ES2287130T3 - Polipeptidos para inhibir la proliferacion de celulas b y t inducida por april. - Google Patents
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Abstract
Uso de un asociado de unión específica de APRIL seleccionado de: i) SEC ID Nº 16; o ii) SEC ID Nº 13; para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades o trastornos relacionados con el sistema inmune e inflamatorios, autoinmunes y otros relacionados con el sistema inmune, enfermedades linfoproliferativas y otros cánceres, o para la prevención del rechazo de transplante, mediante la inhibición de la actividad APRIL, la inhibición de la actividad TACI, la inhibición de la actividad TACI y BCMA, o la inhibición de la proliferación o activación de células B o T en un mamífero.
Description
Polipéptidos para inhibir la proliferación de
células B y T inducida por APRIL.
La presente invención se refiere a proteínas que
están implicadas en inflamación e inmunomodulación, supervivencia o
activación o en trastornos linfoproliferativos u otros cánceres. La
invención se refiere además a proteínas relacionadas con la
superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF)/factor de
crecimiento nervioso (NGF) y a ácidos nucleicos relacionados, a
vectores de expresión, a células huésped y a ensayos de unión. La
memoria descriptiva describe también composiciones y métodos para
el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con el
sistema inmune e inflamatorios, autoinmunes y otros relacionados con
el sistema inmune tales como artritis reumatoide (AR), enfermedad
de Crohn (EC), lupus y enfermedad de injerto contra huésped (EICH),
así como para el tratamiento de enfermedades linfoproliferativas y
otros cánceres.
Después de años de estudio de la necrosis de
tumores, se clonaron finalmente los factores de necrosis tumoral
(TNF) \alpha y \beta en 1984. Los años posteriores fueron
testigos de la emergencia de una superfamilia de citocinas TNF,
incluyendo ligando fas (FasL), ligando CD27 (CD27L), ligando CD30
(CD30L), ligando CD40 (CD40L), ligando inductor de la apoptosis
relacionada con TNF (TRAIL, también designado
AGP-1), proteína de unión a osteoprotegerina
(OPG-BP o ligando OPG), ligando
4-1BB, LIGHT, APRIL y TALL-1, Smith
et al. (1994), Cell, 76: 959-962;
Lacey et al. (1998), Cell, 93:
165-176; Chichepotiche et al., (1997), J.
Biol. Chem., 272: 32401-32410; Mauri et
al. (1998), Immunity, 8: 21-30; Hahne
et al. (1998), J. Exp. Med., 188:
1185-1190; Shu et al., (1999), J.
Leukocyte Biology, 65: 680-683. Esta familia
está unificada por su estructura, particularmente en la terminación
C. Además, la mayoría de los miembros conocidos hasta la fecha se
expresan en compartimentos inmunes, aunque algunos miembros se
expresan también en otros tejidos y órganos. Smith et al.
(1994) Cell, 76: 959-962. Todos los miembros
ligandos, con la excepción de LT-\alpha, son
proteínas transmembrana de tipo II caracterizadas por una región de
150 aminoácidos conservada dentro del dominio extracelular
C-terminal. Aunque limitado a sólo un
20-25% de identidad, el dominio de 150 aminoácidos
conservado se pliega en un sándwich de lámina \beta plegada
característico y trimeriza. Esta región conservada puede liberarse
proteolíticamente, generando así una forma funcional soluble. Banner
et al. (1993), Cell, 73: 431-445.
Muchos miembros dentro de esta familia de
ligandos se expresan en tejidos enriquecidos en linfoides y
desempeñan papeles importantes en el desarrollo y la modulación del
sistema inmune. Smith et al. (1994). Por ejemplo, el
TNF\alpha se sintetiza principalmente por macrófagos y es un
mediador importante de respuestas inflamatorias y defensas inmunes.
Tracey & Cerami (1994), Annu. Rev. Med., 45:
491-503. El Fas-L, expresado
predominantemente en células T activadas, modula la apoptosis
mediada por TCR de timocitos. Nagata, S. & Suda, T. (1995)
Immunology Today, 16: 39-43; Castrim et
al., (1996), Immunity, 5: 617-627. El
CD40L, también expresado por células T activadas, proporciona una
señal esencial para la supervivencia, proliferación y cambio de
isotipo de inmunoglobulina de células B. Noelle (1996),
Immunity, 4: 415-419.
Se han identificado los receptores semejantes
para la mayoría de los miembros de la familia del ligando TNF.
Estos receptores comparten repeticiones ricas en cisteína múltiples
características dentro de sus dominios extracelulares, y no poseen
motivos catalíticos dentro de las regiones citoplásmicas. Smith
et al., (1994). Los receptores señalizan mediante
interacciones directas con proteínas de dominio de muerte (por
ejemplo, TRADD, FADD y RIP) o con proteínas TRAF (por ejemplo,
TRAF2, TRAF3, TRAF5 y TRAF6), desencadenando rutas de señalización
divergentes y superpuestas, por ejemplo, apoptosis, activación de
NF-\kappaB o activación de JNK. Wallach et
al (1999), Annual Review of Immunology 17:
331-367. Estos eventos de señalización conducen a
la muerte, proliferación, activación o diferenciación celular. El
perfil de expresión de cada miembro receptor varía. Por ejemplo, el
TNFR1 se expresa en un amplio espectro de tejidos y células,
mientras que el receptor de superficie celular de OPGL está
limitado principalmente a los osteoclastos. Hsu et al. (1999)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 3540-3545.
Se cree que dichas proteínas desempeñan un papel en procesos
inflamatorios e inmunes, sugiriendo su utilidad en el tratamiento
de trastornos autoinmunes e inflamatorios.
Una serie de grupos de investigación han
identificado recientemente ligandos de la familia de TNF con la
misma secuencia o sustancialmente similar, pero no han identificado
el receptor asociado. El ligando se ha nombrado de diversas
maneras: neutrocina-\alpha (documento WO
98/18.921, publicado el 7 de mayo de 1998), 63954 (documento WO
98/27.114, publicado el 25 de junio de 1998), TL5 (documento EP
869.180, publicado el 7 de octubre de 1998), NTN-2
(documentos WO 98/55.620 y WO 98/55.621, publicados el 10 de
diciembre de 1998), TNRL1-alfa (documento WO
99/11.791, publicado el 11 de marzo de 1999), ligando kay (documento
WO99/12.964, publicado el 18 de marzo de 1999) y
AGP-3 (sol. prov. de EE.UU nº 60/119.906, presentada
el 12 de febrero de 1999 y nº 60/166.271, presentada el 18 de
noviembre de 1999, respectivamente). De aquí en adelante en la
presente memoria, esta secuencia proteica se designa como
"AGP-3".
Un artículo reciente ha identificado dos
proteínas conocidas anteriormente como receptores de
AGP-3. Gross et al. (2000), Nature,
404: 995-999. El primer receptor se identificó
anteriormente como un receptor de superficie de linfocito llamado
activador transmembrana e interactor con CAML (TACI). Véanse el
documento WO 98/39.361, publicado el 11 de septiembre de 1998, y
von Bulow & Bram (1997), Science, 278:
138-140, cada uno de los cuales está incorporado a
la presente memoria como referencia en su totalidad. Según estas
referencias, el TACI se une a un ligando de ciclofilina
intracelular designado CAML, que modula la ruta de señalización de
calcio en linfocitos.
El segundo receptor identificado para
AGP-3 es la denominada proteína de maduración de
células B (BCMA). El gen de BCMA humana se descubrió mediante el
análisis molecular de una translocación t(4:16) que
caracteriza un linfoma de células T humanas. Laabi et al.
(1993), EMBO J., 11: 3897-3904. Se reseñó que
el ARNm de BCMA se encontraba principalmente en tejidos linfoides.
El ADNc de BCMA humana codifica una proteína de 184 aminoácidos
(185 residuos para el ratón), la bibliografía no reseña similitudes
obvias con ninguna proteína ni motivo conocido, y su función
permaneció desconocida. Se reseñó que la proteína residía en el
aparato de Golgi (Gras et al., (1995), Intl.
Immunol., 7: 1093-1106). Recientes
especulaciones sugirieron que la BCMA puede ser un miembro distante
de la superfamilia de TNFR. Madry et al. (1998), Intl.
Immunol., 10: 1693-1702.
Un ligando denominado APRIL o G70 es un ligando
de la familia de TNF que sigue sin un receptor reseñado en la
bibliografía. Según la bibliografía, el APRIL está asociado a cáncer
de próstata, cáncer de mama, enfermedad de Alzheimer, trastornos
inmunes, trastornos inflamatorios y anormalidades gestacionales.
Véanse los documentos WO 99/00518 (26 de junio de 1997), WO
99/11.791 (5 de septiembre de 1997), WO 99/12.965 (12 de septiembre
de 1997), EP 911.633 (8 de octubre de 1997), EP 919.620 (26 de
noviembre de 1997), WO 99/28.462 (3 de diciembre de 1997), WO
99/33.980 (30 de diciembre de 1997), WO 99/35170 (5 de enero de
1998) y Hahne et al. (1998), J. Exp. Med., 188:
1185-1190. Un artículo reciente describía isoformas
de APRIL y sugería que el APRIL causa la muerte celular. Kelly
et al. (2000), Cancer Res., 60:
1021-1027. La técnica se beneficiaría de la
identificación de un receptor de APRIL y de una aclaración de su
actividad.
Se ha encontrado ahora que el sG70 (APRIL) se
une a receptores de superficie celular en células de linfoma T y B,
dando como resultado la estimulación de la proliferación de células
B y T primarias humanas y de ratón tanto in vitro como in
vivo. Se ha encontrado ahora que la BCMA y el TACI son
receptores de superficie celular de APRIL. Se ha encontrado también
que el APRIL compite con la unión de AGP-3 a TACI y
BCMA. Además, se muestra aquí que la sBCMA inhibe la unión de APRIL
y AGP-3 a sus receptores. La sBCMA mejora las
respuestas inmunes humorales dependientes de células T e
independientes de células T in vivo. Además, se ha encontrado
que el sTACI inhibe la unión de APRIL y AGP-3 a sus
receptores y mejora las respuestas inmunes humorales dependientes
de células T e independientes de células T in vivo. Además,
se ha encontrado ahora que la sBCMA reduce el crecimiento tumoral
de células de linfoma y carcinoma de colon in vivo. Se ha
encontrado ahora también que la sBCMA aumenta la supervivencia y
reduce la incidencia de proteinuria y el desarrollo de anticuerpos
anti-ADNbc en un modelo animal de lupus. Se ha
encontrado también que la BCMA exhibe similitud con el TACI en un
solo dominio rico en cisteínas localizado N-terminal
a un dominio transmembrana potencial. Se ha encontrado también que
el APRIL estimula el crecimiento de células B y la producción de
inmunoglobulina in vitro e in vivo. Además, el
tratamiento con un anticuerpo anti-APRIL de bloqueo
mejora la generación de inmunoglobulina específica de antígeno,
sugiriendo que el APRIL endógeno es necesario para la inmunidad
humoral in vivo. Esta invención se refiere a nuevos métodos
de uso y a composiciones de material que explota estos
descubrimientos. Los descubrimientos proporcionan una estrategia
para el desarrollo de terapias para el tratamiento de enfermedades
autoinmunes y cáncer, y para la prevención del rechazo de
transplante.
Estos descubrimientos muestran que la actividad,
estados patológicos y parámetros de enfermedad asociados a APRIL y
AGP-3 pueden estar afectados por la modulación de
BCMA. Igualmente, los estados patológicos y parámetros de
enfermedad asociados a TACI pueden estar afectados por la modulación
de APRIL. Además, dichos estados patológicos y parámetros de
enfermedad pueden estar afectados por la modulación de cualquiera de
TACI, BCMA, APRIL y AGP-3 conjuntamente. Este
descubrimiento sugiere además moléculas y métodos de tratamiento
mediante los que más de uno de TACI, BCMA, APRIL y
AGP-3 pueden modularse por una sola molécula.
La Figura 1 muestra la secuencia de APRIL humano
(SEC ID Nº 1 y 2)
Los codones de inicio y terminación están
subrayados.
Las Figuras 2A y 2B muestran las secuencias de
ADN y aminoácidos de APRIL/G70 de ratón (SEC ID Nº 3 y 4,
respectivamente). Los codones de inicio y terminación están
subrayados. Se proporciona también la secuencia de aminoácidos de
APRIL de ratón soluble marcado con FLAG (SEC ID Nº 19).
La Figura 3 muestra un alineamiento de APRIL
humano (SEC ID Nº 22) y de ratón (SEC ID Nº 23). La línea media de
cada fila muestra la secuencia consenso (SEC ID Nº 24).
La Figura 4 muestra que G70/APRIL es un potente
estimulante de linfoma de células B y T. La Figura 4A muestra la
estimulación dependiente de la dosis de la proliferación de células
Jurkat (células T leucémicas humanas), Raji (linfoma de Burkitt
humano) y K562 (células de leucemia mielogenosa crónica humana). Se
determinó la proliferación de células incubando 3 x 10^{4}
células/pocillo en 100 \mul de medio con la concentración
indicada de sG70/APRIL recombinante y solución salina tamponada con
fosfato (PBS, sin ligando) como control. Después de 48 horas, se
midió el número de células viables mediante un ensayo de
proliferación Celltiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). En la Figura
4B, las células U937 (células leucémicas similares a monocitos),
NIH/3T3 (estirpe celular de embrión de ratón) y 293 (estirpe
celular primaria humana transformada de riñón embrionario) no
respondieron a la estimulación con sG70/APRIL.
Las Figuras 5A y 5B muestran un análisis FACS de
la unión a receptor de G70/APRIL. Se evaluó la expresión del
receptor de G70/APRIL en la estirpe celular indicada utilizando
anticuerpo monoclonal anti-Flag seguido de
anticuerpo de cabra conjugado a FITC contra IgG de ratón. Se utilizó
un anticuerpo monoclonal anti-CD16/CD32 de ratón
(bloqueo Fc) para bloquear la unión no específica a células.
La Figura 6 muestra el efecto de sG70/APRIL
sobre la proliferación de células B, células T y granulocitos de
sangre periférica. Se purificaron células T (CD4+ y CD8+), células B
y granulocitos periféricos humanos a partir de tres donantes
diferentes utilizando anticuerpos del cóctel RosetteSep (Stem Cell
Tech., Vancouver). Se cultivaron células purificadas en pocillos de
plástico tratados con cultivo de tejido
(Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ) durante 6 días
en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero de
ternero fetal, L-glutamina 2 mM y
2-ME (50 \muM) a las presentes concentraciones
diferentes de sG70/APRIL. Para el ensayo de proliferación de
células B, se recubrieron pocillos de plástico con anticuerpo
monoclonal de ratón purificado anti-IgM humana (3
\mug/ml, Pharmingen, San Diego, CA). El control positivo para la
estimulación de células T es IL-2.
La Figura 7 muestra el efecto de G70/APRIL sobre
la proliferación de células T y B de múrido in vitro. Se
purificaron células T y B de bazos de ratones C57B1 mediante
selección con columnas de enriquecimiento de células T y células B
de múrido. Se cultivaron 1 x 10^{5} células por pocillo en
ausencia o presencia de diversos G70/APRIL durante 48 horas, se
sometieron a pulsos durante las últimas 18 horas con 0,5 \muCi de
^{3}H-timidina y se recogieron para contar la
radiactividad incorporada.
La Figura 8 muestra el efecto de G70/APRIL sobre
la proliferación de células T de múrido coestimulada mediante
anticuerpo anti-CD28. Se purificaron células T de
bazos de ratones C57B1 mediante selección con una columna de
enriquecimiento en células T de múrido. Se trataron 1 x 10^{5}
células T por pocillo con G70/APRIL en ausencia o presencia de una
concentración subliminal de anticuerpo anti-CD28
(0,9 \mug/ml) durante 48 horas, se sometieron a pulsos durante
las últimas 18 horas con 0,5 \muCi de
^{3}H-timidina y se recogieron para contar la
radiactividad incorporada.
La Figura 9 muestra el efecto de G70/APRIL sobre
la proliferación de células T de múrido coestimulada mediante
anticuerpo anti-CD3. Se purificaron células T de
bazos de ratones C5B71 mediante selección con una columna de
enriquecimiento en células T de múrido. Se trataron 1 x 10^{5}
células T por pocillo con G70/APRIL en ausencia o presencia de una
concentración subliminal de anticuerpo anti-CD3 (0,9
\mug/ml) durante 48 horas, se sometieron a pulsos durante las
últimas 18 horas con 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina
y se recogieron para contar la radiactividad incorporada. La Tabla
1 muestra el análisis FACS de bazo (Tabla 1A) y nódulos linfáticos
mesentéricos (Tabla 1B) después de la administración sistémica in
vivo de miembros de la familia de TNF. Se han ensayado in
vivo varios miembros de la familia de TNF, teniendo cada grupo 5
ratones (BDF-1, de 8 semanas de edad, dosis: 1
mg/kg/día en 0,2 ml durante 5 días). Se han aislado bazo, timo y
nódulos linfáticos mesentéricos de tres ratones de cada grupo para
análisis FACS utilizando un panel de anticuerpos marcados de
superficie celular de células T y células B. Se han resumido los
resultados del análisis FACS en las siguientes tablas.
Las Figuras 10A y 10B muestran la secuencia de
BCMA humana (SEC ID Nº 5). El dominio extracelular de BCMA (SEC ID
Nº 6) se extiende desde el aa 1 al aa 51 y se identifica por
flechas. La región consenso rica en cisteína (SEC ID Nº 7, descrita
detalladamente a continuación en la presente memoria) se muestra en
negrita. La región transmembrana (SEC ID Nº 8) está subrayada.
huBCMA-Fc (SEC ID Nº 9). mBCMA-Fc
(SEC ID Nº 10).
La Figura 11 muestra un alineamiento de la
secuencia de aminoácidos de BCMA humana y la secuencia de
aminoácidos de BCMA de múrido (SEC ID Nº 11). La secuencia humana
se muestra en la línea superior, la de múrido en la línea inferior
de cada fila. La secuencia consenso humana-de múrido
(SEC ID Nº 12) aparece en la línea media de cada fila. Un "+"
en la secuencia consenso indica una sustitución conservativa. La
porción rica en cisteína de la secuencia consenso (SEC ID Nº 13)
aparece en negrita.
Las Figuras 12A y 12B muestran la secuencia de
hTACI (SEC ID Nº 14). El dominio extracelular de TACI (SEC ID Nº
15) se extiende del aa 1 al aa 166. La región consenso rica en
cisteína (SEC ID Nº 16) se muestra en negrita, y la región
transmembrana (SEC ID Nº 17) está subrayada.
hTACI-Fc (SEC ID Nº 18).
La Figura 13 muestra un alineamiento de regiones
extracelulares ricas en cisteína de TACI humano y BCMA humana. La
región consenso rica en cisteína de BCMA (SEC ID Nº 20) aparece en
la línea superior, la región consenso rica en cisteína de TACI (SEC
ID Nº 21) aparece en la línea inferior de cada fila. Los residuos de
aminoácidos conservados se indican por una barra vertical (I). Los
residuos de aminoácidos
\hbox{relacionados se indican con dos
puntos (:).}
Las Figuras 14A, 14B y 14C muestran la unión de
G70/APRIL de ratón soluble a células 293 que expresan el gen de
BCMA. Se incubaron células 293 humanas transfectadas con los
vectores pmBCMA y pcDNA3 con G70/APRIL-Flag,
seguido de tinción con anticuerpo anti-Flag
conjugado con FITC para análisis FACS. A. Las células 293 se
transfectaron con vector pcDNA3 solo. B. Las células 293 se
transfectaron con vector pmBCMA antisentido. C. Las células 293 se
transfectaron con vector pmBCMA con sentido.
La Tabla 2 muestra el análisis BIACore de la
cinética de unión estequiométrica de APRIL y AGP-3 a
BCMA y TACI. El APRIL-Flag se une específicamente a
BCMA de múrido y humana con afinidades de 0,25 nM y 0,29 nM,
respectivamente, y a TACI humano con una afinidad de 1,48 nM.
También una versión más larga de APRIL marcado con Flag (aa
50-240) se une a BCMA y TACI con una alta afinidad
similar a la de AGP-3-Fc (Tabla 2).
En experimentos separados, se determinó que ni APRIL ni
AGP-3 se unen a OPG y también que TNF\alpha, OPGL,
LIGHT, TWEAK y TRAIL no se unen a BCMA ni a TACI. Por tanto, APRIL
y AGP-3 se unen específicamente tanto a BCMA como a
TACI con alta afinidad.
La Figura 15 muestra la unión de G70/APRIL a
células 293 que expresan el gen de hTACI. Se incubaron células 293
humanas transfectadas con los vectores phTACI y pcDNA3 con
G70/APRIL-Flag, seguido de tinción con anticuerpo
anti-Flag conjugado con FITC para análisis FACS. En
la Figura 15A, se transfectaron células 293 con el vector phTACI.
En la Figura 15B, se transfectaron células 293 con el vector pcDNA3
solo.
La Figura 16 muestra que G70/APRIL bloquea
completamente la unión de AGP-3 a su receptor. Se
tiñeron células A20 de linfoma B de ratón con
AGP-Fc o con 10 x exceso de G70/APRIL, ligando CD40,
ligando TRAIL y Tweak. Después de lavar 3 veces, se incubaron las
células con anticuerpo secundario de cabra
anti-IgG-Fc humana conjugado con
FITC. En la Figura 16A, 10 x G70/APRIL bloqueaba completamente la
unión de AGP-3 a células A20. En las Figuras 16B, C
y D, 10 x ligando CD40, Tweak y TRAIL no tienen ese efecto sobre la
unión de
AGP-3.
AGP-3.
La Figura 17 muestra que la unión de receptor de
TACI soluble (sTACI) compite con la unión de G70/APRIL a células
A20. Se incubaron las células A20 con G70/APRIL o al mismo tiempo
con 10 x receptor de TACI soluble, TRAIL R2 y TRAIL R3, seguido de
tinción con anticuerpo anti-Flag conjugado con FITC
para análisis FACS. En la Figura 17A, el receptor de TACI soluble
competía parcialmente en la unión con la unión de G70/APRIL a
células A20. En las Figuras 17B y 17C, los receptores TRAIL R2 y
TRAIL R3 solubles no interferían con la unión de
G70/APRIL.
G70/APRIL.
La Figura 18 muestra que la proteína de fusión
receptor de BCMA humana soluble-Fc
(shBCMA-Fc) y la proteína de fusión receptor de
TACI humano soluble-Fc (shTACI-Fc)
bloquean completamente la unión de la proteína de fusión receptor
de AGP-3 humana soluble-Fc
(shAGP-3-Fc) a células A20. Se
incubaron las células A20 con
shAGP-3-Fc o al mismo tiempo con 10
x shBCMA-Fc o shTACI-Fc, seguido de
tinción con anticuerpo anti-Flag conjugado con FITC
para análisis FACS.
La Figura 19A muestra que la
shBCMA-Fc bloquea completamente la unión de
shAGP-3-Fc a células A20. Se
incubaron las células A20 con
shAGP-3-Fc con o sin 10 x hBCMA
soluble-Fc, seguido de tinción con anticuerpo
anti-Flag conjugado con FITC para análisis FACS. La
Figura 19B muestra que la shBCMA-Fc bloquea la unión
de APRIL de múrido soluble (smAPRIL) a células A20. Se incubaron
las células A20 con smAPRIL con o sin 10 x shBCMA-Fc
seguido de tinción con anticuerpo anti-Flag
conjugado con FITC para análisis FACS.
La Figura 20 muestra los niveles séricos de IgG
e IgM anti-KLH e IgM anti-Pneumovax
en ratones tratados con proteínas de fusión TACI-Fc
o BCMA-Fc o Fc no fusionado como control. Los
valores de p designan la comparación con el grupo tratado con Fc.
n= 7. Véanse los Materiales y Métodos a continuación en la presente
memoria.
La Figura 21 muestra la secuencia de
APRIL-Fc humana
La Figura 22 muestra el efecto de
APRIL-Fc humana y
AGP-3/BlyS/Tall-1 humana soluble
sobre la proliferación de células B primarias de múrido. Se
cultivaron células B de bazo de múrido purificadas en presencia de
diversas cantidades de APRIL-Fc humana y
AGP-3 no marcada más anti-IgM 2
\mug/ml. Los datos muestran la incorporación de
^{3}H-timidina como cpm, y representan la media de
pocillos por triplicado.
La Figura 23 muestra que la
hBCMA-Fc y la hTACI-Fc inhiben la
proliferación de células B de ratón mediada por
mAPRIL-Flag. Se cultivaron células B de bazo de
múrido purificadas con las cantidades indicadas de
BCMA-Fc y TACI-Fc solubles en
presencia de mAPRIL-Flag 10 ng/ml y un
anti-IgM 2 \mug/ml durante 72 h. La incorporación
de ^{3}H-timidina se indica como cpm. Los datos
mostrados representan la media de pocillos por triplicado.
La Figura 24 muestra que la administración de
hBCMA-Fc (15 mg/kg intraperitoneal (i.p., los días
0, 3 y 6)) reduce los niveles de células B en sangre periférica de
ratón medidos el día 7. Se trataron ratones normales (n= 7) con
BCMA-Fc humana y Fc no fusionado como control los
días 0, 3 y 6 (15 mg/kg). Se midieron los niveles de células B de
sangre periférica el día 7.
La Figura 25 muestra que la administración de
hBCMA-Fc (15 mg/kg i.p. los días 0, 3 y 6) reduce
los niveles de células B de bazo de ratón medidos el día 7.
La Figura 26 muestra que la producción de IgA
mediada por mAPRIL-Flag y hAGP-3
está inhibida por hBCMA-Fc y
hTACI-Fc in vitro. Se cultivaron células B de
bazo de múrido purificadas con LPS (100 ng/ml),
AGP-3 (10 ng/ml), APRIL-Flag (10
ng/ml) o con BCMA-Fc (100 ng/ml) y
TACI-Fc (100 ng/ml) durante 12 días. Se recogieron
los sobrenadantes de cultivo el día 7 y el día 12 para detectar el
nivel de IgA.
La Figura 27 muestra que la producción de IgG
mediada por mAPRIL-Flag y hAGP-3 se
inhibe por hBCMA-Fc y hTACI-Fc
in vitro.
La Figura 28 muestra los niveles totales
reducidos de IgE e IgA en ratones normales tratados con
mBCMA-Fc y hTACI-Fc truncada (5
mg/kg, i.p., los días 0, 3 y 6). Se trataron ratones normales (n= 7)
con BCMA-Fc humana, TACI-Fc
truncada y Fc no fusionado como control los días 0, 3 y 6 (5 mg/kg).
Se midieron los niveles de inmunoglobulina en suero el día 7.
La Figura 29 muestra que el tratamiento con
hBCMA-Fc o hTACI-Fc truncada reduce
los niveles de IgM específica anti-Pneumovacs en
ratones normales. Se trataron ratones normales (n= 7) con
BCMA-Fc humana, TACI-Fc truncada y
Fc no fusionado como control a dosis diarias de 0,5 mg/kg a 15 mg/kg
durante 7 días. En la preinmunización, no fueron detectables
anti-KLH y anti-Pneumovax. Se
midieron los anticuerpos el día 7 y el día 14.
La Figura 30 muestra que el anticuerpo
monoclonal específico anti-mAPRIL nº c19 inhibe la
proliferación de células B de ratón mediada por
mAPRIL-Flag. Se cultivaron células B de bazo de
múrido purificadas en presencia de mAPRIL-Flag 10
ng/ml con anti-IgM 2 \mug/ml. Se añadieron
anticuerpo monoclonal
anti-APRIL-Flag c-19
e IgG control de rata al cultivo al mismo tiempo. Los datos
muestran la incorporación de ^{3}H-timidina como
cpm, y representan la media de pocillos por triplicado.
La Figura 31 muestra que el tratamiento con el
anticuerpo monoclonal específico anti-mAPRIL nº c19
inhibe la generación de anticuerpos específicos
anti-Pneumovacs in vivo.
La Figura 32 muestra que el tratamiento con
hBCMA-Fc aumenta la supervivencia en el modelo de
ratón NZB/
NZWF1 de LES.
NZWF1 de LES.
La Figura 33 muestra que el tratamiento con
hBCMA-Fc reduce la incidencia de proteinuria en el
modelo de ratón NZB/NZWF1 de LES.
La Figura 34 muestra que el tratamiento con
hBCMA-Fc reduce los niveles de anticuerpo específico
anti-ADNbc en el modelo de ratón NZB/NZWF1 de
LES.
La Figura 35 muestra que el tratamiento con
hBCMA-Fc reduce el porcentaje de células B en sangre
periférica en el modelo de ratón NZB/NZWF1 de LES.
La Figura 36 muestra que el APRIL se une a una
serie de estirpes celulares tumorales. Se determinó la unión de
APRIL a estirpes celulares tumorales humanas mediante la incubación
de células con APRIL-Fc o APRIL-Flag
1 \mug/ml, seguido de tinción con anticuerpo secundario marcado
con FITC y análisis FACS.
La Figura 37 muestra que el APRIL estimula el
crecimiento de células U266-B1 y que éste puede
inhibirse por BCMA-Fc o TACI-Fc. Se
cultivaron células U266 en presencia de APRIL-Fc
humana 10 ng/ml o con BCMA-Fc soluble,
TACI-Fc truncada 50 ng/ml durante 48 h. Se indica la
incorporación de ^{3}H-timidina como cpm. Los
datos mostrados representan la media de pocillos por
triplicado.
La Figura 38 muestra que APRIL estimula el
crecimiento de células A20 de linfoma B de ratón y que éste puede
inhibirse por BCMA-Fc o TACI-Fc. Se
cultivaron linfomas de células B de ratón A20 en presencia de
APRIL-Flag de ratón,
AGP-3-Flag humana 50 ng/ml o con
BCMA-Fc soluble 100 ng/ml durante 48 h. Se indica la
incorporación de ^{3}H-timidina como cpm. Los
datos mostrados representan la media de pocillos por triplicado.
La Figura 39 muestra que el tratamiento con
BCMA-Fc reduce el crecimiento de células B tumorales
de linfoma A20 en ratones Balb/C. Se implantaron células A20 (0,2
millones), i.d., el día 0. Se administraron tratamientos con PBS,
CHO-Fc, mBCMA-Fc,
hBCMA-Fc, mTACI-Fc,
hTACI-Fc (10 mg/kg, i.p.) los días 0, 7, 10, 13, 16,
19, 22. Se hicieron medidas del tumor dos veces por semana. Se
sacrificaron los ratones los días 27-31, se
congelaron inmediatamente los tumores para el aislamiento de ARN,
se recogió la sangre y se congelaron las muestras de
suero.
suero.
La Figura 40 muestra que el tratamiento con
hBCMA-Fc reduce el crecimiento en volumen del tumor
de estirpe celular HT29 de carcinoma de colon humano en ratones. Se
inyectaron por vía subcutánea 2 x 10^{6} células más Matrigel al
50% a ratones desnudos atímicos. Rx: BCMA-Fc humana
a 2, 5 y 15 mg/kg Q2D, empezando el día 0 (n= 10/grupo). Control 1:
CHO-Fc a 15 mg/kg Q2D. Control 2: 0,2 ml de PBS Q2D
IP. Volumen tumoral: 3 veces por semana, desde el día 7. Peso
tumoral al final del estudio. Peso corporal 2 veces por semana.
La Figura 41 muestra que el tratamiento con
mBCMA-Fc reduce el crecimiento en volumen del tumor
de estirpe celular HT29 de carcinoma de colon humano en ratones. Se
inyectaron por vía subcutánea 2 x 10^{6} células más Matrigel al
50% a ratones desnudos atímicos. Rx: BCMA-Fc de
ratón a 2, 5 y 15 mg/kg Q2D, empezando el día 0 (n= 10/grupo).
Control 1: CHO-Fc a 15 mg/kg Q2D. Control 2: 0,2 ml
de PBS Q2D IP. Volumen tumoral: 3 veces por semana desde el día 7.
Peso tumoral al final del estudio. Peso corporal 2 veces por
semana.
Los términos utilizados a lo largo de esta
memoria descriptiva se definen a continuación, a menos que se
limiten de otro modo en casos específicos.
El término "comprende" significa que un
compuesto puede incluir aminoácidos adicionales en cualquiera o
ambas de las terminaciones N o C de la secuencia dada. Por
supuesto, estos aminoácidos adicionales no deberían interferir
significativamente con la actividad del compuesto.
"Actividad AGP-3" designa
la modulación del crecimiento, supervivencia o activación celular
como resultado de la unión de AGP-3 humana natural
a TACI o BCMA, particularmente en células B. A la inversa, la
"actividad antagonista de AGP-3" designa la
actividad opuesta a la actividad AGP-3 como
resultaría, por ejemplo, por la inhibición de la unión de
AGP-3 a TACI o BCMA. Dicha actividad puede
determinarse, por ejemplo, mediante ensayos tales como los
descritos en "Actividad biológica de AGP-3" en
los Materiales y Métodos del documento PCT/US00/03653. Aparecen
ensayos adicionales mediante los que puede identificarse la
actividad AGP-3 en las referencias WO 98/18.921 (7
de mayo de 1998), WO 98/27.114 (25 de junio de 1998), EP 869.180 (7
de octubre de 1998), WO 98/55.620 y WO 98/55.621 (10 de diciembre
de 1998), WO 99/11.791 (11 de marzo de 1999), WO 99/12.964 (18 de
marzo de 1999) y Gross et al. (2000), Nature, 404:
995-999. Cualquiera de los ensayos descritos en las
mismas puede modificarse según sea necesario mediante métodos
conocidos por personas expertas en la técnica.
"Actividad APRIL" designa la modulación del
crecimiento, supervivencia o activación celular como resultado de
la unión de APRIL humana natural a TACI o BCMA, particularmente en
células T. A la inversa, la "actividad antagonista de APRIL"
designa la actividad opuesta a la actividad APRIL como resultaría,
por ejemplo, por la inhibición de la unión de APRIL a TACI o BCMA.
Dicha actividad puede determinarse, por ejemplo, mediante ensayos
tales como se describen en los Materiales y Métodos a continuación
en la presente memoria. Aparecen ensayos adicionales mediante los
que puede identificarse la actividad APRIL en las referencias WO
99/00518 (26 de junio de 1997), WO 99/11.791 (5 de septiembre de
1997), WO 99/12.965 (12 de septiembre de 1997), EP 911.633 (8 de
octubre de 1997), EP 919.620 (26 de noviembre de 1997), WO 99/28.462
(3 de diciembre de 1997), WO 99/33.980 (30 de diciembre de 1997),
WO 99/35.170 (5 de enero de 1998) y Hahne et al., (1998),
J. Exp. Med., 188: 1185-1190. Cualquiera de
los ensayos descritos en las mismas y en la presente memoria puede
modificarse según sea necesario mediante métodos conocidos por
personas expertas en la técnica.
"Actividad BCMA" designa la modulación del
crecimiento, supervivencia o activación celular como resultado de
la unión de APRIL humana natural o AGP-3 humana
natural a BCMA. A la inversa, la "actividad antagonista de
BCMA" designa la actividad opuesta a la actividad BCMA como
resultaría, por ejemplo, por la inhibición de la unión de
AGP-3 o APRIL a BCMA. Dicha actividad puede
determinarse, por ejemplo, mediante ensayos tales como se describen
en los Materiales y Métodos a continuación en la presente memoria.
Aparecen ensayos adicionales mediante los que puede identificarse
la actividad BCMA en las referencias WO 99/00518 (26 de junio de
1997), WO 99/11.791 (5 de septiembre de 1997), WO 99/12.965 (12 de
septiembre de 1997), EP 911.633 (8 de octubre de 1997), EP 919.620
(26 de noviembre de 1997), WO 99/28.462 (3 de diciembre de 1997), WO
99/33.980 (30 de diciembre de 1997), WO 99/35.170 (5 de enero de
1998), Hahne et al. (1998), J. Exp. Med. 188:
1185-1190, WO 98/18.921 (7 de mayo de 1998), WO
98/27.114 (25 de junio de 1998), EP 869.180 (7 de octubre de 1998),
WO 98/55.620 y WO 98/55.621 (10 de diciembre de 1998), WO 99/11.791
(11 de marzo de 1999), WO 99/12.964 (18 de marzo de 1999) y Gross
et al. (2000), Nature, 404: 995-999.
Cualquiera de los ensayos descritos en las mismas y en la presente
memoria puede modificarse según sea necesario mediante métodos
conocidos por personas expertas en la
técnica.
técnica.
"Actividad TACI" designa la modulación del
crecimiento, supervivencia o activación celular como resultado de
la unión de AGP-3 humana natural o APRIL humano
natural a TACI. A la inversa, la "actividad antagonista de
TACI" designa la actividad opuesta a la actividad TACI como
resultaría, por ejemplo, por la inhibición de la unión de
AGP-3 o APRIL a TACI. Dicha actividad puede
determinarse, por ejemplo, mediante ensayos tales como se describen
en los Materiales y Métodos de los documentos PCT/US00/03653, WO
98/18921 (7 de mayo de 1998), WO 98/27.114 (25 de junio de 1998),
EP 869.180 (7 de octubre de 1998), WO 98/55.620 y WO 98/55.621 (10
de diciembre de 1998), WO 99/11.791 (11 de marzo de 1999), WO
99/12.964 (18 de marzo de 1999), WO 98/39.361 (11 de septiembre de
1998), von Bulow & Bram (1997), Science, 278:
138-140 y Gross et al. (2000), Nature,
404: 995-999. Cualquiera de los ensayos descritos
en los mismos puede modificarse según sea necesario mediante
métodos conocidos por personas expertas en la técnica.
La expresión "asociado de unión específica"
designa cualquier molécula que se una preferiblemente a una proteína
de interés, independientemente de la actividad antagonista o
agonista de la molécula hacia la proteína de interés. Los asociados
de unión específica ejemplares incluyen anticuerpos, receptores
solubilizados, péptidos, péptidos modificados como se describen a
continuación en la presente memoria, y similares.
El término "vehículo" designa una molécula
que evita la degradación y/o aumenta la semivida, reduce la
toxicidad, reduce la inmunogenicidad o aumenta la actividad
biológica de una proteína terapéutica. Los vehículos ejemplares
incluyen un dominio Fc (que se prefiere) así como un polímero lineal
(por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrano, etc.),
un polímero de cadena ramificada (véanse, por ejemplo, las patentes
de EE.UU. nº 4.289.872 de Denkenwalter et al., expedida el
15 de septiembre de 1981; nº 5.229.490 de Tam, expedida el 20 de
julio de 1993; WO 93/21.259 de Frechet et al., publicada el
28 de octubre de 1993), un lípido, un grupo colesterol (tal como un
esteroide), un carbohidrato u oligosacárido, o cualquiera proteína,
polipéptido o péptido natural o sintético que se une a un receptor
nativo. Los vehículos se describen detalladamente a continuación en
la presente
memoria.
memoria.
La expresión "Fc nativo" designa la
molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento sin
unión a antígeno resultante de la digestión del anticuerpo
completo, tanto en forma monomérica como multimérica. La fuente de
inmunoglobulina original del Fc nativo es preferiblemente de origen
humano, y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se
prefieren IgG1 e IgG2. Los Fc nativos están constituidos por
polipéptidos monoméricos que pueden ligarse en formas diméricas o
multiméricas mediante asociación covalente (concretamente, enlaces
disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro
intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc
nativas oscila de 1 a 4, dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG,
IgA, IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2).
Es un ejemplo de un Fc nativo el dímero con enlace disulfuro
resultante de la digestión con papaína de una IgG (véase Ellison
et al., (1982), Nucleic Acids Res., 10:
4071-4079). La expresión "Fc nativo" como se
utiliza en la presente memoria es genérica de las formas monomérica,
dimérica y
multimérica.
multimérica.
La expresión "variante de Fc" designa una
molécula o secuencia que está modificada a partir de un Fc nativo,
pero que comprende todavía un sitio de unión para el receptor de
recuperación, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34.631
(publicada el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32.478 describen
variantes ejemplares de Fc, así como la interacción con el receptor
de recuperación. Por tanto, la expresión "variante de Fc"
comprende una molécula o secuencia que está humanizada a partir de
un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende sitios que
pueden eliminarse porque proporcionan rasgos estructurales o
actividad biológica que no son necesarios para las moléculas de
fusión de la presente invención. Por tanto, la expresión "variante
de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o
más sitios o residuos de Fc nativo que afectan o están implicados
en (1) la formación de enlace disulfuro, (2) la incompatibilidad con
una célula huésped seleccionada, (3) la heterogeneridad
N-terminal tras la expresión en una célula huésped
seleccionada, (4) la glicosilación, (5) la interacción con el
complemento, (6) la unión a un receptor de Fc distinto de un
receptor de recuperación, o (7) la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpo (ADCC). Se describen variantes de Fc con
mayor detalle en el documento WO 99/24.782, publicado el 4 de mayo
de 2000.
La expresión "dominio de Fc" comprende
moléculas y secuencias de Fc nativo y variante de Fc como se definen
anteriormente. Como con las variantes de Fc y Fc nativos, la
expresión "dominio de Fc" incluye moléculas en forma
monomérica o multimérica, tanto digeridas a partir del anticuerpo
completo como producidas por otros
medios.
medios.
El término "multímero", como se aplica a
dominios o moléculas de Fc que comprenden dominios Fc, designa
moléculas que tienen dos o más cadenas polipeptídicas asociadas
covalentemente, no covalentemente o tanto por interacciones
covalentes como no covalentes. Las moléculas de IgG forman
típicamente dímeros, IgM pentámeros, IgD dímeros e IgA monómeros,
dímeros, trímeros o tetrámeros. Los multímeros pueden formarse
explotando la secuencia y la actividad resultante de la fuente de
IgG nativa del Fc o derivatizando (como se define a continuación)
dicho Fc nativo.
El término "dímero", como se aplica a
dominios de Fc o moléculas que comprenden dominios de Fc, designa
moléculas que tienen dos cadenas polipeptídicas asociadas
covalentemente o no covalentemente.
Los términos "derivatizar" y
"derivado" o "derivatizado" comprenden procesos y los
compuestos resultantes respectivamente en los que (1) el compuesto
tiene una porción cíclica, por ejemplo, reticulación entre residuos
cisteinilo dentro del compuesto, (2) el compuesto está reticulado o
tiene un sitio de reticulación, por ejemplo, el compuesto tiene un
residuo cisteinilo y forma por tanto dímeros reticulados en cultivo
o in vivo, (3) uno o más enlaces peptidilo están
reemplazados por un enlace no peptidilo, (4) la terminación N está
reemplazada por -NRR^{1}, NRC(O)R^{1},
-NRC(O)OR^{1}, -NRS(O)_{2}R^{1},
-NHC(O)NHR, un grupo succinimida o
benciloxicarbonil-NH- sustituido o no sustituido,
en los que R y R^{1} y los sustituyentes de anillo son como se
definen a continuación en la presente memoria, (5) la terminación C
está reemplazada por -C(O)R^{2} o -NR^{3}R^{4},
en los que R^{2}, R^{3} y R^{4} son como se definen a
continuación en la presente memoria y (6) los compuestos en los que
los residuos de aminoácido individuales están modificados mediante
tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas o residuos terminales. Los derivados se describen
detalladamente a continuación en la presente memoria.
El término "péptido" designa moléculas de 2
a 40 aminoácidos, prefiriéndose moléculas de 3 a 20 aminoácidos y
siendo las más preferidas aquellas de 6 a 15 aminoácidos. Pueden
generarse aleatoriamente péptidos ejemplares mediante cualquiera de
los métodos citados anteriormente, portados en una biblioteca
peptídica (por ejemplo, una biblioteca de presentación en fago) o
derivarse mediante digestión de proteínas.
El término "aleatorizado", como se utiliza
para designar secuencias peptídicas, designa secuencias
completamente aleatorias (por ejemplo, seleccionadas mediante
métodos de presentación en fago) y secuencias en las que uno o más
residuos de una molécula de origen natural se reemplazan por un
residuo aminoacídico que no aparece en esa posición en la molécula
de origen natural. Los métodos ejemplares para identificar
secuencias peptídicas incluyen presentación en fago, presentación
en E. coli, presentación en ribosoma, examen basado en
levadura, examen de ARN-péptido, examen químico,
diseño racional, análisis estructural de proteína y similares. Los
péptidos aleatorizados y métodos para generarlos aparecen en el
documento WO 00/24.782, publicado el 4 de mayo de
2000.
2000.
La expresión "farmacológicamente activo"
significa que se determina que una sustancia así descrita tiene una
actividad que afecta a un parámetro médico (por ejemplo,
proliferación de células T) o estado patológico (por ejemplo,
cáncer, trastornos autoinmunes). Por tanto, los compuestos
farmacológicamente activos comprenden compuestos agonistas o
miméticos y antagonistas como se definen a continuación.
Los términos "mimético" y "agonista"
designan una molécula que tiene una actividad biológica comparable
con una proteína (por ejemplo, APRIL, AGP-3) que
interacciona con una proteína de interés. Estos términos incluyen
además moléculas que imitan indirectamente la actividad de una
proteína de interés, tal como potenciando los efectos del ligando
natural de la proteína de interés.
Los términos "antagonista" o
"inhibidor" designan una molécula que bloquea o que interfiere
de algún modo la actividad biológica de la proteína de interés
asociada, o que tiene una actividad biológica comparable a un
antagonista o inhibidor conocido de la proteína de interés
asociada.
Adicionalmente, se comprenden también en la
presente memoria sales fisiológicamente aceptables de los compuestos
de esta invención. Por "sales fisiológicamente aceptables", se
pretende cualquiera sal que sea conocida por ser, o que se descubra
después que es, farmacéuticamente aceptable. Son algunos ejemplos
específicos: acetato, trifluoroacetato, halohidratos tales como
clorhidrato y bromhidrato, sulfato, citrato, tartrato, glicolato y
oxalato.
La presente descripción se refiere a un método
de inhibición de la proliferación de células T en un mamífero, que
comprende administrar un agente terapéutico que comprende:
- a.
- un asociado de unión específica a TACI, en el que el asociado de unión específica tiene actividad antagonista de TACI;
- b.
- un asociado de unión específica a BCMA, en el que el asociado de unión específica tiene actividad antagonista de BCMA;
- c.
- tanto a como b; o
- d.
- un asociado de unión específica a TACI y BCMA, en el que el asociado de unión específica tiene actividad antagonista de TACI, actividad antagonista de BCMA o ambas.
La presente descripción se refiere a un método
de inhibición de la actividad APRIL en un mamífero, que comprende
administrar un agente terapéutico que comprende de a a d
anteriores.
La descripción se refiere también a un método de
inhibición de la actividad TACI, la actividad BCMA o ambas en un
mamífero, que comprende administrar un asociado de unión específica
a APRIL. Este método puede comprender además administrar un
asociado de unión específica a AGP-3.
Algunas indicaciones se benefician de un aumento
en la respuesta inmune. En consecuencia, la descripción se refiere
además a un método de aumento de la proliferación de células T en un
mamífero, que comprende administrar un agente terapéutico que
comprende:
- a.
- un asociado de unión específica a TACI, en el que el asociado de unión específica tiene actividad agonista de TACI;
- b.
- un asociado de unión específica a BCMA, en el que el asociado de unión específica tiene actividad agonista de BCMA;
- c.
- tanto a como b; o
- d.
- un asociado de unión específica a TACI y BCMA, en el que el asociado de unión específica tiene actividad agonista de TACI, actividad agonista de BCMA o ambas.
La descripción se refiere también a un método
para aumentar la actividad APRIL en un mamífero, que comprende
administrar un agente terapéutico que comprende de a a d
anteriores.
Los inventores contemplan llevar a cabo los
métodos de tratamiento anteriores con cualquiera de varios tipos
diferentes de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, anticuerpos
y péptidos modificados por ingeniería genética y moléculas de
fusión descritas a continuación en la presente memoria. Estas
moléculas pueden utilizarse también en ensayos para identificar
células y tejidos que expresan AGP-3, TACI, APRIL o
BCMA. La invención se refiere además a ácidos nucleicos, vectores y
células huésped útiles en la preparación de dichas moléculas.
La descripción se refiere además a métodos de
identificación de compuestos que son útiles en los métodos de uso
anteriormente citados. Dichos compuestos incluyen ácidos nucleicos,
péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos o moléculas orgánicas
de bajo peso molecular, y pueden actuar como agonistas o
antagonistas de la actividad de proteína BCMA, TACI,
AGP-3 o APRIL.
Se cree que AGP-3, APRIL, BCMA y
TACI desempeñan un papel en la regulación de la función inmune. En
consecuencia, estas moléculas, sus formas solubles y los agonistas
y antagonistas de las mismas pueden ser útiles para el diagnóstico
y/o el tratamiento de enfermedades de inflamación y función inmune.
Las indicaciones para antagonistas incluyen, pero sin limitación,
las siguientes:
- \bullet
- infecciones tales como infecciones bacterianas, fúngicas, protozoarias y víricas, especialmente VIH-1 o VIH-2;
- \bullet
- diarrea;
- \bullet
- psoriasis;
- \bullet
- inflamación;
- \bullet
- alergias;
- \bullet
- dermatitis atópica;
- \bullet
- enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar por hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, neumonía eosinofílica (por ejemplo, síndrome de Loeffler, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar intersticial (EPI) tal como fibrosis pulmonar idiopática o EPI asociada a artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis);
- \bullet
- anafilaxia sistémica o respuestas de hipersensibilidad;
- \bullet
- alergia a medicamentos;
- \bullet
- alergia a picaduras de insecto;
- \bullet
- enfermedad inflamatoria intestinal tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa;
- \bullet
- espondiloartropatía;
- \bullet
- escleroderma;
- \bullet
- psoriasis;
- \bullet
- dermatosis inflamatoria tal como dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, urticaria, vasculitis (por ejemplo, vasculitis necrosante, cutánea y por hipersensibilidad), miositis eosinofílica y fascitis eosinofílica;
- \bullet
- enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, artritis psoriásica, esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, miastenia grave, diabetes de inicio juvenil, glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune y enfermedad de Behcet;
- \bullet
- rechazo de injerto, incluyendo rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped;
- \bullet
- cánceres con infiltración leucocitaria de la piel o los órganos;
- \bullet
- lesión por reperfusión;
- \bullet
- aterosclerosis;
- \bullet
- ciertas malignidades hematológicas;
- \bullet
- shock, incluyendo shock séptico y shock endotóxico.
\newpage
Los agonistas pueden utilizarse para tratar:
- \bullet
- inmunosupresión, por ejemplo, en pacientes de SIDA o individuos que experimentan terapia de radiación, quimioterapia, terapia para enfermedad autoinmune u otra terapia de medicamentos, e inmunosupresión debida a deficiencia congénita en la función de receptor u otras causas; y
- \bullet
- enfermedades infecciosas tales como enfermedades parasitarias, incluyendo infecciones por helmintos tales como nematodos (gusanos redondos).
Cualquier serie de moléculas puede servir como
asociados de unión específica dentro de la presente invención. Son
de particular interés anticuerpos, péptidos y moléculas de fusión
péptido-Fc.
La descripción proporciona también un anticuerpo
o dominio de unión a antígeno del mismo, o un fragmento, variante o
derivado del mismo, que se une a un epítopo en cualquiera de las
moléculas diana (APRIL, AGP-3, TACI o BCMA) y que
tiene una actividad agonista o antagonista parcial o completa.
Preferiblemente, la molécula diana es de mamífero, más
preferiblemente humana, y puede estar en formas solubles o asociada
a superficie celular, o fragmentos, derivados y variantes de las
mismas.
Son conocidos en la técnica una serie de métodos
para la generación de anticuerpos. Todos dichos métodos son útiles
para generar moléculas útiles según la presente descripción.
Convencionalmente, puede prepararse un anticuerpo inmunizando un
animal con la molécula diana (por ejemplo, BCMA o TACI de múrido o
humano) o con un fragmento inmunogénico, derivado o variante de la
misma. Además, puede inmunizarse un animal con células
transfectadas con un vector que contiene una molécula de ácido
nucleico que codifica la molécula diana, de tal modo que la
molécula diana se expresa y se asocia a la superficie de las células
transfectadas. Como alternativa, pueden obtenerse asociados de
unión específica que son anticuerpos mediante examen de una
biblioteca que comprende secuencias de anticuerpo o de dominio de
unión a antígeno para la unión a la molécula diana. Dicha biblioteca
se prepara convenientemente en bacteriófago como fusiones de
proteína o péptido con una proteína de cubierta de bacteriófago que
se expresan sobre la superficie de partículas de fago ensambladas, y
las secuencias de ADN codificante están contenidas dentro de las
partículas de fago (denominado "biblioteca de presentación en
fago"). En un ejemplo, una biblioteca de presentación en fago
contiene secuencias de ADN que codifican anticuerpos humanos tales
como las cadenas ligera y pesada variables. Las secuencias que se
unen a la molécula diana pueden evolucionar además mediante
múltiples rondas de mutagénesis y examen.
Los asociados de unión específica que son
anticuerpos o dominios de unión a antígeno pueden ser glicoproteínas
tetraméricas similares a anticuerpos nativos, o pueden ser
anticuerpos monocatenarios, por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab' o
F(ab)', anticuerpos biespecíficos, heteroanticuerpos u otros
fragmentos, variantes o derivados de los mismos que son capaces de
unirse a la molécula diana y neutralizar parcial o completamente la
actividad de la molécula diana. Los anticuerpos o dominios de unión
a antígeno pueden producirse en estirpes celulares de hibridoma
(células productoras de anticuerpo tales como células de bazo
fusionadas con células de mieloma de ratón, por ejemplo), o pueden
producirse en estirpes celulares heterólogas transfectadas con
moléculas de ácido nucleico que codifican dicho anticuerpo o
dominio de unión a antígeno.
Los anticuerpos de la descripción incluyen
anticuerpos monoespecíficos policlonales, policlonales,
monoclonales, recombinantes, quiméricos, humanizados, totalmente
humanos, monocatenarios y/o biespecíficos. Los fragmentos de
anticuerpo incluyen aquellas porciones de un anticuerpo que se unen
a un epítopo en una molécula diana. Los ejemplos de dichos
fragmentos incluyen fragmentos Fab, F(ab'), F(ab)', Fv
y sFv. Los anticuerpos pueden generarse mediante escisión
enzimática de anticuerpos completos o mediante técnicas de ADN
recombinante tales como la expresión de plásmidos recombinantes que
contienen secuencias de ácido nucleico que codifican regiones
variables de anticuerpo.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones
heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de
animales inmunizados con un antígeno. Un antígeno es una molécula o
una porción de una molécula capaz de unirse a un anticuerpo, que es
adicionalmente capaz de inducir a un animal a producir un anticuerpo
capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede
tener uno o más epítopos. La reacción específica designada
anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará, de
manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no
con la multitud de otros anticuerpos que pueden evocarse por otros
antígenos.
Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia una
molécula diana se crean generalmente en animales (por ejemplo,
conejos o ratones) mediante múltiples inyecciones subcutáneas o
intraperitoneales de la molécula diana y un coadyuvante. Según la
invención, puede ser útil conjugar la molécula diana, o una
variante, fragmento o derivado de la misma, con una proteína
vehículo que sea inmunogénica en la especie que se va a inmunizar,
tal como hemocianina de lapa bocallave, suero, albúmina,
tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja. Además, se
utilizan agentes agregantes tales como alúmina para potenciar la
respuesta inmune. Después de la inmunización, se extrae sangre a
los animales y se ensaya en el suero la valoración de anticuerpo
anti-diana.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) contienen una
población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos de
antígenos, conteniendo dicha población sitios de unión a epítopo
sustancialmente similares. Dichos anticuerpos pueden ser de
cualquier clase inmunogénica, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y
cualquier subclase de los mismos. Puede cultivarse un hibridoma
productor de un anticuerpo monoclonal de la presente invención in
vitro, in situ o in vivo. La producción de altas
valoraciones in vivo o in situ es un método de
producción
preferido.
preferido.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia la
molécula diana se producen utilizando cualquier método que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante
estirpes celulares continuas en cultivo. Los ejemplos de métodos
adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los
métodos de hibridoma de Kohler et al., Nature, 256,
495-497 (1975) y el método de hibridoma de células B
humanas, Kozbor, J. Immunol., 133, 3001 (1984); Brodeur
et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications", pág. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.,
Nueva York, 1987); y Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory
(1988).
(1988).
Los asociados de unión específica preferidos
incluyen anticuerpos monoclonales que inhibirán parcial o
completamente la unión de la molécula diana humana a su ligando o
receptor semejante o un anticuerpo que tenga sustancialmente las
mismas características de unión específica, así como fragmentos y
regiones de los mismos. Los métodos preferidos para determinar la
especificidad y afinidad de anticuerpo monoclonal mediante
inhibición competitiva pueden encontrarse en Harlow et al.,
"Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et
al., ed., "Current Protocols in Immunology", Greene
Publishing Assoc. y Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), y
Muller, Meth. Enzymol., 92: 589-601
(1983).
Se proporcionan también en la descripción
estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos
monoclonales reactivos con polipéptidos diana.
Los anticuerpos quiméricos son moléculas en las
que diferentes porciones derivan de diferentes especies animales,
tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un
anticuerpo monoclonal de múrido y una región constante de
inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se utilizan
principalmente para reducir la inmunogenicidad en la administración
y para aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo,
cuando los anticuerpos monoclonales de múrido tienen mayores
rendimientos a partir de hibridomas pero mayor inmunogenicidad en
seres humanos, de modo que se utilizan anticuerpos monoclonales
quiméricos humanos/de múrido.
Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su
producción son conocidos en la técnica. Cabilly et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3273-3277
(1984), Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al.,
Nature, 312: 643-646 (1984), Neuberger et
al., Nature, 314: 268-270 (1985); Liu
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:
3439-3443 (1987); y Harlow y Lane, "Antibodies: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
Puede utilizarse un anticuerpo monoclonal
quimérico de la descripción como agente terapéutico. En dicho
anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es
idéntica a u homóloga de la correspondiente secuencia en
anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a
una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el
resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo de
la correspondiente secuencia en anticuerpos derivados de otra
especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así
como fragmentos de dichos anticuerpos, a condición de que exhiban
la actividad biológica deseada (véase la patente de EE.UU. nº
4.816.567, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81, 6851-6855 (1985).
Como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas
monovalentes, divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico
monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena H quimérica
asociada mediante puentes disulfuro con una cadena L quimérica. Un
anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero (H_{2}L_{2})
formado por dos dímeros HL asociados mediante al menos un puente
disulfuro. Puede producirse también un anticuerpo quimérico
polivalente, por ejemplo, empleando una región C_{H} que agregue
(por ejemplo, a partir de una cadena H o cadena \mu de IgM).
Los anticuerpos, fragmentos y regiones de múrido
y quiméricos de la presente descripción pueden comprender cadenas
de inmunoglobulina individuales pesadas (H) y/o ligeras (L). Una
cadena H quimérica comprende una región de unión a antígeno
derivada de la cadena H de un anticuerpo no humano específico de la
molécula diana, que está ligado al menos a una porción de una
región C de cadena H humana (C_{H}) tal como CH_{1} o
CH_{2}.
Una cadena L quimérica según la presente
descripción comprende una región de unión a antígeno derivada de la
cadena L de un anticuerpo no humano específico de la molécula diana,
ligado al menos a una porción de una región C de cadena L humana
(C_{L}).
Los asociados de unión específica tales como
anticuerpos, fragmentos o derivados, que tienen cadenas H y cadenas
L quiméricas de la misma o diferente especificidad de unión a la
región variable, pueden prepararse también mediante la asociación
apropiada de las cadenas polipeptídicas individuales, según etapas
de métodos conocidos, por ejemplo, según Ausubel et al., ed.
"Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience,
N.Y. (1993), y Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N.Y. (1988). Con este enfoque, se cultivan separadamente
huéspedes que expresan cadenas H quiméricas (o sus derivados) a
partir de huéspedes que expresan cadenas L quiméricas (o sus
derivados), y las cadenas de inmunoglobulina se recuperan
separadamente y después se asocian. Como alternativa, los huéspedes
pueden cocultivarse y las cadenas se permiten asociar
espontáneamente en el medio de cultivo, seguido de la recuperación
de la inmunoglobulina ensamblada, fragmento o derivado.
Como ejemplo, la región de unión a antígeno del
asociado de unión específica (tal como un anticuerpo quimérico) de
la presente invención deriva preferiblemente de un anticuerpo no
humano específico del análogo humano de la molécula diana. Las
fuentes preferidas del ADN que codifica dicho anticuerpo no humano
incluyen estirpes celulares que producen anticuerpos tales como
estirpes celulares híbridas conocidas habitualmente como
hibridomas.
hibridomas.
La descripción proporciona también fragmentos,
variantes y derivados, y fusiones de anticuerpos
anti-diana, en los que los términos
"fragmentos", "variantes", "derivados" y
"fusiones" se definen en la presente memoria. La invención
comprende fragmentos, variantes, derivados y fusiones de anticuerpos
anti-diana que son funcionalmente similares al
anticuerpo no modificado, es decir, retienen al menos una de las
actividades del anticuerpo no modificado. Además de las
modificaciones expuestas anteriormente, se incluye también la
adición de secuencias genéticas que codifican proteínas citotóxicas
tales como toxinas de plantas y bacterianas. Los fragmentos,
variantes, derivados y fusiones de los anticuerpos pueden producirse
mediante cualquiera de los huéspedes de esta inven-
ción.
ción.
Los fragmentos adecuados incluyen, por ejemplo,
Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv y scFv. Estos fragmentos carecen
del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se eliminan más
rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión no
específica a tejido que un anticuerpo intacto. Véase Wahl et
al., J. Nucl. Med., 24: 316-325 (1983).
Estos fragmentos se producen a partir de anticuerpos intactos
utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo,
mediante escisión proteolítica con enzimas tales como papaína (para
producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos
F(ab')_{2}). La identificación de estas regiones de unión a
antígeno y/o epítopos reconocidos por anticuerpos monoclonales de
la presente invención proporciona la información necesaria para
generar anticuerpos monoclonales adicionales con características de
unión y utilidad terapéutica o diagnóstica similares que se
asemejan a las realizaciones de esta invención.
Se proporcionan también variantes de asociados
de unión específica. En una realización, las variantes de
anticuerpos y dominios de unión a antígeno comprenden cambios en
las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y/o pesada que
aparecen naturalmente o se introducen mediante modificación genética
in vitro de secuencias nativas utilizando técnicas de ADN
recombinante. Las variantes de origen natural incluyen variantes
"somáticas" que se generan in vivo en las
correspondientes secuencias nucleotídicas de estirpe germinal
durante la generación de una respuesta de anticuerpo ante un
antígeno extraño.
Las variantes de anticuerpos y dominios de unión
a antígeno se preparan también mediante técnicas de mutagénesis
conocidas en la técnica. En un ejemplo, pueden introducirse
aleatoriamente cambios de aminoácidos a lo largo de la región de
codificación de un anticuerpo, y en las variantes resultantes puede
examinarse una actividad deseada tal como la afinidad de unión por
la molécula diana. Como alternativa, pueden introducirse cambios de
aminoácidos en regiones seleccionadas de un anticuerpo tales como en
las CDR de cadena ligera y/o pesada y regiones marco conservadas, y
en los anticuerpos resultantes puede examinarse la unión a la
molécula diana o alguna otra actividad. Los cambios de aminoácidos
comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en una CDR, en el
intervalo de una sola diferencia de aminoácido a la introducción de
todas las posibles permutaciones de aminoácidos dentro de una CDR
dada tal como CDR3. En otro método, puede evaluarse la contribución
de cada residuo en una CDR a la unión a diana mediante la
sustitución de al menos un residuo dentro de la CDR por alanina
(Lewis et al. (1995), Mol. Immunol., 32:
1065-1072). Los residuos que no son óptimos para
unión a la molécula diana pueden cambiarse después para determinar
una secuencia más óptima. Se comprenden también variantes generadas
mediante la inserción de aminoácidos para aumentar el tamaño de una
CDR tal como CDR3. Por ejemplo, la mayoría de las secuencias CDR3
de cadena ligera son de nueve aminoácidos de longitud. Las
secuencias de CDR3 de cadena ligera en un anticuerpo que son más
cortas de nueve aminoácidos pueden optimizarse para unión a la
molécula diana mediante la inserción de los aminoácidos apropiados
para aumentar la longitud de la
CDR.
CDR.
En una realización, las variantes de anticuerpo
o dominio de unión a antígeno comprenden uno o más cambios de
aminoácidos en una o más de las CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada o
ligera, y opcionalmente una o más de las regiones marco conservadas
de cadena pesada o ligera FR1, FR2 o FR3. Los cambios de aminoácidos
comprenden sustituciones, deleciones y/o inserciones de residuos de
aminoácidos.
Las variantes pueden prepararse también mediante
"redistribución de cadena" de cadenas pesadas o ligeras. Marks
et al. (1992), Biotechnology, 10:
779-783. Típicamente, se combina una cadena ligera
(o pesada) sencilla con una biblioteca que tiene un repertorio de
cadenas pesadas (o ligeras), y se examina en la población
resultante la actividad deseada tal como unión a la molécula diana.
Esta técnica permite examinar una muestra mayor de cadenas pesadas
(o ligeras) diferentes en combinación con una sola cadena ligera (o
pesada) que la posible con bibliotecas que comprenden repertorios
de cadenas tanto pesadas como ligeras.
Los asociados de unión específica de la
invención pueden ser biespecíficos. Los asociados de unión
específica biespecíficos de esta invención pueden tener varias
configuraciones. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se
parecen a anticuerpos sencillos (o fragmentos de anticuerpo), pero
tienen dos sitios de unión a antígeno diferentes (regiones
variables). Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante
técnicas químicas (véase, por ejemplo, Kranz et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 5807 (1981)) mediante
técnicas de "polidoma" (véase la pat. de EE.UU. nº 4.474.893
de Reading) o mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, un
anticuerpo biespecífico según esta invención puede unirse a APRIL y
AGP-3. Como otro ejemplo, un anticuerpo
biespecífico puede unirse a TACI y BCMA.
Los asociados de unión específica de la
descripción pueden ser también heteroanticuerpos. Los
heteroanticuerpos son dos o más anticuerpos, o fragmentos de unión
a anticuerpo (Fab), ligados entre sí, teniendo cada anticuerpo o
fragmento una especificidad diferente.
La descripción se refiere también a anticuerpos
"humanizados". Los métodos para humanizar anticuerpos no
humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un
anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos
introducidos en un anticuerpo humano a partir de una fuente que es
no humana. En general, los residuos no humanos estarán presentes en
CDR. La humanización puede realizarse siguiendo métodos conocidos en
la técnica (Jones et al., Nature, 321,
522-525 (1986); Riechmann et al.,
Nature, 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et
al., Science, 239, 1534-1536 (1988)),
sustituyendo regiones determinantes de la complementariedad (CDR)
de roedores por las correspondientes regiones de un anticuerpo
humano.
Los asociados de unión específica de la
descripción incluyen anticuerpos quiméricos, injertados en CDR y
humanizados que pueden producirse mediante métodos recombinantes
conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican los
anticuerpos se introdujeron en células huésped y se expresaron
utilizando materiales y procedimientos descritos en la presente
memoria y conocidos en la técnica. En una realización preferida, los
anticuerpos se producen en células huésped de mamíferos tales como
células CHO. Pueden producirse anticuerpos completamente humanos
mediante la expresión de ADN recombinante transfectado en células
huésped o mediante la expresión en células de hibridoma como se
describe anteriormente.
Están comprendidas en la práctica de esta
invención las técnicas para crear versiones de ADN recombinante de
las regiones de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo que
evitan la generación de anticuerpos monoclonales. Para hacer esto,
se extraen moléculas de ARN mensajero específicas de anticuerpo de
células del sistema inmune tomadas de un animal inmunizado, y se
transcriben a ADN complementario (ADNc). El ADNc se clona después en
un sistema de expresión bacteriano. Un ejemplo de dicha técnica
adecuada para la práctica de esta invención utiliza un sistema de
vector de bacteriófago lambda que tiene una secuencia líder que
causa que la proteína Fab expresada migre al espacio periplásmico
(entre la membrana de pared bacteriana y la pared celular) o se
secrete. Pueden generarse y examinarse rápidamente grandes números
de fragmentos Fab funcionales para aquellos que se unen al
antígeno. Dichos asociados de unión específica a molécula diana
(fragmentos Fab con especificidad por la molécula diana) están
comprendidos específicamente dentro del término "anticuerpo"
como se define, discute y reivindica en la presente
memoria.
memoria.
Están también dentro del alcance de la
descripción técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos
quiméricos mediante ayuste de los genes de una molécula de
anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto
con genes de una molécula de anticuerpo humana de actividad
biológica apropiada, tal como la capacidad de activar el
complemento humano y mediar la ADCC. (Morrison et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851 (1984), Neuberger et
al., Nature, 312: 604 (1984)). Es un ejemplo el reemplazo
de una región Fc por la de un isotipo diferente. Los asociados de
unión específica tales como los anticuerpos producidos mediante
esta técnica están dentro del alcance de la descripción.
En una realización preferida de la descripción,
los anticuerpos son anticuerpos completamente humanos. Están así
comprendidos por la descripción anticuerpos que se unen a molécula
diana y que están codificados por secuencias de ácidos nucleicos
que son variantes somáticas de origen natural de secuencias de ácido
nucleico de inmunoglobulina de estirpe germinal humana y
fragmentos, variantes sintéticas, derivados y fusiones de las
mismas. Dichos anticuerpos pueden producirse mediante cualquier
método conocido en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen la
inmunización con un antígeno diana (cualquier polipéptido diana
capaz de desencadenar una respuesta inmune, y opcionalmente
conjugado con un vehículo) de animales transgénicos (por ejemplo,
ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos
humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena.
Véanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., 90, 2551-2555 (1993); Jakobovits et
al., Nature, 362, 255-258 (1993);
Bruggermann et al., Year in Immunol., 7, 33
(1993).
Como alternativa, pueden generarse anticuerpos
humanos mediante el examen in vitro de bibliotecas de
anticuerpo de presentación en fago. Véanse Hoogenboom et
al., J. Mol. Biol., 227, 381 (1991); Marks et al.,
J. Mol. Biol., 222, 581 (1991). Se han descrito diversas
bibliotecas de presentación en fago que contienen anticuerpo, y
pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica. Las
bibliotecas pueden contener una diversidad de secuencias de
anticuerpo humano tales como fragmentos Fab, Fv y scFv humanos, que
pueden examinarse frente a una diana apropiada. Como se describe
detalladamente a continuación, las bibliotecas de presentación en
fago pueden comprender péptidos o proteínas distintos de los
anticuerpos que pueden examinarse para identificar asociados de
unión específica de la molécula diana.
Un anticuerpo anti-idiotípico
(anti-Id) es un anticuerpo que reconoce
determinantes únicos asociados generalmente al sitio de unión a
antígeno de un anticuerpo. Puede prepararse un anticuerpo Id
inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por
ejemplo, cepa de ratón) como fuente del anticuerpo monoclonal con el
anticuerpo monoclonal con el que se está preparando un
anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y
responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo
inmunizante produciendo un anticuerpo ante estos determinantes
idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por
ejemplo, la pat. de EE.UU. nº 4.699.880. El anticuerpo
anti-Id puede utilizarse también como
"inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en aún otro
animal, produciendo el denominado anticuerpo
anti-anti-Id. El
anti-anti-Id puede ser
epitópicamente idéntico al anticuerpo monoclonal original que
indujo el anti-Id. Por tanto, utilizando anticuerpos
de los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar
otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad.
La solicitud de patente WO 00/24.782, publicada
el 4 de mayo de 2000, mencionada anteriormente en la presente
memoria, describe con detalle diversas técnicas de generación de
péptido. Esta solicitud de patente describe además diversos
derivados y moléculas de fusión.
Particularmente, un péptido utilizado como
asociado de unión específica puede estar comprendido en una molécula
de fórmula
(X^{1})_{a} - F^{1} -
(X^{2})_{b}
en la
que
F^{1} es un vehículo;
X^{1} y X^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de
-(L^{1})_{c}-P^{1},
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2},
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{c}-P^{3}
y
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{c}-P^{3}-(L^{4})_{f}-P^{4},
P^{1}, P^{2}, P^{3} y P^{4} son
independientemente cada uno secuencias peptídicas en las que al
menos una es un asociado de unión específica;
L^{1}, L^{2}, L^{3} y L^{4} son cada uno
independientemente engarces; y
a, b, c, d, e y f son cada uno
independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b
sea 1.
Preferiblemente, dicha molécula comprende una
estructura de fórmulas
X^{1} -
F^{1}
o
F^{1} -
X^{2}.
Una molécula más preferida comprende una
estructura de fórmula
F^{1} -
(L^{1})_{c} - P^{1} - (L^{2})_{d} -
P^{2}
en la que P^{1} y/o P^{2} es un
asociado de unión específica de TACI o
BCMA.
Dichas moléculas facilitan la modulación tanto
de TACI como de BCMA, por ejemplo, uno de P^{1} y P^{2} es un
asociado de unión específica de TACI y el otro es un asociado de
unión específica de BCMA. A la inversa, en un inhibidor de ligando,
uno de P^{1} y P^{2} es un asociado de unión específica de APRIL
y el otro es un asociado de unión específica de
AGP-3.
Para todas estas moléculas, el vehículo
preferido es un dominio Fc. Entre los dominios Fc, se prefieren Fc
de IgG, particularmente de IgG1.
Los dominios Fc, engarces y procesos de
preparación de las moléculas anteriores se describen en el documento
WO 00/24.782, publicado el 4 de mayo de 2000.
\newpage
Otra clase de asociados de unión específica son
los fragmentos de receptor soluble. Son de particular interés los
fragmentos identificados en las figuras:
- a.
- la región extracelular de TACI (SEC ID Nº 15)
- b.
- la región extracelular de BCMA (SEC ID Nº 6)
- c.
- la región consenso de TACI (SEC ID Nº 16)
- d.
- la región consenso de BCMA (SEC ID Nº 7)
- e.
- la secuencia consenso extracelular TACI/BCMA (SEC ID Nº 13).
Estas moléculas tienen la ventaja no reconocida
hasta el momento de unirse tanto a APRIL como a
AGP-3. Como los péptidos anteriormente citados,
estos asociados de unión específica pueden estar también ligados
covalentemente a un vehículo, preferiblemente un dominio Fc.
Pueden resultar secuencias peptídicas útiles
adicionales a partir de modificaciones conservativas y/o no
conservativas de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos,
péptidos, péptidos de fusión con Fc y fragmentos de receptor
anteriormente citados.
Las modificaciones conservativas producirán
moléculas que tienen características funcionales y químicas
similares a las de la molécula a partir de la que se preparan
dichas modificaciones. En contraposición, pueden realizarse
modificaciones sustanciales de las características funcionales y/o
químicas de las moléculas seleccionando sustituciones en la
secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su
efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena
principal molecular en la zona de sustitución, por ejemplo, en
conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de
la molécula en el sitio diana, o (c) el tamaño de la molécula.
Por ejemplo, una "sustitución de aminoácido
conservativa" puede implicar una sustitución de un residuo de
aminoácido nativo por un residuo no nativo de tal modo que haya poco
o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de
aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el
polipéptido puede sustituirse también por alanina, como se ha
descrito anteriormente para la "mutagénesis de análisis con
alanina" (véanse, por ejemplo, MacLennan et al., 1998,
Acta Physiol. Scand. Suppl., 643: 55-67;
Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys., 35:
1-24, que discute la mutagénesis de análisis con
alanina).
Las sustituciones de aminoácido deseadas (tanto
conservativas como no conservativas) pueden determinarse por los
expertos en la técnica en el momento en que se desean dichas
sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden
utilizarse para identificar residuos importantes de la secuencia
molecular, o para aumentar o reducir la afinidad de las moléculas
descritas en la presente memoria. Se exponen sustituciones de
aminoácido ejemplares en la Tabla 3.
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En ciertas realizaciones, las sustituciones de
aminoácido conservativas comprenden también residuos de aminoácido
de origen no natural que se incorporan típicamente mediante síntesis
peptídica química en lugar de síntesis en sistemas biológicos.
Como se observa en la sección anterior
"Definición de términos", los residuos de origen natural pueden
dividirse en clases basadas en propiedades de la cadena lateral
comunes que pueden ser útiles para modificaciones de secuencia. Por
ejemplo, las sustituciones no conservativas pueden implicar el
intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de
otra clase. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en
regiones de la molécula que son homólogas de ortólogos no humanos,
o en las regiones no homólogas de la molécula. Además, pueden
hacerse también modificaciones utilizando P o G con fines de influir
en la orientación de cadena.
Al hacer dichas modificaciones, puede
considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Se ha
asignado a cada aminoácido un índice hidropático basándose en sus
características de hidrofobicidad y carga, estos son: isoleucina
(+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8),
cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina
(-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptófano (-0,9), tirosina
(-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5),
glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina
(-3,9) y arginina (-4,5).
La importancia del índice hidropático de
aminoácidos para conferir función biológica interactiva a una
proteína es entendida en la técnica. Kyte et al., J. Mol.
Biol., 157: 105-131 (1982). Es conocido que
ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que
tienen un índice o puntuación hidropático similar y seguir
reteniendo una actividad biológica similar. Al hacer cambios
basados en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de
aminoácidos cuyos índices hidropáticos están a \pm 2, aquellos que
están a \pm 1 son particularmente preferidos y aquellos a \pm
0,5 son aún más particularmente preferidos.
Se entiende también en la técnica que la
sustitución de aminoácidos similares puede hacerse eficazmente
basándose en la hidrofilicidad. La mayor hidrofilicidad media local
de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos
adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad,
concretamente, con una propiedad biológica de la proteína.
Se han asignado los siguientes valores de
hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0),
lisina (+3,0), aspartato (+3,0 \pm1), glutamato (+3,0 \pm1),
serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0),
treonina (-0,4), prolina (-0,5 \pm1), alanina (-0,5), histidina
(-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina
(-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5),
triptófano (-3,4). Al hacer cambios basados en valores de
hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos
cuyos valores de hidrofilicidad están a \pm 2, se prefieren
particularmente aquellos que están a \pm 1, y se prefieren aún
más particularmente aquellos a \pm 0,5. Pueden identificarse
también epítopos de secuencias de aminoácidos primarias basándose
en la hidrofilicidad. Estas regiones se designan también como
"regiones núcleo epitópicas".
Un experto en la técnica será capaz de
determinar las variables adecuadas del polipéptido como se expone en
las secuencias anteriores utilizando técnicas bien conocidas. Para
identificar las zonas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse
sin destruir la actividad, un experto en la técnica puede dirigirse
a zonas que se cree que no son importantes para la actividad. Por
ejemplo, cuando son conocidos polipéptidos similares con actividades
similares de la misma especie o de otras especies, un experto en la
técnica puede comparar la secuencia de aminoácidos de una molécula
con moléculas similares. Con dicha comparación, pueden identificarse
los residuos y porciones de las moléculas que están conservados
entre polipéptidos similares. Se apreciará que sería menos probable
que los cambios en las zonas de una molécula que no están
conservados respecto a dichas moléculas similares afectaran
adversamente a la actividad biológica y/o la estructura de la
molécula. Un experto en la técnica sabría también que, incluso en
regiones relativamente conservadas, se pueden sustituir con
aminoácidos químicamente similares los residuos de origen natural
reteniendo la actividad (sustituciones conservativas de residuos de
aminoácidos). Por lo tanto, incluso zonas que pueden ser importantes
para la actividad biológica o la estructura, pueden estar sujetas a
sustituciones conservativas de aminoácidos sin destruir la actividad
biológica o sin afectar adversamente la estructura de la
molécula.
Adicionalmente, un experto en la técnica puede
revisar los estudios de estructura-función
identificando los residuos en moléculas similares que son
importantes para la actividad o la estructura. A la vista de dicha
comparación, puede predecirse la importancia de los residuos de
aminoácido en una molécula que corresponden con los residuos de
aminoácido que son importantes para la actividad o la estructura en
moléculas similares. Un experto en la técnica puede optar por
sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos
residuos de aminoácidos importantes predichos de las moléculas.
Un experto en la técnica puede analizar también
la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos con
respecto a esa estructura en polimoléculas similares. A la vista de
esa información, un experto en la técnica puede predecir el
alineamiento de los residuos de aminoácidos de una molécula con
respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica
puede elegir no hacer cambios radicales en los residuos de
aminoácido que se predice que están en la superficie de la
proteína, ya que dichos residuos pueden estar implicados en
interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en
la técnica puede generar variantes de ensayo que contienen una sola
sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Las
variantes pueden examinarse después utilizando ensayos de actividad
conocidos por los expertos en la técnica. Dichos datos podrían
utilizarse para reunir información sobre variantes adecuadas. Por
ejemplo, si se descubriera que un cambio en un residuo de
aminoácido particular daba como resultado una actividad destruida,
indeseablemente reducida o inadecuada, se evitarían las variantes
con dicho cambio. En otras palabras, basándose en la información
reunida a partir de dichos experimentos rutinarios, un experto en la
técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en que deberían
evitarse sustituciones adicionales solas o en combinación con otras
mutaciones.
Se han dedicado una serie de publicaciones
científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véanse
Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):
422-427 (1996); Chou et al.,
Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974);
Chou et al., Biochemistry, 113(2):
211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol.
Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978);
Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:
251-276 y Chou et al., Biophys. J.,
26: 367-384 (1979). Además, están actualmente
disponibles programas informáticos para ayudar a predecir la
estructura secundaria. Un método de predicción de la estructura
secundaria está basado en la modelización por homología. Por
ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de
secuencia de más de un 30%, o una similitud superior a un 40%, a
menudo tienen topologías estructurales similares. El reciente
crecimiento de la base de datos estructurales de proteínas (PDB) ha
proporcionado una predecibilidad potenciada de la estructura
secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos en la
estructura de un polipéptido o proteína. Véase Holm et al.,
Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247
(1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct.
Biol., 7(3): 369-376 (1997)) que hay un
número limitado de plegamientos en un polipéptido o proteína dado y
que, una vez se ha resuelto un número crítico de estructuras, la
predicción estructural ganará drásticamente exactitud.
Los métodos adicionales de predicción de la
estructura secundaria incluyen "enhebrado", (Jones, D.,
Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):
377-387 (1997); Sippl. et al.,
Structure, 4(1): 15-19 (1996)),
"análisis de perfil" (Bowie et al., Science,
253: 164-170 (1991); Gribskov et al.,
Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84(13):
4355-4358 (1987)) y "conexión evolutiva" (véase
Home, anteriormente, y Brenner, anteriormente).
Cuando el asociado de unión específica para
preparar es un asociado de unión específica proteico tal como un
anticuerpo o un dominio de unión de antígeno o molécula de fusión
péptido-Fc, están disponibles diversos métodos
biológicos o químicos para producir dicho asociado.
Los métodos biológicos son preferibles para
producir suficientes cantidades de un asociado de unión específica
para uso terapéutico. Las técnicas de ADN recombinante son
particularmente útiles para la producción de anticuerpos y dominios
de unión a antígeno de la invención. Se describen a continuación
vectores de expresión, células huésped y métodos para la
recuperación del producto expresado ejemplares.
Se inserta una molécula de ácido nucleico que
codifica un anticuerpo o dominio de unión a antígeno en un vector
de expresión apropiado utilizando técnicas de ligamiento estándar.
Se selecciona típicamente el vector para ser funcional en la célula
huésped particular empleada (concretamente, el vector es compatible
con la maquinaria de la célula huésped de tal modo que pueda
ocurrir la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Puede
amplificarse/expresarse una molécula de ácido nucleico que codifica
un anticuerpo en células huésped procarióticas, de levadura, de
insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucarióticas. La selección de
la célula huésped dependerá en parte de si el anticuerpo ha de
modificarse post-traduccionalmente (por ejemplo,
glicosilarse y/o fosforilarse). En ese caso, son preferibles
células huésped de levadura, insecto o mamífero. Para una revisión
de los vectores de expresión, véase Meth. Enz., v. 185,
(D.V. Goeddel, ed.), Academic Press Inc. San Diego, CA (1990).
Típicamente, los vectores de expresión
utilizados en cualquier célula huésped contendrán uno o más de los
siguientes componentes: un promotor, una o más secuencias
potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de
terminación transcripcional, una secuencia de intrón completa que
contiene un sitio donante y un sitio aceptor de ayuste, una
secuencia líder para secreción, un sitio de unión a ribosoma, una
secuencia de poliadenilación, una región de poliengarce para
insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a
expresar, y un elemento marcador detectable. Cada una de estas
secuencias se discute con más detalle a continuación.
Los componentes del vector pueden ser homólogos
(concretamente, de la misma especie y/o cepa que la célula
huésped), heterólogos (concretamente, de una especie distinta de la
especie o cepa de la célula huésped), híbridos (concretamente, una
combinación de diferentes secuencias de más de una fuente),
sintéticos o secuencias nativas que funcionan normalmente regulando
la expresión de inmunoglobulina. Como tal, una fuente de componentes
vector puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico,
cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta,
a condición de que los componentes sean funcionales en, y puedan
activarse por, la maquinaria de la célula huésped.
Se selecciona un origen de replicación basándose
en el tipo de célula huésped utilizado para expresión. Por ejemplo,
el origen de replicación del plásmido pBR322 (nº de producto
303-3s, New England Biolabs, Beverly, MA) es
adecuado para la mayoría de las bacterias
gram-negativas, mientras que diversos orígenes de
SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) o
papilomavirus (tales como HPV o BPV) son útiles para clonar
vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente origen
de replicación no es necesario para vectores de expresión de
mamífero (por ejemplo, el origen SV40 se utiliza a menudo sólo
porque contiene el promotor temprano).
Una secuencia de terminación de la transcripción
está localizada típicamente 3' del extremo de las regiones que
codifican un polipéptido, y sirve para terminar la transcripción.
Habitualmente, es una secuencia de terminación de la transcripción
en células procarióticas un fragmento rico en G-C
seguido por una secuencia de poli-T. Aunque la
secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso
se adquiere comercialmente como parte de un vector, puede
sintetizarse también fácilmente utilizando métodos para la síntesis
de ácido nucleico tales como los descritos anteriormente.
El elemento gen marcador detectable codifica una
proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una
célula huésped crecida en un medio de cultivo selectivo. Los genes
marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a)
confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo,
ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huésped
procarióticas, (b) complementan deficiencias auxotróficas de la
célula, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en
medios complejos. Los marcadores detectables preferidos son el gen
de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el
gen de resistencia a tetraciclina. Puede utilizarse también un gen
de resistencia a neomicina para selección en células huésped
procarióticas y eucarióticas.
Pueden utilizarse otros genes selectivos para
amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso
en el que los genes que tienen mayor demanda para la producción de
una proteína crítica para el crecimiento se repiten en serie dentro
de los cromosomas de generaciones sucesivas de células
recombinantes. Los ejemplos de marcadores detectables adecuados
para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y
timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se
disponen bajo presión selectiva en la que sólo los transformantes
están adaptados únicamente para sobrevivir en virtud del marcador
presente en el vector. La presión selectiva se impone cultivando
las células transformadas en condiciones en las que la concentración
de asociado selectivo en el medio se cambia sucesivamente,
conduciendo así a la amplificación tanto del gen selectivo como del
ADN que codifica un anticuerpo. Como resultado, se sintetizan
cantidades aumentadas de un anticuerpo a partir del ADN
amplificado.
Habitualmente es necesario un sitio de unión a
ribosoma para la iniciación de la traducción de ARNm, y se
caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno
(procariotas) o secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento se
localiza típicamente 3' del promotor y 5' de la secuencia de
codificación del polipéptido que se va a expresar. La secuencia de
Shine-Dalgarno varía, pero es típicamente una
polipurina (concretamente, que tiene un alto contenido de
A-G). Se han identificado muchas secuencias de
Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede
sintetizarse fácilmente utilizando métodos expuestos anteriormente
y utilizarse en un vector procariótico.
Se utiliza una secuencia líder, o señal, para
dirigir la secreción de un polipéptido. Puede colocarse una
secuencia señal dentro o directamente en el extremo 5' de una región
codificante de polipéptido. Se han identificado muchas secuencias
señal y pueden seleccionarse basándose en la célula huésped
utilizada para expresión. En la presente descripción, una secuencia
señal puede ser homóloga (de origen natural) o heteróloga de una
secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o dominio de
unión a antígeno. Una secuencia señal heteróloga seleccionada
debería ser aquella que es reconocida y procesada, concretamente se
escinde, por una peptidasa señal por la célula huésped. Para
células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan una
secuencia señal de inmunoglobulina nativa, la secuencia señal se
sustituye por una secuencia señal procariótica seleccionada, por
ejemplo, del grupo de líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa o
enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levadura, puede
sustituirse una secuencia señal de inmunoglobulina nativa por
líderes de invertasa de levadura, factor alfa o fosfatasa ácida. En
la expresión de células de mamífero, la secuencia señal nativa es
satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias señal de
mamífero.
En la mayoría de los casos, la secreción de un
anticuerpo o dominio de unión a antígeno a partir de una célula
huésped dará como resultado la eliminación del péptido señal del
anticuerpo. Por tanto, el anticuerpo maduro carecerá de cualquier
secuencia líder o señal.
En algunos casos, tales como cuando se desea
glicosilación en un sistema de expresión de célula huésped
eucariótica, pueden manipularse las diversas presecuencias para
mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, puede
alterarse el sitio de escisión de peptidasa de un péptido señal
particular, o añadirse prosecuencias que pueden afectar también a
la glicosilación. El producto proteico final puede tener en la
posición -1 (respecto al primer aminoácido de la proteína madura)
uno o más aminoácidos adicionales inherentes a la expresión, que
pueden no haberse eliminado completamente. Por ejemplo, el producto
proteico final puede tener uno o dos aminoácidos encontrados en el
sitio de escisión de peptidasa, unidos a la terminación N. Como
alternativa, el uso de algunos sitios de escisión enzimática puede
dar como resultado una forma ligeramente truncada del polipéptido
deseado, si la enzima corta en dicha zona dentro del polipéptido
maduro.
Los vectores de expresión de la presente
invención contendrán típicamente un promotor que se reconoce por el
organismo huésped y está ligado operativamente a una molécula de
ácido nucleico que codifica un anticuerpo o dominio de unión a
antígeno. Puede utilizarse un promotor nativo o heterólogo,
dependiendo de la célula huésped utilizada para expresión y del
rendimiento de la proteína deseada.
Los promotores adecuados para uso con huéspedes
procarióticos incluyen los sistemas promotores de
beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un
sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales
como el promotor tac. Son también adecuados otros promotores
bacterianos conocidos. Sus secuencias se han publicado,
posibilitando así que un experto en la técnica los ligue a
la(s) secuencia(s) de ADN deseado, utilizando engarces
o adaptadores según sea necesario para suministrar cualquier sitio
de restricción necesario.
Los promotores adecuados para uso con huéspedes
de levadura son también bien conocidos en la técnica. Los
potenciadores de levadura se utilizan ventajosamente con promotores
de levadura. Los promotores adecuados para uso con células huésped
de mamíferos son bien conocidos e incluyen aquellos obtenidos a
partir de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus
de viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), papilomavirus
bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus,
virus de la hepatitis B y, lo más preferiblemente, virus de simio
40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen
promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de
shock térmico y el promotor de actina.
Los promotores adicionales que pueden utilizarse
para expresar los asociados de unión específica de la invención
incluyen, pero sin limitación: la región promotora temprana de SV40
(Benoist y Chambon (1981), Nature, 290:
304-310); el promotor de CMV; el promotor contenido
en la repetición terminal larga 3' de virus del sarcoma de Rous
(Yamamoto et al., (1980), Cell, 22:
787-797); el promotor de timidina quinasa de herpes
(Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78, 1444-1445); las secuencias reguladoras del gen
de metalotioneína (Brinster et al., (1982), Nature,
296: 39-42); vectores de expresión procariótica
tales como el promotor de beta-lactamasa
(Villa-Kamaroff et al. (1978), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75: 3727-3731) o el promotor
tac (DeBoer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80: 21-25). Son también de interés las siguientes
regiones de control transcripcional animal, que exhiben
especificidad de tejido y que se han utilizado en animales
transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es
activa en células acinares pancreáticas (Swift et al.,
(1984), Cell, 38: 639-646; Ornitz et
al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:
399-409; MacDonald (1987), Hepatology, 7:
425-515); la región de control del gen de insulina
que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan (1985),
Nature, 315: 115-122); la región de control
del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides
(Grosschedl et al., (1984), Cell, 38:
647-658; Adames et al. (1985),
Nature, 318: 533-538; Alexander et al.
(1987), Mol. Cell. Biol., 7: 1436-1444); la
región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activa
en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder
et al., (1986), Cell, 45: 485-495); la
región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado
(Pinkert et al., (1987), Genes and Devel., 1:
268-276); la región de control del gen de
alfafetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al.
(1987), Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer
et al., (1987), Science, 235: 53-58);
la región de control del gen de
alfa-1-antitripsina que es activa en
el hígado (Kelsey et al. (1987), Genes and Devel., 1:
161-171; la región de control del gen de
beta-globina que es activa en células mieloides
(Mogram et al. (1985), Nature, 315:
338-340; Kollias et al., (1986),
Cell, 46: 89-94); la región de control del
gen de la proteína básica mielina que es activa en células
oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., (1987),
Cell, 48: 703-712); la región de control del
gen de cadena ligera 2 de miosina que es activa en músculo
esquelético (Sani (1985), Nature, 314:
283-286); y la región de control del gen de hormona
de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason
et al., (1986), Science, 234:
1372-1378).
Puede insertarse una secuencia potenciadora en
el vector para aumentar la transcripción en células huésped
eucarióticas. Son conocidas diversas secuencias potenciadoras
disponibles en genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa,
albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Sin
embargo, típicamente se utilizará un potenciador de un virus. El
potenciador SV40, el potenciador promotor temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma y los potenciadores de
adenovirus son elementos potenciadores ejemplares para la activación
de promotores eucarióticos. Aunque un potenciador puede ayustarse
en el vector en una posición 5' o 3' de la región de codificación
del polipéptido, se localiza típicamente en un sitio 5' del
promotor.
Los vectores preferidos para practicar esta
invención son aquellos que son compatibles con células huésped de
bacterias, insectos y mamíferos. Dichos vectores incluyen, entre
otros, pCRII, pCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA),
pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison,
WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ),
pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII,
Invitrogen), pDSR-alfa (publicación PCT nº WO
90/14.363) y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY).
Los vectores posibles adicionales incluyen, pero
sin limitación, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero el
sistema de vector debe ser compatible con la célula huésped
seleccionada. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación,
plásmidos tales como derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido
basado en ColE1 de alto número de copias, Stratagene Cloning
Systems Inc., La Jolla, CA), plásmidos de clonación por PCR
diseñados para clonar productos de PCR amplificados por Taq (por
ejemplo, TOPO^{TM} TA Cloning® Kit, derivados del plásmido
PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA) y vectores de mamífero, levadura
o víricos tales como un sistema de expresión de baculovirus
(derivados del plásmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA). Las
moléculas recombinantes pueden introducirse en células huésped
mediante transformación, transfección, infección, electroporación u
otras técnicas
conocidas.
conocidas.
Las células huésped de la invención pueden ser
células huésped procarióticas (tales como E. coli) o células
huésped eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula
de insecto o una célula de vertebrado). Las células huésped
procarióticas tales como E. coli producen proteína no
glicosilada, por ejemplo, shBCMA no glicosilada y shTCAI no
glicosilada, que puede poseer ventajas frente a las moléculas
eucarióticas glicosiladas. La célula huésped, cuando se cultiva en
condiciones apropiadas, expresa un anticuerpo o dominio de unión a
antígeno de la invención que puede recogerse posteriormente del
medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta en el medio) o
directamente de la célula huésped que lo produce (si no se secreta).
La selección de una célula huésped apropiada dependerá de diversos
factores tales como los niveles de expresión deseados, las
modificaciones polipeptídicas que son deseables o necesarias para la
actividad tales como glicosilación o fosforilación, y la facilidad
de plegamiento en una molécula biológicamente activa.
Son conocidas una serie de células huésped en la
técnica, y muchas están disponibles en la American Type Culture
Collection (ATCC), Manassas, VA. Los ejemplos incluyen células de
mamíferos tales como células CHO DHFR de ovario de hámster chino
(CHO) (nº de ATCC CCL61) (Urlaub et al. (1980), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4217-4220), células
293 o 293T de riñón embriónico humano (HEK) (nº de ATCC CRL1573) o
células 3T3 (nº de ATCC CCL92). Son conocidos en la técnica la
selección de las células huésped de mamífero y los métodos para la
transformación, cultivo, amplificación, examen y producción y
purificación de producto adecuados. Son otras estirpes celulares de
mamífero adecuadas las estirpes celulares COS-1 de
mono (nº de ATCC CRL1650) y COS-7 (nº de ATCC
CRL1651) y la estirpe celular CV-1 (nº de ATCC
CCL70). Las células huésped de mamífero ejemplares adicionales
incluyen estirpes celulares de primate y estirpes celulares de
roedor, incluyendo estirpes celulares transformadas. Son también
adecuadas células diploides normales, cepas celulares derivadas del
cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes
primarios. Las células candidatas pueden ser genotípicamente
deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de
selección de acción dominante. Otras estirpes celulares de mamífero
adecuadas incluyen, pero sin limitación, células N2A de
neuroblastoma de ratón, células HeLa, L-929 de
ratón, estirpes 3T3 derivadas de ratones Swiss,
Balb-c o NIH, estirpes celulares de hámster BHK o
HaK, que están disponibles en la American Type Culture Collection,
Manassas, VA). Cada una de estas estirpes celulares es conocida por
y está disponible para los expertos en la técnica de la expresión de
proteína.
Son similarmente útiles como células huésped
adecuadas para la presente invención las células bacterianas. Por
ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101,
nº de ATCC 33694), DH5\alpha, DH10 y MC1061 (nº de ATCC 53338))
son bien conocidas como células huésped en el campo de la
biotecnología. Pueden emplearse también diversas cepas de
Pseudomonas spp., B. subtilis, otros Bacillus spp.,
Streptomyces spp. y similares en este método.
Muchas cepas de células de levadura conocidas
por los expertos en la técnica están también disponibles como
células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente
invención. Las células de levadura preferidas incluyen, por
ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.
Adicionalmente, cuando se desee, pueden
utilizarse sistemas de células de insecto en los métodos de la
presente invención. Dichos sistemas se describen, por ejemplo, en
Kitts et al. (1993), Biotechniques, 14:
810-817, Lucklow (1993), Curr. Opin.
Biotechnol., 4: 564-572 y Lucklow et al.,
(1993), J. Virol. 67: 4566-4579. Las células
de insecto preferidas son Sf-9 e Hi5 (Invitrogen,
Carlsbad, CA).
La transformación o transfección de una molécula
de ácido nucleico que codifica un asociado de unión específica en
una célula huésped seleccionada puede conseguirse mediante métodos
bien conocidos, incluyendo métodos tales como cloruro de calcio,
electroporación, microinyección, lipofección o el método de
extracción con DEAE-dextrano. El método
seleccionado estará en parte en función del tipo de célula huésped
que se va a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son
bien conocidos por el experto en la técnica y se exponen, por
ejemplo, en Sambrook et al., anteriormente.
Pueden utilizarse también animales transgénicos
para expresar asociados de unión específica glicosilados tales como
anticuerpos y dominios de unión a antígeno. Por ejemplo, puede
utilizarse un animal productor de leche transgénico (una vaca o
cabra, por ejemplo) y obtener asociados de unión glicosilados en la
leche animal. Como alternativa, pueden utilizarse plantas para
producir asociados de unión específica glicosilados.
Las células huésped que comprenden (por
transformación o transfección) un vector de expresión que codifica
un asociado de unión específica de la molécula diana pueden
cultivarse utilizando medios estándar bien conocidos por el experto
en la técnica. Los medios contendrán habitualmente todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las
células. Son medios adecuados para cultivar células E. coli,
por ejemplo, caldo Luria (LB) y/o caldo Terrific (TB). Los medios
adecuados para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM,
DMEM, todos los cuales pueden suplementarse con suero y/o factores
de crecimiento según sea necesario para la estirpe celular
particular que se está cultivando. Un medio adecuado para cultivos
de insecto es el medio Grace suplementado con Yeastolate,
hidrolizado de lactoalbúmina y/o suero de ternero fetal, según sea
necesario.
Típicamente, se añade como suplemento a los
medios un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento
selectivo de células transfectadas o transformadas. El compuesto que
se va a utilizar estará dictado por el elemento marcador detectable
presente en el plásmido con el que se transformó la célula huésped.
Por ejemplo, cuando el elemento marcador detectable es la
resistencia a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo
será kanamicina. Otros compuestos para crecimiento selectivo
incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina.
La cantidad de un anticuerpo o dominio de unión
a antígeno producida por una célula huésped puede evaluarse
utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Dichos métodos
incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western,
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida,
electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC,
inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad.
La purificación de un asociado de unión
específica que se ha secretado en los medios celulares puede
conseguirse utilizando una variedad de técnicas, incluyendo
cromatografía de afinidad, inmunoafinidad o intercambio iónico,
cromatografía de tamiz molecular, electroforesis en gel preparativa
o enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque y cromatografía líquida de
alta presión. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una región
Fc pueden purificarse convenientemente mediante cromatografía de
afinidad con proteína A, que se une selectivamente a la región Fc.
Las formas modificadas de un anticuerpo o dominio de unión a
antígeno pueden prepararse con marcajes de afinidad tales como
hexahistidina u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak
Co., New Haven, CT) o myc (Invitrogen) en su terminación carboxilo
o amino y purificarse mediante una columna de afinidad de una
etapa. Por ejemplo, la polihistidina se une con mayor afinidad y
especificidad al níquel, por tanto puede utilizarse una columna de
afinidad de níquel (tal como las columnas de níquel Qiagen®) para la
purificación de asociados de unión específica marcados con
polihistidina. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed.
(1993), "Current Protocols in Molecular Biology", sección
10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York. En algunos casos, puede
ser necesaria más de una etapa de
purificación.
purificación.
Los asociados de unión específica de la
invención que se expresan en células huésped procarióticas pueden
estar presentes en forma soluble en el espacio periplásmico o en el
citoplasma, o en forma insoluble como parte de los cuerpos de
inclusión intracelulares. Los asociados de unión específica pueden
extraerse de la célula huésped utilizando cualquier técnica
estándar conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, las
células huésped pueden lisarse para liberar los contenidos del
periplasma/citoplasma mediante prensa French, homogeneización y/o
sonicación, seguido de centrifugación.
Las formas solubles de un anticuerpo o dominio
de unión a antígeno presente en el citoplasma o liberado desde el
espacio periplásmico pueden purificarse además utilizando métodos
conocidos en la técnica, por ejemplo, se liberan fragmentos Fab
desde el espacio periplásmico bacteriano mediante técnicas de shock
osmótico.
Si un anticuerpo o dominio de unión a antígeno
ha formado cuerpos de inclusión, a menudo pueden unirse a las
membranas celulares interior y/o exterior, y por tanto se
encontrarán principalmente en el material de sedimento después de
la centrifugación. El material de sedimento puede tratarse después a
pH extremo o con un asociado caotrópico tal como un detergente,
guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en
presencia de un asociado reductor tal como ditiotreitol a pH
alcalino o triscarboxietilfosfina a pH ácido para liberar,
disgregar y solubilizar los cuerpos de inclusión. El asociado de
unión específica soluble puede analizarse después utilizando
electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea
aislar un anticuerpo o dominio de unión a antígeno solubilizado, el
aislamiento puede realizase utilizando métodos estándar tales como
los expuestos anteriormente y en Marston et al. (1990),
Meth. Enz., 182: 264-275.
En algunos casos, un anticuerpo o dominio de
unión a antígeno puede no ser biológicamente activo tras el
aislamiento. Pueden utilizarse diversos métodos para
"replegar" o convertir el polipéptido a su estructura terciaria
y generar enlaces disulfuro para restaurar la actividad biológica.
Dichos métodos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH
habitualmente superior a 7 y en presencia de una concentración
particular de un caotrópico. La selección del caotrópico es muy
similar a las elecciones utilizadas para la solubilización de
cuerpos de inclusión, pero habitualmente el caotrópico se utiliza a
una concentración menor y no es necesariamente igual que los
caotrópicos utilizados para la solubilización. En la mayoría de los
casos, la solución de replegamiento/oxidación contendrá también un
asociado reductor o el asociado reductor más su forma oxidada a una
relación específica para generar un potencial rédox particular que
permita que ocurra una redistribución de disulfuros en la formación
del (de los) puente(s) de cisteína de la proteína. Algunas de
las parejas rédox utilizadas habitualmente incluyen
cisteína/cistamina, glutation (GSH)/ditiobis-GSH,
cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano-DTT y
2-mercaptoetanol (bME)/ditio-(bME). En muchos
casos, puede utilizarse un codisolvente o puede ser necesario para
aumentar la eficacia del replegamiento, y los reasociados más
comunes utilizados con este fin incluyen glicerol, polietilenglicol
de diversos pesos moleculares, arginina y
similares.
similares.
Los asociados de unión específica de la
invención pueden prepararse también mediante métodos de síntesis
química (tales como síntesis peptídica en fase sólida) utilizando
técnicas conocidas en la técnica tales como las expuestas por
Merrifield et al. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85: 2149;
Houghten et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82: 5132; y Stewart y Young (1984), Solid Phase Peptide
Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Dichos
polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en la
terminación amino. Los anticuerpos y los dominios de unión a
antígeno sintetizados químicamente pueden oxidarse utilizando
métodos expuestos en estas referencias para formar puentes
disulfuro. Los anticuerpos así preparados retendrán al menos una
actividad biológica asociada a un anticuerpo o dominio de unión a
antígeno nativo o producido recombinantemente.
La invención se describirá detalladamente ahora
mediante ejemplos experimentales específicos. Estos ejemplos se
pretende que sean ilustrativos en lugar de limitantes.
Se aislaron ADNc de BCMA de ratón y humana
mediante PCR utilizando el cebador con sentido de BCMA de ratón.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-CACAATACCTGTGGCCCTCTTAAGAC-3'\cr
(SEC ID Nº
25)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
y el cebador sin
sentido
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-TGGTAAACGGTCATCCTAACGACATC-3'\cr
(SEC ID Nº
26)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
el cebador con sentido de BCMA
humana
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-TTACTTGTCCTTCCAGGCTGTTCT-3'\cr
(SEC ID Nº
27)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
y el cebador sin
sentido
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-CATAGAAACCAAGGAAGTTTCTACC-3'\cr
(SEC ID Nº
28)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Para el aislamiento de ADNc de TACI, se
utilizaron el cebador con sentido
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-AGCATCCTGAGTAATGAGTGGCCTGG-3'\cr
(SEC ID Nº
29)\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
y el cebador sin
sentido
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-GTGATGACGACCTACAGCTGCACTGGG-3'\cr
(SEC ID Nº
30)\cr}
Se transcribieron inversamente ARN
poli(A)+ de la estirpe celular de linfoma B de ratón A20 y de
nódulo linfático humano, y se sintetizó ADNc utilizando el kit de
amplificación de ADNc Smart RACE (Clontech, Palo Alto, California).
Se clonaron el ADNc completo de los genes de BCMA de ratón y humano,
así como del gen de TACI humano, en el vector pcDNA3 para expresión
en células de mamífero (Invitrogen, Carlsbad, California).
Se generó proteína APRIL-Flag de
múrido soluble fusionando la secuencia Flag en fase con la
terminación N de los aminoácidos 101-239 de APRIL.
Se expresó la proteína mAPRIL-Flag soluble en E.
coli y se purificó por afinidad la proteína replegada mediante
columna de anticuerpo M2 anti-Flag. Se generó la
proteína AGP-3 marcada con Fc fusionando el péptido
señal OPG seguido de
IgG-\gamma1-Fc humana en fase con
la terminación N de los aminoácidos 128-285 de
AGP-3. Se expresó la proteína en baculovirus y se
purificó con columna de proteína A-Sepharose. Se
codificó APRIL humana marcada con Fc mediante un constructo similar
(véase la Figura 21), se expresó en células CHO y se purificó con
columna de proteína A-Sepharose.
Se expresaron en E. coli proteína TACI
soluble (aminoácidos 1-165) y proteína BCMA
(aminoácidos 4-55) seguido de
IgG-\gamma1 humana en fase. Se solubilizaron los
cuerpos de inclusión formados. Se purificó la proteína replegada
mediante cromatografía de intercambio catiónico.
La purificación de BCMA-Fc
humana producida en E. coli recombinante se inició
solubilizando 53,3 g de una preparación de cuerpos de inclusión
lavada en una solución que tiene una composición final de cloruro
de guanidinio 6 M, Tris(HCl) 50 mM, ditiotreitol 8,0 mM. El
volumen final de la solución fue de aproximadamente 200 ml. Se
ajustó la solución a pH 9,0 a 23ºC y se dejó agitar a temperatura
ambiente durante 1 hora.
Se añadió después la solución de polipéptido
solubilizado a 3,8 l de urea 4 M fría, L-arginina
160 mM, glicerol al 20% (en volumen), cisteína 4 mM, cistamina 1
mM, Tris 50 mM. Se ajustó el pH a 8,9 a 12ºC y se dejó agitar la
muestra a 4-8ºC durante aproximadamente 60
horas.
Se clarificó después la mezcla de replegamiento
mediante filtración a través de un cartucho Cuno 10SP de 836
cm^{2}. Se concentró después el filtrado aproximadamente cinco
veces y se diafiltró con cinco volúmenes de retenido de fosfato de
sodio 10 mM/cloruro de sodio 40 mM, pH 9, utilizando un módulo TFF
de celulosa regenerada Pall Filtron de 929 cm^{2} con un corte de
peso molecular nominal de 50 kDa. Se realizó el procesamiento a
4-8ºC.
Se eliminó el retenido de la unidad, se calentó
a 20ºC y se ajustó a pH 5,0 utilizando ácido acético 1 M. Se
eliminaron los sólidos precipitados después mediante centrifugación
en una centrífuga Beckman J6-B operando a 20ºC
aproximadamente a 2.500 x g durante aproximadamente 15 minutos. Se
tomaron alícuotas del sobrenadante y se almacenaron congeladas a
-30ºC.
Se descongelaron las alícuotas de sobrenadante y
se procesaron en una columna de 5,0 cm de diámetro x 27,5 cm de
altura de SP-Sepharose Fast Flow. Todas las fases de
la cromatografía se realizaron a 8ºC. Se equilibró la columna
utilizando fosfato de sodio 25 mM, pH 6,5. Se acondicionó el
producto para carga ajustando el pH a 6,5. Después de la carga, se
lavó la columna con tampón de equilibrado y se eluyó después el
producto con un gradiente lineal de cloruro de sodio 17 mM a 60 mM
en un fondo de fosfato de sodio 25 mM a pH 6,5 durante 20 volúmenes
de columna. Se seleccionaron las fracciones para procesamiento
adicional basándose en su apariencia en un gel de poliacrilamida
SDS teñido con azul de Coomasie.
Se procesaron además las fracciones de
SP-Sepharose Fast Flow combinadas con una columna de
5,0 cm de diámetro x 27,5 cm de altura de Butyl Toyopearl 650M
operada a 21ºC. Se acondicionó el producto antes de cargar añadiendo
fosfato de potasio sólido, proporcionando una concentración final
de aproximadamente 0,6 M. Se equilibró la columna utilizando
fosfato de potasio 0,6 M, pH 7,0. Después de cargar, se lavó la
columna con 0,5 volúmenes de lecho de tampón de equilibrado y se
eluyó después el producto utilizando un gradiente lineal de fosfato
de potasio 0,5 M a 0,3 M durante 15 volúmenes de columna. Se
combinaron las fracciones del pico de elución de UV predominante
para procesamiento adicional.
Se concentraron las fracciones combinadas de la
cromatografía Butyl Toyopearl veinte veces y se diafiltraron frente
a seis volúmenes de retenido de solución salina tamponada con
fosfato utilizando un módulo Millipore XL TFF, operado a
4-8ºC. Se tomaron alícuotas de la combinación de
retenido final y se almacenaron a -30ºC.
Se adquirieron ratones B6 (6-8
semanas de edad) en Charles River Laboratories y se inyectaron i.p.
APRIL-Flag de múrido y otras proteínas TNF a 1
mg/kg/día durante 5 días. El día 7, se recogieron células de bazos y
nódulos linfáticos mesentéricos de ratón y se analizó la activación
y diferenciación de células B y T mediante FACS utilizando tinción
de anticuerpos monoclonales específicos.
Se adquirieron células epiteliales de riñón
humano 293, células de linfoma de Burkitt Raji, células de
linfoblastoma T humanas Jurkat y de estirpe celular de linfoma B de
ratón A20 en la American Type Culture Collection (Rockville,
Maryland). Se mantuvieron las células Raji, Jurkat y A20 en medio
completo RPMI-1640 (Life Technologies) suplementado
con 10% de suero bovino fetal (HyClone, Logan, Utah) y HEPES 25 mM.
Se cultivaron células 293 en medio Dulbecco modificado por Eagle
(Life Technologies) con 10% de suero bovino fetal. Se determinó la
proliferación celular mediante incubación de 5 x 10^{4}
células/pocillo en 100 \mul de medio con la concentración indicada
de proteína APRIL-Flag utilizando el ensayo de
proliferación Celltiter 96AQ (Promega Corp., Madison, WI) siguiendo
las instrucciones del fabricante. Como alternativa, se sometieron a
pulsos las células durante 18 h con ^{3}H-timidina
(0,5 \muCi/pocillo). Después de recoger las células, se
monitorizó la incorporación de ^{3}H-timidina
mediante recuento de centelleo líquido.
Para las células 293 que expresan receptor de
BCMA y TACI, se sembraron 2 x 10^{6} células 293 en una placa de
6 pocillos, se transfectaron las células con Lipofectamine 2000
según el procedimiento del fabricante (Life Technologies), 48 h
después de la transfección se recogieron las células y se incubaron
a 4ºC con ligando APRIL-Flag o ligando
Blys-(AGP-3)-Fc 1 \mug/ml durante
60 min. Después de lavar 3 veces con PBS (que contiene 2% de FBS),
se tiñeron las células con anticuerpo secundario conjugado con FITC
durante 30 min, después se lavaron 3 veces con PBS y se analizó la
fluorescencia mediante un analizador FACS (Becton Dickinson,
Mountain View, California).
Se realizó un análisis de interacción
biomolecular (BIA) utilizando un BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala,
Suecia). Se inmovilizaron los receptores, BCMA-Fc y
TACI-Fc (2 \mug/ml en acetato de sodio 10 mM, pH
4,5) sobre el chip sensor CM5 utilizando el procedimiento de
acoplamiento amina estándar BIACORE. Se consiguió un nivel de
inmovilización de aproximadamente 120 UR. Se diluyeron los analitos,
APRIL-FLAG y
AGP-3-Fc a entre 100
nM-0,01 nM en tampón de proceso (HEPES 10 mM, NaCl
0,5 M, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0,005%, CM-dextrano 2
mg/ml, pH 6,8). Se inyectaron los analitos sobre un receptor de
superficie inmovilizado durante 2 minutos a 50 \mul/min y se
permitieron disociar durante 10 minutos. Se eliminó la proteína
unida mediante una inyección de 1 minuto de HCl 50 mM. Se
determinaron las afinidades de unión utilizando un modelo Langmuir
1:1 (BIA Evaluation software, versión 3.1.2, BIACORE).
Se purificaron células T de los bazos de ratones
C57 BI/6 mediante selección negativa con una columna de
enriquecimiento en células T de múrido (R&D Systems). Se
cultivaron células T (1 x 10^{5} por pocillo) en ausencia o
presencia de diversa proteína APRIL-Flag durante 48
h. Como alternativa, se prerrecubrieron placas de 96 pocillos con
cantidades subliminales de anticuerpo anti-CD3, se
trataron las células T con proteína APRIL-Flag
durante 72 h, se sometieron a pulsos durante las últimas 18 h con 1
\muCi de ^{3}H-timidina y se recogieron para
contar la incorporación de radiactividad.
Se seleccionaron negativamente células B de
ratón a partir de bazos con columna de recuperación de células B de
ratón (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canadá). Se sembraron 1 x
10^{6}/ml en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96
pocillos en medio RPMI-1640 (5% de FBS, 2 ME 5 x
10^{-5} M, IgM de cabra anti-ratón purificada por
afinidad 2,5 \mug/ml, Pharmingen, San Diego). Se trataron después
las células B con proteína APRIL-Flag más
diferentes concentraciones de proteína BCMA-Fc
soluble durante 72 h y el cultivo recibió 1 \muCi de
^{3}H-timidina durante las últimas 18 h. Se
cuantificó la proliferación de células B midiendo la incorporación
de radiactividad.
Para el análisis de la secreción de Ig de
células B, se cultivaron células B purificadas a 5 x 10^{5}/ml en
placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos en
presencia de APRIL-Flag durante 6 días. Se recogió
el sobrenadante de cultivo y se determinaron los niveles de IgG, IgM
e IgA mediante una técnica ELISA de sándwich específica de isotipo.
Se determinó la concentración de Ig en las muestras de ensayo
comparando los valores de ensayo por triplicado con patrón de
control de isotipo.
Se inmunizaron ratones (Balb/c hembra de
9-11 semanas y 19-21 g, Charles
River Laboratories, Wilmington, MA) el día 0 con 100 \mug de KLH
(Pierce, Rockford, IL) en CFA s.c. o con 115 \mug de Pneumovax
(Merck, West Point, PA) i.p. Empezando el día 0, los ratones
recibieron 7 inyecciones i.p. diarias de 5 mg/kg de proteínas de
fusión TACI-Fc o BCMA-Fc o Fc no
fusionado, y después se les extrajo sangre el día 7. Se midieron las
IgG e IgM anti-KLH y anti-Pneumovax
en suero mediante ELISA. Brevemente, para la medida de los
anticuerpos anti-KLH, se recubrieron las placas con
KLH en PBS, se bloquearon y se añadieron diluciones de patrón y
muestras de ensayo. Se revelaron las IgG o IgM
anti-KLH capturadas utilizando anticuerpos
biotinilados anti-IgG o anti-IgM y
HRP conjugado con neutravidina. Para la medida de IgM
anti-Pneumovax, se recubrieron las placas con
Pneumovax utilizando poli-L-lisina,
se bloquearon y se añadieron diluciones de patrón y muestras de
ensayo. Se reveló la IgM anti-Pneumovax capturada
utilizando un anticuerpo biotinilado anti-IgM y HRP
conjugado con neutravidina. Los resultados se compararon con el
test t de Student.
En un segundo experimento, se trataron ratones
normales (n= 7) con BCMA-Fc humana,
TACI-Fc truncada y Fc no fusionado como control a
dosis diarias de 0,5 mg/kg a 15 mg/kg durante 7 días. En la
preinmunización, los anti-KLH y
anti-Pneumovax fueron indetectables. Se midieron los
anticuerpos el día 7 y el día 14.
Se trataron ratones normales (15 mg/kg i.p. los
días 0, 3 y 6, n= 7) con BCMA-Fc y Fc no fusionado
como control los días 0, 3 y 6 (15 mg/kg). Se midió el nivel de
células B en sangre periférica y bazo el día 7.
Se cultivaron células B de bazo de múrido
purificadas con LPS (100 ng/ml), AGP-3 (10 ng/ml),
APRIL-Flag (10 ng/ml) o con BCMA-Fc
(100 ng/ml) y TACI-Fc (100 ng/ml) durante 12 días.
Se recogieron los sobrenadantes de cultivo el día 7 y el día 12
para detectar los niveles de IgA e IgG.
Se trataron ratones normales con
mBCMA-Fc, hTACI-Fc truncada o
control Fc (5 mg/kg i.p. los días 0, 3 y 6, n= 7). Se midieron los
niveles de inmunoglobulina en suero el día 7.
Se utilizó mAPRIL-Flag como
antígeno para la generación de anticuerpos monoclonales de rata
específicos anti-mAPRIL siguiendo procedimientos
estándar. Se identificaron 40 clones que reconocieron
APRIL-Flag en un ELISA. Se determinó el efecto de
los clones sobre la proliferación de células B de ratón mediada por
mAPRIL-Flag. Se cultivaron células B de bazo de
múrido purificadas en presencia de mAPRIL-Flag 10
ng/ml más anti-IgM 2 \mug/ml. Se añadieron
anticuerpo monoclonal
anti-APRIL-Flag e IgG control de
rata al cultivo al mismo tiempo. Los datos muestran la
incorporación de ^{3}H-timidina como cpm, y
representan la media de pocillos por triplicado. Se utilizó el
anticuerpo monoclonal específico anti-mAPRIL nº c19
a 5 mg/kg i.p. los días 0, 3 y 6 para determinar el efecto del
bloqueo de APRIL endógeno sobre IgM anti-Pneumovacs
in vivo.
Se trataron ratones NZBxNZWF1 de 5 meses 3
veces/semana (lun, miér, vier) durante un periodo de 5 meses con la
cantidad indicada de proteína. Una dosis de 100 \mug se traduce a
4 mg/kg. Se extrajo sangre a los ratones el día de tratamiento para
analizar posteriormente los anticuerpos específicos de ADN, las
proteínas histona, etc. También el día 0, se extrajo orina y se
analizaron los niveles de proteínas. Se excluyeron los animales que
tenían ya altos niveles de proteína en la orina, un signo de lupus.
Se inyectó i.p. el tratamiento. Se extrajeron orina y sangre cada
30 días y se analizaron hasta el día 150.
Se determinó la unión de APRIL a estirpes
celulares tumorales humanas incubando las células con
APRIL-Fc o APRIL-Flag 1 \mug/ml,
seguido de tinción con anticuerpo secundario marcado con FITC y
análisis FACS.
Se cultivaron células U266 en presencia de
APRIL-Fc humana 10 ng/ml o con
BCMA-Fc soluble, TACI-Fc truncada
50 ng/ml durante 48 h. La incorporación de
^{3}H-timidina se indica como cpm. Los datos
mostrados representan la media de pocillos por triplicado. Se
cultivaron células A20 de linfoma B de ratón en presencia de
APRIL-Flag de ratón,
AGP-3-Flag humana 50 ng/ml o con
BCMA-Fc soluble 100 ng/ml durante 48 h. La
incorporación de ^{3}H-timidina se indica como
cpm. Los datos mostrados representan la media de pocillos por
triplicado.
Se implantaron células A20 (0,2 millones) i.d.
el día 0. Se administraron tratamientos con PBS,
CHO-Fc, mBCMA-Fc,
hBCMA-Fc, mTACI-Fc,
hTACI-Fc (10 mg/kg, i.p.) los días 0, 7, 10, 13, 16,
19, 22. Se hicieron medidas de tumor dos veces por semana. Se
sacrificaron los ratones los días 27-31, se
congelaron inmediatamente los tumores para el aislamiento de ARN,
se recogió sangre y se congelaron las muestras de suero.
Se inyectaron por vía subcutánea 2 x 10^{6}
células HT29 más Matrigel al 50% en ratones desnudos atímicos. Rx:
BCMA-Fc humana o de ratón a 2, 5 y 15 mg/kg Q2D,
empezando el día 0 (n= 10/grupo). Control 1: CHO-Fc
a 15 mg/kg Q2D. Control 2: 0,2 ml de PBS Q2D IP. Volumen de tumor:
3 veces por semana, desde el día 7. Peso de tumor al final del
estudio. Peso corporal 2 veces por semana.
Se aisló G70 humana y de ratón, también llamada
APRIL, y se caracterizó (Figuras 1, 2 y 3). Se produjo G70 de ratón
soluble marcada con FLAG (smG70) purificada y replegada en E.
coli (Figura 2). La G70 soluble (smG70) estimula
específicamente la proliferación celular de linfoma de células B y T
de manera dependiente de la dosis (Figura 4). Además, la G70
soluble:
- 1)
- se une específicamente a receptores de superficie celular expresados en células de linfoma B y T humanas (Figura 5);
- 2)
- estimula específicamente la proliferación de células B y T de sangre periférica humana purificadas (Figura 6);
- 3)
- estimula la proliferación de células B y T de bazo de múrido purificadas de manera dependiente de la dosis (Figura 7);
- 4)
- actúa sinérgicamente con el anticuerpo anti-CD28 para estimular la proliferación de células T de múrido purificadas (Figura 8);
- 5)
- tiene una fuerte actividad coestimulante sobre células T de múrido purificadas (Figura 9) en presencia de una concentración subóptima de activador de receptor de células T: anticuerpo anti-CD3.
Se realizó una serie de experimentos para
dilucidar la actividad biológica de G70/APRIL soluble en ratones
normales in vivo. Cada grupo consistía en 5 ratones
(BDF-1, 8 semanas de edad, dosificados a 1
mg/kg/día, 0,2 ml durante 5 días). Se utilizaron bazo, timo y
nódulos linfáticos mesentéricos de tres ratones de cada grupo para
análisis FACS utilizando un panel de anticuerpos marcadores de
superficie de células T y células B, y se analizaron todos los
ratones mediante necropsia estándar y análisis patológicos.
Bazo (Tabla 1A): La G70 soluble de múrido causó
una reducción media de aproximadamente un 60% del porcentaje de
células T CD3+. Además, hubo un aumento medio de 5 veces de la
activación de células T auxiliares y un aumento medio de 22 veces
de la activación de células T citotóxicas medido por la expresión
del receptor IL-2. Además, el porcentaje de células
B inmaduras aumentó aproximadamente 2 veces, mientras que el
porcentaje de células B maduras aumentó 3 a 4 veces. El porcentaje
total de linfocitos (T+B) no cambió comparado con el control.
Nódulos linfáticos mesentéricos (Tabla 1B): Los
ratones tratados con G70 soluble tenían una reducción media de un
25% del porcentaje de células T. Hubo un aumento medio de 3 veces
del porcentaje de células T auxiliares activadas y un aumento de 36
veces de las células T citotóxicas activadas medido por la expresión
del receptor CD25/IL-2. Además, el porcentaje de
células B inmaduras aumentó una media de 2 veces, mientras que las
células B maduras lo hacían una media de 4 veces.
En resumen, las observaciones preliminares
indican que el G70/APRIL estimula tanto células T como B en el bazo
y los nódulos linfáticos mesentéricos. El análisis patológico reveló
que los ratones tratados con G70 soluble tienen bazos ligeramente
agrandados de morfología normal.
El G70/APRIL está relacionado con el miembro
AGP-3/BlyS de la familia de ligandos de TNF. Se ha
mostrado recientemente que el miembro TACI de la familia de
receptores TNFR (Fig. 12) es un receptor de AGP-3
([solicitud de patente nº serie A-570A]). Además,
el TACI tiene coincidencia con el miembro huérfano BCMA de la
familia de receptores TNFR (Figura 10) en un dominio rico en
cisteína extracelular conservado (Figura 13). Estas observaciones
conjuntas llevaron a investigar si el G70/APRIL es un ligando de
BCMA y TACI y a ensayar si, además de TACI,
AGP-3/BlyS es también un ligando de BCMA.
El G70 de ratón soluble se une específicamente a
células 293 que expresan BCMA exógena (Figura 14). El G70 se une
también a células 293 que expresan TACI (Figura 15). Además, el G70
soluble bloquea específicamente la unión de
AGP-3/BlyS a receptores de superficie celular
localizados en células de linfoma B de ratón (Figura 16). Esto
sugiere que G70 y AGP4 se unen ambos a BCMA y TACI.
Se produjeron BCMA soluble
(smBCMA-Fc, Fig. 10) y TACI soluble
(shTACI-Fc) en E. coli, se purificaron hasta
homogeneidad y se replegaron.
El receptor de TACI soluble evita
específicamente la unión de G70 a células B de ratón (Figura 17).
Además, la shBCMA-Fc y la shTACI-Fc
evitan ambas la unión de AGP-3 a células B (Figura
18 y Figura 19A). La hBCMA-Fc soluble mejora
también la unión de G70 a células A20 (Figura 19B).
En resumen: 1) tanto G70 como
AGP-3 se unen a los miembros huérfanos TACI y BCMA
de la familia de receptor TNFR; 2) BCMA y TACI solubles inhiben
ambas eficazmente la unión de G70 y AGP-3 a células
B; 3) G70 y AGP-3 compiten por la unión a
receptores de superficie celular.
El tratamiento con TACI-Fc o
BCMA-Fc inhibía significativamente la producción de
anticuerpos anti-KLH y
anti-Pneumovax. Los niveles séricos de ambas IgG e
IgM anti-KLH fueron aproximadamente 25% y 19%
menores, repectivamente, en ratones tratados con
TACI-Fc que en controles (Figura 20). Las IgG e IgM
anti-KLH en suero fueron aproximadamente 52% y 66%
menores, respectivamente, en ratones tratados con
BCMA-Fc que en controles (Figura 20). Los niveles
en suero de IgM anti-Pneumovax fueron también
menores en ratones tratados con TACI-Fc y
BCMA-Fc que en controles (24% y 42%,
respectivamente, Figura 20). Segundo experimento: el tratamiento con
hBCMA-Fc o hTACI-Fc truncada reduce
los niveles de IgM específica anti-Pneumovacs en
ratones normales (Figura 29). Se trataron ratones normales (n= 7)
con BCMA-Fc humana, TACI-Fc truncada
y Fc no fusionado como control a dosis diarias de 0,5 mg/kg a 15
mg/kg durante 7 días. En la preinmunización,
anti-KLH y anti-Pneumovax fueron
indetectables. Se midieron los anticuerpos el día 7 y el día
14.
El tratamiento de ratones NZB/NZWF1 con
BCMA-Fc humana aumentó la supervivencia, redujo la
proteinuria, redujo el nivel de anticuerpos específicos
anti-ADNbc y redujo el porcentaje de células B en
sangre periférica. Protocolo para LES: Se trataron ratones
NZBxNZWF1 de 5 meses 3 veces/semana (lun, miér, vier) durante un
periodo de 5 meses con la cantidad indicada de proteína. 100 \mug
de dosis se traduce a 4 mg/kg. Se extrajo sangre a los ratones el
día de tratamiento para analizar después los anticuerpos específicos
de ADN, proteínas histona, etc. También el día 0, se extrajo orina
y se analizaron los niveles de proteína. Se excluyeron los animales
que tienen ya altos niveles de proteína en la orina, un signo de
lupus. Se inyectó el tratamiento i.p. Se extrajeron orina y sangre
cada 30 días y se analizaron hasta el día 150.
El tratamiento con BCMA-Fc
reduce el crecimiento de células tumorales de linfoma B A20 en
ratones Balb/C. Se implantaron células A20 (0,2 millones), i.d., el
día 0. Se administraron los tratamientos con PBS,
CHO-Fc, mBCMA-Fc,
hBCMA-Fc, mTACI-Fc,
hTACI-Fc (10 mg/kg, i.p.) los días 0, 7, 10, 13, 16,
19, 22. Se hicieron las medidas de tumor dos veces por semana. Se
sacrificaron los ratones los días 27-31, se
congelaron inmediatamente los tumores para aislamiento de ARN, se
recogió sangre y se congelaron las muestras de suero.
El tratamiento con hBCMA-Fc
reduce el crecimiento en volumen del tumor de estirpe celular HT29
de carcinoma de colon humano en ratones. Se inyectaron 2 x 10^{6}
células más Matrigel al 50% por vía subcutánea en ratones desnudos
atímicos. Rx: BCMA-Fc humana a 2, 5 y 15 mg/kg Q2D,
empezando el día 0 (n= 10/grupo). Control 1: CHO-Fc
a 15 mg/kg Q2D. Control 2: 0,2 ml de PBS Q2D IP. Volumen tumoral: 3
veces por semana desde el día 7. Peso tumoral al final del estudio.
Peso corporal: 2 veces por semana.
La APRIL-Fc humana y la
AGP-3/BlyS/Tall-1 humana soluble
estimulan la incorporación de ^{3}H-timidina a
células B primarias de múrido. Se cultivaron células B de bazo de
múrido purificadas en presencia de diversas cantidades de
APRIL-Fc humana y AGP-3 no marcada
más anti-IgM 2 \mug/ml. Los datos muestran la
incorporación de ^{3}H-timidina como cpm, y
representan medias de pocillos por triplicado.
Las hBCMA y hTACI-Fc inhiben la
proliferación de células B de ratón mediada por
mAPRIL-Flag (Figura 23). Se cultivaron células B de
bazo de múrido purificadas con las cantidades indicadas de
BCMA-Fc y TACI-Fc solubles en
presencia de mAPRIL-Flag 10 ng/ml y
anti-IgM 2 \mug/ml durante 72 h. La incorporación
de ^{3}H-timidina se indica como cpm. Los datos
mostrados representan medias de pocillos por triplicado.
La shBCMA-Fc (15 mg/kg i.p. los
días 0, 3 y 6) reduce los niveles de células B en sangre periférica
de ratón medidos el día 7 (Figuras 24 y 25). Se trataron ratones
normales (n= 7) con BCMA-Fc humana y Fc no fusionado
como control los días 0, 3 y 6 (15 mg/kg). Se midieron los niveles
de células B en sangre periférica y bazo (B220) el día 7.
La producción de IgA mediada por
mAPRIL-Flag y hAGP-3 se inhibe por
hBCMA-Fc y hTACI-Fc in vitro
(Figura 26). Se cultivaron células B de bazo de múrido purificadas
con LPS (100 ng/ml), AGP-3 (10 ng/ml),
APRIL-Flag (10 ng/ml) o con BCMA-Fc
(100 ng/ml) y TACI-Fc (100 ng/ml) durante 12 días.
Se recogieron los sobrenadantes de cultivo el día 7 y el día 12
para detectar el nivel de IgA. La producción de IgG mediada por
mAPRIL-Flag y hAGP-3 está inhibida
por hBCMA-Fc y hTACI-Fc in
vitro (Figura 27).
Se reducen los niveles de IgE e IgA totales en
ratones normales tratados con mBCMA-Fc y
hTACI-Fc truncada (5 mg/kg, i.p., días 0, 3 y 6).
Se trataron ratones normales (n= 7) con BCMA-Fc
humana, TACI-Fc truncada y Fc no fusionado como
control los días 0, 3 y 6 (5 mg/kg). Se midieron los niveles de
inmunoglobulina en suero el día 7.
El anticuerpo monoclonal específico
anti-mAPRIL nº c19 inhibe la proliferación de
células B de ratón mediada por mAPRIL-Flag (Figura
30). Se cultivaron células B de bazo de múrido purificadas en
presencia de mAPRIL-Flag 10 ng/ml más
anti-IgM 2 \mug/ml. Se añadieron el anticuerpo
monoclonal anti-APRIL-Flag
c-19 e IgG control de rata al cultivo al mismo
tiempo. Los datos muestran la incorporación de
^{3}H-timidina como cpm, y representan la media
de pocillos por triplicado. El tratamiento con anticuerpo monoclonal
específico anti-mAPRIL nº c19 inhibe la generación
de anticuerpos específicos anti-Pneumovacs in
vivo (Figura 31).
El APRIL se une a una serie de estirpes de
células tumorales (Fig. 36). La unión de APRIL a estirpes celulares
tumorales humanas se determinó incubando células con
APRIL-Fc o APRIL-Flag 1 \mug/ml,
seguido de tinción con anticuerpo secundario marcado con FITC y
análisis FACS. El APRIL estimula el crecimiento de células
U266-B1 y éste puede inhibirse por
BCMA-Fc o TACI-Fc (Figura 37). Se
cultivaron células U266 en presencia de APRIL-Fc
humana 10 ng/ml o con BCMA-Fc soluble,
TACI-Fc truncada 50 ng/ml durante 48 h. La
incorporación de ^{3}H-timidina se indica como
cpm. Los datos mostrados representan la media de pocillos por
triplicado.
<110> AMGEN INC.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE MATERIA
CONCERNIENTES A APRIL/G70, BCMA, BLYS/AGP-3, Y
TACI
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> A-686B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US 01/15504
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
14-05-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/204,039
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
12-05-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/214,591
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-06-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1465
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 233
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1486
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<212> DNA
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<213> Mus musculus
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 240
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
\newpage
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 181
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 51
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 34
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 21
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 283
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 281
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
\newpage
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 185
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<212> PRT
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<213> Murine
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 117
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<212> PRT
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<213> Consenso humana-de
múrido
\newpage
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 81
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<212> PRT
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<213> Consenso
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 293
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 166
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 67
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 16
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 397
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 149
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 59
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 20
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<210> 21
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<211> 58
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 21
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<210> 22
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<211> 233
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (79)..(79)
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<223> Xaa es cualquier aminoácido
\newpage
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<400> 22
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<210> 23
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<211> 232
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
\newpage
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<400> 23
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<210> 24
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<211> 190
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<212> PRT
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<213> Consenso
\newpage
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<400> 24
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaatacct gtggccctct taagag
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
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<211> 26
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antisentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtaaacgg tcatcctaac gacatc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttacttgtcc ttccaggctg ttct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatagaaacc aaggaagttt ctacc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcatcctga gtaatgagtg gcctgg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgatgacga cctacagctg cactggg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
Claims (27)
1. Uso de un asociado de unión específica de
APRIL seleccionado de:
- i)
- SEC ID Nº 16; o
- ii)
- SEC ID Nº 13;
para la fabricación de un
medicamento para tratar enfermedades o trastornos relacionados con
el sistema inmune e inflamatorios, autoinmunes y otros relacionados
con el sistema inmune, enfermedades linfoproliferativas y otros
cánceres, o para la prevención del rechazo de transplante, mediante
la inhibición de la actividad APRIL, la inhibición de la actividad
TACI, la inhibición de la actividad TACI y BCMA, o la inhibición de
la proliferación o activación de células B o T en un
mamífero.
2. Un uso según la reivindicación 1, en el que
el asociado de unión específica está comprendido en una molécula de
fórmula:
(X^{1})_{a} -
F^{1}-(X^{2})_{b}
en la
que
F^{1} es un vehículo;
X^{1} y X^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de
-(L^{1})_{c}-P^{1},
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2},
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{c}-P^{3}
o
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{c}-P^{3}-(L^{4})_{f}-P^{4};
P^{1}, P^{2}, P^{3} y P^{4} son
independientemente cada uno secuencias peptídicas en las que al
menos una es un asociado de unión específica;
L^{1}, L^{2}, L^{3} y L^{4} son cada uno
independientemente engarces, y
a, b, c, d, e y f son cada uno
independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b
sea 1.
3. Un uso según la reivindicación 2, en el que
la molécula comprende una estructura de fórmulas:
X^{1} -
F^{1}
o
F^{1} -
X^{2}.
4. Un uso según la reivindicación 2, en el que
la molécula comprende una estructura de fórmula:
F^{1} -
(L^{1})_{c} -
P^{1}.
5. Un uso según la reivindicación 2, en el que
la molécula comprende una estructura de fórmula:
F^{1} -
(L^{1})_{c}-P^{1} - (L^{2})_{d} -
P^{2}.
6. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en el que el vehículo es un dominio Fc.
7. Un uso según la reivindicación 1, en el que
el asociado de unión específica está unido covalentemente a un
vehículo.
8. Un uso según la reivindicación 7, en el que
el vehículo es un dominio Fc.
9. Uso de una secuencia de aminoácidos
seleccionada de:
- a)
- SEC ID Nº 16; o
- b)
- SEC ID Nº 13;
\newpage
para la fabricación de un
medicamento para tratar un trastorno linfoproliferativo de células B
o un trastorno linfoproliferativo de células
T.
10. Un uso según la reivindicación 9, en el que
la secuencia de aminoácidos está unida covalentemente a un
vehículo.
11. Un uso según la reivindicación 10, en el que
el vehículo es un dominio Fc.
12. Un uso según la reivindicación 1, en el que
el medicamento es para tratar infecciones, incluyendo infecciones
bacterianas, fúngicas, protozoarias y víricas, incluyendo
VIH-1 o VIH-2; diarrea, psoriasis;
inflamación; alergias; enfermedades alérgicas respiratorias
incluyendo asma, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar por
hipersensibilidad, pneumonitis por hipersensibilidad, neumonía
eosinofílica (por ejemplo, síndrome de Loeffler, neumonía
eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar intersticial (EPI),
incluyendo fibrosis pulmonar idiopática o EPI asociada a artritis
reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilisis anquilosante,
esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o
dermatomiositis; anafilaxia sistémica o hipersensibilidad a
respuestas; alergia a medicamentos; alergia a picadura de insectos;
enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo enfermedad de Crohn
y colitis ulcerosa; espondiloartropatía; escleroderma; dermatosis
inflamatoria, incluyendo dermatitis, eccema, dermatitis atópica,
dermatitis alérgica por contacto, urticaria, vasculitis, incluyendo
vasculitis necrosante, cutánea y por hipersensibilidad, miositis
eosinofílica y fascitis eosinofílica; enfermedades autoinmunes,
incluyendo artritis reumatoide, artritis psoriásica, esclerosis
múltiple, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, diabetes de
inicio juvenil, glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune y
enfermedad de Behcet; rechazo de injerto, incluyendo rechazo de
aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped; cánceres con
infiltración leucocitaria de la piel o los órganos; lesión por
reperfusión; aterosclerosis; malignidades hematológicas; o shock,
incluyendo shock séptico y shock endotóxico.
13. Una secuencia de aminoácidos seleccionada
de:
- a)
- SEC ID Nº 16; o
- b)
- SEC ID Nº 13;
para uso en un método de
tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con el sistema
inmune e inflamatorios, autoinmunes u otros relacionados con el
sistema inmune, enfermedades linfoproliferativas y otros cánceres,
para uso en la prevención del rechazo de transplantes, para uso en
el tratamiento de un trastorno linfoproliferativo de células B o
para uso en el tratamiento de un trastorno linfoproliferativo de
células T, mediante la inhibición de la proliferación o activación
de células B o T en un
mamífero.
14. Una secuencia de aminoácidos seleccionada
de:
- a)
- SEC ID Nº 16; o
- b)
- SEC ID Nº 13.
15. Una composición de material de fórmula
(X^{1})_{a} -
F^{1}-(X^{2})_{b}
en la
que
F^{1} es un vehículo;
X^{1} y X^{2} se seleccionan cada uno
independientemente de
-(L^{1})_{c}-P^{1},
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2},
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{c}-P^{3}
y
-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{c}-P^{3}-(L^{4})_{f}-P^{4};
P^{1}, P^{2}, P^{3} y P^{4} son
independientemente cada uno secuencias peptídicas en las que al
menos una es un asociado de unión específica seleccionado de:
- i)
- SEC ID Nº 16; o
- ii)
- SEC ID Nº 13;
L^{1}, L^{2}, L^{3} y L^{4} son cada uno
independientemente engarces; y
a, b, c, d, e y f son cada uno
independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b
sea 1.
\newpage
16. La composición de material de la
reivindicación 15, en la que la molécula comprende una estructura de
fórmula:
X^{1} -
F^{1}
o
F^{1} -
X^{2}.
17. La composición de material de la
reivindicación 15, en la que la molécula comprende una estructura de
fórmula:
F^{1} -
(L^{1})_{c} -
P^{1}.
18. La composición de material de la
reivindicación 15, en la que la molécula comprende una estructura de
fórmula:
F^{1} -
(L^{1})_{c} - P_{1} - (L^{2})_{d} -
P^{2}.
19. La composición de material según una
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que el vehículo
es un dominio Fc.
20. Un ácido nucleico aislado que codifica la
composición de material de una cualquiera de las reivindicaciones
14 a 18.
21. El ácido nucleico de la reivindicación 20,
que incluye uno o más codones preferidos para la expresión de
Escherichia coli.
22. Un vector de expresión que comprende el
ácido nucleico de la reivindicación 20 ó 21.
23. Una célula huésped transformada con el
vector de expresión de la reivindicación 22.
24. La célula huésped de la reivindicación 23,
en la que la célula es una célula procariótica.
25. La célula huésped de la reivindicación 24,
en la que la célula es Escherichia coli.
26. Uso in vitro de los polipéptidos de
SEC ID Nº 16 ó 13 para inhibir APRIL.
27. Uso in vitro de los polipéptidos de
SEC ID Nº 16 ó 13 para inhibir la proliferación de células B o
T.
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