial o completamente la actividad de la molécula objetivo. Los anticuerpos o dominios de aglutinación del antígeno pueden ser producidos en las líneas celulares del hibridoma (células que producen anticuerpos tales como las células del bazo fusionadas a las células del mieloma del ratón, por ejemplo) o pueden ser producidas en -las líneas celulares heterólogas con las moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio de aglutinación del anticuerpo o del antígeno. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales, policlonales monoespecíficos, monoclonales, recombinantes, quiméricos, humanizados, completamente humanos, de cadena sencilla y/o biespecíficos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen aquellas porciones de un anticuerpo que se aglutinan a un epítope sobre una molécula objetivo. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen los fragmentos Fab F(ab'), F(ab)', Fv, y sFv. Los anticuerpos pueden ser generados por la segmentación enzimática de los anticuerpos de longitud total o por técnicas de ADN recombinantes, tales como la expresión de los plás idos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican regiones variables del anticuerpo. Los anticuerpos policlonales son .poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas del suero de los animales inmunizados con un antígeno. Un antigeno es una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida o aglutinada por un anticuerpo el cual es capaz adicionalmente de inducir a un animal para que produzca un anticuerpo capaz de aglutinación a un epítope de este antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopes. La reacción específica referida anteriormente se entiende que indica que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos los cuales pueden ser evocados por otros antígenos. Los anticuerpos policlonales dirigidos hacía una molécula objetivo generalmente son realzados en animales (por ejemplo, conejos o ratones) por inyecciones intraperitoneales o subcutáneas múltiples de la molécula objetivo y un adyuvante. De acuerdo con la invención, puede ser útil conjugar la molécula objetivo, o una variante, fragmento, o derivado del mismo con una proteína portadora que es inmunogénica en las especies que van a ser inmunizadas, tales como la hemocianina de lapa marina, el suero, la albúmina, tiroglobulina de bovino, o el inhibidor de tripsina de soya. También, los agentes de agregación tales como el alumbre son utilizados para mejorar la respuesta inmune. Después de la inmunización, a los animales se les extrae sangre y el suero es evaluado para verificar la concentración del anticuerpo anti-obj etivo . Los anticuerpos monoclonales (mAbs) contienen una población substancial ente homogénea de anticuerpos específicos para los antígenos, tal población condene sitios de aglutinación del epítope substancialmente semejantes. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser cultivado in vitro, in situ, o in vivo. La producción de concentraciones elevadas in vivo o in situ es un método de producción preferido. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia la molécula objetivo son producidos utilizando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos por líneas celulares continuas en el cultivo. Los ejemplos de los métodos adecuados para preparar los anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de hibridoma de Kohier et al, Natura 256, 495-497 (1975), y el método del hibridoma de la célula B humana, Kozbor, J. Immunol . 133, 3001 (1984) ; Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ; los contenidos de tales referencias son incorporados completamente aquí para referencia. Los partícipes de aglutinación específica preferidos incluyen anticuerpos monoclonales los cuales inhibirán parcial o completamente la aglutinación de la molécula objetivo humana a su ligando o receptor semejante o un anticuerpo que tiene substancialmente las mismas características de aglutinación específicas, así como fragmentos y regiones de las mismas. Los métodos preferidos para determinar la especificidad del anticuerpo monoclonal y la afinidad por inhibición competitiva se pueden encontrar en Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al, eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), y Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983). Cada una de estas referencias es incorporada aquí para referencia en su totalidad. También se proporcionan por la invención las líneas celulares del hibridoma las cuales producen los anticuerpos monoclonales reactivos con los polipéptidos objetivo. Los anticuerpos quiméricos son moléculas en las cuales diferentes regiones son derivadas de especies de animales diferentes, tales como aquellas que tienen una región variable derivada d un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos son utilizados principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para incrementar los rendimientos en la producción, por ejemplo, en donde los anticuerpos monoclonales de murino tienen rendimientos más elevados de los hibridomas pero una inmunogenicidad más elevada en los seres humanos, de tal modo que son utilizados los anticuerpos monoclonales quiméricos de ser humano/murino. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción ya son conocidos en el arte. Cabilly et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277 (1984); Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al, Nature, 312:643-646 (1984); Neuberger et al, Nature, 314:268-270 (1985); Liu et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:3439-3443 (1987); y Harlow y Lañe Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) . Estas referencias son", incorporadas aquí para referencia en su totalidad. Un anticuerpo monoclonal quimérico de la invención puede ser utilizado como un agente terapéutico. En tal anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con, u homologa con la secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con, u homólogo con, la secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que los mismos exhiban la actividad biológica deseada (véase la Patente U.S.

No. 4, 816, 567; " Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci., 81, 6851-6855 (1985) . Cuando se utilice aquí, el término "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena quimérica H asociada a través de puentes de disulfuro con una cadena L quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es el tetrámero (H2L2) formado por dos dímeros HL asociados a través de al menos un puente de disulfuro. Un anticuerpo quimérico polivante también puede ser producido, por ejemplo, empleando una región CH que se agrega (por ejemplo, desde una cadena de IgM H, o la cadena µ) • Los anticuerpos, fragmentos y regiones de murino y quiméricas de la presente invención pueden comprender cadenas de inmunoglobulina ligera (L) y/o pesada (H) individuales. Una cadena H quimérica comprende una región de aglutinación del antígeno derivada de la cadena H de un anticuerpo no humano específico para la molécula objetivo, la cual está enlazada al menos a una región C de la cadena H humana (CH) , tal como CHX o CH2. Una cadena L quimérica de acuerdo con la presente invención comprende una región de aglutinación del antígeno derivada de la cadena L de un anticuerpo no humano especifico para la molécula objetivo, enlazada al menos a una porción de una región C de la cadena L humana (CL) . Los partícipes de aglutinación específica, tales como los anticuerpos, fragmentos, o derivados, que tienen cadenas H y cadenas L quiméricas de una especificidad de aglutinación de la región variable igual o diferente, también pueden ser preparados por la asociación apropiada de las cadenas de polipéptidos individuales, de acuerdo con los pasos del método conocidos, por ejemplo, de acuerdo con Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1993), y Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) . Los contenidos de estas referencias son incorporados completamente aquí para referencia. Con este método, los huéspedes que expresan las cadenas H quiméricas (o sus derivados) son cultivadas por separado a partir de los huéspedes que expresan las cadenas L quiméricas (o sus derivados) , y las cadenas de inmunoglobulina son recuperadas por separado y luego asociadas. Alternativamente, los huéspedes pueden ser co-cultivados y las cadenas se deja que se asocien espontáneamente en el medio de cultivo, seguido por la recuperación de la inmunoglobulina, fragmento o derivado ensamblado. Como un ejemplo, la región de aglutinación del antígeno del partícipe de aglutinación específica (tal como un anticuerpo quimérico) de la presente invención es derivado preferentemente de un anticuerpo no humano específico para el análogo humano de la molécula objetivo. Las fuentes preferidas para el ADN que codifican tal anticuerpo no humano incluyen líneas celulares las cuales producen anticuerpos, tales como las líneas celulares híbridas conocidas comúnmente como hibridomas . La invención también proporciona fragmentos, variantes y derivados, y fusiones de los anticuerpos anti- objetivo, en donde los términos "fragmentos", "variantes", "derivados" y "fusiones" son como se definieron aquí. La invención abarca .fragmentos, variantes, derivados, y fusiones de anticuerpos anti-objetivo los cuales son semejantes funcionalmente al anticuerpo no modificado, es decir, los mismos retendrán al menos una de las actividades del anticuerpo no modificado. Además de las modificaciones descritas anteriormente, también está incluida la adición de secuencias genéticas que codifican las proteínas citotóxicas tales como las toxinas vegetales y bacterianas. Los fragmentos, variantes, derivados y fusiones de los anticuerpos pueden ser producidos de cualquiera de los huéspedes de esta invención. Los fragmentos adecuados incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv. Estos fragmentos carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se despejan más rápidamente de la circulación, y pueden tener una aglutinación del tejido no específico menor que un anticuerpo intacto. Véase Wahl et al, J. Nucí. Med., 24:316-325 (1983). Estos fragmentos son producidos a partir de anticuerpos intactos utilizando los métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo por escisión proteolítica con enzimas tales como la papaína (para producir fragmentos FAB) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2)- La identificación de estas regiones de aglutinación del antígeno y/o los epítopes reconocidos por los anticuerpos monoclonales de la presente invención proporcionan la información necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales con características de aglutinación semejantes y la utilidad terapéutica o de diagnóstico que es paralela a las modalidades de esta invención. También se proporcionan partícipes de aglutinación específica. En una modalidad, las variantes de anticuerpos y los dominios de aglutinación del antígenp comprenden cambios en las secuencias de aminoácido de cadena ligera y/o pesada que están presentes de manera natural o que son introducidas por diseño in vitro de las secuencias naturales utilizando técnicas de ADN reco binante . Las variantes que están presentes de manera natural incluyen las variantes "somáticas" .las cuales son generadas in vivo en las secuencias de nucleótidos de la línea germinal correspondiente durante la generación de una respuesta del anticuerpo a un antígeno extraño . Las variantes de los anticuerpos y los dominios de aglutinación del antígeno también son preparados por técnicas de mutagénesis conocidas en el arte. En un ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden ser introducidos al azar de principio a fin de una región de codificación del anticuerpo y las variantes resultantes pueden ser seleccionadas para una actividad deseada, tales como la afinidad de aglutinación para la molécula objetivo. Alternativamente, los cambios de aminoácidos pueden ser introducidos en las regiones seleccionadas de un anticuerpo, tales como los CDRs de cadena ligera y/o pesada, y las regiones de la estructura, y los anticuerpos resultantes pueden ser seleccionados para la aglutinación a la molécula objetivo o alguna otra actividad. Los cambios de aminoácidos abarcan una o más substituciones de aminoácidos en un CDR, que varían desde una diferencia de un solo' aminoácido hasta la introducción de todas las permutaciones posibles de aminoácidos dentro de un CDR dado, tal como CDR3. En otro método, la contribución de cada residuo dentro de un CDR a la aglutinación de objetivo puede ser evaluada substituyendo al menos un residuo dentro del CDR con alanina (Lewis et al, (1995), Mol . Immunol . 32:1065-72). Los residuos que no son óptimos para la aglutinación a la molécula objetivo pueden ser cambiados entonces para determinar una secuencia más óptima. También son abarcadas las variantes generadas por la inserción de aminoácidos para incrementar el tamaño de un CDR, tal como CDR3. Por ejemplo, la mayoría de las secuencias de CDR3 de cadena ligera son de nueve aminoácidos de longitud. Las secuencias de CDR3 de cadena ligera en un anticuerpo las cuales son más cortas que nueve residuos pueden ser optimizadas por la aglutinación a la molécula objetivo por la inserción de los aminoácidos apropiados para incrementar la longitud de CDR.

En una modalidad, las variantes del dominio de aglutinación del anticuerpo o del antígeno comprenden uno o más cambios de aminoácidos en una o más de las cadenas ligeras o pesadas CDRl, CDR2 o CDR3 y opcionalmente una o más de las regiones de estructura FRl, FR2 o FR3 de la cadena ligera o pesada. Los cambios de aminoácidos comprenden substituciones, deleciones, y/o inserciones de residuos de aminoácidos . También se pueden preparar variantes por el "mezclado de la cadena" de las cadenas ya sea ligeras o pesadas. Marks . et al, (1992), Biotechnology 10:779-83. Típicamente, una cadena ligera (o pesada) única es combinada con un banco que tiene un repertorio de cadenas pesadas (o ligeras) y la población resultante es seleccionada para una actividad deseada, tal como la aglutinación a la molécula objetivo. Esta técnica permite la selección de una muestra más grande de cadenas pesadas (o ligeras) diferentes en combinación con una cadena ligera (o pesada) única que es posible con los bancos que comprenden repertorios de cadenas tanto ligeras como pesadas. Los partícipes de aglutinación específica de la invención pueden ser biespecíficos. Los partícipes de aglutinación biespecíficos de esta invención pueden ser de varias configuraciones. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se parecen a los anticuerpos únicos o sencillos (o fragmentos de anticuerpos) pero tienen dos sitios de aglutinación del antígeno diferentes (regiones variables) . Los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos por técnicas químicas (véase por ejemplo, Kranz et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:5807 (1981)), por técnicas de "polidoma" (véase también la Pat. U.S. No. 4,474,893 de Reading) o por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con esta invención puede aglutinarse a APRIL y AGP-3. Como otro ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede aglutinarse a TACI y BCMA. Los partícipes de aglutinación específica de la invención también pueden ser heteroanticuerpos . Los heteroanticuerpos son dos o más anticuerpos, o fragmentos de aglutinación de anticuerpos (Fab) enlazados conjuntamente, cada anticuerpo o fragmento tiene una especificidad diferente. La invención también se refiere a los anticuerpos "humanizados". Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el arte. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en un anticuerpo humano desde una fuente la cual es no humana. En general, los residuos no humanos estarán presentes en los CDRs. La humanización puede ser efectuada siguiendo los métodos conocidos en el arte (Jones et al, Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 322, 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science 239, 1534-1536 (1988)), substituyendo las regiones de determinación de complementación de roedor (CDRs) para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano . Los partícipes de aglutinación específica de la invención incluyen anticuerpos quiméricos, injertados con CDR, y humanizados que pueden se producidos por métodos recombinantes conocidos en el arte. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos son introducidos en las células huésped y expresados utilizando los materiales y procedimientos descritos aquí y conocidos en el arte. En una modalidad preferida, los anticuerpos son producidos en células huésped de mamífero, tales como las células CHO. Los anticuerpos humanos totales pueden ser producidos por la expresión del ADN recombinante transfectado en las células huésped o por la expresión en las células de hibridoma como se describió anteriormente. Las técnicas para crear versiones de ADN recombinante de las regiones de aglutinación del antígeno de las moléculas del anticuerpo las cuales derivan la generación de los anticuerpos monoclonales, están abarcadas dentro de la práctica de esta invención. Para hacerlo así, las moléculas del ARN mensajero específico para el anticuerpo son extraídas de las células del sistema inmune tomadas de un animal inmunizado, y transcritas hacia un AD? complementario (AD?c) .

El ADNc es clonado entonces en un sistema de expresión bacteriano. Un ejemplo de tal técnica adecuada para la práctica de esta invención utiliza un sistema del vector lambda del bacteriófago que tiene una secuencia directora que provoca que la proteína de Fab expresada migre al espacio periplásmico (entre la membrana de la célula bacteriana y la pared celular) o para que sea secretada. Se pueden generar y seleccionar rápidamente grandes números de fragmentos de Fab funcional para aquellos que se aglutinan al antígeno. Tales partícipes de aglutinación específica de la molécula objetivo (fragmentos Fab con especificidad hacia la molécula objetivo) están abarcados específicamente dentro del término "anticuerpo" como se define, describe, y reivindica aquí. También están dentro del alcance de la invención las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos empalmando los genes de una molécula de anticuerpo del ratón de especificidad del antígeno apropiada junto con los genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada, tal como la capacidad de activar los ADCC intermedio y de complemento, humanos. (Morrison et al, Proc. Nati. Acad. Sci., 81:6851 (1984); Neuberger et al, Nature, 312:604 (1984)). Un ejemplo es el reemplazo de una región de Fc con aquella de un isotipo diferente. Los partícipes de aglutinación específica tales como los anticuerpos producidos por esta técnica están dentro del alcance de la invención. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos son anticuerpos totalmente humanos . Por consiguiente, están abarcados por la invención los anticuerpos que se aglutinan a las moléculas objetivo y están codificados por las secuencias de ácido nucleico que son variantes somáticas que están presentes de manera natural de la secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina de la línea germinal humana, y los fragmentos, variantes sintéticas, derivados y fusiones de los mismos. Tales anticuerpos pueden ser producidos por cualquier método conocido en el arte. Los métodos ejemplares incluyen la inmunización con un antígeno objetivo (cualquier polipéptido objetivo capaz de producir una respuesta inmune, y opcionalmente conjugado con un portador) de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al, Proc. Nati. Acad. Sci, 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immunol, 1_, 33 (1993). Alternativamente, los anticuerpos humanos pueden ser generados a través de la selección in vitro de los bancos de los anticuerpos de exhibición del fago. Véase Hoogenboom et al, J. Mol. Biol., 227, 381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. , 222, 581 (1991), incorporada aquí para referencia.

Varios bancos de exhibición del fago que contienen el anticuerpo han sido descritos y pueden ser preparados por un experto en el arte. Los bancos pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpo humano, tales como fragmentos Fab, Fc, y ScFv humanos, que pueden ser seleccionados contra un objetivo apropiado. Como se describe adicionalmente después, los bancos de exhibición del fago pueden comprender péptidos o proteínas diferentes de los anticuerpos lo cuales pueden ser seleccionados para identificar los partícipes de aglutinación específica de la molécula objetivo. Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-ld) es un anticuerpo el cual reconoce las determinantes únicas asociadas generalmente con un sitio de aglutinación del antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede ser preparado inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, la cepa del ratón) como la fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal para el cual un anti-ld está siendo preparado. El animal inmunizado reconocerá y responderá a las determinantes idiotípicas del anticuerpo de inmunización produciendo un anticuerpo para estas determinantes idiotípicas (el anticuerpo anti-ld) . Véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,699,880, la cual es incorporada aquí en su totalidad para referencia. El anticuerpo anti-ld también puede ser utilizado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en todavía otro animal, produciendo un anticuerpo así llamado anti-anti-id. El anti-anti-ld puede ser idéntico epitópicamente al anticuerpo monoclonal original el cual indujo el anti-ld. Por consiguiente, utilizando los anticuerpos para las determinantes idiotípicas de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan los anticuerpos de especificidad idéntica.

Péptidos y moléculas de fusión del péptido La solicitud de patente WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000, mencionada previamente aquí, describe con detalle varias técnicas de generación del péptido. Esta solicitud de patente describe adicionalmente varios derivados y moléculas de fusión. En particular, un péptido utilizado como un partícipe de aglutinación especifica puede estar comprendido dentro de una molécula de la fórmula en donde: F1 es un vehículo; X1 y X2 son seleccionados cada uno independientemente de - (L1) c-P1- (L2) d-P2, (L2)d-P2-(L3)e-P3, y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; P1, P2, P3, y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptido, en donde al menos uno es un partícipe de aglutinación específica; L1, L2, L3, y L4 son cada uno independientemente enlazadores; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 o 1, siempre que al menos uno de a y b sea 1. Preferentemente, tal molécula comprende una estructura de las fórmulas X^F1 o F^X Una molécula más preferida comprende una estructura de la fórmula o una estructura de la fórmula en donde P1 y/o P2 es un partícipe de aglutinación específica para TACI o BCMA. Tales moléculas facilitan la modulación tanto de TACI como BCMA; por ejemplo, uno de P1 y P2 es un partícipe de aglutinación específica para TACI y el otro es un partícipe de aglutinación específica para PBCMA. Por el contrario, en un inhibidor del ligando, uno de P1 y P2 es un partícipe de aglutinación específica para APRIL y el otro es un partícipe de aglutinación específica para AGP-3. Para la totalidad de estas moléculas, el vehículo preferido es un dominio de Fc. entre los dominios de Fc, IgG Fc, particularmente IgGl, es preferido. . Los dominios de Fc, enlazadores, y procesos para la preparación de las moléculas precedentes se describen en WO 00/24782, publicada el 4 de mayo del 2000.

Fragmentos receptores solubles Otra clase de partícipes de aglutinación específica son fragmentos solubles del receptor. Son de interés particular los fragmentos identificados en las Figuras : a. la región extracelular de TACI (SEC ID NO: 15) . b. la región extracelular de BCMA (SEC ID NO: 6) . c. la región de consenso de TACI (SEC ID NO: 16) . d. la región de consenso de BCMA (SEC ID NO: 7) . e. la secuencia de consenso extracelular de TACI/BCMA (SEC ID NO: 13) . Estas moléculas tienen la ventaja no reconocida hasta ahora de la aglutinación tanto de APRIL como de AGP-3. De manera semejante a los péptidos mencionados anteriormente, estos partícipes de aglutinación específica también pueden ser enlazados covalentemente a un vehículo, preferentemente un dominio de Fc.

Muteínas Las secuencias de péptidos útiles adicionales pueden resultar de las modificaciones conservadoras y/o no conservadoras de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos, péptidos, péptidos de fusión-Fe, y fragmentos del receptor mencionados anteriormente . Las modificaciones conservadoras producirán moléculas que tienen características funcionales y químicas semejantes a aquellas de la molécula a partir de la cual se hacen tales modificaciones. En contraste, las modificaciones substanciales en las características funcionales y/o químicas de las moléculas pueden ser efectuadas seleccionando las substituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto molecular en el área de substitución, por ejemplo, como una hoja o conformación de hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el tamaño de la molécula. Por ejemplo, una "substitución de aminoácido conservador" puede involucrar una substitución de un residuo de aminoácido natural con un residuo no natural de tal modo que existe un efecto pequeño o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácidos en esta posición. Además, cualquier residuo natural en el polipéptido también puede ser substituido con alanina, como ha sido descrito previamente para "mutagénesis de exploración de alanina" (véase, por ejemplo, MacLennan et al, 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al, 1998, Adv. Biophys . 35:1-24, el cual describe la mutagénesis de exploración de alanina) . Las substituciones de aminoácidos deseadas (ya sea conservadoras o no conservadoras) pueden ser determinadas por aquellos expertos en el arte en el instante que se deseen tales substituciones. Por ejemplo, las substituciones de aminoácidos pueden ser utilizadas para identificar residuos importantes de la secuencia de la molécula, o para incrementar o reducir la afinidad de las moléculas descritas aquí. Las substituciones de aminoácidos ejemplares se describen en la Tabla 3.

Tabla 3 - Substituciones de Aminoácidos En ciertas modalidades, las substituciones de aminoácidos conservadores también abarcan los residuos de aminoácidos que no están presentes de manera natural los cuales son incorporados típicamente por la síntesis química de péptidos en lugar de por la síntesis en sistemas biológicos . Como se señaló en la sección precedente "Definición de los Términos", los residuos que están presentes de manera natural pueden ser divididos en clases con base en las propiedades comunes de la cadena lateral que pueden ser útiles para modificaciones de la secuencia. Por ejemplo, las substituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un elemento de una de estas clases por un elemento de otra clase. Tales residuos substituidos pueden ser introducidos en las regiones de la molécula que son homologas con los ortólogos no humanos, o en las regiones no homologas de la molécula. Además, también se pueden hacer modificaciones utilizando P o G para el propósitos de influir en la orientación de la cadena. En la fabricación de tales modificaciones, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y las características de la carga; estas son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) . La importancia del índice de aminoácido hidropático para conferir una función biológica interactiva sobre una proteína es entendida en el arte. Kyte et al, J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Ya se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser substituidos por otros aminoácidos que tienen una evaluación o índice hidropático semejante y todavía retienen una actividad biológica semejante. Para hacer cambios basados en el índice hidropático, la substitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +2 es preferida, aquellos que están dentro de +1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de +0.5 son aún más preferidos particularmente. También se entiende en el arte que la substitución de aminoácidos semejantes se puede hacer de manera efectiva con base en la hidrofilicidad. La hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, cuando es gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1); glutamato (+3.0 + 1) ; serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4). Para hacer cambios basados en los valores de hidrofilicidad semejantes, la substitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +2 es preferida, aquellos que están dentro de +1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de +0.5 son aún más preferidos particularmente. Se pueden identificar también los epítopes de las secuencias de aminoácido primario con base en la hidrofilicidad. Estas regiones también son referidas co o "regiones del núcleo epitópico". Un artesano experto será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipéptido como se describe en las secuencias precedentes utilizando técnicas bien conocidas. Para identificar las áreas adecuadas de la molécula que pueden ser cambiadas sin destruir la actividad, un experto en el arte puede ubicar como objetivo áreas que no se crea que son importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando polipéptidos semejantes con actividades semejantes de las mismas especies o de otras especies son conocidos, un experto en el arte puede comparar la secuencia de aminoácidos de una molécula con las moléculas semejantes. Con tal comparación, se pueden identificar los residuos y porciones de las moléculas que son conservados entre los polipéptidos semejantes. Se apreciará que los cambios en las áreas de una molécula que no son conservados con relación a tales moléculas semejantes podría ser menos probable que afectaran adversamente la actividad biológica y/o la estructura de la molécula. Un experto en el arte podría saber que, aún en las regiones relativamente conservadas, se pueden substituir aminoácidos semejantes químicamente por los residuos que están presentes de manera natural al mismo tiempo que se retiene la actividad (substituciones de residuos de aminoácidos conservadores) . Por lo tanto, aún las áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden ser sometidas a substituciones de aminoácido conservador sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura de la molécula. Adicionalmente, un experto en el arte puede revisar los estudios de estructura-función que identifican los residuos en moléculas semejantes que son importantes para la actividad o estructura. En vista de tal comparación, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en una molécula que corresponde a los residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en moléculas semejantes. Un experto en el arte puede optar por las substituciones de aminoácidos semejantes químicamente para tales residuos de aminoácidos importantes predichos de las moléculas.

Un experto en el arte puede analizar también la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos con relación a esta estructura en polimoléculas semejantes. En vista de esta información, un experto en el arte puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de una molécula con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en el arte puede elegir no hacer cambios radicales a los residuos de aminoácidos que se ha predicho que van a estar sobre la superficie de la proteína, puesto que tales residuos pueden estar involucrados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en el arte puede generar variantes de prueba que contienen una substitución de un solo aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden ser seleccionadas entonces utilizando ensayos de actividad conocidos por aquellos expertos en el arte. Tales datos podrían ser utilizados para agrupar la información acerca de las variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio para un residuo de aminoácido particular condujo a variantes destruidas, reducidas indeseablemente, o de actividad inadecuada, tal cambio podría ser evitado. En otras palabras, basado en la información agrupada de tales experimentos de rutina, un experto en el arte puede determinar fácilmente los aminoácidos en donde las substituciones adicionales deben ser evitadas ya sea solas o en combinación con otras mutaciones . Un número de publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry, 13 (2) : 222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113 (2) : 211-222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. reas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al, Biophys. J., 26:367-384 (1979) . Además, los programas de computadora están disponibles comúnmente para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria está basado en la modelación por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de la secuencia mayor que el 30%, o de manera semejante mayor que el 40%, frecuentemente tienen topologías estructurales semejantes. El crecimiento reciente de la base de datos estructurales de la proteína (PDB) ha proporcionado una capacidad de predicción mejorada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de una estructura del polipéptido o de la proteína. Véase Holm et al, Nucí. Acid. Res., 27 (1) : 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)) que existe un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dada y que una vez que un número crítico de estructuras ha sido resuelto, la predicción estructural mejorará ampliamente en su exactitud. Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen el "enhebrado" (Jones, D., Curr. Opin.

Struct. Biol. 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al, Structure, 4(1): 15-9 (1996)), "profile analysis" (Bowie et al, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al, Meth. Enzy ., 183:146-159 (1990); Gribskov et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13) : 4355-8 (1987) ) , y "evolutionary linkage" (Véase Home, supra, y Brenner, supra) .

Producción de partícipes de aglutinación especifica Cuando el partícipe de aglutinación específica que va a ser preparado, es un partícipe de aglutinación específica proteináceo, tal como un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno o una molécula de fusión del Fc-péptido, varios métodos biológicos cr químicos para la producción del partícipe están disponibles. Los métodos biológicos son preferibles para producir cantidades suficientes de un partícipe de aglutinación específica para uso terapéutico. Las técnicas de ADN recombinante estándares son particularmente útiles para la producción de dominios de aglutinación de antígeno y anticuerpos de la invención. Los vectores de expresión, células huésped y métodos ejemplares para la recuperación del producto expresado son descritos posteriormente.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de aglutinación de anticuerpo o antígeno es insertado en un vector de expresión apropiado utilizando técnicas de unión o ligación estándares. El vector es seleccionado típicamente para que sea funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de tal modo que la amplificación del gen y/o la expresión del gen pueda ocurrir) . Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo puede ser amplificada/expresada en las células huéspedes procarióticas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucarióticas. La selección de la célula huésped dependerá en parte de si un anticuerpo va a ser modificado pos-transicionalmente (por ejemplo, glicosilado y/o fosforilado) . Si es así, las células de levadura, insecto, o mamífero, son preferibles. Para una revisión de los vectores de expresión, véase Meth. Enz . v. 185, (D.V. Goeddel, ed.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990). Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualesquiera células huésped contienen uno o más de los siguientes componentes: un promotor, una o más secuencias mejoradoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme del donador y aceptor, una secuencia directora para la secreción, un sitio de aglutinación del ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que va a ser expresado, y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias es descrita con mayor detalle posteriormente. Los componentes del vector pueden ser secuencias homologas (es decir, de las mismas especies y/o cepa que la célula huésped) , heterólogas (es decir, de una especie diferente que las especies o la cepa de la célula huésped) , híbridas (es decir, una combinación de diferentes secuencias de más de una fuente) , sintéticas, o naturales, las cuales funcionan normalmente para regular la expresión de inmunoglobulina. Como tal, una fuente de los componentes del vector puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que los componentes sean funcionales en, y puedan ser activados por, la maquina de la célula huésped. Un origen de replicación es seleccionado con base en el tipo de la célula huésped que es utilizada por la expresión. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (Producto No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de bacterias Gam-negativas mientras que varios orígenes de SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VS) o pailomavirus (tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en las células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión del mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 es utilizado frecuentemente solo a causa de que el mismo contiene el promotor inicial) . Una secuencia de terminación de la transcripción está localizada típicamente 3' del extremo de unas regiones de codificación del polipéptido y sirven para terminar la transcripción. Usualmente, una secuencia de terminación de la transcripción en las células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli T. Aunque la secuencia es clonada fácilmente de un banco o aún comprada comercialmente como parte de un vector, la misma también puede ser sintetizada fácilmente utilizando los métodos para la síntesis del ácido nucleico tales como aquellos descritos anteriormente . Un elemento del gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped que crece en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para las células huésped procarióticas, (b) las deficiencias auxotróficas de complemento de la célula; (c) nutrientes críticos de suministro no disponibles del medio complejo. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina. Un gen de resistencia a la kanamicina también puede ser utilizado para la selección en las células huésped procarióticas y eucarióticas . Otros genes de selección pueden ser utilizados para amplificar el gen el cual será expresado. La amplificación es el proceso en donde los genes los cuales están en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento son reiterados en serie dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de los marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina cinasa. Los transformantes de la célula del mamífero son colocados bajo la presión de selección en la cual solamente los transformantes están adaptados únicamente para sobrevivir en virtud del marcador presente en el vector. La presión de selección es impuesta cultivando las células transformadas bajo condiciones, en las cuales la concentración del partícipe de selección en el medio es cambiada exitosamente, por lo cual conducen a la 'amplificación tanto del gen de selección como el ADN que codifica un anticuerpo. Como resultado, cantidades crecientes de un anticuerpo son sintetizadas a partir del ADN amplificado. Un sitio de aglutinación del ribosoma usualmente es necesario para el inicio de la traducción del ARNm y está caracterizado por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas) . El elemento está localizado típicamente 3' con respecto al promotor y 5' con respecto a la secuencia de codificación del polipéptido que va a ser expresado. La secuencia de Shine-Dalgarno se hace variar pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un contenido de A-G elevado) . Muchas de las secuencias de Shine-Dalgarno han sido identificadas, cada una de las cuales puede ser sintetizada fácilmente utilizando los métodos descritos anteriormente y utilizadas en un vector procariótico . Una secuencia o señal directora, es utilizada para dirigir la secreción de un polipéptido. Una secuencia de la señal puede ser colocada dentro o directamente en el extremo 5' de una región de codificación del polipéptido. Muchas secuencias de la señal han sido identificadas y pueden ser seleccionadas con base en la célula huésped utilizada para la expresión. En la presente invención, una secuencia de la señal puede ser homologa (que está presente naturalmente) o heteróloga con respecto a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de aglutinación del anticuerpo o del antígeno. Una secuencia de la señal heteróloga debe ser una que sea reconocida y procesada, es decir, escindida, por una peptidasa de la señal, por la célula huésped. Para las células huésped procarióticas que no reconocen y procesan una secuencia de la señal de inmunoglobulina natural, la secuencia de la señal está substituida por una secuencia de la señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, o secuencias directoras de enterotoxina II estable con calentamiento. Para la secreción de levadura, una secuencia de la señal de inmunoglobulina natural puede ser substituida por la invertasa de levadura, el factor alfa, o secuencias directoras de fosfatasa acida. En la expresión de la célula del mamífero la secuencia de la señal natural es satisfactoria, aunque otras secuencias de la señal del mamífero pueden ser adecuadas. En la mayoría de los casos, la secreción de un dominio de aglutinación del anticuerpo o del antígeno a partir de una célula huésped conducirá a la remoción del péptido de la señal del anticuerpo. Así, el anticuerpo maduro puede carecer de alguna secuencia directora o de la señal. En algunos casos, tal como en donde es deseable la glicosilación en un sistema de expresión de la célula huésped eucariótica, se pueden manipular las diversas presecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de segmentación de la peptidasa de un péptido de la señal particular, o agregar prosecuencias, las cuales también pueden afectar la glicosilación. El producto de la proteína final puede tener, en la posición -1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales incidentes para la expresión, los cuales pueden no haber sido removidos totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos aminoácidos encontrados en el sitio de segmentación de la peptidasa, fijados a la terminación N. Alternativamente, el uso de algunos sitios de segmentación de la enzima pueden conducir a una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima se corta en tal área dentro del polipéptido maduro. Los vectores de expresión de la presente invención contendrán típicamente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y enlazados operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno. Ya sea un promotor heterólogo o natural puede ser utilizado dependiendo de la célula huésped utilizada para la expresión y la producción de la proteína deseada. Los promotores adecuados para su uso con los huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) ; y promotores híbridos tales como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos también son adecuados. Sus secuencias han sido publicadas, por lo cual se hace posible que un experto en el arte una o ligue a la(s) secuencia (s) de ADN deseada (s), utilizando los enlazadores o adaptadores necesarios para suministrar cualesquiera sitios de restricción requeridos. Los promotores adecuados para su uso con los huéspedes de levadura también son bien conocidos en el arte. Los mejoradores de levadura son utilizados ventajosamente con los promotores de levadura. Los promotores adecuados para su uso con las células huésped de mamífero son bien conocidas e incluyen aquellas obtenidas de los genomas de los virus tales como el virus de polioma, virus fowlpox, adenovirus (tales como Adenovirus 2) , virus de papiloma de bovino, virus de sarcoma de ave, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el virus 40 del Simio (SV40) . Otros promotores de mamífero adecuados incluyen los promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, los promotores del choque térmico y el promotor de actina. Los promotores adicionales los cuales pueden ser utilizados para la expresión de los partícipes de aglutinación específica de la invención incluyen, pero no están limitados a: la región promotora inicial SV40 (Benoist y Chambón (1981), Nature, 290:304-310); el promotor CMV; el promotor contenido en la repetición 3' terminal larga del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al, (1980), Cell, 22:787-97); el promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner et al, (1981), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 78:1444-5); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al, (1982), Nature, 296:39-42): vectores de expresión procariótica tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al (1978), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31); o el promotor tac (DeBoer, et al (1983), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control transcripcional del animal, las cuales exhiben la especificidad del tejido y han sido utilizadas en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I la cual es activa en las células del acinar pancreático (Swift et al, (1984), Cell, 38:639-46; Ornitz et al (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 50:399-409; MacDonald (1987), Hepatology, 7::425-515); la región de control del gen de insulina el cual es activo en las células beta pancreáticas (Hanahan (1985), Nature, 315:115-122); la región de control del gen de inmunoglobulina la cual es activa en las células linfoides (Grosschedl et al (1984), Cell, 38:647-58; Adames et al, (1985), ?ature, 318:533-8; Alexander et al, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); la región de control del virus del tumor mamario del ratón la cual es activa en las células testiculares, del pecho, linfoides y mastocitos (Leder et al, (1986) , Cell, 45:485-95), la región de control del gen de albúmina la cual es activa en el hígado (Pinkert et al, (1987) , -Genes y Devel, 1:268-76); la región de control del gen de alfafetoproteína la cual es activa en el hígado (Kru lauf et al, (1987), Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al, (1987), Science, 235:53-58); la región de control del gen de alfa 1- antitripsina la cual es activa en el hígado (Kelsey et al, (1987), Genes and Devel . , 1:161-171); la región de control del gen de beta-globina la cual es activa en las células mieloides (Mogram et al, (1985), Nature, 315:338-340; Kollias et al, (1986), Cell, 46:89-94); la región de control del gen de proteína básica de mielina la cual es activa en las células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al, (1987), Cell, 48:703-712); la región de control del gen de la cadena 2 ligera de miosina la cual es activa en el músculo- " .esquelético (Sani (1985), Nature, 314:283-286); y la región de control del gen de hormona de liberación gonadotrópica la cual es activa en el hipotálamo (Masón et al, (1986) , Science, 234:1372-8) . Una secuencia mejoradora puede ser insertada en el vector para incrementar la transcripción en las células huésped eucarióticas . Varias secuencias mejoradoras disponibles de los genes de mamífero ya son conocidas (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se utilizará un mejorador de un virus. El mejorador de SV40, el mejorador del promotor inicial del citomegalovirus, el mejorador del polioma, y los mejoradores del adenovirus son elementos mejoradores ejemplares para la activación de los promotores eucarióticos. Aunque un mejorador puede ser empalmado en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la región de codificación del polipéptido, el mismo está localizado típicamente en un sitio 5' desde el promotor. Los vectores preferidos para la práctica de esta invención son aquellos los cuales son compatibles con las células bacterianas, de insecto, y de mamífero. Tales vectores incluyen, inter alia, pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA) , pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA) , pET15 (Novagen, Madison, Wl) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacII; Invitrogen) , pDSR-alfa (Publicación PCT No. WO90/14363) y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY) . Los vectores posibles adicionales incluyen, pero no están limitados a, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a los plásmidos tales como los derivados del plásmido Bluescript® (un faguemido a base de ColEl de número de copias elevado, Strategene Cloning Systems Inc., La Jolla CA) , los plásmidos de clonación de PCR designados para la clonación de los productos de PCR amplificados por Taq (por ejemplo, el kit TOPO™ TA Cloning®, los derivados del plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carisbad, CA) , y los vectores de mamífero, de levadura o de virus tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA) . Las moléculas recombinantes pueden ser introducidas en las células huésped por medio de la transformación, transfección, infección, electroporación, u otras técnicas conocidas. Las células huésped de la invención pueden ser células huésped procarióticas (tales como E. coli) o células huésped eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado) . Las células huésped procarióticas tales como E. coli producen la proteína no glicosilada; por ejemplo, shBCMA no glicosilada y shTACI no glicosilada, las cuales poseen ventajas sobre las moléculas eucarióticas glicosiladas. La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, expresa un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno de la invención el cual puede ser colectado subsiguientemente del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta en el medio) o directamente de la célula huésped que lo produce (si no es secretado) . La selección de una célula huésped apropiada dependerá de varios factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones del polipéptido que sean deseables o necesarias para la actividad, tales como la glicosilación o fosforilación, y la facilidad del plegado en una molécula activa biológicamente. Ya se conocen varias células huésped adecuadas en el arte y muchas están disponibles del American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Los ejemplos incluyen las células de mamífero, tales como las células del ovario del hámster chino (CHO) (ATCC No. CCL61), células CHO DHFR (Urlaub et al, (1980), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97, 4216- 20) , células 293 o 293T del riñon embriónico humano (HEK) (ATCC No. CRL1573), o células 3T3 (ATCC No. CCL92). La selección de las células huésped de mamífero y los métodos para la transformación, el cultivo, amplificación, selección y fabricación del producto y purificación ya son conocidos en el arte. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas, son las líneas celulares COS-1 (ATCC No. CRL1650) y COS-7 (ATCC No. CRL1651) del mono, y la línea de la célula CV-1 (ATCC No. CCL70) . Además, las células huésped del mamífero ejemplares adicionales incluyen las líneas celulares del primate y las líneas celulares del ratón, incluyendo las líneas celulares transformadas. Las líneas diploides normales, las cepas celulares derivadas del cultivo in vitro del tejido primario, así como los explantes primarios, también son adecuados. Las células candidatas pueden ser deficientes genotípicamente en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección de actuación dominante. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen pero no están limitadas a, células N2A del neuroblastoma del ratón, Hela, células L-929 del ratón, líneas 3T3 derivadas de las líneas celulares Swiss, Balb-c o NIH de los ratones, BHK o HaK del hámster, las cuales están disponibles del American Type Culture Collection, Manassas, VA) . Cada una de estas líneas celulares es conocida por, y está disponible para, aquellos expertos en el arte de la expresión de proteínas. De manera semejante, las células bacterianas son útiles como las células huésped adecuadas para la presente invención. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, (ATCC No. 33694) DH5a, DH10, y MC1061 (ATCC No. 53338)) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Varias cepas de Pseudomonas spp., B. subtilis, otros Bacillus spp., Streptomyces spp., y semejantes también pueden ser empleadas en este método. Muchas cepas de las células de levadura conocidas por aquellos expertos en el arte también están disponibles para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Las células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerevisae. Adicionalmente, en donde sea deseable, los sistemas de células de insectos pueden ser utilizados en los métodos de la presente invención. Tales sistemas son descritos por ejemplo en Kitts et al, (1993), Biotechniques, 14:810-7, Lucklow (1993), Curr . Opin.Biotechnol . , 4:564-72, y Lucklow et al, (1993), J. Virol., 67:4566-79. Las células de insectos preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carisbad, CA) . La transformación o transfección de una molécula de ácido nucleico que codifica un partícipe de aglutinación específica en una célula huésped seleccionada puede ser efectuada por métodos bien conocidos que incluyen los métodos tales como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el método de DEAE-dextrano. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped que va a ser utilizada. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos para el artesano experto, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al, supra . Se pueden utilizar también animales transgénicos para expresar los partícipes de aglutinación específica glicosilados, tales como los anticuerpos y el dominio de aglutinación del antígeno. Por ejemplo, se puede utilizar un animal productor de leche, transgénico (una vaca o una cabra, por ejemplo) y obtener partícipes de aglutinación glicosilados en la leche del animal. Alternativamente, se pueden utilizar plantas para producir los partícipes de aglutinación específica glicosilados.

Las células huésped que comprenden (como por transformación o transfección) un vector de expresión que codifica un partícipe de aglutinación específica de la molécula objetivo pueden ser cultivadas utilizando medios estándares bien conocidos por los expertos en el arte. Los medios contendrán usualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar las células de E. coli son por ejemplo, el Caldo Luria (LB) y/o el Caldo Terrific (TB) . Los medios adecuados para cultivar las células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, la totalidad de los cuales pueden ser suplementados con factores del suero y/o de crecimiento cuando sea requerido por la línea celular particular que es cultivada. Un medio adecuado por los cultivos de insectos es el medio de Grace suplementado con yeastolate, hidrolisado de lactalbúmina, y/o el suero de bovino fetal cuando sea necesario. Típicamente, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas o transfectadas es agregado como un suplemento al medio. El compuesto que va a ser utilizado estará dictado por el elemento marcador seleccionable presente sobre el plásmido con el cual la célula huésped fue transformada. Por ejemplo, en donde el elemento del marcador seleccionable es la resistencia a la kanamicina, el compuesto agregado al medio de cultivo será la kanamicina. Otros compuestos para el crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina. La cantidad de un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno producido por una célula huésped puede ser evaluado utilizando los métodos estándares conocidos en el arte. Tales métodos incluyen, sin limitación, el análisis de transferencia de Western, la electrofóresis en gel de poliacrilamida-SDS, la electrofóresis en un gel no desnaturalizante, la separación por CLAR, inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad. La purificación de un partícipe de aglutinación específica que ha sido secretado en el medio de la célula puede ser efectuada utilizando una variedad de técnicas incluyendo cromatografía de afinidad, inmunoafinidad o intercambio iónico, cromatografía de tamices moleculares, electrofóresis en gel preparativo o enfocamiento isoeléctrico, cromatoenfoque, y cromatografía líquida de alta resolución. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una región Fc pueden ser purificados convenientemente por cromatografía de afinidad con Proteína A, la cual se aglutina selectivamente a la región de Fc. Las formas modificadas de un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno pueden ser preparadas con etiquetas de afinidad, tales como hexahistidina u otros péptidos pequeños tales como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc (Invitrogen) ya sea en su terminación de carboxilo o amino y purificada por una columna de afinidad de un paso. Por ejemplo, la polihistidina se aglutina con gran afinidad y especificidad al níquel, por consiguiente una columna de afinidad de níquel (tales como las columnas de níquel Qiagen®) pueden ser utilizadas para la purificación de los partícipes de aglutinación específica etiquetados con polihistidina. Véase por ejemplo, Ausubel et al, eds. (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, New York. En algunos casos, más de un paso de purificación puede ser requerido. Los partícipes de aglutinación específica de la invención los cuales son expresados en las células huésped procarióticas pueden estar presentes en la forma soluble ya sea en el espacio periplásmico o en el citoplasma o en una forma insoluble como parte de los cuerpos de inclusión intracelulares. Los partícipes de aglutinación específica pueden ser extraídos de la célula huésped utilizando cualquier técnica estándar conocida por los expertos en el arte. Por ejemplo, las células huésped pueden ser lisadas para liberar el contenido del periplasma/citoplasma por prensa French, homogeneización, y/o sonicación seguida por centrifugación. Las formas solubles de un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno presente ya sea en el citoplasma o liberado del espacio periplásmico, pueden ser purificadas adicionalmente utilizando métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo los fragmentos Fab son liberados del espacio periplásmico bacteriano por técnicas de choque osmótico. Si un dominio de aglutinación de anticuerpo o antígeno ha formado cuerpos de inclusión, los mismos pueden aglutinarse frecuentemente a las membranas celulares internas y/o externas y por consiguiente serán encontradas principalmente en el material de la microesfera después de la centrifugación. El material de la microesfera puede ser tratado entonces en los extremos de pH o con un partícipe caotrópico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en la presencia de un partícipe reductor tal como el ditiotreitol a un pH alcalino o tris carboxietil fosfina a pH ácido para liberar, retirar por ruptura, y solubilizar los cuerpos de inclusión. El partícipe de aglutinación específica soluble puede ser analizado entonces utilizando la electrofóresis en gel, inmunoprecipitación o semejante. Si se desea aislar un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno, solubilizado, el aislamiento puede ser efectuado utilizando los métodos estándares tales como aquellos descritos posteriormente y en Marston et al, (1990) , Math. Enz., 182:264-75. En algunos casos, un dominio de aglutinación del anticuerpo o antígeno puede no ser biológicamente activo durante el aislamiento. Varios métodos para el "repliegue" o la conversión del polipéptido a su estructura terciaria y la generación de enlaces de disulfuro, pueden ser utilizados para restablecer la actividad biológica. Tales métodos incluyen la exposición del polipéptido solubilizado a un pH usualmente arriba de 7 y en la presencia de una concentración particular de un caotropo. La selección del caotropo es muy semejante a las elecciones utilizadas para la solubilización del cuerpo de inclusión, pero usualmente el caotropo es utilizado a una concentración inferior y no es necesariamente el mismo que los caotropos utilizados para la solubilización. En la mayoría de los casos la solución de repliegue/oxidación también contendrá un partícipe de reducción o el partícipe de reducción más su forma oxidada a una relación específica para generar un potencial redox particular que permita el mezclado del disulfuro para que esté presente en la formulación del (de los) puente (s) de cisteína de la proteína. Algunas de las parejas redox utilizadas comúnmente incluyen cisteína/cistamina, glutationa (GHS) /ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditíotreitol (DTT) /ditiano DT.T, y 2-mercaptoetanol (bMe) /ditio-b (ME) . En muchos casos, un cosolvente puede ser utilizado o puede ser necesario para incrementar la eficacia del repliegue y los partícipes más comunes utilizados para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares, arginina y semejantes. Los partícipes de aglutinación específica de la invención también pueden ser preparados por métodos de síntesis química (tales como la síntesis de péptidos en fase sólida) utilizando las técnicas conocidas en el arte tales como aquellas descritas por Merrifield et al, (1963), J. Am. Chem. Soc., 85:2149; Houghten et al, (1985), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:5132; y Stewart y Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Tales polipéptidos pueden ser sintetizados con o sin una metionina sobre la terminación de amino . Los anticuerpos sintetizados químicamente y los dominios de aglutinación del antígeno pueden ser oxidados utilizando los métodos descritos en estas referencias para formar puentes de disulfurs. Los anticuerpos así preparados retendrán al menos una actividad biológica asociada con un dominio de aglutinación del antígeno o anticuerpo natural o producido recombinantemente. La invención será descrita ahora adicionalmente por ejemplos experimentales específicos. Estos ejemplos se entiende que van a ser ilustrativos en lugar de limitativos.

Ejemplos de Trabajo Materiales y Métodos Aislamiento de ADNs de BCMA y TACI El ADNc de BCMA humano y del ratón fue aislado por PCR utilizando el cebador de sentido de BCMA 5' -CACAATACCTGTGGCCCTCTTAAGAG-3' (SEC ID NO: 25) , y el cebador antisentido 5' -TGGTAAACGGTCATCCTAACGACATC-3' (SEC ID NO: 26), el cebador de sentido de BCMA humano 5' -TTACTTGTCCTTCCAGGCTGTTCT-3' (SEC ID NO: 27) , y el cebador antisentido 5'-CATAGAAACCAAGGAAGTTTCTACC-3' (SEC ID NO: 28) . Para el aislamiento del ADNc de TACI humano, el cebador de sentido 5' -AGCATCCTGAGTAATGAGTGGCCTGG-3' (SEC ID NO: 29) y el cebador antisentido 5' -GTGATGACGACCTACAGCTGCACTGGG-3' (SEC ID NO: 30) fueron utilizados. El poli (A) + ARN de la línea celular -A20 del linfoma B del ratón y los Nodos linfáticos humanos fueron transcritos de manera inversa y el ADNc fue sintetizado utilizando el Kit de amplificación de ADNc Smart RACE (Clontech, Palo Alto, California) . El ADNc de longitud completa de los genes de BCMA de ratón y de ser humano así como el gen TACI humano fueron clonados en el vector pcDNA3 para la expresión de la célula de mamífero (Invitrogen, Carisbad, California) .

Proteínas recombinantes La proteína APRIL-Flag de murino soluble fue generada fusionando la secuencia de Flag en la estructura con respecto a la terminación N de los aminoácidos 101-239 de APRIL. La proteína mAPRIL-Flag soluble fue expresada en E.co-li y la proteína replegada fue purificada por afinidad por la columna de anticuerpo anti-Flag M2. La proteína AGP3 etiquetada con Fc fue generada fusionando el péptido de la señal OPG seguido por IgG-yl Fc humano en la estructura para la terminación N de los aminoácidos 128-285 de AGP-3. La proteína fue expresada en el baculovirus y purificada con la columna de sepharose de la proteína A. APRIL humana etiquetada con Fc fue codificada por una construcción semejante (véase la Figura 21) y expresada en las células CHO y purificada con la columna de sepharose de la proteína A. La proteína TACI soluble (aminoácidos 1-165) y la proteína BCMA (aminoácidos 4-55) seguido por IgG-yl Fc humanan en la estructura, fue expresada en E. coli. Los cuerpos de inclusión formados fueron solubilizados. La proteína replegada fue purificada por cromatografía de intercambio catiónico.

Purificación de la BMCA-Fc humana La purificación de la BCMA-Fc humana producida en E. coli recombinante fue iniciada solubilizando 53.3 g de una preparación del cuerpo de inclusión lavado en una solución que tiene una composición final de cloruro de guanidinio 6M, Tris (HCl) 50 mM, ditiotreitol 8.0 mM. El volumen final de la solución fue de aproximadamente 200 ml . La solución fue ajustada a pH 9.0 a 23 grados centígrados y se dejó agitar a temperatura ambiente durante una hora. La solución del polipéptido solubilizado fue agregada entonces a 3.8 1 de urea 4 M fría, L-arginina 160 M, glicerol al 20% (en volumen) , cisteína 4mM, cistamina 1 mM, Tris 50 mM. .El pH fue ajustado a 8.9 a 12 grados centígrados y la mezcla se deja agitar a 4-8 durante aproximadamente 60 horas. La mezcla para repliegue fue aclarada entonces por filtración a través de un cartucho Cuno 10SP de 0.083 m2 (0.9 pies cuadrados). El filtrado fue concentrado entonces aproximadamente cinco veces y se diafiltró con cinco volúmenes del material retenido de fosfato de sodio 10 mM/cloruro de sodio 40 M, pH 9 utilizando un cásete TFF de celulosa regenerada Pall Filtron de 0.093 m2 que tiene un corte de peso molecular nominal de 50 kDa. El procesamiento fue efectuado a 4-8 grados centígrados. El material retenido fue removido de la unidad, calentado a 20 grados centígrados, y ajustado a pH 5.0 utilizando ácido acético 1 M. Los sólidos precipitados fueron removidos entonces por centrifugación en una centrífuga Beckman-J6-B que opera a 20 grados Centígrados a aproximadamente 2500 x g durante aproximadamente 15 minutos. Se to aron alícuotas del sobrenadante y se almacenaron congeladas á -30 grados centígrados. Las alícuotas del sobrenadante fueron descongeladas y procesadas sobre una columna de 5.0 cm de diámetro x 27.5 cm de altura de SP-Sepharose Fast Flow. Todas las fases de la cromatografía fueron efectuadas a 8 grados centígrados. La columna fue equilibrada utilizando fosfato de sodio 25mM, pH 6.5. El producto fue acondicionado para la carga por el ajuste del pH a 6.5. A continuación de la carga, la columna fue lavada con el amortiguador de equilibrio, y el producto fue eluido entonces con un gradiente lineal de cloruro de sodio desde 17 mM hasta 60 mM en una base de fosfato de sodio 25 mM de pH 6.5, sobre 20 volúmenes de la columna. Las fracciones fueron seleccionadas para el procesamiento adicional con base en su aparición sobre un gel de poliacrilamida de SDS teñido con azul de Coomassie. Las fracciones de SP-Sepharose Fast Flow agrupadas fueron procesadas adicionalmente sobre una columna de 5.0 c de diámetro x 27.5 cm de altura de Butyl Toyopearl 650M, operada a 21 grados centígrados. El producto fue acondicionado previa a la carga agregando fosfato de potasio sólido para dar una concentración final de aproximadamente 0.6 M. La columna fue equilibrada utilizando fosfato de potasio 0.6M, pH 7.0. Después de la carga, la columna fue lavada con 0.5 volúmenes del lecho del amortiguador de equilibrio, y el producto fue eluido entonces utilizando un gradiente lineal desde 0.5 M hasta 0.3 M de fosfato de sodio sobre 15 volúmenes de la columna. Las fracciones del pico de elución de UV predominante fueron agrupadas para procesamiento adicional. Las fracciones agrupadas de la cromatografía de Butyl Toyopearl fueron concentradas veinte veces y diafiltradas contra seis volúmenes del material retenido de la solución salada amortiguada con fosfato utilizando un cásete Millipore XL TFF, operado a 4-8 grados centígrados. A la agrupación del material retenido final se le tomaron alícuotas y se almacenaron a -30 grados centígrados.

Estudio In Vivo Los ratones B6 (de 6-8 semanas de edad) fueron comprados de Charles River Laboratories y APRIL-Flag de murino y otras proteínas fueron inyectadas i.p. de 1 mg/kg/día durante 5 días. El día 1 , las células de los bazos del ratón y los nodos linfáticos mesentéricos fueron colectados y la activación- y diferenciación de las células B y T fue analizada por FACS utilizando el teñido de los anticuerpos monoclonales específicos.

Líneas celulares y ensayos de proliferación Las células epiteliales del riñon humano 293, del linfoma de Raji Burkitt, las células Jurkat del linfoblastoma T humano y A20, la línea celular del linfoma B de ratón, fueron compradas del American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) , Las células A20, Raji y Jurkat fueron mantenidas en un medio completo de RPMI-1640 (Life Technologies) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (HyClone, Logan, Utah) y HEPES 25 mM. Las células 293 fueron cultivadas en un medio de Eagle modificado de Dulbecco (Life Technologies) con 10% de suero de bovino fetal. La proliferación de las células fue determinada por la incubación de 5x104 células/cavidad en 100 µl del medio con la concentración indicada de la proteína APRIL-flag utilizando el ensayo de proliferación celltiter 96 AQ (Promega Corp., Madison, Wl) siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, las células fueron sometidas a impulsos durante 18h con 3H timidina (0.5 µCi/cavidad) después de colectar las células, la incorporación de 3H timidina fue verificada por el conteo de centelleos de líquido.

Transfección y análisis citrométrico de flujo Para las células 293 que expresan el receptor BCMA y TACI, 2X1O6 células 293 fueron colocadas en placas de 6 cavidades, las células fueron transfectadas con lipofectAMINE 2000 siguiendo el procedimiento del fabricante (Life Technologies) , 48 h después de la transfección, las células fueron colectadas e incubadas a 4 C con 1 µg/ml del ligando APRIL-Flage o el ligando Blys (AGP3)-Fc durante 60 minutos, después del lavado 3 veces con PBS (que contiene 2% de FBS), las células fueron teñidas con el anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 30 minutos, luego se lavaron 3 veces con PBS y la fluorescencia fue analizada por el explorador FACS (Becton Dickinson, Mountain View, California) .

Determinación de las afinidades de aglutinación de APRIL y TALL-1 para BCMA y TACI El análisis de interacción biomolecular (BIA) fue efectuado utilizando un aparato BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) . Los receptores BCMA-Fc y TACI-FC (2 µg/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 4.5), fueron inmovilizados sobre Sensor Chip CM5 utilizando el procedimiento de unión de amina estándar BIACORE. Un nivel de inmovilización de aproximadamente 120 RUs fue logrado. Los analitos, Flag-APRIL y Fc-AGP-3 fueron diluidos entre 100 nM-0.01 nM en el amortiguador de la corrida (HEPES 10 mM, NaCl 0.5 M, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0.005%, 2 mg/ml de CM dextrano, pH 6.8) . Los analitos fueron inyectados sobre una superficie receptora inmovilizada durante 2 minutos a 50 µl/min y se dejó disociar durante 10 minutos. La proteína aglutinada fue removida por una inyección de 1 minuto de HCl 50 M. Las afinidades de aglutinación fueron determinadas utilizando un modelo Langmuir 1:1 (programa de Evaluación BIA Versión 3.1.2, BIAGORE) .

Ensayo de co-estimulación de la célula T Las células T de los bazos de los ratones C57 BI/6 fueron purificadas por selección negativa a través de una columna de enriquecimiento de la célula T de murino (R&D Systems) . Las células T (1x105 por cavidad) fueron cultivadas en la ausencia o presencia de varias proteínas de APRIL-Flag durante 48 horas. Alternativamente, las placas de 96 cavidades fueron pre-recubiertas con cantidades subliminales del anticuerpo anti-CD3, las células T fueron tratadas con la proteína APRIL-Flag durante 72 horas, sometidas a impulsos durante las últimas 18 horas con 1 µCi de 3H timidina y se colectaron para contar la radioactividad incorporada.

Proliferación de la célula B y secreción de Ig La célula B del ratón fue seleccionada negativamente de los bazos por la columna de recuperación de la célula B del ratón (Cedarlane, Hornby, Ontario Canadá) . Ixl06/ml fueron sembradas en placas de cultivo del tejido de fondo plano de 96 cavidades en el medio (RPMI-1640, 5% de FBS, 5x10"5 M 2 ME, 2.5 µg/ml de IgM anti-ratón de cabra purificada por afinidad, Pharmingen, San Diego) . Las células B fueron tratadas entonces con la proteína APRIL-Flag más una concentración diferente de la proteína de BCMA-Fc soluble durante 72 horas y el cultivo recibió 1 µCi de 3H timidina durante las últimas 18 horas. La proliferación de la célula B fue cuantificada por la medición de la incorporación de la radioactividad. Para el análisis de la secreción de Ig a partir de las células B, 5xl05/ml células B purificadas fueron cultivadas en placas de cultivo del tej ido de fondo plano de 96 cavidades en la presencia de APRIL-Flag durante seis días. El sobrenadante del cultivo fue colectado y los niveles de IgG, IgM e IgA fueron determinados por una técnica de ELISA de sandwich específico del isotipo. La concentración de Ig en las muestras de prueba fue determinada comparando los valores de la prueba por triplicado con el estándar de control del isotipo.

Inducción y detección de la hemocianina de anti-lapa marina (KLH) y anticuerpos anti-Pneumovax. Los ratones (hembras Balb/c de 9-11 semanas y 19-21 g, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fueron inmunizados el día 0 con 100 µg de KLH (Pierce, Rockford, IL) en CFA c.s. o con 115 µg de Pneumovax (Merck, West Poínt, PA) i.p. Partiendo del día 0, los ratones recibieron 7 inyecciones i.p. diariamente de 5 mg/kg de las proteínas de fusión ya sea de TACI-Fc o BCMA-Fc o Fc no fusionado y después se les extrajo sangre el día 7. IgG e IgM anti-KLH y anti-Pneumovax fueron medidos en el suero por ELISA. Brevemente, para la medición de los anticuerpos anti-KLH, las placas fueron recubiertas con KLH en PBS, bloqueadas, y se agregaron con diluciones de las muestras de prueba y estándar. El IgG o IgM anti-KLH capturados fueron revelados utilizando anticuerpos biotinilados anti-IgG o anti-lgM y HRP conjugado con neutravidina. Para la medición de IgM anti-Pneumovax, las placas fueron recubiertas con Pneumovax utilizando la poli-L-lisina, bloqueadas y agregadas con diluciones de las muestras estándares y de prueba. Los IgG anti-Pneumovax capturados fueron revelados utilizando un anticuerpo biotinilado anti-IgG y HRP conjugado con neutravidina. Los resultados fueron comparados con la prueba t de Student. En un segundo experimento, los ratones normales (n=7) fueron tratados con BCMA-Fc humano, TACI-Fc truncado y Fc no fusionado como un control en dosis diarias de 0.5 mg/kg hasta 15 mg/kg durante 7 días. En la preinmunización fueron no detectables el antí-KLH y anti-Pneumovax. Los anticuerpos fueron medidos en el día 7 y el día 14.

Efecto del hBCMA-Fc en la célula B de la sangre periférica de ratón in vivo Los ratones normales (15 mg/kg ip en los días 0, 3, y 6; n=7) fueron tratados con BCMA-Fc humano y Fc no fusionado como un control en los días 0, 3, y 6 (15 mg/kg) . El nivel de las células B en la sangre periférica y el bazo fue medido el día 7.

Efectos de Flag-mAPRIL, hAGP3, hBCMA-Fc y hTACI-Fc sobre la producción de inmunoglobulina in vitro. Las células B del bazo de murino purificadas fueron cultivadas con LPS (100 ng/ml), AGP3 (lOng/ml) , Flag-APRIL (lOng/ml) o más BCMA-Fc (lOOng/ml) y TACI-Fc (lOOng/ml) durante 12 días. Los sobrenadantes del cultivo fueron colectados el día 7 y el día 12 para detectar IgA y los niveles de IgG.

Efecto de mBCMA-Fc y hTACI-Fc trunc. sobre los niveles de inmunoglobulina in vitro. Los ratones normales fueron tratados con mBCMA-Fc; hTACI-Fc trunc. ; o Fc-control (5 mg/kg ip los días 0, 3, y 6; n=7) . Los niveles de inmunoglobulina en el suero fueron medidos el día 7.

Generación y análisis de anticuerpo monoclonal específico anti-mAPRIL. Flag-mAPRIL fue utilizado como antígeno para la generación de anticuerpos monoclonales específicos anti-mAPRIL de la rata siguiendo los procedimientos estándares. Cuarenta clones que reconocen Flag-APRIL en un ELISA fueron identificados. El efecto de los clones sobre la proliferación de la célula B del ratón mediada por Flag-mAPRIL fue determinada. Las células B del bazo del murino purificado fueron cultivadas en la presencia de lOng/ml de mFlag-APRIL más 2 ug/ml de anti-IgM. El anticuerpo monoclonal anti-Flag-APRIL y el control de IgG de la rata fueron agregados en el cultivo al mismo tiempo. Los datos muestran la incorporación de 3H timidina como cpm, y representa el promedio de las cavidades por triplicado. 5 mg/kg ip de anticuerpo monoclonal #cl9 específico para anti-mAPRIL en los días 0, 3, y 6 fueron utilizados para determinar el efecto del bloqueo de APRIL endógeno sobre anti-Pheumovacs IgM In Vivo .

Modelo de lupus de NZBxNZWFl . Ratones NZBxNZWFl de cinco meses de edad fueron tratados 3 veces/semana (lunes, miércoles, viernes) durante un período de 5 meses con la cantidad indicada de proteína. Una dosis de 100 ug se traduce en 4mg/kg. A los ratones se les extrajo sangre el día de tratamiento hasta el último para analizar los anticuerpos específicos del ADN, las proteínas de histona, etc. También en el día 0, la orina fue tomada y analizada para verificar los niveles de proteína. Se excluyen los animales que ya tienen niveles elevados de proteína en la orina, un signo de lupus. El tratamiento fue inyectado i.p. La orina y la sangre son tomados cada 30 días y analizados hasta el día 150.

Aglutinación con APRIL y estimulación de las células del tumor La aglutinación de APRIL a las líneas celulares del tumor humano fueron determinadas por incubación de las células con lug/ml de Fc-APRIL o Flag-APRIL a continuación del teñido del anticuerpo secundario etiquetado con FITC y análisis FACS. El efecto de APRIL y BCMA-Fc o TACI-Fc sobre el crecimiento de la célula U266-B1: Las células U266 fueron cultivadas en la presencia de lOng/ml de Fc-APRIL humano o más 50 ng/ml de BCMA-Fc soluble, TACI-Fc truncado durante 48 horas. La incorporación de 3H timidina está indicada como cpm. Los datos mostrados representan el promedio de las cavidades por triplicado. El linfoma de la célula B del A20 fue cultivado en la presencia de 50 mg/ml de Flag-APRIL de ratón, Flag-AGP3 humano o más 100 ng/ml de BCMA-Fc soluble durante 48 horas. La incorporación de 3H timidina está indicada como cpm. Los datos mostrados representan el promedio de las cavidades por triplicado.

Crecimiento de la célula del tumor del linfoma B de A20 en ratones Balb/c. Las células A20 (0.2 millones) fueron implantadas, id, el día 0. Los tratamientos con PBS, CHO-Fc, mBCMA-Fc, mTACI-Fc, hTACI-Fc fueron proporcionados (10 mg/kg, ip) en los 'días 0, 7, 10, 13, 16, 19, 22. Las mediciones del tumor se hicieron dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados en los días 27-31, los tumores fueron congelados rápidamente para el aislamiento del ARN, la sangre fue colectada y las muestras del suero fueron congeladas.

Crecimiento del tumor de la línea celular HT29 del carcinoma del colon humano . 2 x 10e células de HT29 más 50% de matrigel se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos. Rx: BCMA-Fc de ratón o ser humano a 2.5, y 15 mg/kg Q2D, iniciando el día 0 (n=10/grupo) . Control 1: CHO-Fc a 15 mg/kg Q2D. Control 2: 0.2 ml de PBS Q2D IP. Volumen del tumor: 3/semana, desde el día 7. El tumor se pesó al final del estudio. Peso corporal 2/semana.

Resultados Función de G7Q/APRIL in vitro G70 de ser humano y ratón, también llamado APRIL, fue aislado y caracterizado (Figuras 1, 2, y 3) . El G70 del ratón soluble etiquetado con FLAG (smG70) fue producido en E^ coli purificado y se volvió a plegar. (Figura 2) . G70 soluble (smG70) estimula específicamente la proliferación de la célula del linfoma de las células B y T de una manera dependiente de la dosis (Figura 4) . Además, G70 soluble: 1) se aglutina específicamente a los receptores de la superficie de la célula expresados sobre las células del linfoma B y T humano (Figura 5); 2) estimula específicamente la proliferación de las células B y T de la sangre periférica humana purificada (Figura 6) ; 3) estimula la proliferación de las células B y T del bazo del murino purificadas de una manera dependiente de la dosis (Figura 7) ; 4) actúa sinergísticamente con el anticuerpo anti-CD28 para estimular la proliferación de las células T de murino purificadas (Figura 8 ) ; tiene una actividad coestimuladora fuerte sobre las células T de murino purificadas (Figura 9) en la presencia de la concentración sub-óptima del activador del receptor de la célula T: anticuerpo anti-CD3.

Función in vivo de G70/APRIL Se efectuaron una serie de experimentos para discernir la actividad biológica de G70/APRIL soluble en los ratones normales in vivo. Cada grupo consistió de 5 ratones (BDF-l, de 8 semanas de edad, dosificados a 1 mg/kg/día, 0.2 ml durante 5 días) . Los nodos linfáticos mesentéricos, del timo y del bazo de tres ratones de cada grupo fueron utilizados para el análisis de FACS utilizando un panel de anticuerpos marcadores de la superficie de la célula B y la célula T y todos los ratones fueron analizados por análisis patológico y de necropsia estándares. Bazo (Tabla ÍA) : G70 de murino soluble provocó un promedio aproximadamente 60% de reducción en el porcentaje de células T CD3+. Además, existió un promedio de incremento de 5 veces en la activación de las células auxiliadoras T y un incremento de 22 veces en promedio en la activación de la célula T citotóxica cuando se mide por la expresión del receptor de IL-2. Además, el porcentaje de células B inmaduras se incrementó aproximadamente 2 veces mientras que el porcentaje de células B maduras se incremento 3 a 4 veces. El porcentaje total de los linfocitos (T+B) permaneció sin cambio comparado con el control . Nodos Linfáticos Mesentéricos (Tabla IB) : Los ratones tratados con G70 soluble tuvieron un promedio del 25% de reducción en el porcentaje de las células T. Existió un promedio de incremento de 3 veces en el % de las células auxiliadoras T activadas y un incremento de 36 veces en las células T citotóxicas activadas como se mide por la expresión del receptor CD25/IL-2. Además, el porcentaje de las células B inmaduras fue incrementado en promedio 2 veces mientras que las. células B maduras lo hicieron hasta en un promedio de 4 veces. En resumen las observaciones preliminares de los inventores indican que G70/APRIL estimula las células tanto T como B en el bazo y los nodos linfáticos mesentéricos. El análisis patológico reveló que los ratones tratados con G70 soluble tuvieron bazos ligeramente agrandados de morfología normal .

G70/APRIL es un ligando para BCMA y TACI G70/APRIL está relacionado con el miembro AGP3/BlyS de la familia del ligando de TNF. El miembro TACI de la familia del receptor de TNFR (Figura 12) se mostró recientemente que va a ser un receptor para AGP3 ( [solicitud de patente No. de Serie A-570A] ) . Además, TACI tiene una correspondencia con el miembro BCMA de la familia del receptor de TNFR del orfano (Figura 10) en un dominio rico en cisteína extracelular conservada (Figura 13) . Estas observaciones conjuntas motivaron a los inventores a investigar si G70/APRIL es un ligando para BCMA y TACI y para probar si además de TACI AGP3/BlyS también es un ligando para BCMA. G70 del ratón soluble se aglutina específicamente a las células 293 que expresan BCMA exógeno (Figura 14) . G70 también se aglutina a las células 293 que expresan TACI (Figura 15) . G70 soluble además bloquea específicamente AGP3/BLyS que se aglutina a los receptores de la superficie celular localizados sobre las células del linfoma B del ratón (Figura 16) . Esto sugiere que G70 y AGP3 ambos se aglutinan a BCMA y TACI. smBCMA-Fc y shTACI-Fc previenen la aglutinación del ligando G70 y AGP3 a los receptores de la superficie de la célula El BCMA soluble (smBCMA-Fc; Figura 10) y TACI soluble (shTACI-Fc) fueron producidos en E. coli purificado hasta la homegeneidad y replegado. El receptor TACI soluble previene específicamente que G70 se aglutine a las células B del ratón (Figura 17) . Además, shBCMA-Fc y shTACI-Fc ambos previenen la aglutinación de AGP3 a las células B (Figura 18; y Figura 19 A) . hBCMA-Fc también mejora la aglutinación de G70 a las células A20 (Figura 19 B) . En resumen: 1) tanto G70 como AGP3 se aglutinan a los miembros TACI y BCMA de la familia del receptor de TNFR del orfano; 2) BCMA y TACI solubles ambos inhiben efectivamente G70 y AGP3 de la aglutinación a las células B; 3) G70 y AGP3 compiten por la aglutinación a los receptores de la superficie de la célula.

Efectos del tratamiento de TACI-Fc y BCMA-Fc sobre la producción de los anticuerpos anti-KLH y anti-Pneumovax. El tratamiento ya sea con TACI-Fc o BCMA-Fc inhibió significativamente la producción de anticuerpos anti-KLH y anti-Pneumovax. Los niveles del suero tanto de IgG como IgM anti-KLH fueron aproximadamente 25% y 19% inferiores, respectivamente, en los ratones tratados con TACI-Fc que los controles (Figura 20) . IgG e IgM anti-KLH del suero fueron aproximadamente 52% y 66% inferiores, respectivamente, en los ratones tratados con BCMA-Fc que los controles (Figura 20) . Los niveles del suero de IgM de anti-Pneumovax también fueron inferiores en los ratones tratados con TACI-Fc y BCMA-Fc que los controles (24% y 42%, respectivamente, Figura 20) .

Segundo experimento: El tratamiento con hBCMA-Fc o Trun-hTACI-Fc reduce los niveles de IgM específicos anti-Pneumovacs en los ratones normales (Figura 29) . Los ratones normales (n=7) fueron tratados con BCMA-Fc humano, TACI-Fc truncado y Fc no fusionado como un control en dosis diarias de 0.5 mg/kg hasta 15 mg/kg durante 7 días. En la preinmunización anti-KLH y anti-Pneumovax fueron indetectables . Los anticuerpos fueron medidos el día 7 y el día 14.

Efectos de hBCMA-Fc sobre el progreso del lupus en ratones NZBXNZWF1. El tratamiento de los ratones NZB/NXWF1 con BCMA-Fc humano incrementó la supervivencia, redujo la proteinurea, redujo el nivel de anticuerpos específicos anti-dsDNA, y redujo el % de células B en la sangre periférica. Protocolo para SLE: ratones NZBxNZWFl de cinco meses de edad fueron tratados 3 veces/semana (lunes, miércoles, viernes) durante un período de 5 meses con la cantidad indicada de proteína. Una dosis de 100 ug se traduce en 4 mg/kg. A los ratones se les tomaron muestras de sangre en el día de tratamiento hasta el último día para ser analizados para verificar los anticuerpos específicos de DNA, proteínas de histona, etc. También en el día 0, la orina fue tomada y analizada para verificar los niveles de proteínas. Los animales que ya tienen niveles elevados de proteína en la orina son excluidos, un signo de lupus. El tratamiento fue inyectado i.p. La orina y la sangre son tomados cada 30 días y analizados hasta el día 150.

Efectos de hBCMA-Fc sobre el crecimiento de las células de. linfoma A20 in vivo. El tratamiento con BCMA-Fc reduce el crecimiento de las células del tumor del linfoma A20 B en ratones Balb/c. Las células A20 (0.2 millones) se implantaron, id, el día 0. Los tratamientos con PBS, CHO-Fc, mBCMA-Fc, hBCMA-Fc, mTACI-Fc, hTACI-Fc fueron provistos (10 mg/kg, ip) en los días 0, 7, 10, 13, 16, 19, 22. Las mediciones del tumor se hicieron dos -veces por semana. Los ratones fueron sacrificados los días 27-31, los tumores fueron congelados rápidamente para el aislamiento del ARN, la sangre se colectó y las muestras de suero fueron congeladas .

Efectos de hBCMA-Fc sobre el crecimiento de las células HT29 del carcinoma del colon humano in vivo. El tratamiento con hBCMA-Fc reduce el crecimiento del volumen del tumor de la línea celular HT29 del carcinoma del colon humano en los ratones. 2xl06 células más 50% de matrigel se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos. Rx: BCMA-Fc humano a 2, 5, y 15 mg/kg Q2D, iniciando el día 0 (n=lO/grupo) . Control 1: CHO-Fc a 15 mg/kg Q2D. Control 2: 0.2 ml de PBS Q2D IP. Volumen del tumor: 3/semana, desde el día 7. El tumor se pesó al final del estudio. Peso corporal 2/semana.

Efecto de Fc-APRIL sobre las células B 'Fc-APRIL humana y AGP3 humana/BlyS/Tall-1 soluble estimula la incorporación de 3H timidina en las células B de murino primarias. Las células B del bazo de murino purificadas fueron cultivadas en la presencia de varias cantidades de Fc-APRIL humana y AGP3 sin etiquetar más 2 ug/ml de anti-lgM. Los datos muestran la incorporación de 3H timidina como cpm, y representa el promedio de las cavidades por -triplicado .

Efecto de hBCMA-Fc sobre la proliferación de la célula B mediada por APRIL hBCMA-Fc y hTACI-Fc inhibe la proliferación de la célula B del ratón mediada por Flag-mAPRIL (Figura 23) . Las células B del bazo del murino purificadas fueron cultivadas con las cantidades indicadas de BCMA-Fc y TACI-Fc solubles en la presencia de 10 ng/ml de Flag-mAPRIL y 2 ug/ml de un anti-lgM durante 72 horas. La incorporación de 3H timidina está indicada cómo cpm. Los datos mostrados representan el promedio de las cavidades por triplicado.

Efecto de hBCMA-Fc sobre los niveles de la célula B de la sangre periférica El hBCMA-Fc (15 mg/kg ip el día 0, 3, y 6) reduce los niveles de la célula B en la sangre periférica del ratón medidos en el día siete . (Figuras 24 y 25) . Los ratones normales (n==7) fueron tratados con BCMA-Fc humano y Fc no fusionado como un control el día 0, 3 y 6 (15 mg/kg) . El nivel de las células B del bazo y la sangre periférica (B220) fue medido el día 7. La producción de IgA mediada por Flag-mAPRIL y hAGP3 es inhibida por hBCMA-Fc y hTACI-Fc in vi tro (Figura 26) . Las células B del bazo de murino purificadas fueron cultivadas con LPS (100 ng/ml), AGP3 (lOng/ml) , Flag-APRIL (10, ng/ml) o más BCMA-Fc (100 ng/ml) y TACI-Fc (100 ng/ml) durante 12 días. Los sobrenadantes del cultivo fueron colectados el día 7 y el día 12 para detectar el nivel de IgA. La producción de IgG mediada por Flag-mAPRIL y hAGP3 es inhibida por hBCMA-Fc y hTACI-Fc in vi tro (Figura 27) .

Efecto de BCMA-Fc sobre la inmunoglobulina total in vivo. Los niveles totales de IgE e IgA son reducidos en -los ratones normales tratados con mBCMA-Fc y hTACI-Fc trun (5 mg/kg ip el día 0, 3, y 6) . Los ratones normales (n=7) fueron tratados con BCMA-Fc humano, TACI-Fc Truncado y Fc no fusionado como un control en el día 0, 3 y 6 (5 mg/kg) . Los niveles de inmunoglobulina en el suero fueron medidos el día 7) .

Efecto del anticuerpo monoclonal específico de anti-mAPRIL . El anticuerpo monoclonal #cl9 específico para anti-mAPRIL inhibe la proliferación de la célula B de ratón mediada por Flag-mAPRIL (Figura 30) . Las células B del bazo de murino purificadas fueron cultivadas en la presencia de lOng/ml mFlag-APRIL más 2 ug/ml de anti-IgM. El anticuerpo monoclonal c-19 anti-Flag-APRIL y el control de IgG de la rata fueron agregados en el cultivo al mismo tiempo. Los datos mostraron la incorporación de 3H timidina como cpm, y representan el promedio de las cavidades por triplicado. El tratamiento con el anticuerpo monoclonal #cl9 específico para anti-mAPRIL inhibe la generación de anticuerpos específicos anti-Pneumovacs in vivo (Figura 31) .

Aglutinación de APRIL y efecto sobre las células del tumor. APRIL se aglutina a un número de líneas celulares del tumor (Figura 36) . La aglutinación de APRIL a las líneas de la célula del tumor humano fue determinada por la incubación de la célula con 1 ug/ml de Fc-APRIL o Flag-APRIL a continuación del teñido con el anticuerpo secundario etiquetado con FITC y análisis FACS. APRIL estimula el crecimiento de la célula U266-B1 y esta puede ser inhibida por BCMA-Fc o TACI-Fc (Figura 37) . Las células U266 fueron cultivadas en la presencia de lOng/ml de Fc-APRIL humana o más 50 ng/ml de BCMA-Fc soluble, TACI-Fc Truncada durante 48 horas. La incorporación de 3H timidina está indicada como cmp. Los datos mostrados, representan el promedio de las cavidades por triplicado.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método de inhibición de la proliferación o activación de las células T o B en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende: a. un partícipe de aglutinación específica para TACI, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad antagonista de TACI; b. un partícipe de aglutinación específica para BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad antagonista de BCMA; c. ambos de a y b; o d. un partícipe de aglutinación específica para TACI y
BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene actividad antagonista de TACI, actividad antagonista de BCMA o ambas. 2. Un método de inhibición de la actividad de
APRIL en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende: a. un partícipe de aglutinación específica para TACI, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene actividad antagonista de TACI; b. un partícipe de aglutinación específica para BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad antagonista de BCMA; c. ambos de a y b; o d. un partícipe de aglutinación específica para TACI y BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene actividad antagonista de TACI, actividad antagonista de BCMA o ambas. 3. Un método de inhibición de la actividad de TACI, la actividad de BCMA, o ambas en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar un partícipe de aglutinación específica para APRIL .
4. El método de conformidad con la reivindicación 3. caracterizado porque comprende además la administración de un partícipe de aglutinación específica para AGP-3.
5. Un método para incrementar la proliferación de la célula T en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende: a. un partícipe de aglutinación específica para TACI, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad agonista de TACI; b. un partícipe de aglutinación específica para BCMA, en donde el partícipe de aglutinación- específica tiene una actividad agonista de BCMA; c. ambos de a y b; o d. un partícipe de aglutinación específica para TACI y BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene actividad agonista de TACI, actividad agonista de BCMA o ambas.
6. Un método para incrementar la actividad de APRIL en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende: a. un partícipe de aglutinación específica para TACI, en donde el participe de aglutinación específica tiene una actividad agonista de TACI; b. un partícipe de aglutinación específica para BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene una actividad agonista de BCMA; c. ambos de a y b; o d. un partícipe de aglutinación específica para TACI y BCMA, en donde el partícipe de aglutinación específica tiene actividad agonista de TACI, actividad agonista de BCMA o ambas.
7. Un método de tratamiento de trastornos linfoproliferativos de la célula B, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a. la región extracelular de TACI (SEC ID NO: 15) ; b. la región extracelular de BCMA (SEC ID NO: 6) ; c. la región de consenso de TACI (SEC ID NO: 16) ; d. la región de consenso de BCMA (SEC ID NO: 7) ; e. la secuencia de consenso extracelular de TACI/BCMA (SEC ID NO: 13) .
8. Un método de tratamiento de trastornos linfoproliferativos de la célula T, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a. la región extracelular de TACI (SEC ID NO: 15) ; b. la región extracelular de BCMA (SEC ID NO: 6) ; c. la región de consenso de TACI (SEC ID NO: 16); d. la región de consenso de BCMA (SEC ID NO: 7) ; e. la secuencia de consenso extracelular de TACI/BCMA (SEC ID NO: 13) .
9. Un método de tratamiento de uno o más tumores sólidos, caracterizado porque comprende administrar un agente terapéutico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a. la región extracelular de TACI (SEC ID NO: 15); b. la región extracelular de BCMA (SEC ID NO: 6) ; c. la región de consenso de TACI (SEC ID NO: 16); d. la región de consenso de BCMA (SEC ID NO: 7);- e. la secuencia de consenso extracelular de TACI/BCMA (SEC ID NO: 13) .
10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el tumor es seleccionado del pulmón, gastrointestinal, pancreático y de la próstata.
11. El método de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porgue el partícipe de aglutinación específica es un anticuerpo .
12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
13. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo derivado de un banco de exhibición del fago.
14. Los métodos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizados porque el partícipe de aglutinación específica es un péptido.
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el participe de aglutinación específica está comprendido dentro de una molécula de la fórmula (X1)a-F1-(X2)b en donde: F1 es un vehículo; X1 y X2 son seleccionados cada uno independientemente de -(L^-P1, - (L1) c-P1- (L2) d-P2, -(L^c-P1- (L2)d-P2-(L3)e-P3, Y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4 P1, P2, P3, y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptido, en donde al menos uno es un partícipe de aglutinación específica; L1, L2, L3, y L4 son cada uno independientemente enlazadores; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 o 1, siempre que al menos uno de a y b sea 1.
16. El método de la reivindcación 15, caracterizado porque la molécula comprende una estructura de las fórmulas: X^F1 o F^X2.
17. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula comprende una estructura de la fórmula
18. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula comprende una estructura de la fórmula en donde uno de P1 y P2 es un partícipe de aglutinación específica para TACI y el otro es un partícipe de aglutinación específica para BCMA.
19. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula comprende una estructura de la fórmula en donde uno de P1 y P2 es un partícipe de aglutinación específica para APRIL y el otro es un partícipe de aglutinación específica para AGP-3.
20. El método de la reivindicación 15 de la fórmula caracterizado porque uno de P1 y P2 es un partícipe de aglutinación específica para APRIL y el otro es un partícipe de aglutinación específica para AGP-3.
21. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque el vehículo es un dominio de Fc.
22. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque el partícipe de aglutinación específica comprende una secuencia seleccionada de: a. la región extracelular de TACI .(SEC ID NO: 15) ; b. la región extracelular de BCMA (SEC ID NO: 6) ; c. la región de consenso de TACI (SEC ID NO: 16) ; d. la región de consenso de BCMA (SEC ID NO: 7) ; e. la secuencia de consenso extracelular de TACI/BCMA (SEC ID NO: 13) .
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7, 8, 9 y 22, caracterizado porque el partícipe de aglutinación específica está unido covalentemente a un vehículo.
24. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque el vehículo es un dominio de Fc.
25. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque el partícipe de aglutinación específica está comprendido dentro de una molécula que tiene una secuencia de anticuerpos en la cual una o más regiones de CDR de anticuerpo son reemplazadas por una o más secuencias seleccionadas de: a. la región extracelular de TACI (SEC ID NO: 15) ; b la región extracelular de BCMA (SEC ID NO: 6) ; c la región de consenso de TACI (SEC ID NO : 16) ; d la región de consenso de BCMA (SEC ID ?O: 7); e la secuencia de consenso extracelular de TACI/BCMA (SEC ID ?O: 13) ; f. la secuencia de un péptido capaz de aglutinarse específicamente a APRIL; y g. la secuencia de un péptido capaz de aglutinarse específicamente a AGP-3.
26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7, 8, y 9, caracterizado porque la secuencia de aminoácido reemplaza una región de CDR dentro de una molécula de anticuerpo.
27. Una composición de materia de la fórmula caracterizada porque: - F es un vehículo; X1 y X2 son seleccionados cada uno independientemente de -(L^-P1, - (L1) c-P1- (L2) d-P2,_ -(L^c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3, y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4 P1, P2, P3, y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptido, en donde al menos uno es un partícipe de aglutinación específica para TACI, BCMA, o APRIL; L1, L2, L3, y L4 son cada uno independientemente enlazadores; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 o 1, siempre que al menos uno de a y b sea 1.
28. La composición de materia de la reivindicación 27, caracterizada porque tiene la fórmula: X1-F1 F^X2.
29. La composición de materia de la reivindicación 27, caracterizada porque tiene la fórmula:
30. La composición de materia de la reivindicación 27, caracterizada porque tiene la fórmula: " F1- (I,1 ) c-P1- ( 2 ) d-P2 en donde uno de P1 y P2 es un partícipe de aglutinación específica para TACI y el otro es un partícipe de aglutinación especifica para BCMA.
31. La composición de materia de la reivindicación 27, caracterizada porque el vehículo es un dominio de Fc.
32. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica la composición de materia de la reivindicación 31.
33. El ácido nucleico de la reivindicación 32, caracterizado porque incluye uno o más codones preferidos para la expresión de Escherichia coli.
34. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de la reivindicación 32.
35. Una célula huésped, caracterizada porque está transformada o transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 34.
36. La célula huésped de la reivindicación 35, caracterizada porque la célula es una célula procariótica.
37. La célula huésped de la reivindicación 36, caracterizada porque la célula es de Escherichia coli. RESUMEN DE IA INVENCION Esta invención se refiere a interacciones entre APRIL/G70, AGP-3/BLYS, BCMA, y TACI y a métodos relacionados de uso y a composiciones de materia. Se ha encontrado que (1) sAPRIL/G70 se aglutina a los receptores BCMA y TACI de la superficie celular sobre las células del linfoma T y B, conduciendo a la estimulación de la proliferación de las células B y T del ratón y del ser humano, primarias, tanto in vitro como in vivo; (2) APRIL compite con la aglutinación de AGP3 a TACI y BCMA; (3) sBCMA inhibe la aglutinación de APRIL y AGP3 a sus receptores; (4) sBCMA mejora las respuestas inmunes humorales de la célula T y dependientes de la célula T, in vivo; (5) sTACI inhibe la aglutinación de APRIL y AGP3 a sus receptores y mejora las respuestas inmunes humorales dependientes de la célula T e independientes de la célula T in vivo; y (6) BCMA exhibe una semejanza con TACI dentro de un dominio rico en cisteína único localizado N-terminal con respecto a un dominio potencial de la transmembrana. Estos descubrimientos proporcionan una estrategia para el desarrollo de métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, y cáncer, para la prevención del rechazo de trasplantes. Los estados de enfermedad y los parámetros de enfermedad asociados con APRIL y AGP-3 pueden ser afectados por la modulación de BCMA o TACI; los estados de enfermedad y los parámetros asociados con TACI pueden ser afectados por la modulación de APRIL; los estados de enfermedad y los parámetros pueden ser afectados por la modulación de TACI, BCMA, APRIL y AGP-3 por un agente terapéutico único o dos o más agentes terapéuticos conjuntamente.