EA015923B1 - ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К c-Kit И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К c-Kit И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA015923B1
EA015923B1 EA200802168A EA200802168A EA015923B1 EA 015923 B1 EA015923 B1 EA 015923B1 EA 200802168 A EA200802168 A EA 200802168A EA 200802168 A EA200802168 A EA 200802168A EA 015923 B1 EA015923 B1 EA 015923B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
agent according
cells
Prior art date
Application number
EA200802168A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200802168A1 (ru
Inventor
Гордон Нг
Вениан Шен
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA200802168A1 publication Critical patent/EA200802168A1/ru
Publication of EA015923B1 publication Critical patent/EA015923B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения связанных с c-Kit расстройств, таких как фиброз, в частности к композициям, которые содержат гуманизированные антитела к c-Kit.

Description

Область техники
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США, серийный номер 60/794,771, поданной 24 апреля, 2006 г., которая тем самым включена в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к композициям для лечения связанных с с-Κίΐ воспалительных, фиброзных, аутоиммунных и раковых заболеваний и к композициям, содержащим гуманизированные антитела к с-Κίΐ.
Уровень техники
Было показано, что тучные клетки вовлечены в опосредование воспалительных состояний, таких как астма, ревматоидный артрит и воспалительное заболевание кишечника, и их роль в аллергическом воспалении широко известна. Число тучных клеток повышено в эксплантатах легких пациентов, тяжелобольных астмой, и они являются основным источником клинически значимых воспалительных медиаторов, таких как лейкотриены, гистамин и 1Ъ2-цитокины. Тучные клетки являются основным источником ФНО (фактор некроза опухолей), ранее образовавшегося в подверженных болезни тканях.
Фактор стволовых клеток (8СР) представляет собой гликопротеин, который передает сигналы через ассоциированный с клеткой и мембраной рецептор с тирозин-киназной активностью, далее именуемый сΚίΐ, и этот путь передачи сигналов играет ключевую роль при гемопоэзе, действуя как положительный и отрицательный регулятор, часто синергично с другими цитокинами. Растворимый отделившийся от клетки с-Κίΐ рецептор может играть роль в регуляции 8СР. с-Κίΐ экспрессируется на плюрипотентных гематопоэтических стволовых клетках, которые являются предшественниками зрелых клеток, принадлежащих лимфоидной и эритроидной линиям. В отличие от других гематопоэтических клеток, предшественники тучных клеток и зрелые тучные клетки сохраняют высокие уровни экспрессии с-Κίΐ. Следовательно, передача сигналов 8СР через с-Κίΐ жизненно важна для развития, функционирования, транспорта и выживаемости тучных клеток. Он также играет роль в гаметогенезе и меланогенезе. Мыши с инактивирующими с-Κίΐ мутациями в локусе фактически не имеют тучных клеток. Активирующие с-Κίΐ мутации у людей связаны с мастоцитозом.
с-1<л1-положительные плюрипотентные гематопоэтические стволовые клетки являются предшественниками множества типов клеток, включая мезенхимальные клетки, фибробласты и тучные клетки. Фиброзное заболевание характеризуется отчасти избыточной активностью и пролиферацией фибробластов, что приводит к отложению внеклеточного матрикса. Было обнаружено, что с-Κίΐ положительные плюрипотентные гематопоэтические стволовые клетки костного мозга являются источником фибробластов и тучных клеток в фиброзных тканях.
Тучные клетки могут обеспечить постоянный источник воспалительных, ангиогенных, митогенных и фиброгенных медиаторов. Тучные клетки функционально и структурно связаны с фибробластами и играют непосредственную роль в активации фибробластов. Тучные клетки увеличивают кинетику и масштаб опосредованного фибробластами сокращения коллагена, отложения внеклеточного матрикса и могут превращать фибробласты в миофибробласты. Фибробласты, в свою очередь, секретируют 8СР, что приводит к еще большей активировации и увеличению количества тучных клеток, и оба типа клеток являются компонентами фиброгенной сети.
Количество тучных клеток и медиаторов тучных клеток значительно повышено при большинстве фиброзных заболеваний человека, включая идиопатический фиброз легких (ИФЛ) и склеродермию. Отличительные фенотипы в отношении тучных клеток обнаруживаются у некоторых пациентов со склеродермией и в Ткк модели склеродермии на мышах. Агрессивная системная форма мастоцитоза может быть охарактеризована миелофиброзом, что указывает на то, что тучные клетки могут быть эффекторными клетками при фиброзе.
Гливек™ (О1ееуес™) и другие препараты данного класса, подобные Сутенту™ (8н1сп1™). представляют собой имеющие множество мишеней ингибиторы рецептора с тирозин-киназной активностью, которые могут воздействовать на сигнальную активность с-Κίΐ, но также ингибируют ряд других киназ. Эти ингибиторы киназ предназначены для онкологических заболеваний. Сообщали, что применение Гливека вызывает миелосупрессию, анемию и ряд побочных эффектов, включая кардиотоксичность и периферические отеки. Таким образом, указанные молекулы не обладают наилучшим соотношением польза/риск при длительном лечении заболеваний, связанных с передачей сигналов с-Κίΐ. Следовательно, существует необходимость в создании новых способов лечения и реагентов, особенно таких, которые являются более действенными и селективными и имеют лучшие показатели безопасности в отношении лечения связанных с с-Κίΐ воспалительных и фиброзных заболеваний. Такие соединения могут также проявлять значительно лучшие показатели эффективности и безопасности при онкологических заболеваниях, таких как лейкоз миелоидного происхождения, заболеваниях, связанных с мутациями с-Κίΐ, таких как стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (О18Т) и мастоцитоз, заболеваниях, связанных с чрезмерной экспрессией с-Κίΐ и/или избыточной аутокринной активностью 8СР, как при меланоме и различных мелкоклеточных раках легкого (8СЬС). На данный момент отсутствуют способы лечения и реагенты, нацеленные на с-Κίΐ человека и обладающие терапевтической пользой в отсутствие значительных неблагоприятных эффектов.
- 1 015923
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает агенты, которые являются антагонистами и нейтральными антагонистами 8СР, которые действуют на ассоциированные с клеткой и мембранные с-Κίΐ рецепторы, такие как моноклональные антитела. В более конкретных вариантах реализации предусмотрены гуманизированные (не мышиные) моноклональные антитела, которые связывают с-Κίΐ. В еще более конкретных вариантах реализации указанные гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению содержат последовательность аминокислот, выбранную из тех, которые представлены последовательностями 8ЕО ΙΌ N0 2, 4 и 6. Настоящее изобретение также обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие любые из вышеуказанных антител или специфически связывающих агентов. В связанном варианте реализации настоящего изобретения предусмотрен вектор, который содержит любую из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот. В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, которая содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот или векторов.
В одном варианте реализации с-Кй-связывающие агенты и нейтральные антагонисты могут содержать последовательность аминокислот, соответствующую 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4 или 6. В другом варианте реализации любой из вышеуказанных агентов содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентична одной или более последовательности аминокислот, приведенной в 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4 или 6. В таких вариантах реализации указанное отличие последовательности от 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4 или 6, соответственно, может представлять собой, например, консервативную замену в соответствующей каркасной области 1дС с применеием альтернативной аминокислоты человека в этом положении.
В примерах вариантов реализации указанное антитело или специфически связывающий агент, который связывает с-Кй, содержит последовательность аминокислот, соответствующую 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4 или 6. Тем не менее, предусмотрено, что антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой смесь изотипов антител ΙβΟ (например, смесь подтипов !дС1. ΙβΟ2. ΙβΟ3 или ΙβΟ4).
Любое из вышеуказанных антител может быть, например, нативным или мутированным Ι§0 антителом (например, подтипа ΙβΟ1 или Ι§03, или любого другого подтипа ΙβΟ). Вышеуказанные антитела могут проявлять авидность, характеризуемую кд менее чем 1х 10-2, или менее чем 1х10-3, или 1х10-4, 1х 10-5, 1х10-6, 1х10-7, 1х10-8 или 1х10-9, при определении посредством поверхностного плазмонного резонанса (анализ Высоте).
Вышеуказанные антитела могут иметь значение ТС50, соответствующее нейтральным антагонистам менее чем 1х 10-2, или менее чем 1х 10-3, или 1 х10-4, 1х 10-5, 1х 10-6, 1х 10-7, 1х 10-8 или 1х 10-9, при определении посредством анализа в клеточной системе. В определенном варианте реализации аффинность и функциональная эффективность указанного гуманизированного антитела по меньшей мере сравнима с аффинностью и антитела мыши, из которого оно получено. В предпочтительном варианте реализации указанное гуманизированное антитело не является агонистом с-Κίΐ рецептора и не активирует тучные клетки, что могло бы привести к анафилактическим реакциям, и должно проявлять фармакодинамику/фармакокинетику (ФД/ФК) и профиль иммуногенности, которые, по меньшей мере, сравнимы с таковыми для родительского антитела мыши.
Настоящее изобретение охватывает множество способов. Например, предусмотрен способ получения вышеуказанного антитела или специфически связывающего агента, включающий культивирование вышеуказанной клеки-хозяина таким образом, что происходит экспрессия указанной нуклеиновой кислоты с образованием антитела или агента. Такие способы могут также включать этап получения указанного антитела или агента из культуры клеток-хозяев. В родственном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает очищенное антитело или агент, полученные вышеуказанным способом.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы применения любого из вышеупомянутого антитела или специфически связывающего агента, например, для лечения или предотвращения связанного с с-Кй расстройства путем введения эффективного количества указанного антитела или агента. Одним примером подобного расстройства, которое лечат, является фиброзное заболевание.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: 8К.-1 ингибирует тучные клетки в модели активизации ранением.
Фиг. 2: Количество тучных клеток в модели заживления ран.
Фиг. 3: Гуманизированные изоформы 8К.-1 ингибируют индуцированную фактором стволовых клеток (8СР) активацию с-Κίΐ и последующее фосфорилирование посредством с-Κίΐ.
Подробное описание изобретения
Антитело мыши против с-Κίΐ человека 8К.-1 описано в патенте США номер 5,919,911, и патенте США номер 5,489,516, каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки. 8К.-1 проявило подходящие свойства в отношении связывания с с-Κίΐ и блокировало 8СР-опосредованную передачу сигналов через рецептор, тем не менее, эта молекула не проявляла все свойства, которые были бы желательны при терапии человека, помимо существования очевидной проблемы иммуногенности. Втоийу сообщил, что 8К.-1 в некоторой степени проявляло сходную с агонистической активность, которая могла привести к интернализации и фосфорилированию рецептора. 1 Се11 Рйуыок, март 1994;158(3):545-54.
- 2 015923
Такие функциональные активности делали указанную молекулу менее эффективной и менее безопасной. Несмотря на то, что гуманизация моноклональных антител является хорошо известной методикой и то, что биологические молекулы, обладающие активностью, как правило, подразумевают надлежащую трансляцию, конформация указанного гуманизированного 8Я-1 антитела, зависящая от каркасной части антитела человека, может служить причиной различных присущих активностей, проявляемых в отношении с-Κίί и, следовательно, биологических функций. В этом частном примере следовало бы добиваться необходимых фармакологических, а не нежелательных агонистических свойств, но методика для достижения этого результата еще не была опубликована. Участки, определяющие комплементарность 8Я-1 антитела, вставили в уникальную комбинацию тяжелых и легких цепей, различающихся по структуре 1дС1 и 1дС2, и 1дС4 человека, при удивительном сохранении сходной аффинности в отношении с-Κίί. Тем не менее, как оказалось, каждая из указанных каркасных областей имела свои недостатки.
Было показано, что гуманизированное антитело 8Я-1 на основе 1дС2 имело высокую аффинность к с-Κίί, но в клетках многих типов было неспособно полностью блокировать 8СР-опосредованную интернализацию рецептора, и в тестах с культивируемыми тучными клетками приводило к фосфорилированию с-Κίί, сигналу выживаемости, и опосредовало необычную агрегацию указанных клеток. Указанные свойства теоретически нежелательны, так как целью терапевтической стратегии является обеднение популяции тучных клеток и предшественников за счет апоптоза путем блокировки сигнала выживаемости 8СР и избежать активации тучных клеток, которая может привести к анафилактическим реакциям ίη νίνο. Когда СЭЯ области (области, определяющие комплементарность) 8Р-1 мыши вставляли в каркас 1дС1 человека, аффинность и функциональная эффективность также оставались неизменными, но эта основа является менее желательной вследствие активации комплемента и клеточно-опосредованной цитотоксичности, часто обнаруживаемых при применении этого изотипа антител. Когда СЭЯ области 8Я-1 мыши вставляли в каркас 1дС4 человека, аффинность и функциональная эффективность также сохранялись, но неожиданно эта молекула проявила значительную аггрегацию при очистке и наработке.
Соответственно, авторы настоящего изобретения искали способы преодолеть недостатки каждой из этих молекул путем создания антитела, которое не активирует комплемент и не активирует с-Κίί и тучные клетки, при этом сохраняя необходимые аффинность, эффективность нейтрального антагониста в отношении мембранного с-Κίί рецептора, но не растворимого с-Κίί рецептора. Такое антитело должно также проявлять надлежащие ФД/ФК и должно эффективно обеднять популяцию тучных клеток и не проявлять признаков агонизма тучных клеток ίη νίνο.
Легкая каппа цепь гуманизированного 8К-1
8ЕО ΙΌ N0: 1 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую каппа цепь гуманизированного 8Я-1.
АТССТСТТССАСАСССАССТСТТСАТТТСТСТСТТССТСТеСАТСТСТСОТСССТАСССеСАСАТССТСАТОАСС
САЗТСТССАЗАСТСССтеЗСТСТОТСТСТебССбАОАйебССАССАТСААСтесАйАЕССАаТСАААЭТСТТСАТ
АТТТАТеССААТАбТТТТАТССАСТССТАССАССАСАААССАССАСАСССТССТААЗСТеСТСАТТТАССТТССА
ТССААССТАВААТСТСеСЕТСССТеАСССАТТСАЙТСбСАЙСеСОТСТеЗСАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАеС
АаССТССАСССТСААбАТбТСССАСТТТАТТАСТСТСАССААААТААТСАЙСАТСССТАСАССТТСОЗАССТССО
АССААСеТССАААТААААССТАСЕСТЗССТССАССАТСТСТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТСАССАСТТСААА
ТСтеСААСтеССТСТСТТСтеТСССТЗСТЗААТААСТТСТАТСССАОАЗАСЗССАААСТАСАСТЗСААесТСОАТ
ААСЙСССТССААТСОСЙТААСТСССАбСАЗАЙТОТСАСАЙАССАССАСАЙСААСеАСАССАССТАСАСССТСАСС
АССАСССТСАСеСТСАССАААССАСАСТАССАСАААСАСАААСТСТАССССТбСеААСТСАСССАТСАОСеССТС
АЙСТССССССТСАСАААСАССТТСААСАСССЗАЗАЗТЗТТЕА (ЗЕГ) Ю N0:1)
8Е0 ΙΌ N0: 2 представлена ниже, где жирным шрифтом отмечены СЭЯ (например, СЭЯ1 представляет собой аминокислоты с 43 по 58 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2, СЭЯ2 представляет собой аминокислоты с 74 по 80 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2 и СЭЯ3 представляет собой аминокислоты с 113 по 121 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2):
ΜνΤζΟΤΟΥΕΊΒ ЬЬЬИ15САУС 0ΐνΗΤ03Ρ03 ЬАУЗЪСЕВАТ ПГСКАЗЕЗТО
1УС№ГМНИУ
ООКРЗСРРКЬ
1ДУ1А8ЫЬЕ8
СУРОКГЗСЗС
101
ЗЬОАЕОУАУУ
УСООИИЕОРУ
ΤΕΌοστκνει №ΤνΑΑΡ5νε
1ЕРРЗСЕ0ЬК
151
ЗСТАЗУУСЬЪ
ΝΝΕΪΡΕΕΑΚν
5Ν30Ε3ντες оекозтгзьз
201
3ΤΕΤΕ3ΚΑ0Ϊ
ΕΚΗΚνΥΑΟΕν
ТНОСЬЗЗРУТ
КЗГЫВСЕС (5Е0 10 N0:2)
Зрелая гуманизированная легкая каппа цепь представляет собой аминокислоты с 20 по 248 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2.
8Е0 ΙΌ N0: 3 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую не содержащую сахаров тяжелую цепь Ι§01 гуманизированного 8Я-1
- 3 015923
АТСЙАСТСЙАССТССАСССТСТТСТССТТаСТСССАСТССССССАССТССССАСТСССАССТССАССТС
СТССДСТСТСССССТСАССТСААСААбССТССССССТСАСТСААССТСТССТССААббСТТСТССАТАСАССТТС
АССАОТТАСААТАТССАСТСССТСССССАСОССССТССАСАА&СССТТСАСТССАТСЙбАСТТАТТТАТТСАССА
ААТССТСАТАСТТССТАСААТСАСААСТТСАААСССАСССТСАССАТТАССССТСАСАААТССАССАССАСАССС
ТАСАТССАССТСАССАСССТСАСАТСТСАССАСАССССССТСТАТТАСТСТСССАСАСАСАСССАТАСТССТТТТ
ССТААСТССССССААЗСеАСТСТбСТСАСССТСТСТАбТСССТССАССААЙСССССАТСССТСТТСССССТСССА
СССТССТССААСАССАССТСТССССССАСАСССЕСССТССССТСССТССТСААССАСТАСТТСССССААССССТС
АСбСТСТССТССААСТСАСССЗСССТСАССАССССССТССАСАССТТССССССТСТССТАСАСТССТСАбСАСТС
ТАСТСССТСАССАСССТССТСАСССТССССТССАССАССТТССССАСССАСАССТАСАТСТССААССТСААТСАС
ААССССАОСААСАССААССТССАСААСАААСТТеАССССАААТСТТСТСАСААААСТСАСАСАТеСССАСССТСС
ССАССАССТСААСТССТССССССАСССТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААССАСАСССТСАТСАТСТСС
СССАССССТСАССТСАСАТСССТССТССТССАССТСАСССАССААСАСССТСАССТСААСТТСААСТССТАССТС
САСССССТССАСЗТЗСАТААТЗССААСАСАААССССССССАССАССАСТАССАСАССАССТАСССТСТССТСАСС
СТССТСАССОТССТССАССАССАСТСССТСААТСССААССАСТАСААСТССААССТСТССААСАААССССТСССА
ССССССАТССАСААААССАТСТССАААСССАААССССАССССССАСААССАСАССТЕТАСАСССТССССССАТСС
ССССАТСАССТСАССААСААССАЙСТСАЙССТСАССТеССТССТСАААбеСТТСТАТСССАБСОАСАТСССССТС
САСТССеАЙАССААТССССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТССССТССТССАСТСССАССССТССТТС ТТССТСТАТАССААССТСАСССТСбАСААСАССАССТСССАССАССССААСбТСТТСТСАТССТСССТСАТССАТ САСССТСТССАСААССАСТАСАСССАСААСАСССТСТСССТйТСТСССССТАААТСА (5Е0 10 N0:3),
ΟΌΚ обозначены жирным шрифтом (например, ΟΌΚ1 представляет собой аминокислоты с 50 по 54 последовательности 8Ер ΙΌ N0: 4, СЭЕ2 представляет собой аминокислоты с 69 по 85 последовательности 8Е9 Ш N0: 4, и ΟΌΚ 3 представляет собой аминокислоты с 118 по 125 последовательности 8Ер ΙΌ N0: 4):
1 МОИТИКУГСЬ ЬАУАРСАНЗО ν0Ι.νζ}5ΟΑΕν ΚΚΡ3Ά8νκνΞ СКАЗСУТЕТЗ
51 ΥΝΜΗΜνΚΟΑΡ СОСЪЕНМЭТ! узаысотзум οκτκεκντιτ АЦКЗТЗТАУМ
101 БЬЗЗЬВЭЕОТ АУУУСАКЕЙО ЮТСЫЫСОСТ ЬУТУЗЗАЗТК СРЗУЕРЪАРЗ
151 ЗКЗТЗСЙТАА ЪССИУКОУЕР ΕΡνΤνΞΗΝΞΕ АЬТЗСУНТРР АУЕОЗЗСЬУЗ
201 ЬЗЗУУТУРЗЗ 5ЫЗТ0ТУ1СН νΝΗΚΡ5ΜΤΚν РКК'-'ЕРКЗСО КТНТСРРСРА
251 РЕЬЬССРЗУГ ЬГРРКРКОТЕ М13КТРЕУТС νννονδΗΕΟΡ ΕνΚΓΝΗΥνϋΰ
301 УЕУННАКТКР ΚΕΕ0Ϊ03ΤΪΕ УУЗУЬТУЕВД РИЬМбКЕУКС КУЗЦКАЬРАР
351 ΙΕΚΤΙ3ΚΑΚ0 ςρρΕρςνΥΊΈ РРЗКОЕЬТКЦ ОУЗЬТСЬУКС ΕΥΡΞϋΙΑνΕΗ
401 Ε3Ν02ΡΞΝΝΥ ΚΤΤΡΡνΣϋΞΟ СЗЕТЬУЗКЪТ νβΚ3ΗΜ0Ώ6Ν УЕЗСЗУМНЕА
451 ЬНЫНУТОКЗЬ ЗЬЗРСК (Зед Ιό Νο:4)
8Ер ΙΌ N0: 5 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь 1§С2 гуманизированного 8К-1
АТОСАСТбОАССТСбАОеСТСТТСТССТТССТСОСАСТебССССАССТбСССАСТСССАСОТССАССТССТССАС
ТСТСООССТСАСОТСААОААСССТССССССТСАОТОААССТСТССТбСААСбСТТСТССАТАСАССТТСАССАСТ
ТАСААТАТОСАСТОССТССОССАСОССССТССАСААСОССТТОАСТСОАТССОАеТТАТТТАТТСАССАААТССТ
САТАСТТССТАСААТСАСААСТТСАААС5САСССТСАССАТТАССССТСАСАААТССАССА6САСА6ССТАСАТС
САССТСАССАСССТСАСАТСТСАССАСАССССССТСТАТТАСТСТСССАСАСАСАСОбАТАСТССТТТТССТААС
ТССдОССААСССАСТСТСОТСАСССТСТСТАСТСССТССАССААССССССАТССаТСТТСССССТСССССССТОС
ТССАССАОСАССТСССАСАОСАСАОССССССТСеССТСССТСОТСААОСАСТАСТТСССССААССССТСАССОТС
ТССТССААСТСАОССеСТСТЕАССАССССССТОСАСАССТТСССАОСТСТССТАСАСТССТСАССАСТСТАСТСС
СТСАОСАОССТСеТСАСССТССССТССАССААСТТСОССАСССАСАССТАСАССТССААСОТАОАТСАСААСССС
АССААСАССААССТССАСАЛСАСАСТТСАССССАААТОТТСТОТССАСТССССАСССТССССАССАССАССТСТС
ССАССАСССТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААССАСАСССТСАТ6АТСТСССССАСССС'ГСА13СТСАСС
ТССЙТССТССТСОАССТСАОССАССААОАСССССАССТССАОТТСААСТССТАСОТССАСССССТОСАСОТССАТ
ААТСССААСАСАААСССАССССАССАССАСТТСААСАССАССТТСССТСТСОТСАССОТССТСАСССТТОТССАС
САСОАСТООСТОААССССААССАСТАСААОТбСААССТСТССААСАААСОССТСССАОСССССАТССАСААААСС
АТСТССААААССАААССССАССССССАСААССАСАССТСТАСАСССТССССССАТССССОСАСОАСАТСАССААС
ААССАеСТСАСССТСАССТбССТЗбТСАААСССТТСТАССССАССбАСАТСбСССТСбАСТОССАСАОСААТОЗО
САСССССАОААСААСТАСААСАССАСАССТСССАТССТССАСТСССАССССТССТТСТТССТСТАСАОСААОСТС
АСССТССАСААСАССАОСТеССАОСАССССААСаТСТТСТСАТССТСССТОАТССАТСАСОСТСТбСАСААССАС
ТАСАСССАОААСАСССТСТСССТОТСТССССОТАААТОА Ιά Νο: 5)
Далее представлена полноразмерная последовательность аминокислот тяжелой цепи 1§С2 8К-1, и
СЭЕ выделены жирным шрифтом:
моитивл/есь ьауарсанзд νςΣνφεοΑΕν κκροΆΞνκνΞ сказсутетз
ΥΝΜΗΝνΒΟΑΡ ООСЬЕНМСУ! ΥδΟΝΟΟΤεΥΝ βΚΓΚβΒνΤΙΤ ΑΟΚ5Τ5ΤΑΥΜ
- 4 015923
101 ЕЪЗЗЬВЗЕОТ ΑνΥΥΟΑΒΕΚΟ ткгсыибоет ЬУТУЗЗАЗТК СРЗУГРЬАРС
151 5КЗТ5ЕЗТАА ЬССЬУКОУГР ΕΡντν3Μ№6 АЬТБСУНТЕР АУЪОЗЕСЬУЗ
201 ЬЗЗУУТУРБЗ КГСТСТУТСЫ νοΗΚΡΕΝΤΚν ОКТУЕККССУ ΕΟΡΡΟΡΑΡΡν
251 АОРЗУЕЬГРР КРК0ТЬМ13К ΤΡΕντΟνννΟ УБНЕПРЕУОГ ΝΗϊνϋΰνΕνΗ
301 ΝΑΚΤΚΡΒΕΕΟ ΓΝδΤΕΈννβν ьттюоиъы СКЕУКСКУЗИ К6ЬРАР1ЕКТ
351 15КТКС0РКЕ ρονγτι,ρρδκ ЕЕМТК№УЗЬ ТСЬУКСГУРЗ ΟΙΆνΕΚΕΕΝΟ
401 9ΡΕΝΝΥΚΤΤΡ РМЬОЗОСЗГГ ΣΥ3ΚΕΤνϋΚ3 НИООбМУЕБС ЗУМНЕАЬНМН
451 утокзьзьзр (Зед Ιά Νο: 6ί
8Ε0 ГО N0: 7 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь 8Я-1 МИЬС
АТС(ЗАСАСАСАСАСАСТССТССТАТСЗСТ6СТССТССТСТС5СТТССАССТТССАСАС6ТААСАТТСТСТТСАСС
СААТСТССАССТТСТТТСССТеТСТСТСТАССССТСАСССССАССАТАТССТССАСАСССАСТСАААСТСТТСАТ
АТТТАТСБСААТАСТТТТАТССАСТССТАССАбСАБАААССАССАСАСССАСССАААСТССТСАТСТАТСТТбСА
ТССААССТАБААТСТбОСБТСССТСССАССТТСАСТОССАСТббСТСТА&ЗАСАСАСТТСАСССТСАССАТТСАТ
ССТСТССАСССТСАТСАТССТССААССТАТТАСТСТСАССААААТААТСАССАТСССТАСАССТТСбСАбЙБбеС
ТСТССАСБТСССТСАСТССТСТССТТСТТСААСААСТТСТАССССАААСАСАТСААТСТСААСТаСААСАТТСАТ
СССАСТСАА.ССАСААААТббССТССТСААСАСТТОСАСТСАТСАеСАСАССАААСАСАССАССТАСАбСАТСАСС
АСТТСАСССАТТСТСААСА6СТТСААСАБСААТ6АСТСТТСА (5Е0 Ю N0: 7)
ΟΌΚ обозначены жирным шрифтом:
1 МЕТОПЛЬИУ ЬЬЬИУРСЗТС
51 ΙΥΟΝβΕΜΗΗΥ ООКРСОРРКЬ
101 ΡνΕΑΟΟΑΑΤΥ ΪΟΟΟΝΝΕΟΡΥ
151 ЗСбАЗУУСЕЬ ΝΝΕΥΡΚΏΙΝν
201 ЗТЬТЬТКОЕУ ΕΚΗΝΞΥΤΟΕΑ
К1УЬТ0БРАЗ
ЫУХЛЗИЪЕЗ
ТЕСССТКЪЕ!
КНК1РС5ЕВ<2
ТНКТ5Т5Р1У
ЬАУЗЬбЬВАТ 15СВА8Е87П
ЗУРАКГЗСЗС ЗНТОЕТЬТЮ
К ВАСААРТУБ 1ЕРР55ЕфЬТ
ЫСУЬ№НТО0 ОЗКСЗТУЗМЗ
Κ5ΕΝΒΝΕ0 (Зед Νο: 8)
8Ε0 ГО N0:9 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь 1дС2а мыши 8Я-1
АТС55АТ6САЗТТСТАТСАТССТСТТСТТС6ТАССААСАССТАСАССТСТССАСТСССА6СТССААСТССАССАС
ССТССС5СТ5АССТОбТСААСССТСССОССТСАЗТСААСАТбТССТССАА6ССТТСТСССТАСАСАТТТАССАСТ
ТАСААТАТбСАСТССБТАААССАСАСАССТССАСАСССССТССААТССАТТОСАСТТАТТТАТТСАССАААТССТ
САТАСТТССТАСААТСАСААСТТСАААСССААССССАСАТТСАСТбСАбАСАААТССТССАССАСАСССТАСАТб
САААТСААСАСССТЗАСАТСТСАСБАСТСТСССОТСТАТТАСТСТССААбАОАСАСБОАТАСТССТТТТССТААС
ТССббССААСБСАСТСТСбТСАСТ&ТСТСТССАСССААААСААСАбССССАТСССТСТАТССАСТССССССТСТб
Т6ТБСА5АТАСААСТСССТССТСеСТСАСТСТАССАТСССТаСТСАА60(ЗТТАТТТСССТаА0ССА<ЗТ(ЗАССТТ6
АССТ6СААСТСТССАТСССТ6ТССАЕТ53ТСТССАСАССТТСССАЗСТ6ТССТССАСТСТСАССТСТАСАСССТС
АССАССТСАбТСАСТСТААССТС6А5САССТСССССАЕССАСТССАТСАССтесААТЗТебСССАССС65САА6С
АССАССААС5Т0САСААСААААТТСАССССАСАеС6СССАСААТСААССССТ6ТССТССАТССАААТССССА5СА
ССТААССТСТТбССтееАССАТСССТСТТСАТСТТСССТССАААСАТСААССАТСТАСТСАТеАТСТСССТСАСС
СССАТАСТСАСАТбТСТаСТССТСаАТСТСАСССАССАТСАСССАСАТСТССАБАТСАССТССТТТСТСААСААС сссатссассассассастссатсастсбсаассасттсааатбсаасстсаасаасааасасстсссасссссс атссабасаассатстсаааасссааасостсастааоасстссасасстататстсттссстссассайаасаа бАОАТСАСТААОАААСАССТСАСТСТСАССТЗСАТ'ССТСАСАбАСТТСАТЙССТ'ЗААБАСАТТТАССТбСАБТСС
АССААСААСССеААААСАСАССТАААСТАСААСААСАСТСААССАБТССТССАСТСТСАТЙеТТСТТАСТТСАТС
ТАСА0СААБСТбАбАбТ6бААААбАА6ААСТБ6СТССАААБАААТА0СТАСТСсЕдЕЕсадЕдд1:ссасдадддЕ сСдсасааСсассасасдасЬаададсЫгсЬсссддасЬссдддЬаааЬдАСЗец Ιά Νο 9)
1 МЗИЗСПЬЕ! УАТАТЗУНЗС УОЬеОРЗАЕЪ УКРОАЗУКМЗ СКАЗСУТГТЗ ΥΝΜΗκνκςτρ
61 Υ5ΘΝΟΟΤ3ΎΝ ОКРКСКАТЬТ Α0ΚΞ33ΤΑΥΜ ЗШЗЬТЗЕОЗ АУУУСАКЕЮ
121 твгсыисест ЬУТУБААКТТ АРЗУУРЬАРУ ссоттеззут ЬССЪУКСУГР ЕРУТЪТИЫЗС
181 ЗЬЗЗСУНТЕР АУЬСЗРЪУТЪ ЗЗЗУТУТЗЗТ ИР3051ТСМУ АНРАЗЗТКУР КК1ЕРВСРТ1
241 КРСРРСКСРА РГСЬЬССРЗУЕ 1ЕРРК1КПУЬ М15Ь5Р1УТС УУУОУЗЕООР ОУОТБМГУММ
301 УЕУНТАОТОТ НВЕЕУМБТЬН УУЗАЬРЮНО ОГОМЗСКЕГКС КУЫЫКОЬРАР 1ЕКТ13КРКБ
361 ЗУНАРСУУУЬ РРРЕЕЕМТКК Ф/ТЪТСМУТО ΕΜΡΕΟΙΥνΕΉ ТЬЖБКТЕЗЖ ΚΝΤΕΡνϊ,ϋ5Ρ
421 еБУЕМУЗКЕК. УЕККМИУЕШЯ ЗУЗСЗУУНЕб ЩЦННТТКЗЕ ЗКТРСК (Зед Ιά Νο: 10)
0ΌΡ1 легкой цепи 8Я-1 имеет последовательность ΚΑδΕδνΟΙΥΟΝδΡΜΗ (аминокислоты с 44 по 58 последовательности δΕφ ГО N0: 8), СЭЕ2 легкой цепи 8Я-1 имеет последовательность ΕΆδΝΣΕδ (аминокислоты с 74 по 80 последовательности δΕφ ГО N0: 8), и 0ΌΕ3 легкой цепи 8Я-1 имеет последовательность 00ΝΝΕΌΡΥΤ (аминокислоты с 111 по 121 последовательности δΕφ ΙΌ N0: 8). СЭК1 тяжелой цепи имеет последовательность 8ΥΝΜΗ (аминокислоты с 50 по 54 последовательности δΕφ ГО N0: 10), 0ΌΡ2 имеет последовательность ΥΙΥ8ΟΝΟΌΤ8ΥΝ0ΚΕΚΟ (аминокислоты с 69 по 85 последова- 5 015923 тельности 8ЕО ΙΌ N0: 10), СЭВ3 имеет последовательность ΚΌΤΚΕ6Ν, (аминокислоты с 118 по 125 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 10).
Очевидно, что каждая из тяжелых и легких цепей, описанных в настоящей заявке, процессируется в клетке до зрелой формы. Соответственно, сигнальные пептиды отщепляются и, в случае тяжелых цепей антител, отщепляется С-концевой лизин. Соответственно, зрелая форма процессируется протеолитически и также проходит другие посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование в случае экспрессии в клетках млекопитающего. Сигнальный пептид для каждой тяжелой и легкой цепи представляет собой аминокислоты с 1 по 20 последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 2 и 10 и аминокислоты с 1 по 19 последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 4, 6 и 10.
Последовательности нуклеотидов и аминокислот легкой цепи 8В-1 мыши приведены в 8ЕЦ ΙΌ N0: 7 и 8Е0 ΙΌ N0: 8. Последовательности нуклеотидов и аминокислот тяжелой цепи 8В-1 мыши приведены в 8Е0 ΙΌ N0: 9 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 10. Варианты с дополнительными заменами (например, консервативными заменами аминокислот мыши) также могут сохранять высокую аффинность связывания. Замены, делеции или вставки в положениях внутри СЭВ и каркаса можно производить, не оказывая влияния на аффинность.
В одном варианте реализации указанное гуманизированное антитело содержит легкую цепь, в которой сохранены исходные СЭВ мыши из антитела 8В-1 мыши, например аминокислоты в положениях приблизительно 44-58, приблизительно 74-80 и приблизительно 113-121 последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 8. В других вариантах реализации указанное гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, в которой сохранены СЭВ мыши из антитела 8В-1 мыши, например аминокислоты в положениях приблизительно 50-54, приблизительно 68-85 и приблизительно 118-125 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:10, и имеет полученную из антител человека каркасную область. При использовании в данной заявке подразумевается, что термин приблизительно предусматривает изменения в положениях от двух до пяти аминокислот, при условии, что аффинность к е-Κίΐ сохраняется.
В одном варианте реализации такие агенты могут содержать последовательность аминокислот, соответствующую 8Е0 ПЭ N0: 2, 4, или 6. В другом варианте реализации любой из вышеуказанных агентов содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентична последовательности аминокислот, приведенной в 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4 или 6. В подобных вариантах реализации изменение последовательности относительно 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4 или 6, соответственно, может представлять собой, например, консервативную замену в соответствующей каркасной области Ι§0 с использованием альтернативной аминокислоты человека в этом положении.
В одном варианте реализации вышеуказанные антитела проявляют авидность, которая характеризуется к,| менее чем 10-2, или менее чем 10-3, или 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, при определении с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ВМеогс-анализ). В другом варианте реализации вышеуказанные антитела проявляют активность нейтрального антагониста с Ιί.'50 менее чем 1 х 10-2, или менее чем 1х 10-3, или 1х10-4, 1х10-5, 1х10-6, 1х10-7, 1х10-8, 1х10-9, при определении с применением клеток.
Настоящее изобретение обеспечивает множество специфично связывающихся и нейтральных антагонистических агентов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: антитела человека или гуманизированные специфичные антитела к е-Κίί, которые получены из 8В-1 мыши и сохраняют желаемые свойства, такие как к,| (константа скорости диссоциации) по отношению к е-Κίΐ в диапазоне 1х 10-2 или менее, или находящаяся в диапазоне до 1х 10-9 или менее (например, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или менее) и/или ГС50 нейтрального антагониста е-Κίΐ в диапазоне 1х 10-2 или менее, или находящаяся в диапазоне до 1х 10-9 или менее (например, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или менее) и/или способность уменьшать выраженность симптомов связанного с е-Κίΐ расстройства. Настоящее изобретение также обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды специфически связывающих агентов, векторы и рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат такие нуклеиновые кислоты, способы получения таких специфически связывающих агентов, фармацевтические лекарственные формы, которые содержат такие специфически связывающие агенты, способы получения фармацевтических лекарственных форм и способы лечения пациентов фармацевтическими лекарственными формами и соединениями.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные модифицированные вариабельные области легкой цепи, конструируют и совместно экспрессируют с нуклеиновыми кислотами, кодирующими СЭВпривитую или гуманизированную тяжелую цепь, или наоборот, и возможно соединять с константными областями. Любую гуманизированную или химерную тяжелую цепь и легкие цепи можно объединить, при условии, что сохраняется подходящая аффинность связывания. Необходимые гены были введены в клетки млекопитающего и полученные рекомбинантные продукты иммуноглобулинов были экспрессированы, очищены и охарактеризованы.
Термин антитело используют в его наиболее широком смысле и он включает полностью собранные антитела, моноклональные антитела (включая антитела человека, гуманизированные или химерные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), и фрагменты антител, которые могут связывать антиген (например, РаЬ1, Р'(аЬ)2, Ру, одноцепочечные
- 6 015923 антитела, димерные антитела - бьаЬобьек), включающие участки, определяющие комплементарность (СЭВ), указанного выше, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность. Термин антитело в явной форме исключает антитело мыши (т.е. антитело, продуцированное мышиной гибридомой или имеющее ту же последовательность, что и антитело, продуцированное мышиной гибридомой) из объема данного термина.
Термин специфически связывающий агент охватывает антитела согласно определению выше и рекомбинантные пептиды или другие соединения, которые содержат последовательности, полученные из СОВ, имеющие необходимые антиген-связывающие свойства. Особенно включены в объем данного термина пептиды, которые содержат последовательности аминокислот, которые по меньшей мере на 80, 90 или 100% идентичны одной или более СОВ области антитела 8В-1 мыши, предпочтительно включающие СЭВ3 тяжелой цепи.
При использовании в данной заявке термин нейтральный антагонист означает специфически связывающий агент, который способен ингибировать агонистическую активность. Эти агенты включают антитела, как определено выше, и рекомбинантные пептиды или другие соединения, которые содержат последовательности, полученные из СЭВ, имеющие необходимые антиген-связывающие свойства. Особенно включены в объем данного термина пептиды, содержащие последовательности аминокислот, которые по меньшей мере на 80, 90 или 100% идентичны одной или более СЭВ области антитела 8В-1 мыши, предпочтительно включающие СЭВ3 тяжелой цепи.
Также включены в объем данного термина пептидные антитела -рерйЬобьек, которые представляют собой молекулы, содержащие Те домен антитела в качестве носителя, который присоединен к по меньшей мере одному антиген-связывающему пептиду. СЭВ области антител, происходящие из антитела 8В-1, могут быть подходящими для введения в пептидное антитело, особенно включая СЭВ3 тяжелой цепи. Получение пептидных антител в общих чертах описано в публикации согласно РСТ АО 00/24782, опубликованной 4 мая, 2000 г. Пептиды могут быть связаны тандемно (т.е., последовательно), в присутствии или в отсутствие линкеров. Пептиды, содержащие цистеиновый остаток, могут образовывать сшивку с другим Сук-содержащим пептидом, любой или каждый из которых может быть связан с носителем. Любой пептид, имеющий более чем один остаток Сук, также может образовать внутрипептидную дисульфидную связь. Любой из этих пептидов может быть модифицирован, например, карбоксильный конец может быть блокирован аминогруппой, могут быть блокированы цистеины, или остатки аминокислот могут быть замещены на молекулы, отличные от остатков аминокислот (см., например, ВйаШадаг и др., 1. Меб. Сйет. 39: 3814-9 (1996), и СиШЬейкои и др., 1. Меб. Сйет. 40: 2876-82 (1997), содержание которых полностью включено в данную заявку посредством ссылки). Последовательности пептидов могут быть оптимизированы, аналогично аффинному созреванию антител, или другим образом изменены аланин сканирующим или неспецифическим, или направленным мутагенезом, с последующим скринингом для определения пептидов, которые лучше всего связываются. Ьотетаи, Апп. Веу. Вюрйук. Вюто1. 81гис1. 26: 401-24 (1997).
Различные молекулы можно вставлять в структуру специфически связывающего агента, например в саму пептидную часть или между частями пептида и носителя специфически связывающих агентов, при этом сохраняя необходимую активность специфически связывающего агента. Можно легко вставить, например, такие молекулы, как Ре домен или его фрагмент, полиэтиленгликоль или другие близкие молекулы, такие как декстран, жирная кислота, липид, холестериновая группа, небольшой карбогидрат, пептид, цитотоксический агент, химиотерапевтический агент, детектируемая молекула, как описано в данной заявке (включая флюоресцентные агенты, радиоактивные метки, такие как радиоактивные изотопы), олигосахарид, олигонуклеотид, полинуклеотид, интерферирующие (или другие) РНК, ферменты, гормоны, или тому подобные. Для специалиста в данной области очевидно, что существуют другие молекулы, подходящие для вставки таким путем, что также охвачено объемом настоящего изобретения. Сюда включена, например, вставка необходимой молекулы между двумя последовательными аминокислотами, возможно с соединением подходящим линкером.
Выделенное антитело представляет собой такое антитело, которое было идентифицировано и отделено от компонентов клетки, которая его экспрессирует. Контаминирующие компоненты клетки представляют собой материал, который будет препятствовать диагностическому или терапевтическому применению указанного антитела и может включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах реализации указанное антитело будет очищенным (1) до более чем 95 вес.% антитела и наиболее предпочтительно более чем 99 вес.%, (2) до степени, достаточной, чтобы получить по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней последовательности аминокислот, или (3) до однородности при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ/ДСН) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, при окраске Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное природное антитело включает антитело ίη кйи внутри рекомбинантной клетки, после того, как по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела будет отсутствовать. Обычно, тем не менее, очищенное антитело будет получено с применением по меньшей мере одного этапа очистки.
Термин моноклональное антитело, при использовании в данной заявке, относится к антителу, по
- 7 015923 лученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие указанную популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против отдельного антигенного сайта или эпитопа, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных эпитопов.
В зависимости от последовательности аминокислот константного домена их тяжелых цепей, иммуноглобулины человека можно отнести к различным классам. Существует пять основных классов, 1дЛ, 1дЭ, 1дЕ, 1дС и 1дМ, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы или изотипы, например 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4. 1дА1 и 1дА2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, названы альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Субъединичные структуры и пространственные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Различные изотипы имеют различные эффекторные функции; например 1дС1 и 1дС3 изотипы имеют антителозависимую клеточно обусловленную цитотоксичность (АЭССактивность).
Термин гипервариабельный участок относится к остаткам аминокислот антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит остатки аминокислот из области, определяющей комплементарность, или СОВ [т.е., остатки 24-34 (Ь1), 50-56 (Ь2) и 89-97 (Ь3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано у КаЬа! и др., 8ес.|иепсе5 οί РгоЮнъ οί 1ттипо1од1са1 1п1еге81, 5ое изд., РиЫ1с НеаИй 8егУ1се, №10опа1 [иьШгПеь οί НеаНй, Бетесда; Мэриленд (1991)]. Даже единичная СОВ область может узнать и связать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания антигена, содержащий все имеющиеся СЭВ. Очевидно, что в области СЭВ антитела могут присутствовать дополнительные или отсутствовать последовательности за пределами конкретных ограничений, определяемых условием, что указанное антитело сохраняет свою способность связываться с целевой молекулой.
Альтернативное определение остатков из гипервариабельной петли описано у С1ю11на и др., 1. ΜοΙ.ΒίοΙ. 196: 901-917 (1987), как остатки 26-32 (Ь1), 50-52 (Ь2) и 91-96 (Ь3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи.
Остатки каркаса или ЕВ представляют собой остатки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельной области.
Фрагменты антител включают часть интактного полноразмерного антитела, предпочтительно антиген-связывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2 и Εν фрагменты; димерные антитела; линейные антитела (2ара1а и др., Рго1еш Епд.,8(10):1057-1062 (1995)); одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.
Расщепление антитела папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых ЕаЬ''-фрагменты, каждый из которых содержит один антигенсвязывающий сайт, и остаточный Ес''фрагмент, который включает константную область. ЕаЬ-фрагмент содержит весь вариабельный домен, также, как и константный домен, легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Есфрагмент несет остатки сахаров и отвечает за многие эффекторные функции антитела (такие, как связывание комплемента и клеточных рецепторов), которые помогают отличать один класс антитела от другого.
Обработка пепсином дает Е(аЬ')2 фрагмент, который содержит два одноцепочечных Εν или &Εν фрагмента антитела, включающих УН и Уъ домены антитела, при этом указанные домены представлены в виде одной полипептидной цепи. ЕаЬ-фрагменты отличаются от ЕаЬ' фрагментов присутствием нескольких дополнительных остатков в карбоксильном конце СН1 домена тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирного участка антитела. Предпочтительно Εν полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между УН И Уь доменами, который позволяет Εν образовывать необходимую структуру для связывания антигена. Для обзора по Μν см. Р1иск1йип в ТИе Ρίκιπικκοίοβ}· οί Μοпοс1οпа1 ΑπίΛο^δ, том. I 13, Вο8епЬи^д и ΜοοίΌ ред., 8ргшдег-Уег1ад, Ыете ΥογΚ стр. 269-315 (1994).
'Έν представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена. Этот участок состоит из димера одной тяжелой и одной легкой цепи вариабельного домена, которые находятся в плотной нековалентной ассоциации. Он находится в такой конфигурации, что три области СЭВ каждого вариабельного домена взаимодействуют с формированием сайта связывания антигена на поверхности УН Уь димера. Все вместе, шесть областей СЭВ придают антигенсвязывающую специфичность указанному антителу. Тем не менее, единичный вариабельный домен (или половина Εν, включающая только три СЭВ, специфичные к антигену) имеет способность узнавать и связывать антиген, хотя с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания.
Термин димеры антител относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (УН), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (Уь) в одной полипептидной цепи (УН Уь). С помощью линкера, который слишком короток, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на той же цепи, обеспечивают спари
- 8 015923 вание указанных доменов с комплементарными доменами другой цепи и создают два антигенсвязывающих сайта. Димеры антител описаны более подробно, например, в ЕР 404,097; \УО 93/11161; и 30 НоШпдет и др., Ргос. ЫаЙ. Асаб. δα. И8А, 90:6444-6448 (1993).
Различные методики были разработаны для получения фрагментов антител. Как правило, эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител, но их также можно получить непосредственно из рекомбинантных клеток-хозяев. См., например, Вейет и др., 8с1еисе 240: 10411043 (1988); 8кетта и др. 8с1еисе 240: 1038-1041 (1988); Сайет и др., Вю/ТесЬпо1о§у 10:163-167 (1992).
Как предусмотренно в данной заявке, в композициях и способах лечения воспалительных, аутоиммунных, онкологических и фиброзных расстройств можно применять один или более анти-с-Кй терапевтических агентов, которые применяют по отдельности или в комбинации с другим терапевтическим агентом, чтобы достичь необходимого эффекта. Примеры антифиброзных агентов, подходящих для применения в соответствии с настоящим изобретением, включают цитокины, причем указанный цитокин выбран из трансформирующего фактора роста β (ТСЕ-β), интерлейкина-4 (1Ь-4), интерлейкина-5 (1Ь-5), интерлейкина-9 (1Ь-9), интерлейкина-13(1Е-13), гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α), интерлейкина-1 бета (1Ь-1 β), фактора роста соединительной ткани (ФРСТ), интерлейкина-6 (1Ь-6), онкостатина М (О8М), фактора роста тромбоцитов (ТРФ), моноцитарного хемотаксического протеина 1 (ССЬ2/МСР-1) и хемокина, регулируемого легкими и активацией (ССЬ18/РЛК.С).
Антитела, полученные из антитела 8Р-1 согласно настоящему изобретению, предпочтительно получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК с применением одной из систем экспрессии антител, хорошо известных в данной области (см., например, Наг1оте и Ьаие, АпйЬоб1ек: А ЬаЬотаФгу Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬогаЮту (1988)). Такие антитела также являются предпочтительно химерными рекомбинантными белками, имеющими полученные из иммуноглобулинов вариабельные последовательности и константные области антител человека, или более предпочтительно являются более похожими на моноклональные антитела человека (такие, как антитела человека или гуманизированные антитела), которые включают остатки антитела человека, но предпочтительно сохраняют, по меньшей мере, СЭК. области антитела 8К.-1 мыши. Кроме интактных, полноразмерных молекул, термин антитело также относится к их фрагментам или мультимерам, или агрегатам интактных молекул и/или фрагментов, которые связываются с с-Кй.
Выражение гуманизированное антитело относится к антителу, полученному из антитела, не происходящего от человека, как правило, из моноклонального антитела мыши. В качестве альтернативы, гуманизированное антитело можно получить из химерного антитела, в котором сохранены или, по существу, сохранены антиген-связывающие свойства родительского, не происходящего от человека, антитела, но которое проявляет пониженную иммуногенность по сравнению с родительским антителом, когда оно введено в человека. Выражение химерное/рекомбинантное антитело при использовании в данной заявке относится к антителу, содержащему последовательность, полученную из двух различных антител (см., например, патент США номер 4,816,567), которые, как правило, происходят из различных видов. В основном, химерные антитела содержат фрагменты антител человека и мыши, обычно константные области человека и вариабельные области мыши.
Рекомбинантное получение антител
Последовательность аминокислот интересующего иммуноглобулина можно определить путем непосредственного секвенирования белка, и подходящие кодирующие последовательности нуклеотидов можно разработать согласно универсальной таблице генетического кода.
В качестве альтернативы, ДНК, кодирующие указанные моноклональные антитела, можно выделить и секвенировать из гибридомных клеток с применением традиционных процедур (например, путем применения олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи указанных моноклональных антител). Определение последовательности, как правило, будет требовать выделения по меньшей мере части интересующего гена или кДНК. Обычно это требует клонирования ДНК или предпочтительно мРНК (т.е., кДНК), кодирующей указанные моноклональные антитела. Клонирование выполняют, применяя стандартные методики (см., например, 8ашЬтоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Сшбе, тома 1-3, Со1б 8ртшд НагЬог Ргекк, которая включена в данную заявку посредством ссылки). Например, библиотеку кДНК можно сконструировать с помощью обратной транскрипции поли А + мРНК, предпочтительно ассоциированной с мембраной мРНК, и скрининга библиотеки с применением зондов, специфичных к последовательности генов полипептида иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте реализации, тем не менее, применяют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации кДНК (или части полноразмерных кДНК), кодирующих сегмент гена интересующего иммуноглобулина (например, вариабельный сегмент легкой цепи). Амплифицированные последовательности можно легко клонировать в любой подходящий вектор, например экспрессионные векторы, минигенные векторы, или векторы фагового дисплея. Должно быть очевидно, что конкретный применяемый способ клонирования не является критичным фактором, при условии, что возможно определить последовательность некоторой части полипептида интере
- 9 015923 сующего иммуноглобулина.
При использовании в данной заявке выделенная молекула нуклеиновой кислоты или выделенная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая либо (1) идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике указанной нуклеиновой кислоты или (2) клонирована, амплифицирована, помечена, или другим образом отделена от фоновых нуклеиновых киелот, таким образом, что можно определить последовательность интересующей нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, которая находится в другой форме или окружении, чем те, в которых она находится в природе. Тем не менее, выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют указанное антитело, где, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты находится в положении на хромосоме, отличном от ее положения в природных клетках.
Одним из источников РНК, используемых при клонировании и секвенировании, является гибридома, полученная посредством получения В-клеток из трансгенной мыши и слияния В-клетки с бессмертной клеткой. Преимуществом применения гибридом является то, что их можно легко подвергнуть скринингу и отобрать гибридомы, которые продуцируют интересующее моноклональное антитело человека. В качестве альтернативы, РНК можно выделить из В-клеток (или целой селезенки) иммунизированного животного. При применении источников, отличных от гибридомы, может быть желательным провести скрининг на последовательности, кодирующие иммуноглобулины или полипептиды иммуноглобулинов, обладающие свойствами специфичного связывания. Одним из способов подобного скрининга является применение технологии фагового дисплея. Фаговый дисплей описан, например, в Бо\усг и др., XVО 91/17271, МеСайейу и др., νθ 92/01047, и СаФи и К.орго\\ъкг Ргос. ЫаЙ. Аеаб. Зе1. И8Л, 87:6450-6454 (1990), содержание каждой из которых включено в данную заявку посредством ссылки. В одном варианте реализации, применяя технологию фагового дисплея, выделяют кДНК из иммунизированной трансгенной мыши (например, тотальную кДНК селезенки), применяют полимеразную цепную реакцию для амплификации последовательностей кДНК, которые кодируют часть полипептида иммуноглобулина, например СБК. области, и амплифицированные последовательности вставляют в фаговый вектор. кДНК, кодирующие интересующие пептиды, например, пептиды вариабельных областей с необходимыми свойствами связывания, определяют с помощью стандартных методик, таких как пеннинг.
Затем определяют последовательность амплифицированной или клонированой нуклеиновой кислоты. Как правило, определяют последовательность, кодирующую всю вариабельную область полипептида иммуноглобулина, тем не менее, иногда может быть более разумным секвенировать только часть вариабельной области, например СБК-кодирующую часть. Обычно секвенированая часть будет иметь длину по меньшей мере 30 оснований, чаще будут секвенированы основания, кодирующие по меньшей мере приблизительно одну треть или по меньшей мере приблизительно половину длины вариабельной области.
Секвенирование можно проводить на клонах, выделенных из библиотеки кДНК, или, если применяется ПЦР, после субклонирования амплифицированной последовательности или путем прямого секвенирования амплифицированного с помощью ПЦР сегмента. Секвенирование проводят, применяя стандартные методики (см., например, 8атЬтоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1эшид: А ЬаЬотаФту Сшбе, тома 1-3, Со1б Зрппд НагЬог Рге§8, и Зайдет, Р. и др. (1977) Ргос. ЫаЙ. Аеаб. Зек ИЗА 74: 5463-5467, которые включены в данную заявку посредством ссылки). Путем сравнения последовательности клонированной нуклеиновой кислоты с опубликованными последовательностями генов и кДНК иммуноглобулинов человека специалист в данной области в зависимости от просеквенированого участка легко сможет определить: (ί) использованный сегмент эмбрионального типа в гибридомном полипептиде иммуноглобулина (включая изотип тяжелой цепи) и (и) последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, включая последовательности, полученные в результате добавления Ν-участка и процесса соматической мутации. Одним из источников информации о последовательностях генов иммуноглобулинов является №1юпа1 СеШет Рог ВюФейиоФду 1иРогтайои, №Шопа1 ЫЬтату οί Мебюше, №Шопа1 [пкШгйек οί НеаНй, Бетесда, Мерилэнд.
После того как указанная ДНК выделена, ее можно функционально связать с последовательностями, контролирующими экспрессию, или поместить в экспрессионные векторы, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. сой, клетки африканской зеленой мартышки (клетки СОЗ), клетки яичников китайского хомячка (СНО), или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы напрямую синтезировать моноклональные антитела в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантное получение антител хорошо известно в данной области.
К последовательности, контролирующей экспрессию, относятся последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Контролирующие последовательности, которые подходят для прокариот, например, включают последовательность промотора, возможно оператора, и участок связывания рибосомы. Эукариотические клетки, как известно, используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота является функционально связанной в том случае, когда она приведена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК,
- 10 015923 кодирующая пропоследовательность или секреторную лидерную последовательность, является функционально связанной с ДНК, кодирующей полипептид, если он экспрессируется в виде пробелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию этой последовательности; или участок связывания рибосомы является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что облегчает трансляцию. Как правило, функционально связанный означает, что связанные таким образом последовательности ДНК являются непрерывными, и, в случае секреторной лидерной последовательности - непрерывной и в рамке считывания. Тем не менее, энхансеры не обязательно располагаются непрерывно. Соединение завершается лигированием в удобных сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, применяют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.
Термины клетка, линия клеток и культура клеток часто применяют взаимозаменяемо, и все подобные обозначения в данной заявке включают потомство. Термины трансформанты и трансформированные клетки включают первичную клетку и культуры, полученные из них, вне зависимости от числа пересеваний. Также очевидно, что все потомство может быть не идеально идентично по содержанию в нем ДНК, вследствие преднамеренных или самопроизвольных мутаций. Мутантное потомство, которое имеет такую же функциональную или биологическую активность, что и подвергнутая скринигу оригинальная трансформированная клетка, также включено в объем термина.
Настоящее изобретение также предусматривает выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие специфически связывающие агенты или антитела согласно настоящему изобретению, возможно функционально связанные с контрольными последовательностями, узнаваемыми клеткой-хозяином, векторы и клетки-хозяева, которые содержат указанные нуклеиновые кислоты, и рекомбинантные методики получения специфически связывающих агентов или антител, которые могут включать культивирование клетки-хозяина таким образом, что происходит экспрессия указанной нуклеиновой кислоты, и, возможно, получение указанного специфически связывающего агента или антитела из культуры клеток-хозяев или культуральной среды.
Множество векторов известны в данной области. Компоненты вектора могут включать один или более из перечисленных далее: сигнальную последовательность (которая может, например, направлять секрецию указанного специфически связывающего агента или антитела), точку начала репликации, один или более генов селективных маркеров (которые могут, например, наделять устойчивостью к антибиотику или другому лекарственному препарату, комплементируют ауксотрофные дефициты, или поставляют важные питательные компоненты, отсутствующие в среде), энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции, каждый из которых хорошо известен в данной области.
Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки, описанные выше. Подходящие для этих целей прокариоты включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например ЕШегоЬайепасеае, такие как Е§скепсШа, например, Е. сой, ЕШегоЬайег, Его1ша, ИеЬыеПа, РгоЮи^ 8а1топе11а, например 8а1топе11а 1урЫтигшт, 8еггайа, например Зеггайа тагсексапк, и 8Ыде11а, также, как и Вас1Ш такие как В. ьиЬИПь и В. Нсйепйогшк, Ркеийотопак и 81гер1отусе5. Кроме прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих специфически связывающие агенты являются эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи. 8ассНаготусе5 сегеу181ае, или обычные пекарские дрожжи, являются наиболее широко используемыми низшими эукариотами среди микроорганизмовхозяев. Тем не менее, ряд других родов, видов и штаммов общедоступны и применимы в рамках данной заявки, таких как РюЫа, например, Р. райогк, ЗсЫ/охассНаготусех ротЬе; Ииууеготусек, Уагго\\'1а; Сапй1йа; ТпсНойегта гееыа; Ыеигокрога сга^а; Зсй^аппютусек, такие как ЗсНтаппютусек осайегИаПщ и мицелиальные грибы, такие как, например, Ыеигокрога, РешсШшт, То1урос1айшт и хозяева АкрегдШик, такие, как А. шйи1ап§ и А. шдег.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного специфически связывающего агента или антитела получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Было идентифицировано множество штаммов бакуловирусов и вариантов и соответствующих допустимых клеток-хозяев насекомых из таких организмов, как: 8ройор1ега Ггищрегйа (гусеница), Аейек аедурй (москит), Аейек а1Ьор!с1н5 (москит), ЭгоюрНПа те1аподайег (плодовая мушка) и шелкопряд ВотЬух топ. Множество вирусных штаммов для трансфекции таких клеток общедоступны, например Ь-1 вариант вируса совки калифорнийской люцерновой (АнЮдгарНа саНГогшса ПРУ) и Вт-5 штамм вируса ВотЬух топ ЫРУ.
Тем не менее, большой интерес вызывали клетки позвоночных, и культивирование клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало обычной процедурой. Примерами подходящих линий клетокхозяев млекопитающих являются клетки яичников китайского хомячка, включая 0ΉΘΚ1 клетки (АТСС ССЬ61), ЭХВ-11, ΌΟ-44, и клетки яичников китайского хомячка /-ΌΗΡΒ (СНО, Иг1аиЬ и др., Ргос. ЫаЙ. Асай. 8сг И8А 77: 4216 (1980)); клетки почки обезьяны линии СУ1, трансформированные вирусом 8У40 (СО8-7, АТСС СКВ 1651); линия эмбриональных клеток почки человека (293 или клетки 293, субклони
- 11 015923 рованные для выращивания в суспензионной культуре [Огайат и др., 1. Оеп νίτοί. 36: 59 (1977)]; клетки почек сирийского хомячка (ВНК, АТСС ССБ 10); клетки Сертоли мыши (ТМ4, МаЛег, Βίοί. Кергоб. 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (С'№1 АТСС ССБ 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (νΕΚΟ-76, АТСС СКБ-1587); клетки карциномы шейки матки человека (НЕБА, АТСС ССБ 2); клетки почек собаки (МОСК, АТСС ССБ 34); клетки печени крысы ВиППа1о (ВКБ 3А. АТСС СКБ 1442); клетки легкого человека (А138, АТСС ССБ 75); клетки гепатомы человека (Нер С2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССБ51); клетки ТК1 (МаЛег и др., Аппа1к Ν.Υ Асаб. 8с1. 383: 44-68 (1982)); клетки МКС 5 или клетки Е84.
Клетки-хозяева трансформируют или трансфецируют вышеописанными нуклеиновыми кислотами или векторами для получения специфически связывающего агента или антитела и культивируют в традиционной питетельной среде, модифицированной надлежащим образом для индукции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих необходимые последовательности. Кроме того, новые векторы и трансфецированные линии клеток с множеством копий транскрипционных единиц, отделенные посредством селективного маркера, являются особенно пригодными и предпочтительными для экспрессии специфически связывающих агентов или антител.
Клетки-хозяева, применяемые для получения специфически связывающего агента или антитела согласно настоящему изобретению, можно культивировать в ряде сред. Доступные для приобретения среды, такие как среда Нат'к Е10 (81дта), минимальная необходимая среда ((МЕМ), (81дта), КРМ1-1640 (81дта), и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла ((ИМЕМ), 81дта), подходят для культивирования указанных клеток-хозяев. Вдобавок, любую из сред, описанных у Нат и др., МеЛ. Εηζ. 58: 44 (1979), Вагпек и др., Апа1. Вюсйет. 102: 255 (1980), в патентах США с номерами 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; АО90103430; АО 87/00195; или в патенте США рег. номер 30,985, можно применять в качестве культуральной среды для указанных клеток-хозяев. Любую из этих сред можно дополнить, если необходимо, гормонами и/или другими факторами роста (такими, как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими, как хлорид натрия, кальция, магния, и фосфаты), буферами (такими, как НЕРЕ8), нуклеотидами (такими, как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими, как препарат Гентамицин™), микроэлементами (определенными как неорганические соединения, обычно представленные в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые дополнительные вещества также могут быть включены в подходящих концентрациях, которые известны специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН, и тому подобные, применяют такие же, как и ранее применяемые для клеток-хозяев, отобранных для экспрессии, и очевидны для среднего специалиста в данной области. Экспрессионные векторы, рИС323 и рИС324, как описано в заявке на патент США номер 20030082735, содержащие подходящую соответствующую пару легкой цепи и тяжелой цепи, трансфицировали в С89 линию клеток-хозяев.
При культивировании указанных клеток-хозяев специфически связывающий агент или антитело могут продуцироваться внутри клетки, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретироваться в среду. Если специфически связывающий агент или антитело получено внутри клетки, в качестве первого этапа, частицы примесей, клетки-хозяева или лизированные фрагменты удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации.
Композицию специфически связывающих агентов или антител можно очистить, применяя, например, гидроксиапатитовую хроматографию, катионо- или анионообменную хроматографию или предпочтительно аффинную хроматографию, с использованием интересующего антигена или белка А или белка О в качестве аффинного лиганда. Белок А можно применять для очистки специфически связывающих агентов или антител, которые основаны на γ1, γ2 или γ4 тяжелых цепях человека (Бшбтагк и др., 1. 1ттипо1. Ме111. 62: 1-13 (1983)). Белок О рекомендуется для всех изотипов мыши и для у3 человека (Оикк и др., ЕМВО 1. 5: 15671575 (1986)). Матрица, к которой присоединяют аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, но другие матрицы также доступны. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стирол-дивинил) бензол, позволяют использовать более быструю скорость потока и более короткое время процедуры, чем достижимые при применении агарозы. Когда специфически связывающий агент или антитело содержит СН3 домен, смола ВакегЬопб АВХ™ (1. Т. Вакег, РйбйркЬигд, N.1.) пригодна для очистки. Другие методики очистки белков, такие как преципитация этанолом, обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения (ВЭЖХ), хроматофокусировка, ПААГ/ДСН и преципитация сульфатом аммония, также возможно зависят от очищаемого специфически связывающего агента или антитела.
Химерные и гуманизированные антитела
Химерные моноклональные антитела, в которых вариабельные домены 1д моноклонального антитела грызунов слиты с константными доменами 1д человека, можно получить, применяя стандартные процедуры, известные в данной области (См. Моткоп, 8. Б, и др. (1984) Оитепс Нитап АпбЬобу Мо1еси1ек; Мойке Апбдеп Вшбшд Иоташк \νί11ι Нитап Сопк1ап1 Еещоп Иоташк, Ргос. N11. Асаб. 8с1. И8А 81, 68416855; и Воийаппе, О. Б, и др., №-1Шге 312, 643-646 (1984)). Хотя некоторые химерные моноклональные
- 12 015923 антитела проявляют меньшую иммуногенность у людей, вариабельные домены 1д грызунов все же могут привести к значительному ответу человека против белка грызунов.
Гуманизированные антитела можно получить множеством способов, включая, например: (1) прививку не происходящих от человека участков, определяющих комплементарность, (СЭВ) на каркасную и константную области иммуноглобулинов человека (процесс, называемый в данной области гуманизированием через СЭВ-прививку), или, в качестве альтернативы, (2) перенос целых не принадлежащих человеку вариабельных доменов, но с их маскировкой под поверхность антител человека путем замены поверхностных остатков аминокслот (процесс, называемый в данной области шлифовка). Эти способы изложены, например, у 1оиек и др., №1Шгс 321:522 525 (1986); Моткой и др., Ргос. №111. Асаб. 8ск, И.8.А., 81:6851 6855 (1984); Моткой и Οί, Α6ν. 1ттипо1., 44:65 92 (1988); Уегйоеуег и др., 8с1еисе 239:1534 1536 (1988); Раб1аи, Мо1ес. 1ттии. 28:489 498 (1991); Раб1аи, Мо1ес. 1ттиио1. 31(3):169 217 (1994); и Кей1еЬогоидй, С.А. и др., РгоФт Еид. 4(7):773 83 (1991), каждая из которых включена в данную заявку посредством ссылки.
В частности, антитело грызуна при повторных ίη νί\Ό введениях людям, либо отдельно, либо в виде конъюгата, приведет к иммунному ответу реципиента против антитела грызуна; так называемому НАМА-ответу (ответу человека против антитела мыши). НАМА-ответ может ограничить эффективность фармацевтического препарата, если необходимо введение повторных доз. Иммуногенность указанного антитела можно уменьшить путем химической модификации антитела гидрофильным полимером, таким как полиэтиленгликоль, или путем применения способов генетической инженерии, чтобы сделать связывающую структуру антитела более подобной таковой у антитела человека.
СЭВ-прививка включает введение одной или более из шести СЭВ областей из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи 1д мыши в подходящие каркасные области вариабельного домена 1д человека. Эта методика (В1есйтаип, Ь, и др., №Ш1ге 332, 323 (1988)) использует консервативные каркасные области (ЕВ1-РВ4) в качестве каркаса для поддержки СЭВ-петель, которые первыми вступают в контакт с антигеном. Значительным недостатком СЭВ-прививки, тем не менее, является то, что она может дать гуманизированное антитело, которое имеет, по существу, более низкую аффинность связывания, чем исходное антитело мыши, потому что аминокислоты каркасных областей могут вносить вклад в связывание антигена, и потому, что аминокислоты СЭВ-петель могут влиять на ассоциацию двух вариабельных доменов 1д. Химерные 8В-1 антитела не проявили подходящей функциональной эффективности в тестах, основанных на клеточной системе.
Чтобы сохранить аффинность указанного гуманизированного моноклонального антитела, методику СЭВ-прививки можно усовершенствовать путем выбора каркасных областей человека, которые наиболее близко похожи на каркасные области исходного антитела мыши, и путем сайтнаправленного мутагенеза отдельных аминокислот внутри каркаса или СЭВ с помощью компьютерного моделирования сайта связывания антигена (например, Со, М. 8., и др. (1994), I. 1ттиио1. 152, 2968-2976).
Один способ гуманизации антител включает выравнивание последовательностей не принадлежащих человеку тяжелой и легкой цепей с последовательностями тяжелой и легкой цепей человека, выбор и замещение не принадлежащей человеку каркасной области на каркасную область человека на основании такого выравнивания, молекулярное моделирование с целью предсказать конформацию гуманизированной последовательности и сравнение с конформацией родительского антитела. После этого процесса следуют повторные обратные мутации остатков в СЭВ участке, которые нарушают структуру СЭВ, до тех пор, пока предсказанная конформация модели гуманизированной последовательности не будет близко походить на конформацию не принадлежащих человеку СЭВ областей родительского антитела, не принадлежащего человеку. Такие гуманизированные антитела можно дополнительно модифицировать, чтобы облегчить захват и клиренс, например, через рецепторы Ашвелла (см., например, Патенты США с номерами 5530101 и 5585089).
В различных источниках сообщалось о нескольких гуманизациях моноклональных антител мыши с помощью конструктивного расчета (см., например, 20020091240, опубликованную 11 июля, 2002 г., \УО 92/11018 и патент США номер 5693762, патент США номер 5766866). Конструирование гуманизированных антител также было описано, например, у 8шбшска и др. патент США номер 5766886; 8шбшска и др. РгоФш Еидшеетшд 7: 805-814 (1994).
Получение вариантов антител
Варианты последовательности аминокислот желательного специфически связывающего агента или антитела можно получить путем введения подходящих изменений нуклеотидов в кодирующей ДНК, или путем пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков внутри последовательностей аминокислот указанных специфически связывающих агентов или антител. Любую комбинацию делеции, вставки и замены применяют, чтобы достичь конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция проявляет необходимые свойства. Изменения аминокислот также могут влиять на посттрансляционные процессы специфически связывающего агента или гуманизированного или измененного антитела, такие как изменение числа или положения сайтов гликозилирования.
- 13 015923
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих вариантные последовательности аминокислот специфически связывающего агента или антитела, получают с помощью множества способов, известных в данной области. Такие способы включают олигонуклеотид-опосредованный (или сайт-направленный) мутагенез, ПЦР-мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученной измененной или неизмененной версии специфически связывающего агента или антитела.
Пригодный способ идентификации определенных остатков или участков специфически связывающего агента или антитела, которые представляют собой предпочтительные положения для мутагенеза, называют аланин сканирующий мутагенез, как описано у Сииишдйат и ^е11к, 8с1еисе, 244:1081-1085 (1989). В этом способе остаток или группу целевых остатков определяют (например, заряженные остатки, такие как агд, акр, Ык, 1ук и д1и) и замещают на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (наиболее предпочтительно аланин или полиаланин), чтобы повлиять на взаимодействие указанных аминокислот с антигеном. Эти положения аминокислот, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, затем оптимизируют путем введения дополнительных или других вариантов рядом, или в самом сайте замены. Следовательно, хотя сайт для введения замен в последовательность аминокислот определяют заранее, нет необходимости определять заранее природу мутации рег ке. Например, чтобы проанализировать влияние некоторой мутации в данном сайте, проводят а1а-сканирование или неспецифический мутагенез в целевом кодоне или участке, и экспрессированные варианты подвергают скринигу на необходимую активность.
Обычно, варианты последовательности аминокислот указанного специфически связывающего агента или антитела имеют последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 60% идентична последовательности аминокислот с последовательностями аминокислот либо тяжелой, либо легкой цепи исходного специфически связывающего агента или антитела (мышиного или гуманизированного), или по меньшей мере 65%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% идентична, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентична, включая, например, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100%. Идентичность или гомология в отношении этих последовательностей определена в данной заявке как процент остатков аминокислот в рассматриваемой последовательности, которые идентичны остаткам в оригинальной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения разрывов (гэпов), если это необходимо, чтобы достичь максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривает любые консервативные замены (определенные в табл. 1 ниже) как составляющие идентичности последовательностей. Ни одно из Ν-концевых, С-концевых или внутренних удлинений, делеций или вставок в последовательность специфически связывающего агента или антитела не должны быть истолкованы как влияющие на идентичность последовательности или гомологию. Следовательно, идентичность последовательностей можно определить с помощью стандартных способов, которые обычно применяют для сравнения схожести в положениях аминокислот двух полипептидов. Применяя компьютерные программы, такие как ВЬА8Т или РА8ТА, два полипептида выравнивают по оптимальному соответствию их соответствующих аминокислот (либо вдоль всей длины одной или обеих последовательностей, либо вдоль заранее определенной части одной или обеих последовательностей). Указанные программы обеспечивают штраф по умолчанию за открытие гэпов и штраф по умолчанию за увеличение гэпов, и матрицу переходов, такую как РАМ 250 [стандартная матрица переходов; см. ЭауйоГГ и др., в Абак οί Рто1еш 8едиеисе апб 81гис1иге. том. 5, прилож. 3 (1978)], можно применять вместе с указанными компьютерными программами. Например, процент идентичности можно затем рассчитать как: общее число идентичных совпадений, умноженное на 100 и затем поделенное на сумму длины более длинной последовательности в рамках совпадающего интервала и числа разрывов, введенных в более короткую последовательность, чтобы выровнять две последовательности.
Вставки
Вставки в последовательность аминокислот включают присоединения по амино- и/или карбоксилконцу, варьирующиеся в длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, также, как и вставки внутри последовательности одного или множества остатков аминокислот.
Примеры концевых вставок включают специфически связывающий агент или антитело с Νконцевым метиониловым остатком или специфически связывающий агент или антитело (включая фрагмент антитела), слитые с эпитопной меткой или эпитопом какаде-рецептора. Другие варианты вставки в молекулу специфически связывающего агента или антитела включают слияние с полипептидом, который увеличивает период полувыведения из сыворотки крови специфически связывающего агента или антитела, например на Ν-конце или С-конце.
Примеры эпитопных меток включают полипептид НА вируса гриппа (Г1и НА 1ад) и его антитело 12СА5 [Р1е1б и др., Мо1. Се11. Βίο1. 8: 2159-2165 (1988)]; метку с-тус и 8Р9, 3С7, 6Е10, 64, В7 и 9Е10 антитела к ней [Еуаи и др., Мо1. Се11. Βίο1. 5(12): 3610-3616 (1985)]; и метку гликопротеина Ό вируса простого герпеса (дЭ) и антитело к ней [РаЬоткку и др., Рго1еш Еидшеетшд 3(6): 547-553 (1990)]. Другие примеры меток представляют собой полигистидиновые последовательности, как правило, около шести гистидиновых остатков, которые позволяют выделить соединение, помеченное таким образом, с помо
- 14 015923 щью хелатирования никеля. Другие метки и таги, такие как РЬЛС®-таг (ЕакЬтап Нойак, Рочестер, НьюЙорк) хорошо известны и обычно применяются в данной области.
Термин эпитоп связывания с ка1уаде-рецептором относится к эпитопу Рс участка молекулы Ι§0 (например, Ι§01, Ι§02, ΙβΟ3 или Ι§04, который отвечает за увеличение ίη νίνο периода полувыведения из сыворотки крови молекулы ΙβΟ).
Замены
Другой тип вариаций включает варианты с аминокислотными заменами. Такие варианты имеют по меньшей мере один остаток аминокислоты в молекуле специфически связывающего агента или антитела, который удаляется и на его место вставляется другой остаток. Замещающий мутагенез внутри любой из гипервариабельной или СОЯ области, или каркасной области также предусмотрен. Консервативные замены показаны в табл. 1. Наиболее консервативные замены можно найти под заголовком предпочтительные замены. Если такие замены не приводят к изменению биологической активности, тогда можно ввести более существенные изменения, названные примерные замены в табл. 1, или как дополнительно описано ниже в ссылке на классы аминокислот, и подвергнуть скринингу продукты.
Таблица 1
Оригинальные Примерные Предпочтительные замены остатков
А1а (А) уа1; )еи; Не уа)
Агд (К) 1уз; д1п; азп 1уз
Азп (Ν) д1п; Ыз; азр, 1уз; д1п агд
Азр (ϋ) д1и; азп д<и
Суз (С) зег; а1а зег
<Э1п (0) азп; д1и азл
<Э1и (Е) азр; д1л азр
01у (0) а1а
ΗΪ8 (Н) азп; д1п; 1уз; агд
Не (1) 1еи; уа1; те1; а!а; 1еи
рНе; норлейцин
Ьеи (Ь) норлейцин; Не; уа1; те(; а1а; рЬе Не
Ьуз (К) агд; д1п, азп агд
Ме( (М) 1еи; рпе; Не 1еи
Рпе (Р) 1еи; уа1; Не; а1а; 1уг
Рго (Р) а1а
Зег(8) ΪΗ1Γ
ТНг(Т) зег зег
ТгрСЛ/) 1уг; р!че 1уг
Туг(У) 1гр; рпе; 1Ьг; зег рпе
7а!(У) Не; 1еи; те(; рЬе; а!а; норлейцин 1еи
Существенные модификации в биологических свойствах специфически связывающего агента или антитела совершают путем отбора замен, которые отличаются значительно по их эффекту на поддержание (а) структуры полипептидной связи в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (Ь) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте, или (с) величины боковой цепи. Естественные остатки подразделяют на группы на основании общих свойств боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, тер а1а, να1, 1еи, 11е;
(2) нейтральные гидрофильные: сук, кег, Шг;
(3) кислые: акр, д1и;
(4) основные: акп, дю, Ык, 1ук, агд;
(5) остатки, которые оказывают влияние на ориентацию цепи: д1у, рго; и (6) ароматические: 1гр, 1уг, рйе.
Консервативные замены вызывают замену аминокислоты на другой член того же класса. Неконсервативные замещения вызывают замену члена одного из данных классов на член другого класса.
Любой остаток цистеина, не участвующий в сохранении правильной конформации специфически связывающего агента или гуманизированного или вариантного антитела, также можно заместить, как правило, на серин для повышения стабильности молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. Напротив, цистеиновую связь(и) можно ввести в специфически связывающий агент или антитело для повышения стабильности (особенно, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Ρν-фрагмент).
Аффинное созревание
Аффинное созревание включает получение и скрининг вариантов специфически связывающего агента или антитела, которые несут мутации (делеции, вставки или замены) внутри СОЯ родительского специфически связывающего агента или антитела, и отбора вариантов, которые имеют улучшенные биологические свойства, такие как аффинность связывания, по сравнению с родительским специфически связывающим агентом или антителом. Удобным путем получения таких вариантов с замещением является аффинное созревание с использованием фагового дисплея. Кратко, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) мутируют для получения всех возможных замен аминокислот в каждом сайте. Полученные таким образом варианты специфически связывающего агента или антитела мож
- 15 015923 но воспроизвести моновалентным образом из нитевидной фаговой частицы в виде слитых конструкций с продуктом гена III М13, упакованного внутри каждой частицы. Воспроизведенные в фаге варианты затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как раскрыто в данном описании.
Можно провести аланин сканирующий мутагенез, чтобы определить остатки гипервариабельной области, которые вносят значительный вклад в связывание антигена. В качестве альтернативы или в дополнение может быть полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антигенантитело для идентификации точек контакта между специфически связывающим агентом или антителом и антигеном. Такие контактные остатки и смежные остатки представляют собой кандидаты на замещение по методикам, детально разработанным в данной заявке. При получении таких вариантов ряд вариантов подвергают скринингу, как описано в данной заявке, и можно отобрать для дальнейшей разработки в одном или более соответствующем тесте специфически связывающие агенты или антитела с наилучшими свойствами.
Методики, в которых используется перетасовка генов и направленная эволюция, можно также использовать для получения и скрининга вариантов специфически связывающего агента или антитела на необходимую активность. Например, 1егти1ик и др., Ргос ΝαΙΙ Асаб 8с1 И8А. 2 янв., 2001; 98(1): 75-80 сообщают, что доработанные стратегии селекции ίη νίϋΌ, основанные на рибосомном дисплее, совмещали с введением разнообразия ίη νίίΐΌ путем перетасовки ДНК, чтобы изменить либо скорость выведения, либо термодинамическую стабильность одноцепочечных Ρν фрагментов антител (ксЕу); Регтег и др., Титоиг Вю1. 2004 1ап-Арт; 25 (1-2): 7-13 сообщили, что применение фагового дисплея в комбинации с перетасовкой ДНК увеличило аффинность почти на три порядка.
Изменение характера гликозилирования
Можно также получить варианты специфически связывающего агента или антитела, которые имеют измененный рисунок (паттерн) гликозилирования по сравнению с родительским специфически связывающим агентом или антителом, например, удалением одной или более молекул сахаров из специфически связывающего агента или антитела, и/или добавлением одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в специфически связывающем агенте или антителе.
Гликозилирование полипептидов, включая антитела, является обычно либо Ν-связанным, либо Освязанным. Ν-связанное относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарани-Х-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к аспарагиновой боковой цепи. Таким образом, наличие любой из данных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт для гликозилирования. Следовательно, Ν-связанные сайты гликозилирования можно ввести в специфически связывающий агент или антитело путем изменения последовательности аминокислот таким образом, что она будет содержать одну или более этих трипептидных последовательностей. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров Ν-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также можно использовать 5гидроксипролин или 5-гидроксилизин. О-связанные сайты гликозилирования можно ввести в специфически связывающий агент или антитело путем вставки или замещения одного или более остатков серина или треонина в последовательности оригинального специфически связывающего агента или антитела.
Другие модификации
Можно удалить или ввести остаток(ки) цистеина в Рс участок, тем самым устраняя или стимулируя образование дисульфидной связи в цепи в этом участке. Гомодимерный специфически связывающий агент или антитело, полученное таким образом, может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной опосредуемой комплементом киллерной для клеток функцией и антителозависимой клеточно обусловленной цитотоксичностью (АЭСС). См. Сагоп и др., I. Ехр Меб. 176: 1191-1195 (1992) и 8йорек, В. I. 1ттипо1. 148: 2918-2922 (1992). Можно также получить гомодимерные специфически связывающие агенты или антитела с использованием гетеробифункциональных кросс-линкеров, как описано у Ао1ГГ и др., Сапсег Векеагсй 53:2560-2565 (1993). В качестве альтернативы, можно сконструировать специфически связывающий агент или антитело, которое обладает двойными Рс-областями, и тем самым можно повысить способность к комплементарному лизису и АЭСС. См. 81егепкоп и др., Ап(1СапсеГОгид Оекьдп 3:219-230 (1989).
Было показано, что последовательности внутри СОВ могут вызывать связывание антитела с главным комплексом гистосовместимости (МНС) II класса и индуцировать нежелательный хелперный Тклеточный ответ. Консервативные замены позволят специфически связывающему агенту или антителу сохранить активность связывания, но снизить его способность индуцировать нежелательный Тклеточный ответ.
Также предполагается, что могут быть удалены одна или более из 20 Ν-концевых аминокислот тяжелой или легкой цепи.
Модификации для увеличения периода полувыведения из сыворотки крови также могут быть желательны, например, их можно произвести путем введения или добавления эпитопа связывания каКаде
- 16 015923 рецептора (например, путем мутации подходящего участка или путем введения эпитопа в пептидную метку, которую затем сливают со специфически связывающим агентом или антителом на любом конце или в середине, например путем ДНК- или пептидного синтеза) (см., например, ^096/32478) или добавления молекул, таких как РЕС или другие водорастворимые полимеры, включая полисахаридные полимеры.
Эпитоп связывания закаде-рецептора предпочтительно образует участок, отличающийся тем, что любой один или более остатков аминокислот из одной или двух петлей Ес домена перенесены в аналогичные положения специфически связывающего агента или антитела, или фрагмента. Еще более предпочтительно, перенесены три или более остатков из одной или двух петлей Ес домена. Еще более предпочтительно указанный эпитоп брали из Сц2 домена Ес участка (например, из 1дС) и переносили в Сц1. С| |3 или Ун участок, или более чем один такой участок, специфически связывающего агента или антитела. В качестве альтернативы, указанный эпитоп берут из Сн2 домена Ес участка и переносят в Сь участок или Уъ участок, или в оба участка, специфически связывающего агента или фрагмента антитела. См. также международные заявки на патент \¥0 97/34631 и \¥0 96/32478, которые описывают Ес варианты и их взаимодействие с заКаде-рецептором.
Регуляция гомеостаза 1дС ίη νίνο зависит от его связывания с неонатальным Ес рецептором (ЕсКи). Сообщали, что изменение взаимодействия между Ес доменом 1дС и ЕсКи улучшает период полувыведения моноклональных антител из сыворотки крови. Мутации в Ес, которые приводят к более высокой аффинности связывания с неонатальным Ес рецептором (ЕсКи) и замедляют деградацию, и улучшают ФК профиль, будут предпочтительны. Сайт связывания ЕсКи на 1дС расположен на границе Сн2-Сн3 домена. Мутации остатков в этой области (М428Ь и Т250р/М428Ь, Т250р/М428Ь, Р2571/О311Е
М252У/8254Т/Т256Е, н433К/Ы434Е/У43бн или М252¥/8254Т/Т256Е/н433К/\434Е/¥43бн) приводят к повышению аффинности 1дС1 к ЕсКи человека при рн 6.0 и рн 7.3. Дополнительно, некоторые из этих мутаций приводили к улучшению фармакокинетических свойств (замедленный клиренс, более долгий период полувыведения) при введении внутривенно обезьянам.
Также были идентифицированы другие сайты константной области, которые отвечают за комплемент-зависимую цитотоксичность (СЭС), такие как сайт связывания С1д, и/или антителозависимую клеточно обусловленную цитотоксичность (ЛЭСС) [см., например, Мо1ес. 1ттиио1. 29 (5): 633-9 (1992); 8Ые1Дз и др., 1. Βίο1. Сйет., 276(9):6591-6604 (2001), полностью включены в данную заявку посредством ссылки]. Мутация остатков внутри сайтов связывания Ес рецептора может привести к изменению (т.е. увеличению или уменьшению) эффекторной функции, как, например, измененная ЛЭСС или СЭС активность, или измененный период полувыведения. Как описано выше, потенциальные мутации включают вставку, делецию или замену одного или более остатков, включая замену на аланин, консервативную замену, неконсервативную замену, или замещение на соответствующий аминокислотный остаток в том же положении из другого подкласса (например, замещение 1дС1 остатка на соответствующий 1дС2 остаток в этом положении).
Другие ковалентные модификации
Ковалентные модификации указанного специфически связывающего агента или антитела также включены в объем настоящего изобретения. Их можно произвести путем химического синтеза или путем ферментативного или химического расщепления специфически связывающего агента или антитела, если они применимы. Другие типы ковалентных модификаций можно ввести в специфически связывающий агент или антитело путем проведения реакции целевых остатков аминокислот с органическим модифицирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или Ν- или Сконцевыми остатками.
Цистеиновые остатки наиболее часто приводят в реакцию с α-галоацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлороацетамид, чтобы получить производные карбоксиметила или карбоксиамидометила. Цистеиновые остатки также дериватизируют с помощью реакции с бромтрифторацетон, а-бром-в-(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Νалкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, пхлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазоллом.
Гистидиловые остатки модифицируют посредством взаимодействия с диэтилпирокарбонатом при рн 5.5-7.0, поскольку указанный агент является относительно специфичным для гистидиловой боковой цепи. Также применим пара-бромфенацилбромид; взаимодействие предпочтительно осуществляют в 0.1 М растворе какодилата натрия при рн 6.0.
Лизиниловые и аминоконцевые остатки приводят во взаимодействие с янтарным ангидридом или ангидридами других карбоновых кислот. Модификация указанными агентами может приводить к изменению заряда лизиниловых остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфааминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; 0-метилизомочевина; 2,4пентан-дион и глиоксилат в реакции, катализируемой трансаминазой.
Аргиниловые остатки модифицируют путем взаимодействия с одним или несколькими обычными
- 17 015923 реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для дериватизации остатков аргинина требуется, чтобы взаимодействие осуществлялось в щелочной среде изза высокой рВа гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, такие реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина.
Можно также совершить необходимые модификации тирозиловых остатков, особенно интересны случаи введения спектральных меток в тирозиловые остатки с помощью реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Наиболее часто применяют №ацетилимидизол и тетранитрометан для образования видов 0-ацетил тирозила и 3-нитропроизводных, соответственно. Тирозиловые остатки йодируют, применяя 125Ι или 131Ι, для получения меченых белков для использования в радиоиммунологическом анализе.
Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) селективно модифицируют путем взаимодействия с карбодиимидами (В^=С=^В'), где В и В' являются разными алкильными группами, такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4диметилфенил)карбодиимид. Кроме того, аспартиловые и глутамиловые остатки превращают в аспарагиниловый и глутаминиловый остатки посредством взаимодействия с ионами аммония.
Глутаминиловые и аспарагиниловые остатки часто деамидируют до соответствующих глутамиловых и аспартиловых остатков, соответственно. Эти остатки деамидируют в нейтральных или основных условиях. Деамидированная форма этих остатков входит в объем настоящего изобретения.
Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп сериловых или треониловых остатков, метилирование альфа-аминогрупп лизина, боковых цепей аргинина и гистидина (Τ. Е. ίτοίβΐιΐοη. РгоШпк: 81гнс1иге апб Мо1еси1аг Рторетйек, \У.Н. Ргеетап & Со., 8ап Ргапс1ксо, стр. 79-86 (1983)), ацетилирование ^концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.
Другой тип ковалентных модификаций включает химическое или ферментативное присоединение гликозидов к специфически связывающему агенту или антителу. Эти процедуры являются преимущественными, так как они не требуют продукции указанного специфически связывающего агента или антитела в клетке-хозяине, которая способна осуществлять N или 0-связанное гликозилирование. В зависимости от применяемого способа присоединения, сахар(а) можно присоединить к (а) аргинину и гистидину, (Ь) свободным карбоксильным группам, (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, (б) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина, (е) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (ί) амидной группе глутамина. Эти способы описаны в XV0 87/05330, опубликованной 11 сент. 1987, и в Арйп и νήκΐοη, СВС Стй. Веу. Вюсйет., стр. 259-306 (1981).
Удаление любой молекулы углевода, присутствующей на указанном специфически связывающем агенте или антителе, можно совершить химически или ферментативно. Химическое дегликозилирование требует контакта специфически связывающего агента или антитела с трифторметансульфоновой кислотой, или эквивалентным соединением. Эта обработка приводит к расщеплению большинства или всех сахаров, кроме сшивающего сахара (№ацетилглюкозамина или №ацетилгалактозамина), при этом оставляя специфически связывающий агент или антитело интактными. Химическое дегликозилирование описано у Нак1тибб1п, и др. Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 259: 52 (1987) и у Ебде и др. Апа1. Вюсйет., 118: 131 (1981). Ферментативное расщепление молекул углевода на специфически связывающем агенте или антителе можно совершить, применяя различные эндо- и экзогликозидазы, как описано у Тйо1акнга и др. Ме1й. Епгуток 138: 350 (1987).
Другой тип ковалентных модификаций указанного специфически связывающего агента или антитела включает сшивание специфически связывающего агента или антитела с одним из множества небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиэтилированными полиолами, полиоксиэтилированным сорбитолом, полиоксиэтилированной глюкозой, полиоксиэтилированным глицерином, полиоксиалкиленами или полисахаридными полимерами, такими как декстран. Подобные способы известны в данной области, см., например, патенты США с номерами 4640835; 4496689; 4301144; 4670417;4791192, 4179337,4766106,4179337,4495285,4609546 или ЕР 315456.
Терапевтические применения
Лечение представляет собой вмешательство, выполненное с намерением предотвратить развитие или изменить патологию расстройства. Соответственно, лечение относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже страдает указанным расстройством, а также тех, у которых указанное расстройство нужно предотвратить.
Млекопитающее для целей лечения относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных для зоопарка, спорта, или домашних любимцев, таких как собаки, лошади, коты, коровы и т. д. Предпочтительно указанное млекопитающее представляет собой человека.
При использовании в данной заявке выражение терапевтически эффективное количество подразумевается обозначающим такое количество терапевтического или профилактического гуманизирован
- 18 015923 ного антитела к с-Κίΐ, которое обеспечивает снижение числа и/или активности тучных клеток или клеток-предшественников, уменьшение фиброзных элементов или предшествующих им образований, или которое обеспечивает снижение тяжести или прогрессирования симптомов, связанных с с-Кй-связанным заболеванием (т.е., которое обеспечивает терапевтическую эффективность). Тучные клетки и гематопоэтические плюрипотентные стволовые клетки-предшественники представляют собой типы первичных клеток, экспрессирующих с-Кй, и, следовательно, предусмотрено, что на клетки, которые получены из ГСК, такие как тучные клетки, и которые вовлечены в заболевания, можно воздействовать композициями и способами согласно настоящему изобретению.
Выражение активность, уменьшающая фиброз подразумевается обозначающим способность ингибировать, полностью или частично и обращать воспаление, вызванное активацией иммунной системы и фиброзом.
При использовании в данной заявке термин фиброзное заболевание или расстройство относится к патологическим состояниям, включающим фиброз одной или более тканей. При использовании в данной заявке термин фиброз относится к аберрантному образованию или развитию избытка фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в виде реактивного процесса, в противоположность образованию фиброзной ткани как нормальной составляющей или заживлению органа или ткани. Фиброз характеризуется накапливанием фибробластов и депонированием коллагена в избытке по отношению к нормальному депонированию в любой конкретной ткани. При использовании в данной заявке термин фиброз применяют синонимично с аберрантное заживление, включающее превращение мезенхимальных клеток в фибробласты, избыточную пролиферацию, активность фибробластов и депонирование коллагена и других белков внеклеточного матрикса.
Фибробласты представляют собой клетки соединительной ткани, которые рассредоточены по соединительной ткани во всем организме. Фибробласты секретируют эластичный внеклеточный матрикс, содержащий коллаген I типа и/или III типа. В ответ на повреждение ткани, близлежащие фибробласты или мезенхимальные клетки-предшественники в кровотоке мигрируют в рану, могут стать, в качестве альтернативы, активированными под влиянием других клеток, таких как тучные клетки и их медиаторы, пролиферировать и продуцировать большие количества коллагенового внеклеточного матрикса. Коллаген представляет собой фибриллярный белок, богатый глицином и пролином, который является основным компонентом внеклеточного матрикса и соединительной ткани, хряща и кости. Молекулы коллагена представляют собой тринитевые спиральные структуры, названные α-цепями, которые обвиваются друг вокруг друга, образуя подобную веревке спираль. Коллаген существует в нескольких формах или типах; из них I тип является наиболее распространенным и обнаруживается в коже, сухожилиях и кости; и III тип обнаруживается в коже, кровеносных сосудах и внутренних органах.
Связанные с тучными клетками фиброзные заболевания включают патологический фиброз или рубцевание (включая эндокардиальный фиброэластоз), идиопатический интерстициальный фиброз, интерстициальный фиброз легких, субадвентициальный фиброз стенок артерий, фиброз Симмерса, перицентральный фиброз, гепатит, дерматофиброму, билиарный цирроз, алкоголический цирроз, острый фиброз легких, идиопатический фиброз легких, синдром острой дыхательной недостаточности, фиброз почек/гломерулонефрит, фиброз почек/диабетическая нефропатию, склеродермию/системную, склеродермию/локальную, келоиды, гипертрофированные шрамы, тяжелое сращение суставов/артрит, миелофиброз, рубцевание роговицы, муковисцидоз, мышечную дистрофию (Дюшенна), фиброз сердца, фиброз мышц/отслоение сетчатки, стриктуру пищевода и болезнь пейрония. Дополнительно фиброзные расстройства могут быть индуцированы или инициированы операцией, включая удаление шрамов/пластическую хирургию, глаукому, фиброз задней капсулы хрусталика, рубцевание роговицы, сращивание связок, заболевание трансплантат против хозяина, операцию на сухожилии, ущемление нерва, контрактуру Дюпюитрена, гинеколигические спайки/фиброз, тазовые спайки, перидуральный фиброз, рестеноз. Также предполагается, что фиброзные патологические состояния, где депонирование фибронектина является причинным фактором, можно лечить согласно настоящему изобретению. Идиопатический фиброз легкого, индуцированный блеомицином фиброз легкого, кистозный фиброз и гломерулярная нефропатия, включая заболевания, характеризуемые отложениями фиброконектина в почках, в конечном счете, приводящие к почечной недостаточности, являются примерами патологических состояний, которые также можно лечить в соответствии с настоящим изобретением. Воспаление, включающее активацию иммунной системы и при котором тучные клетки секретируют воспалительные цитокины, такие как ФНО, и могут активировать и непосредственно взаимодействовать с лимфоцитами, также можно лечить в соответствии с настоящим изобретением.
Склеродермию считают аутоиммунным заболеванием соединительной ткани, приводящим к фиброзному расстройству, характеризующемуся утолщением и уплотнением кожи, вызванным чрезмерной продукцией нового коллагена фибробластами в коже и других органах. Склеродермия может возникнуть как локальное или системное заболевание, затрагивающее ряд органов. Склеродермию также называют системным склерозом. Развитие склеродермической патологии связано с увеличением числа тучных клеток в пораженных подверженных болезни тканях/органах.
- 19 015923
Системный склероз характеризуется образованием гиалинизированной и утолщенной коллагеновой фиброзной ткани, с утолщением кожи и адгезией к подстилающим тканям, особенно на руках и лице. Указанное заболевание также можно охарактеризовать дисфагией вследствие потери перистальтики и подслизистым фиброзом пищевода, одышкой вследствие фиброза легких, фиброзом миокарда и изменениями почечных сосудов (З1ебтаи'§ Меб1еа1 Бюбэиагу, 26ое издание, \νί11ίηιη5 & νίΒοη^ 1995)). Фиброз легких поражает от 30 до 70% пациентов со склеродермией, часто приводя к легочному фиброзу (А1ата§ и др. СуФкте аиб Сго\\111 РаеФг Кеу 14: 537-550 (2003)). Некоторые пациенты имеют одновременно склеродермию и другие заболевания соединительной ткани, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка и полимиозит. Когда признаки склеродермии присутствуют наряду с признаками полимиозита и системной красной волчанки, результирующее патологическое состояние называют смешанным заболеванием соединительной ткани (МСТБ).
Известно, что симптомы, присутствующие в некоторых формах дерматита, вызваны дегрануляцией тучных клеток кожи, приводящей, в частности, к высвобождению гистамина. Следовательно, другим связанным с тучными клетками расстройством, подходящим для лечения согласно настоящему изобретениею, является пигментная крапивница. Это расстройство представляет характерные кожные повреждения, которые представляют собой единичные или множественные пигментированные пятна или узелки, которые зудят при трении и содержат большое количество тучных клеток. Существуют различные формы связанных дерматитов (воспалений кожи), таких как эритема, отек, папулезная сыпь и зуд, которые могут присутствовать при дерматитах человека и животного, каждый из которых можно лечить согласно настоящему изобретению.
Мастоцитоз представляет собой во многих случаях неопластическое заболевание и включает новый или аномальный рост тучных клеток и может являться последствием повышенной аутокринной передачи сигналов ЗСР или активирующей е-Κίΐ мутации. Мастоцитоз может быть ограниченным или системным, включая множество органов, таких как костный мозг. Тучные клетки высвобождают некоторые медиаторы, или химические соединения, одним из которых является гистамин, в организм в ответ на некоторые события. Люди, страдающие системным мастоцитозом, проявляют повышенные количества тучных клеток или имеют тучные клетки неправильной формы, которые не могут нормально функционировать. Вдобавок, тучные клетки не могут отмирать, когда следует, что дополнительно увеличивает общий пул тучных клеток. Когда тучные клетки дегранулируются и высвобождают свое содержимое, это может привести ко многим острым и потенциально серьезным патологическим состояниям или заболеваниям. Расстройства, связанные с тучными клетками, также включают пролиферативные расстройства, приводящие к локализованным заболеваниям, таким как одиночные мастоцитомы кожи вплоть до более тяжелого заболевания, такого как тучноклеточный лейкоз. Примеры включают мастоцитому кожи, активный мастоцитоз, хронический мастоцитоз, мастоцитоз со связанным гематологическим расстройством, пигментную крапивницу, телеангиэктазию таеи1ап8 егирбуа рег§1ап8 (1тер). системное заболевание с участием тучных клеток, тучноклеточный лейкоз, миелоидную лейкемию, системный мастоцитоз (с наличием или без кожных проявлений, таких как пигментная крапивница), синдром/расстройство активации тучных клеток, и более распространенные педиатрические расстройств с участием тучных клеток, такие как одиночная мастоцитома и диффузный мастоцитоз кожи.
Синдром или расстройство активации тучных клеток характеризуется нормальным или почти нормальным числом тучных клеток. Тем не менее, тучные клетки легко провоцируются с высвобождением их содержимого, что приводит ко многим аналогичным симптомам. С данным расстройством связана опасность анафилаксии и шока, но, в отличие от пролиферативных расстройств с участием тучных клеток, у этого синдрома может отсутствовать способность прогрессировать до более агрессивного или злокачественного состояния. Примеры подобных расстройств, связанных с дегрануляцией тучных клеток, могут включать боль в животе, крапивницу и сыпи, анафилаксию, воспаление пищевода, изменение кровяного давления и шок, интестинальные судороги и вздутие, боль костей (от легкой до тяжелой/изнуряющей), чесотку, с сыпями и без, боль в груди, печени, селезенке и окружении других органов, когнитивные затруднения/затуманенность сознания, расстройство всасывания, остеохондроз, мигрени, диарею, мышечную боль, головокружение/вертиго/дурноту, тошноту, потерю сознания, остеопороз/остеопению, утомляемость, периферическую нейропатию и парестезию, гиперемию, учащенное сердцебиение, гастроэзофагеальный рефлюкс и рвоту.
Роль тучных клеток в аллергических заболеваниях была клинически доказана с помощью препаратов, которые блокировали специфичные медиаторы тучных клеток, такие как гистамин и кортикостероиды, которые помимо других активностей вызывают апоптоз тучных клеток. Дополнительные связанные с тучными клетками заболевания включают гистамин-опосредованные аллергические реакции, которые можно лечить путем ингибирования индуцированных хемокинами дегрануляции тучных клеток и базофилов и высвобождения гистамина. Примеры связанных с тучными клетками расстройств или заболеваний, которые можно эффективно лечить способами и композициями согласно настоящему изобретению, также включают, но не ограничены перечисленными, контактный дерматит, атопический дерматит, аллергический дерматит, экзематозный дерматит и дерматит, вызванный укусами или ужалениями насекомых.
- 20 015923
Другие связанные с тучными клетками показания, подходящие для лечения способами и композициями согласно настоящему изобретению, включают воспалительные состояния легких при интерстициальных заболеваниях легких, например саркоидоз, респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДС), бронхопульмональную дисплазию (ΒΡΌ) и состояния, характеризующиеся повышением сывороточной активности РЬА2, такие как РДС взрослых (РДСВ).
Также сообщалось, что тучные клетки играют роль при артрите. Количество тучных клеток повышено в воспаленных синовиальных тканях пациентов с ревматоидным артритом и остеоартритом, и Гливек, как было показано, вызывает апоптоз тучных клеток в синовиальных эксплантатах и контрольнодиагностические исследования людей показали эффективность для пациентов с ревматоидным артритом. Тучные клетки играют роль при септическом шоке, панкреатите, коллагенозе сосудов, острой почечной недостаточности, перитоните и аутоиммунном увеите.
Исследования также позволили предположить, что тучные клетки участвуют в патофизиологии множественного склероза. Считают, что тучные клетки в мозге высвобождают вазоактивные амины, которые могут вызывать демиелинизацию. Высвобождение гистамина из тучных клеток может изменить целостность кровеносных сосудов и вызвать частичное нарушение гематоэнцефалического барьера, опять же участвующее в этиологии множественного склероза. Следовательно, предусмотрено, что способы и композиции согласно настоящему изобретению подходят для лечения или улучшения заболеваемости, связанной с множественным склерозом.
С-Κίί также экспрессируется на некоторых неиммунных клетках, таких как меланоциты и интестинальные клетки, также, как и на сперматоцитах. Настоящее изобретение может иметь применение при лечении меланомы и С18Т и может иметь применение как мужской контрацептив.
Введение и получение фармацевтических лекарственных форм
Анти-с-Κίί специфически связывающие агенты или антитела, используемые при осуществлении способа согласно настоящему изобретению, могут находиться в составе фармацевтических композиций, включающих носитель, подходящий для желаемого способа доставки. Подходящие носители включают любой материал, который при объединении с анти-с-Κίί специфично связывающим и нейтральным антагонистическим агентом или антителом сохраняет их высокую аффинность связывания и эффективность по отношению к с-Κίί и не вступает во взаимодействие с иммунной системой субъекта. Примеры носителей включают, но не ограничены, любой из ряда стандартных фармацевтических носителей, таких как стерильные фосфатно-солевые буферные растворы, бактериостатическая вода и тому подобные. Можно применять различные водные носители, например воду, забуференную воду, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и тому подобные, и может включать другие белки для повышенной стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин, и т.д., подвергнутые легким химическим модификациям или тому подобным.
Примерные концентрации антител в лекарственной форме могут изменяться в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 180 мг/мл или от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/мл, или от приблизительно 0,5 до приблизительно 25 мг/мл, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 2 до приблизительно 10 мг/мл. Водную лекарственную форму указанного антитела можно получить в рН-забуференном растворе, например при рН в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5, или от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,5, или, в качестве альтернативы, приблизительно 5,0. Примеры буферов, которые подходят по рН в рамках этого диапазона, включают ацетат (например, ацетат натрия), сукцинат (такой как сукцинат натрия), глюконат, гистидин, цитрат и буферы других органических кислот. Концентрация буфера может быть от приблизительно 1 до приблизительно 200 мМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 60 мМ, в зависимости, например, от конкретного буфера и необходимой изотоничности лекарственной формы.
В лекарственную форму можно включить агент, влияющий на тоничность, который может также стабилизировать антитело. Примерные тоничные агенты включают полиолы, такие как маннитол, сахароза или трегалоза. Предпочтительно указанная водная лекарственная форма изотонична, хотя гипертонические или гипотонические растворы также могут являться подходящими. Примерные концентрации полиолов в лекарственной форме могут изменяться от приблизительно 1 до приблизительно 15% ^/ν (объемный вес).
Поверхностно-активное вещество можно также добавить к лекарственной форме антитела для уменьшения аггрегации находящегося в лекарственной форме антитела и/или минимизирования образования твердых частиц в лекарственной форме и/или уменьшения всасывания. Примерные поверхностноактивные вещества включают неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбат 20 или полисорбат 80) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Примерные концентрации поверхностно-активного вещества могут изменяться в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,005 до приблизительно 0,2%, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 0,004 до приблизительно 0,01% ^/ν.
В одном варианте реализации указанная лекарственная форма содержит обозначенные выше агенты (т.е. антитело, буфер, полиол и поверхностно-активное вещество) и является, по существу, свободной от одного или более консервантов, таких как бензиловый спирт, фенол, метакрезол, хлоробутанол и бензэ
- 21 015923 тония хлорид. В другом варианте реализации консервант может быть включен в лекарственную форму, например, в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 2%, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1%. Один или более других фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или стабилизаторов, таких как описанные в КетшдФи'к Рйагтасеийса1 8аеисек 16ое изд., Око1, А. ред. (1980), могут быть включены в лекарственную форму при условии, что они не оказывают нежелательного влияния на необходимые свойства указанной лекарственной формы. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают дополнительные забуферивающие агенты; вспомогательные растворители; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как ЕЭТА; комплексные соединения металлов (например, комплексы Ζπ-белок); биодеградируемые полимеры, такие как полиэфиры; и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий.
Терапевтические лекарственные формы указанного антитела готовят для хранения и смешивания указанного антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (КетшдФи'к Рйагтасеи11са1 8с1еисек, 16ое изд., Око1, А. Еб. (1980)), в виде лиофилизованных лекарственных форм или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие, как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и метакрезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу, мальтозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как ЕЭТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Ζи-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Т^ЕЕ№М, РЬИКОМСЗ™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
В одном варианте реализации подходящая лекарственная форма заявленного изобретения содержит изотоничный буфер, такой как фосфатный, ацетатный или ТК18 буфер в комбинации с агентом, влияющим на тоничность, таким как полиол, сорбитол, сахароза или хлорид натрия, которые тонизируют и стабилизируют. Одним примером такого агента, влияющего на тоничность, является 5% сорбитол или сахароза. Кроме того, указанная лекарственная форма может включать поверхностно-активное вещество, например, для предотвращения аггрегации и для стабилизации, в количестве от 0,01 до 0,02% вес/об., рН указанной лекарственной формы может изменяться в диапазоне 4,5-6,5 или от 4,5 до 5,5. Другие примеры описания фармацевтических лекарственных форм для антител можно найти в И8 2003/0113316 и патенте США номер 6171586, каждый полностью включен в данную заявку посредством ссылки.
Заявляемая композиция может также включать более чем одно активное соединение, если необходимо для конкретного показания на лечение, предпочтительно таковые с комплементарными активностями, которые не оказывают нежелательного воздействия друг на друга. Например, может быть желательным дополнительно обеспечить иммуносупрессорным агентом. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в комбинации, в количествах, которые эффективны для намеченного использования.
Активные ингредиенты могут быть также включены в приготовленные микрокапсулы, например, с помощью методик коацервации или межфазной полимеризации, соответственно, например в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из поли(метилметацилата), соответственно, в коллоидные системы для доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микрогранулы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Подобные методики раскрыты в Кетшд1ои'к Рйагтасеийса1 8аеисек, 16ое изд., Око1, А. ред. (1980).
Также охвачены суспензии и кристаллические формы антител. Способы получения суспензий и кристаллических форм известны специалисту в данной области.
Указанные лекарственные формы, применяемые для введения ш у1уо, должны быть стерильными. Композиции согласно настоящему изобретению можно стерилизовать с помощью традиционных, широко известных методик стерилизации. Например, стерилизацию легко совершить путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Полученные растворы можно упаковать для применения или фильтровать при асептических условиях и лиофилизировать, лиофилизированные препараты затем объединяют со стерильным раствором перед введением.
Процесс замораживания-высушивания часто применяют для стабилизации полипептидов для длительного хранения, особенно когда полипептид относительно нестабилен в жидкой композиции. Цикл лиофилизации обычно состоит из трех этапов: замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание; ^1Шатк и РоШ, 1оита1 оГ Рагеи1ега1 8с1еисе аиб Тесйио1оду, т. 38, номер 2, стр. 48-59 (1984). На этапе замораживания указанный раствор охлаждают до тех пор, пока он не замерзнет достаточно хо
- 22 015923 рошо. Вся вода в указанном растворе образует лед на этой стадии. Лед сублимируется на этапе первичного высушивания, который осуществляют путем уменьшения давления в камере ниже давления насыщенного пара льда, применяя вакуум. Наконец, абсорбированную или связанную воду удаляют на этапе вторичного высушивания при пониженном давлении в камере и повышенной температуре полки. В результате данного процесса образуется материал, известный как лиофилизированный пирог. После этого пирог можно ресуспендировать перед использованием.
Стандартной процедурой ресуспендирования лиофилизированного материала является добавление некоторого объема чистой воды (обычно, эквивалентного объему, удаленному в процессе лиофилизации), хотя разбавленные растворы антибактериальных агентов иногда применяют при получении фармацевтических составов для парентерального введения; Сйеи, Эгид ^еνе1ортеиΐ аиб 1ибик1па1 Рйагтасу, т. 18, номера 11 и 12, стр. 1311-1354 (1992).
Вспомогательные вещества в некоторых случаях, как было отмечено, действуют как стабилизаторы для лиофилизированных продуктов; СагреФег и др., Ое^ФортегИк ш Вю1одюа1 8ΐаηба^б^ζаΐ^ои, том 74, страницы 225-239 (1991). Например, известные вспомогательные вещества включают полиолы (включая маннитол, сорбитол и глицерин); сахара (включая глюкозу и сахарозу) и аминокислоты (включая аланин, глицин и глутаминовую кислоту).
Вдобавок, полиолы и сахара также часто используют для защиты полипептидов от повреждений, вызываемых замораживанием и высушиванием и для повышения стабильности во время хранения в высушенном состоянии. Обычно сахара, в частности дисахариды, являются эффективными как в процессах замораживания-высушивания, так и во время хранения. Другие классы молекул, включая моно- и дисахариды и полимеры, такие как поливинилпирролидон, также, как сообщалось, служили стабилизаторами лиофилизированных продуктов.
Для инъецирования указанная фармацевтическая лекарственная форма и/или медикамент может быть порошком, подходящим для ресуспендирования в подходящем растворе, как описано выше. Примеры порошков включают, но не ограничены порошками, высушенными сублимацией, высушенными ротацией или полученными распылительной сушкой, аморфными порошками, гранулами, преципитатами или твердыми частицами. Для инъецирования указанные лекарственные формы могут содержать стабилизаторы, агенты, изменяющие рН, поверхностно-активные вещества, агенты, изменяющие биодоступность, и их комбинации.
Можно приготовить препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие указанное антитело, данные матрицы находятся в виде имеющих определенную форму предметов, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт), полилактиды (патент США номер 3,773,919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и этил-Ьглутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислотыгликолевой кислоты, такие как Ьиргои Эеро1™ (инъекционные микрогранулы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и льюпролида ацетата) и поли-Э-(-)-3-оксимасляную кислоту. Тогда как полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, позволяют добиться высвобождения молекул на протяжении 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких промежутков времени. Если инкапсулированные антитела остаются в организме в течение долгого времени, они могут денатурировать или аггрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приведет к потере биологической активности и возможно изменению иммуногенности. Целесообразные стратегии могут быть разработаны для стабилизации, в зависимости от вовлеченного механизма. Например, если обнаружили, что механизм аггрегации состоит в образовании межмолекулярных 8--8 связей посредством тиодисульфидного обмена, стабилизации можно добиться путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контролирования содержания влаги, применения подходящих добавок и разработки специфичных композиций на основе полимерных матриц.
Лекарственные формы согласно настоящему изобретению могут быть разработаны кратковременно действующими, быстро высвобождающими, длительно действующими или замедленно высвобождающими, как описано в данной заявке. Следовательно, указанные фармацевтические лекарственные формы также могут быть получены в лекарственной форме с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением.
Конкретные дозировки можно подобрать в зависимости от состояния заболевания, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола и диеты субъекта, интервалов между дозами, путей введения, скорости выведения и комбинаций с другими лекарственными препаратами. Любые из вышеупомянутых форм дозировки, содержащих эффективные количества, ложатся в рамки обычного экспериментирования и, таким образом, ложатся в объем настоящего изобретениея.
Указанный специфически связывающий агент или антитело вводят с помощью любых подходящих средств, включая парентеральное, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное и интраназальное,
- 23 015923 и, если необходимо для локального лечения, введения внутрь поражения ткани. Парентеральные инфузии включают внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, внутримышечное, интрадермальное или подкожное введение. Вдобавок, указанный специфически связывающий агент или антитело подходящим образом вводят путем импульсной инфузии, особенно со спадающими дозами указанного специфически связывающего агента или антитела. Предпочтительно дозу вводят путем инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, в зависимости, отчасти, от того, является ли введение кратковременным или продолжительным. Предлагаются также другие способы введения, включая топическое, особенно трансдермальное, трансмукозальное, ректальное, пероральное или локальное введение, например, с помощью катетера, помещенного рядом с желаемым местом. Наиболее предпочтительно специфически связывающий агент или антитело согласно настоящему изобретению вводили внутривенно в физиологическом растворе в дозе, находящейся в диапазоне между 0,01 и 100 мг/кг, с частотой от ежедневного введения до еженедельного, до ежемесячного (например, каждый день, через день, каждый третий день, или 2, 3, 4, 5 или 6 раз в неделю), предпочтительно в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 до 45 мг/кг, от 0,1 до 15 мг/кг или от 0,1 до 10 мг/кг, с частотой 2 или 3 раза в неделю, или вплоть до 45 мг/кг раз в месяц.
Введение с другими агентами
Антитела согласно настоящему изобретению также можно вводить совместно с другими противовоспалительными терапевтическими агентами. Совместное введение включает введение двух различных терапевтических агентов в различное время и различными путями, при условии, что существует перекрывание во времени, в течение которого указанные агенты оказывают свое терапевтическое действие. Примеры анти-с-Κίί агентов, известные в данной области, включают иматиниба мезилат (Гливек™). Следует отметить, что иматиниба мезилат также антагонизирует передачу сигналов от АЬ1 тирозинкиназы и, таким образом, не является специфичным ингибитором с-КП.
Примеры
Гуманизация 8К-1.
Антитело 8К-1 гуманизировали прямой СИК-прививкой, и неожиданно оказалось, что не требуется обратных мутаций для сохранения аффинности, хотя необходимо было продемонстрировать желаемую функциональную активность. Каркасные области человека, которые сохранили большинство канонических остатков и не включали дополнительных остатков пролина, выбрали в качестве акцепторных последовательностей. На основании этого критерия акцепторная последовательность тяжелой цепи νΉ1 146 для каркаса I и II и АН1 1-е для каркаса III, с 1Н4 в качестве наиболее близкого 1-участка (также известного как каркас IV). Акцепторная последовательность легкой цепи была νΚ4 В3 последовательность эмбрионального типа с ΙΚ2 в качестве наиболее близкого 1-участка.
Переключение изотипа совершали для получения ^02, !цС1, [§С4Р и агликозилированных !цС1 форм гуманизированного антитела человека. Консенсусный сайт Ν-связанного гликозилирования удаляли из последовательности константной области ЛС1 человека путем мутации одного остатка аспарагина на глутаминовую кислоту в положении 297 (нумерация по КаЬа1).
Гуманизированное антитело 8К-1 в агликозилированной ЛС1 (Й8К-1 форме связывается необходимым образом с более высокой аффинностью к мембранному с-Κίί по сравнению с растворимым сΚίί и является высоко мощным нейтральным антагонистом 8СЕ и не опосредует напрямую агонизм с-Κίί во всех тестах, основанных на клеточной системе, что проверяли с применением проксимального и дистального считывания сигналинга с-Κίί. Агликозилированный ЛС1 изотип выбрали, чтобы избежать эффекторной функции и лизиса клеток в результате неспецифических эффектов. Это антитело проявило неожиданный и желаемый период полувыведения, нелинейную ФК и насыщаемую опосредованную мишенью элиминацию антитела у обезьян. Оно также обедняло популяцию тучных клеток ш у1уо, как и ожидали.
Связывание с е-Κϊί димером
Активация с-Κίί при его связывании фактором стволовых клеток (8СЕ) приводит к димеризации/олигомеризации, аутофосфорилированию и интернализации рецептора, наиболее вероятно, через клатрин-зависимый путь. Моноклональное антитело 8К-1 связывает с-Κίί димер с в 1000 раз большей аффинностью по сравнению с внеклеточным доменом растворимого с-Κίί мономера, что определяли с помощью В1асоге. Кинетическое моделирование позволило предположить, что 8К-1 будет предпочтительно связывать нативный ассоциированный с мембраной рецептор, даже в присутствии нг/мл растворимого сброшенного мономера рецептора.
Углеводы, присутствующие на гликопротеине, могут влиять на биологические и функциональные свойства. Гуманизация 8К-1 до агликозилированной ЛС1 формы показала, что параметры связывания были консервативны. Гуманизированное 8К-1 3^01 связывалось с рекомбинантным с-Κίί рецептор-Ес с 1<И1ЕхЛ кб равновесного связывания, равной 1.0 пМ, и, применяя В1асоге анализ, 118К-1 аIдО1 блокировало связывание фактора стволовых клеток (8СЕ) с Κί=70 пМ. 118К-1 аIдО1 связывается с высокой аффинностью с димером рецептора, но не с мономером. Это важное свойство, перенос которого нельзя предсказать наверняка при гуманизации, и, как и растворимый с-Κίί мономер, оно менее вероятно будет вы
- 24 015923 ступать в роли акцептора антитела ίη νίνο.
Ингибирование е-Кй-зависимой выживаемости клеток и передачи сигнала через рецептор
Линии клеток мегакариобластов ИТ-7 человека необходим 8СР для выживаемости и удаление 8СР или его ингибирование приводит к быстрой потере жизнеспособности и пониженной пролиферации. Этот способ анализа пригоден для определения ΙΟ’50 мощности 8СР антагонистов. й8В-1 ηΙ§01 проявляло в среднем равную 35 пикомоль.
й8В-1 ηΙβΟ1 эффективно ингибировало 8СР-опосредованное с-Κίΐ фосфорилирование и интернализацию в М07е клетках, указывая на то, что указанное антитело может блокировать события 8СРопосредованного с-Κίΐ сигналинга. В противоположность обнаруженной природной способности 8В-1 опосредовать интернализацию и фосфорилирование с-Κίΐ, неожиданно, не было обнаружено никаких доказательств агонизма й8В-1 ηΙ§01 при проксимальном считывании фосфорилирования с-Κίΐ рецептора в М07е. Стоить заметить, для й8В-1 ΙβΟ2, ΙβΟ2 антитело было несколько менее эффективным и не ингибировало полностью 8СР-опосредованную интернализацию с-Κίΐ рецептора.
й8В-1 ηΙ§01 при концентрации 1,0 мкг/мл проявило нейтрализацию синергитического действия 8СР на образование колоний, произошедших от ГМ-КСФ культуры первичных очищенных СЭ34+, СЭ117+ (с-Κίΐ) клеток костного мозга человека. В соответствии с нашим неожиданным открытием, й8В1 ηΙ§01 не опосредует интернализацию или фосфорилирование с-Κίΐ, и не наблюдалось присущей й8В-1 ηΙ§01 агонистической активности выживаемости вплоть до концентрации 10 мкг/мл указанного антитела в этом тесте. Фактически, указанное антитело было способно ингибировать выживаемость до более низкой, чем основной уровень выживаемости.
Отсутствие аггрегации тучных клеток, активность СБС и РсК
Культивируемые тучные клетки человека, полученные из СЭ34+ клеток костного мозга, использовали для оценки выраженной эффективности и упорядочивания соединений. й8В-1 ηΙβΟ1 ингибировало 8СР-зависимую выживаемость тучных клеток, не сообщало сигнал выживаемости тучным клеткам, не опосредовало фосфорилирование с-Κίΐ рецептора (фиг. 3) и не проявляло способность опосредовать гомотипическую аггрегацию тучных клеток. Наоборот, й8В-1 ΙβΟ2 было способно блокировать 8СРзависимую выживаемость тучных клеток, но само по себе проявило частичную агонистическую активность, сообщая сигнал выживаемости, опосредовало фосфорилирование с-Κίΐ рецептора и приводило к воспроизводимому действию на кластеризацию тучных клеток. Не наблюдали неожиданных аномалий при использовании й8В-1 аЮ§1, когда это антитело вводили ίη νίνο не принадлежащим человеку приматам в дозе вплоть до 30 мг/кг раз в неделю в течение 4 недель или вплоть до 150 мг/кг подкожно раз в неделю в течение 2 недель.
й8В-1 ηΙβΟ1 не проявило детектируемого неспецифичного связывания РсВ с И-937 клетками, экспрессирующими Рсу рецептор Ι = СЭ64, Рсу рецептор ΙΙ = СЭ32 и Рсу рецептор ΙΙΙ = СЭ16. Наоборот, связывание 8В-1 ΙβΟ1 и Ι§Ο4Ρ изотипов обнаруживалось предположительно с высокоаффинным РсуВБ Таким образом, не была предсказана АЭСС активность для й8В-1 а!дО1, и экспериментальные данные на данный момент не проявили комплемент-зависимой цитотоксичной смерти клеток. Агликозилированные химерные ΙβΟ 1 антитела мыши/человека, как сообщалось, сохраняли некоторую эффекторную функцию (НуЬпбота. 1991 Арг; 10(2):211-7) и поэтому эти желаемые активности й8В-1 ηΙβΟ1 были неожиданными. Данные показывают, что применение стандартных методик и, таким образом, выбор обычных ΙβΟ2 или Ι§Ο1, или ΙβΟ4 изотипов не дал бы молекулу с подходящими свойствами, которая являлась бы высокоаффинным связывателем, функционально нейтральным антагонистом с-Κίΐ и которое не активировало бы тучные клетки.
Фармакокинетика
Предварительные исследования ФК проводили, чтобы сравнить ФК й8В-1 Ι§Ο2 и й8В-1 ηΙβΟ1 у самцов яванского макака после однократного введения внутривенно или подкожно в количестве 3 мг/кг. Временные зависимости указывают на нелинейную ФК для обоих. Концентрации понижались более быстро при более низких концентрациях. Два антитела проявили сходные воздействие, что измеряли по С0/Стах и АИС0-(кон, после однократного внутривенного или подкожного введения яванским макакам. На основании АиС0-(кон, выведение из сыворотки было приблизительно < 0,3 мл/ч/кг для обоих гуманизированных антител. Биодоступность была приблизительно 82% и 69% для й8В-1 ηΙβΟ1 и й8В-1 ΙβΟ2 версий гуманизированного 8В-1, соответственно, после подкожного введения.
На основании предварительных данных воздействия 8В-1 и гуманизированных антител при повторных введениях африканским зеленым обезьянам раз в неделю, гуманизированные антитела достигали большего воздействия по сравнению с 8В-1. Стоит заметить, что 1ι8Κ1-ηΙβΟ1 оказалось лучшим в группе по ФК, и ранее было продемонстрировано, что степень гликозилирования молекулы может изменять фармакокинетические свойства и, в случае антитела, его метаболизм и другие биологические свойства. Саосег Iттиηο1 Iттиηοΐйе^. 1992;35(3): 165-74.
Таблица 2. Оценка фармакокинетических параметров после однократного внутривенного (ВВ) или подкожного (ПК) введения й8В-1 ΙβΟ2 или й8В-1 ηΙ§Ο1 в количестве 3 мг/кг самцам яванского макака
- 25 015923
Тестируемое АТ Путь С0/Стах введения (мк/мл) Ттах (ч) Аис0_(кон (ч*мк/мл) СЬ или СЬ/Еа (мл/ч/кг) Р%
К8В-1 а1дС1 ВВ 103 - 9710 < 0.309 -
ЬЗК-1 1д62 вв 107 - 10600 < 0.283 -
К8Я-1 а1дС1 ПК 36.4 72 7970 < 0.376 82.1
Й8К-1 !дС32 ПК 36.7 60 7290 <0.412 68.8
С0 - оцененная начальная концентрация после внутривенного введения дозы
Стах - максимальная концентрация после подкожного введения дозы;
Ттах - время Стах;
АИС0-(кон - область под кривой концентрация-время, начиная с времени 0 до конечной точки времени с измеримой концентрацией;
СЬ - клиренс после внутривенного введения дозы;
СЬ/Р - выраженный клиренс после подкожного введения дозы;
Р% - биодоступность%;
а Клиренс рассчитывали на основании АИС0-4кон - не установлено;
С0, Стах, АиС0-{кон}, СЬ, СЬ/Р и Р% представлены на 3 значимых фигурах.
Определение дозировок для людей
Минимальной эффективной дозой в ФД модели ранения с экспансией тучных клеток является < 0.3 мг/кг, вводимое раз в неделю в течение 2 недель обезьянам. На основании пересчета дозировки, основанного на поверхности тела, минимальная эффективная доза для человека рассчитана как <0.1 мг/кг с эквивалентным режимом дозировки. Тем не менее, это лишь предварительная оценка, так как соотношение ФК и фармакодинамики между степенью и продолжительностью й8В-1 а!дС1 ингибирования с-Κίΐ у человека и клинический результат не известны на данный момент. Более точная оценка будет проведена, когда будет доступно больше фармакокинетических и фармакодинамических данных.
Эффективность ш νί\Ό: обеднение тучными клетками базального легкого и толстой кишки у обезьян с помощью 8В-1 и й8В-1 аЮ§1.
У человека тучные клетки МС1, экспрессирующие триптазу и не имеющие химазы, располагаются преимущественно в тканях слизистых, таких как легкое и толстая кишка, и этот подтип был обнаружен в коже и на высоких уровнях у некоторых пациентов, страдающих склеродермой, что позволило предположить возможную альтернативную активацию тучных клеток при этом патологическом состоянии. Тучные клетки МС1с, экспрессирующие как триптазу, так и химазу, также были колокализованы в некоторых из этих тканей и сходным образом были связаны со склеродермией и другими фиброзными патологическими состояниями. Следовательно, оба подтипа будут представлять первоочередные мишени для ингибитора с-Κίΐ при заболеваниях с участием слизистой и соединительной ткани (например, ИФЛ, системный склероз, астма, ревматоидный артрит и воспалительное заболевание кишечника). Терапевтические препараты также должны быть высоко мощными, эффективными и иметь хороший объем распределения и ФК, так как тучные клетки, как правило, долгоживущие и постоянно находятся в ткани. Более того, тучные клетки в значительной степени неактивны до активации к дегрануляции и бе ηоνо синтезу медиаторов, после чего они играют ключевую роль в воспалительном ответе.
Целью исследований ш νί\Ό было продемонстрировать обеднение базальной слизистой и соединительной ткани тучными клетками, такими как присутствующие в легком и толстой кишке, и определить эффекты на гемопоэз и эффекты на клетки-предшественники, а также вклад в эритропоэз, меланогенез и сперматогенез (таким образом, применение для контрацепции самцов) после продолжительного и высоко фракционного ингибирования с-Κίΐ. Моноклональное антитело 8В-1 было выбрано на основании его эквивалентной функциональной эффективности по отношению к с-Κίΐ человека и обезьяны в СЬ34+ клетках костного мозга при анализе колониеобразующей активности (СРИ) (ингибирование при концентрации 1,0 мкг/мл), и его ФК у обезьян.
8В-1 вводили в дозах в диапазоне от 3 до 30 мг/кг раз в неделю в течение 4 недель. В некоторых исследованиях было показано, что популяция базальных тучных клеток толстой кишки была максимально обеднена после 2 доз на день 14 (минимальная концентрация препарата, определяемая непосредственно перед введением новой дозы С4гоидй > в 800 раз, чем 50% ингибиторная концентрация Κ.'50 клеток), и, следовательно, день 14 был выбран как временная точка для определения фармакологической активности сΚίΐ антагонистов на базальных тучных клетках толстой кишки. В практических целях, базальные тучные клетки легкого оценивали на день 28 во время некропсии и окончания исследования.
При дозе 8В-1 3.0 мг/кг, вводимой раз в неделю, обеднение популяции базальных тучных клеток легкого наблюдали при уровне С1го1|дй ФК > в 200 раз, чем ИТ-7 клеточная ГС50. Влияние более низких доз
- 26 015923
8В-1 на базальные тучные клетки толстой кишки и тучные клетки легкого, меланогенез и сперматогенез не оценивали.
Тем не менее, выполнили исследование с 18В-1 а!дС 1 при более низких дозах, как 0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг. Уровни С4гОи6ь на день 14 были в >200, >2000 и >8000 раз, чем 1С50 клеткок, и эти С1го1|д1| уровни соответствовали отсутствию эффективности, обеднению примерно половины популяции (69%) и практически полному обеднению популяции (96%) базальных тучных клеток толстой кишки (данные суммированы в табл. 2). Соотношение воздействия, клеточной эффективности и действия 18В-1 а1дС1 соответствует таковым для обнаруженных у 8В-1.
Эффективность ΐη νίνο 8К-1 и И8К-1 а1Сц'1 в фармакодинамической модели ранения с экспансией тучных клеток у обезьян
За повреждением кожи следует сильный воспалительный ответ, при котором сначала нейтрофилы, а затем макрофаги и тучные клетки мигрируют из находящихся рядом тканей и из кровотока, происходит грануляция и реэпителизация тканей и связанное с фибробластами стягивание подстилающей рану соединительной ткани (О|сдс1тапп ВЕ, и др., Егой. Вюбсг 2004, янв. 1;9:283-9). Нанесение кожной раны является моделью для исследования механизмов, которые могут быть близки к таковым при фиброзе, так как многие из участвующих в нем типов клеток связаны с этим заболеванием. Более того, сообщали, что у людей ранение кожи связано с повышением количества происходящего от фибробластов 8СЕ и активацией и увеличением плотностей тучных клеток (Тгайшапп А, и др., 1. Ра11ю1. 2000, янв; 190(1): 100-6). После ранения кожи обезьяны количество тучных клеток увеличивалось зависящим от времени образом с плато, которое достигалось через 14 дней после ранения, которое сравнимо с моделью для человека.
Дозировки 0,3, 1 или 3 мг/кг 8В-1, вводимые раз в неделю, позволили достичь примерно максимального ингибирования активированной ранением экспансии тучных клеток на день 14 (фиг. 1). Максимальное ингибирование определено как способность блокировать на 100% увеличение количества тучных клеток по отношению к исходному уровню на день 14 после ранения. Уровни С1го1|д1| для дозы 0,3 мг/кг были > в 7 раз большими, чем ИТ-7 1С50 на день 14 (табл. 3). К 3 неделе уровни в сыворотке были приблизительно в 2 раза большими, чем ИТ-7 1С50, и при этом воздействии наблюдали лишь частичное ингибирование (фиг. 1). На 3 неделе максимальная эффективность все еще наблюдалась как для 1 мг/кг, так и для 3 мг/кг групп, где уровни С.’||О1|д1| в сыворотке сохранялись на уровне > в 200 раз, чем 1С50. Эти исследования позволяют предположить, что постоянное С^ид1 воздействие концентрации > в 7 раз, чем 1С50, похоже, требуется для максимального ингибирования размножившихся после ранения тучных клеток.
Дозировки 0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг 18В-1 а1дС1 оценивали на основании максимальной эффективности, показанной для 8В-1 в этой модели. При самой низкой тестируемой дозе (0,3 мг/кг) максимальное ингибирование индуцированной ранением экспансии тучных клеток наблюдали в пределах 2 недель. Уровни С1го1|д1| в сыворотке к этому моменту были > в 200 раз, чем ИТ-7 1С50 (табл. 3).
В табл. 3 суммированы ФД/ФК эффекты 8В-1 и 18В-1 аЮд1 в ФД модели ранения.
Таблица 3
Препарат ит-7 1С50 (нг/мл) Доза СкоидЬ (нг/мл) Ингибирование Превышение активированных Обеднение популяции базальных тучных клеток толстой кишки
ит-7 Ю50, раз тучных клеток кожи
8В-1 3.6 0.3 мг/кг 30 8 >95% н/о
1.0 мг/кг 994 276 >80% н/о
3.0 мг/кг 1873 520 >80% н/о
НЗП-1 а!д<31 4.5 0.3 мг/кг 910 >200 >95% нет эффекта
1.0 мг/кг 12,400 >2000 >95% >65%
3.0 мг/кг 44,500 >7000 >95% >95%
Наносили инцизионную рану, после чего следовала пункционная биопсия вплоть до 21 дня у человека (слева) или не принадлежащего человеку примата (справа) (фиг. 2). Тучные клетки и/или экспрессирующие 8СЕ фибробласты выявляли хромогенной краской или иммуногистохимией, соответственно. У
- 27 015923 человека экспрессия 8СГ повышается и возвращается на исходный уровень и после этого следует временный подъем числа тучных клеток во время нормального заживления раны. Сходный ответ тучных клеток на ранение наблюдался у обезьяны. Во время фиброза и нарушенного заживления ран экспрессия 8СГ и число тучных клеток остаются повышенными (фиг. 2).
Гемопоэз и меланогенез
Генетика мышей показывает, что с-Κίΐ играет роль в гемопоэзе во время эмбрионального развития, но у гетерозигот человека инактивирующие и/или с потерей функции мутации с-Κίΐ у людей с идиопатической дисхромией кожи (пегой кожей) не были связаны с гематологическими аномалиями. 8СГ и с-Κίΐ важны для гемопоэза человека, так как 8СГ используется в комбинации с С-С8Г для мобилизации гематопоэтических стволовых клеток. Более того, ингибитор множества киназ Гливек, который нацелен преимущественно на ВСК-АВЬ, рецептор фактора роста тромбоцитов и с-Κίί, имеет в качестве первичного фармакологического эффекта миелосупрессию, и тяжелые формы анемии и тромбоцитопении 3-4 степени сообщали для С18Т пациентов (Неп§1еу МЬ, и др., 8етт. НетаФ1. 2003, Арг; 40 (2 8ирр1 2):21-5).
Генетика мышей свидетельствует о том, что с-Κίΐ играет роль в мигрировании меланобластов из нервного гребня во время эмбриогенеза, и эта роль подтверждена для человека с пегой кожей. Сообщали, что Гливек вызывает полосатую депигментацию волос у небольшого числа С18Т пациентов, но это было не постоянное наблюдение, и о гиперпигментации также сообщали. Нельзя исключать вклад других киназ, таких как ТРФ. Исследования на мышах с ингибиторами множества киназ и антителом к с-Κίΐ показало, что ингибирование пигментации волос полностью обратимо, позволяя предположить, что ингибирование с-Κίΐ влияет на функцию меланоцитов, а не на выживаемость в послеродовом окружении (Мо§8 и др., 2003).
8К-1 применяли в исследованиях на определение диапазона доз от 3 до 30 мг/кг, вводимых раз в неделю в течение 4 недель, чтобы определить воздействие, требуемое для ингибирования гемопоэза, сперматогенеза и активного меланогенеза. Исследование на цельной крови, включая расчет количества клеток, выполняли на образцах крови, взятых на исходном уровне, на день 4, 7, 14, 21 и 28 после начала исследования. Анализ свежевыделенных образцов крови выполняли в госпитале имени королевы Елизаветы, в лаборатории Клинической гематологии, в Барбадосе.
Не было обнаружено значительного вклада 8К-1, по сравнению с контрольными субъектами и исходными значениями, в любой из проанализированных гематологических параметров, хотя не наблюдали значительного уменьшения количества эритроцитов у животных, которых лечили препаратом, через 4 недели после начала введения доз. При самой высокой протестированной дозе, 30 мг/кг раз в неделю в течение 4 недель, были достигнуты уровни воздействия с > в 70,000 раз, чем ИТ-7 1С50 эффективностью. Отсутствие значительного влияния на гематологические параметры было подтверждено гистопатологическим анализом костного мозга, не показавшим различий между группой, которой назначали препарат и контрольной группами и не показавшим обеднения популяции СО 117-положительных гематопоэтических стволовых клеток, что позволило предположить наличие потенциальных дополнительных путей гемопоэза у африканской зеленой обезьяны, как представителя не относящихся к человекообразным обезьянам приматов. Также исследовали эффект 3-30 мг/кг, вводимых раз в неделю в течение 4 недель, на меланогенез, так как его можно применить при меланоме. Для оценки влияния на активированные меланоциты, которые могут лучше отражать состояние заболевания, проводили удаление шерсти для активации меланогенеза. Нормальный цвет шерсти визуально не изменялся в любой группе. Тем не менее, ингибирование пигментации кожи до различных степеней наблюдали во вновьрастущей шерсти у обезьян, получающих дозу 30 мг/кг. Не наблюдали эффекта в группе, получавшей 10 мг/кг, что позволило предположить, что неэффективная доза находится в диапазоне между 10-30 мг/кг. В группе, получавшей 10 мг/кг, воздействие 8К-1 было > в 8000 раз, чем ИТ-7 1С50. Максимальная эффективность обеднения тучными клетками достигалась при > в 7 раз, чем ИТ-7 1С50. Эти данные позволили предположить, что ингибирование с-Κίΐ влияет на функцию меланоцитов, и что более высокие дозы/время воздействия могут быть необходимы для блокирования заболеваний, характеризующихся избыточной активностью меланоцитов.
Сперматогенез
Исследования на мышах показали, что с-Κίΐ важен для сохранения и пролиферации дифференцированных с-Κίΐ рецептор-позитивных сперматогониев, но не для начального этапа дифференцировки сперматогониальных клеток. Как самцы, так и самки «пегих» субъектов, которые являлись гетерозиготами по инактивированной аллели с-Κίΐ рецептора, были фертильными, предполагая, что такая степень инактивации с-Κίΐ, похоже, не влияет на развитие, сперматогенез или оогенез примордиальных клеток.
Антитело 8К-1 показало зависимое от дозы ингибирование сперматогенеза от 0.3-30 мг/кг. Доза 0.3 мг/кг раз в неделю приводила к меньшему, чем максимальный, эффекту, наблюдаемому при более высоких дозах, и для определения ЕЭ50 требуются более низкие диапазоны доз. Достигаемые воздействия были в 7 раз больше, чем ИТ-7 1С50, которая отражает воздействие, требуемое для максимальной эффективности в модели ранения с экспансией тучных клеток. Экстраполяция ФК позволила предположить, что указанное антитело может, видимо, окончательно выводиться через 1 месяц после последней дозы,
- 28 015923 но период в 9 месяцев был выбран в качестве консервативной точки времени для оценки восстановления. Нормальный сперматогенез обнаруживали через 9 месяцев у всех животных, которым вводили дозы, что показало что 118К-1 а!дС1-подобную молекулу можно применять в качестве контрацептива самцов.
Резюме
Гуманизированное анти-с-Кй агликозилированное !цС1 (118К-1 а!§С1) антитело представляет собой высоко мощное и специфичное антитело, которое является нейтрализующим во всех тестах, основанных на клеточной системе, анализируемых с использованием проксимальной и дистальной оценки с-Кй сигналинга. По своей природе, оно не опосредует интернализацию или фосфорилирование с-Кй рецептора, как сообщали для родительского моноклонального 8К-1 антитела мыши. Выбор агликозилированного ^01 изотипа из изотипов гуманизированных !цС1. !дС2 и !дС4 нельзя было бы предсказать на основании стандартных подходов. 118К-1 а!цС 1 было выбрано опытным путем посредством новаторского экспериментирования, и было показано, что оно проявляло подходящие фармакологические свойства для мембранного с-К11 рецептора, не обладало агонистической активностью по отношению к с-К11 и тучным клеткам, также наблюдали отсутствие эффекторной функции и смерти клеток вследствие неспецифического действия. Это антитело проявило хорошие биодоступность при подкожном введении и период полувыведения, нелинейную ФК и насыщаемую опосредованную мишенью элиминацию антитела и обеднение популяции тучных клеток у обезьян. Эти данные указывают на подходящую эффективную для человека дозу обеднения популяции тучных клеток.
Минимальная эффективная доза родительского 8К-1 моноклонального антитела мыши в ФД модели ранения обезьян была < 0,3 мг/кг (С4гоидн > в 7 раз, чем Κ'50 для клеток), и при несколько большем воздействии (С4гоидн > в 800 раз, чем Κ'50 для клеток) была также эффективной в обеднении тучными клетками базального слоя кожи, толстой кишки и легкого. Сходным образом, уровни воздействия выше, чем > в 8000 раз, чем Κ'50 для клеток, были необходимы перед тем, как наблюдали количественное влияние на пигментацию шерсти в заново растущей шерсти. Ингибирование пигментации шерсти в заново растущей шерсти сообщалось для ингибиторов множества киназ и антител к с-Кй у грызунов, и 118К-1 а!дС1 может иметь применение в заболеваниях, связанных с избыточной активностью меланоцитов. Этот эффект обратим при прекращении лечения. Эффект ниже максимального на ингибирование сперматогенеза был показан при уровнях > в 7 раз, чем Κ'50 для клеток, воздействие, которое придавало максимальную эффективность в ФД модели ранения.
Все из вышеупомянутых патентов США, публикаций заявок на патент США, заявок на патент США, иностранных патентов, иностранных заявок на патент и не патентных публикаций, на которые ссылались в описании настоящего изобретения и/или перечисляли в перечне данных заявки, полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
Из упомянутого выше должно быть очевидно, что, хотя конкретные варианты реализации настоящего изобретения были описаны в данной заявке с целью иллюстрации, различные его модификации можно получить без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения.
- 29 015923
Перечень последовательностей <110> Амген Инк.
<120> ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К С-К1Т <130> А-1126-ИО-РСТ <150> 60794771 <151> 2006-04-24 <160> 10 <170> Патентная версия 3.3 <210> 1 <211> 717 <212> ДНК <213> Человек <400> 1
атддтдттдс адасссаддС сттсатттст стдттдстст ддатстстдд тдсстасддд 60
дасатсдтда тдасссадтс ТссадасТсс стддстдтдт стстдддсда дадддссасс 120
атсаастдса дадссадгда аадтдттдат атттатддса атадттттат дсастддтас 180
садсадааас саддасадсс ГссГаадсГд сгсагиасс ттдсатссаа сстадаатст 240
ддддтссстд ассдаттсад Тддсадсддд ТсГдддасад атттсастст сассаТсадс 300
адссгдсадд стдаадатдт ддсадттгат ТасСдТсадс ааааТааТда ддатссдтас 360
асдттсддад дтдддассаа ддтддааата ааасдтасдд ГддсТдсасс аТсТдТсТТс 420
аТсТТсссдс саТсТдаГда дсадИдааа тсгддаастд сстстдтгдт дтдсстдстд 480
аатаасттст атсссадада ддссааадта садгддаадд ТддаТаасдс сстссаатсд 540
ддСаасгссс аддададгдт сасададсад дасадсаадд асадсассТа садссТсадс 600
адсассстда сдсТдадсаа адсадастас дадааасаса аадтстасдс стдсдаадтс 660
асссатсадд дсстдадстс дсссдтсаса аададсттса асаддддада дтдттда 717
<210> 2 <211> 238 <212> ПРТ <213> человек <400> 2
МеТ Уа1 ьеи 61 п ТНг С1п Уа1 РНе Пе зег Ьеи ьеи Ьеи Тгр Не 5ег
1 5 10 15
61 у А1а Туг 61 у 20 Азр 11 е Уа1 мет тНг 25 61 η зег РГО АЗр Зег 30 Ьеи А1а
Уа1 зег геи 35 61 у 61 и Агд А1а ТНг 40 11е АЗП суз Дгд А1а 45 зег 61 и Зег
Уа1 Азр И е Туг 61 у А5П Зег РНе мет Н1 5 Тгр туг 61л 61 η ЬУ5 Рго
50 55 60
раде 1
- 30 015923
61 у ΰΐ П Рго Рго СУ5 Ьеи сеи 11е Туг сеи А1а зег АЗП сеи 61 и зег
65 70 75 80
61У Уа1 РГО А5Р Агд 85 РЬе зег 61 у зег 61 у 90 зег б!у ТНг АЗр РЬе 95 тЬг
ьеи тЬг 11 е зег Зег Ьеи 61 η А1а 61 и Азр Уа! А1а Уа1 туг туг Суз
100 105 110
61 η С1п АЗП 115 АЗП 61 и Азр Рго Туг 120 тЬг РЬе 61 у 61 у 61 у 125 ТЬг суз Уа!
61 и Не 1уз Агд ТНг Уа! А1а А1а Рго Зег Уа! РНе 11е РЬе РГО РГО
130 135 140
Зег А5Р С1и 61 η Сеи Суз Зег С1у ТЬг А1а Зег Уа1 уа1 Су5 сеи сеи
145 150 155 160
АЗЛ А5П РЬе Туг РГО Агд 61 и А1а суз уа! 61 η тгр суз уа! АЗр АЗЛ
165 170 175
А1а ьеи 61 η зег 61 у АЗЛ зег 61 η 61 и 5ег уа! тНг 61 и 61 п А5р Зег
180 185 190
Суз Азр Зег 195 ТНг Туг Зег сеи зег 200 Зег ТНг сеи тНг сеи 205 Зег Суз А1а
Азр туг 61 и ьуз Н13 суз Уа1 Туг А1а суз 61и Уа1 ТНг Н13 61п 61у
210 215 220
Сеи Зег 5ег Рго Уа! тНг СУЗ зег РНе АЗП Агд 61у 61 и суз
225 230 235
<210> 3 <211> 1401 <212> ДНК <213> человек <400> 3
ахддасхдда ссхддадддх сссссдссхд схддсадхдд ссссаддхдс ссасъсссад 60
дхдсадсхдд ХдсадХсХдд ддсСдаддСд аадаадссхд дддсс^сад! даадд1с1сс 120
ХдсааддсХХ сХддаХасас сХХсассадХ ХасааХаХдс асгдддтдсд ссаддсссст 180
ддасаадддс ххдадхддах дддадххасх хаххсаддаа ахддгдагас 1гссгасаат 240
садаадххса ааддсадддх сассаххасс дсхдасааах ссассадсас адссгасахд 300
дадсХдадса дссхдадахс Хдаддасасд дссдХдХаХХ ас1:д£дсдад адададддаг 360
асхсдххххд дхаасхдддд ссаадддасх схддхсассд гсгхгадгдс сХссассаад 420
ддсссаХсдд ХсХХсссссХ ддсасссХсс Хссаададса ссСсгддддд сасадсддсс 480
сХдддсХдсс Хддхсаадда сХасххсссс даассддхда сддгдгсдгд даасГсаддс 540
дсссхдасса дсддсдхдса сассххсссд дсхдхссхас раде 2 адгссъсадд асссгасхсс 600
- 31 015923
сГсадсадсд ХддХдассд! дсссхссадс адеХХдддса сссадассга сахсгдсаас 660
дТдааНсаса адсссадсаа сассааддТд дасаадааад ТГдадсссаа 720
аааасЕсаса сагдсссасс дгдсссадса сс1даас!сс гддддддасс д!сад1с11с 780
СЕСГГССССС саааасссаа ддасассс^с а!да1с*ссс ддасссс1:да ддгсасатдс 840
д*дд*дд*дд асд^дадсса сдаадассст даддгсаад! 1саас£ддЪа сдхддасддс 900
дгддаддгдс а(аа(дссаа дасааадссд сдддаддадс ад^ассадад сасдъассд! 960
д1дд1садсд £ссСсассд^ ссХдсассад дас!:ддс1:да а-Сддсаадда д!асаад1:дс 1020
ааддгсгсса асааадсссг сссадссссс атсдадаааа ссагстхсаа адссаааддд 1080
садссссдад аассасаддх дсасасссгд ссссса?ссс дддагдадсг дассаадаас 1140
садд^садсс Едасссдссг ддисаааддс ггсгагссса дсдасагсдс сдтддадтдд 1200
дададсаагд ддсадссдда даасаасгас аадассасдс схсссдхдсх ддастссдас 1260
ддсЕсс1Х(Х ХссСсХаХад саадсхсасс дгддасаада дсаддхддса дсаддддаас 1320
д-ссих'Сса! дсХссд-СдаХ дса1даддс1: с^дсасаасс асХасасдса даададссТс 1380
гссссдгсгс сдддгааа£д а 1401
<210> 4 <211> 466 <212> ПРТ <213> Человек <400> 4
мег А5р 1 тгр тЬг тгр 5 Агд Уа1 рИе суз ьеи 10 ьеи А1а Уа1 А1а РГО 15 61 у
А1а Н1 5 Зег 6ΐη Уа1 С1п 1_еи Уа1 61 п Зег 61 у А1а 61 и Уа1 ьуз ьуз
20 25 30
Рго 61 у А1а Зег Уа1 |_уз Уа1 Зег Суз 1_уз А1а £ег 61 у Туг ΤΓιγ РКе
35 40 45
Ткг Зег 50 Туг Азп МеТ Нтз Тгр 55 Уа1 Агд 61 п А1а Рго 60 61 у б1п 61 у Ьеи
61 и тгр мет 61 у Уа1 11е туг зег 61 у Азп б1у А5р тпг зег туг АЗП
65 70 75 80
61 η ьуз рНе ьуз 61 у Агд уа1 тЬг 11е ТЬг А1а АЗр СУЗ 5ег ТЬг Зег
85 90 95
ТЬг А1а Туг МеТ 61 и Ьеи 5ег Эег 1еи Агд 5ег 61 и Азр тЬг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг СУ5 А1а Агд 61 и Агд Азр тИг Агд РЬе 61 у Азп Тгр 61 у 61 п
115 120 125
раде 3
- 32 015923
61 у тЬг ьеи 130 уа! тНг уа! Зег зег А1а зег тЬг ьуз 61 у РГО зег Уа1
135 140
РЬе Рго Ьеи А1а Рго 5ег 5ег ьуз Зег ТНг Зег 61 у 61 у ТЬг А1а А1а
145 150 155 160
ьеи б1у Суз ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго 61и Рго Уа1 ТЬг Уа! Зег
165 170 175
тгр А5П зег С1у А1а ьеи тЬг Зег 61 у Уа1 Нтз тЬг РЬе Рго А1а Уа1
180 185 190
ьеи 61 п зег Зег 61 у ьеи туг зег ьеи 5ег зег Уа1 уа! ТНг Уа1 РГО
195 200 205
Зег Зег Зег ьеи 61 у ТЬг 61 η ТЬг Туг Не Суз А5Л Уа1 А5П нтз ьуз
210 215 220
РГО 5ег А5П ТЬг 1У5 Уа1 АЗр ьуз ьуз Уа1 б!и РГО ьуз Зег суз А5Р
225 230 235 240
Ьуз ТЬг Н15 ТЬг Суа Рго РГО Суз РГО А1а Рго 61и ьеи Ьеи б!у 61у
245 250 255
РГО зег Уа1 РЬе ьеи РЬе РГО РГО ьуз РГО ьуз АЗр ТЬг ьеи мег 11е
260 265 270
зег Агд тЬг РГО 61 и Уа1 ТЬг суз Уа1 Уа1 уа! Азр Уа! 5ег НТ 5 61 и
275 280 285
АЗр Рго 61 и Уа1 ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр 61 у Уа1 61 и Уа1 НТ 5
290 295 300
А5П А1а Ьуз ТЬг Ьуз РГО Агд 61и 61 и 61 п Туг 01 п 5ег ТЬг Туг Агд
305 310 315 320
Уа1 Уа1 зег Уа1 ьеи 325 тЬг Уа1 ьеи НТЗ 61 п 330 Азр тгр ьеи А5П 61 у 335 ьуз
61 и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег А5П ьуз А1а ьеи Рго А1а Рго Не 61 и
340 345 350
Ьуз ТНг Не 355 Зег Ьуз А1а Ьуз 61у 360 61 п Рго Агд 61и Рго 365 61 п Уа1 Туг
ТЬг Ьеи 370 РГО РГО 5ег Агд А5р 375 61и Ьеи ТЬг ьуз Азп 380 61 п Уа! Зег Ьеи
тНг Суз Ьеи Уа! ьуз 61 у РЬе Туг РГО Зег А5р 11 е А1а Уа1 61 и Тгр
385 390 395 400
<з!и зег АЗП б!у 61 η рго 61 и АЗП А5П туг Ьуз ТЬг тЬг РГО РГО Уа!
раде 4
- 33 015923
405 410 415
Ьеи Азр Зег Азр 420 61у Зег РЬе РЬе ьеи 425 туг Зег ьуз ьеи тЬг 430 Уа1 АЗр
Ьуз Зег Агд Тгр 61 п 61 η 61 у АЗП Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа! МеЬ Нтз
435 440 445
61 и А1а Ьеи Нтз АЗП Нтз Туг тЬг 61 η Ьуз Зег Ьеи зег ьеи Зег Рго
450 455 460
С1у ьуз
465 <210> 5 <211> 1389 <212> ДНК <213> человек <400> 5
агддассдда сстддадддг сггсгдсьтд стддсадгдд ссссаддгдс ссасгсссад 60
дьдсадстдд ЬдсадЬсЬдд ддсЬдаддЬд аадаадссТд дддссЬсадТ дааддьсьсс 120
Гдсааддсьг стддаЬасас сьтсассадь ьасаагагдс асТдддьдсд ссаддссссь 180
ддасаадддс «дадьддат дддадтгагь ьагьсаддаа атддтдатас «ссьасаат 240
садаадЫха ааддсадддь сассаТТасс дстдасааат ссассадсас адсстасатд 300
дадсьдадса дссьдадаьс хдаддасасд дссд-ьдьагь асьдтдсдад адададддаь 360
асТсдЬЬЬЬд дЬаасЬдддд ссаадддасТ сЬддТсассд ЬсТсХадГдс стссассаад 420
ддсссагсдд тстьссссст: ддсдсссЬдс Ьссаддадса ссТссдадад сасадсддсс 480
стгдддсьдсс ЬддЬсаадда сЬасысссс даассддьда сддьдьсдьд даасьсаддс 540
дсТсЬдасса дсддсдЬдса сассИссса дсТдТссТас адТссЬсадд асЬсЬасьсс 600
сгсадсадсд ьддьдассдь дсссьссадс аасысддса сссадассьа сассЬдсаас 660
дьадаьсаса адсссадсаа сассааддтд дасаадасад Ыдадсдсаа аьдхьдсдтс 720
дадЬдсссас сдтдсссадс ассассЬдЬд дсаддассдь садьсььссь сЬЬсссссса 780
ааасссаадд асассстсат даГсЬсссдд ассссСдадд ТсасдТдсдЬ ддЬддгддас 840
дьдадссасд аадассссда ддьссадыгс аасьддьасд гддасддсдг ддаддьдсаь 900
ааЬдссаада сааадссасд ддаддадсад ьгсаасадса сдььссдТдь ддтсадсдтс 960
сгсассдттд Гдсассадда сСддсЬдаас ддсааддадь асаадТдсаа ддьсьссаас 1020
аааддссГсс садсссссаТ сдадаааасс аьсьссаааа ссааадддса дссссдадаа 1080
ссасаддЬдь асасссьдсс сссаьсссдд даддадаГда ссаадаасса ддьсадссьд 1140
ассЬдссЬдд ЬсаааддсЬЬ сЬассссадс дасагсдссд тддадЬддда дадсааЬддд 1200
садссддада асаасТасаа дассасассь сссаьдсьдд асЬссдасдд СТССЬЬСЬТС 1260
сьсьасадса адстхассдь ддасаададс аддГддсадс аддддаасдь сЫхтсаьдс 1320
раде 5
- 34 015923
ТссдТдаТдс аТдаддсТсТ дсасаассас Тасасдсада ададсстстс сстдтстссд ддтааатда
1380
1389 <210> 6 <211> 462 <212> ПРТ <213> Человек <400> 6
Мет АЗр Тгр ТНг Тгр Агд Уа! РНе СУ5 Ьеи ьеи А1а Уа1 А1а РГО 61 у
1 5 10 15
А1а Н1 5 Зег 61П Уа1 6ΐη Ьеи Уа1 61 η Зег 61 у А1а 61 и Уа1 туз суз
20 25 30
РГО 61 у А1а зег уа! ьуз Уа1 зег суз туз А1а Зег 61 у туг тНг РНе
35 40 45
ТНг 5ег 50 Туг А5П Мет Н15 Тгр 55 Уа1 Агд 61 η А1а Рго 60 61 у б1п 61 у Теи
б1и Тгр мет 61 у Уа1 11е Туг Зег 61 у АЗП 61 у Азр ТНг 5ег Туг А5П
65 70 75 80
61 η ьуз РНе ЬУ5 61 у Агд Уа! тНг Не ТНг А1а Азр туз Зег тНг Зег
85 90 95
тНг А1а туг мет 61 и сеи Зег Зег сеи Агд Зег 61 и Азр ТНг А1а Уа!
100 105 110
Туг Туг суз 115 А1а Агд 61 и Агд Азр 120 ТНг Агд РНе 61 у АЗП 125 Тгр 61 у 61 η
61 у ТНг Теи Уа! ТНг Уа1 Зег Зег А1 а Зег Тбг Туз 61 у Рго Зег Уа1
130 135 140
РНе Рго Теи А1а Рго Суз зег Агд 5ег ТНг Зег 61 и Зег ТНг А1а А1а
145 150 155 160
Теи 61 у суз Ьеи Уа! 1уз А5р Туг РНе Рго 61 и Рго Уа1 ТНг Уа1 зег
165 170 175
Тгр А5П Зег 61 у А1а сеи Тбг Зег 61 у Уа1 Н15 ТНг РНе Рго А1а Уа1
180 185 190
Теи 61 п зег Зег 61 у Сеи Туг Зег сеи 5ег зег Уа! Уа1 ТНг Уа! Рго
195 200 205
кег зег 210 АЗП рНе б1у ТНг 61 η 215 ТНг туг тЬг Суз Азп 220 Уа1 Азр Н1 5 суз
Рго Зег А5П тНг ьуз Уа! А5Р 1уз ТНг Уа1 61 и Агд туз суз суз Уа1
раде 6
- 35 015923
225 230 235 240
61 и Суз Рго Рго суз Рго А1а Рго РГО Уа1 А1а 61 у рго Зег Уа! РНе
245 250 255
Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11 е зег Агд ТЬг Рго
260 265 270
61 и Уа1 ТЬг 275 Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр 280 Уа1 Зег Н1 5 61 и Азр 285 рго 61 и Уа1
61 η РЬе Азп тгр Туг Уа1 Азр 61у Уа! 61 и уа! Нтз АЗП А1а Ьуз тНг
290 295 300
Ьуз Рго Агд 61 и 61 и 61 η РЬе Азп Зег ТЬг РЬе Агд Уа! Уа1 Зег Уа1
305 310 315 320
Ьеи ТЬг уа1 Уа1 нтз 325 61 п АЗр Тгр ьеи А5П 330 61 у ьуз 61 и туг ьуз 335 суз
ЬУ5 Уа1 5ег Азп ьуз 61 у Ьеи Рго А1а Рго Пе 61 и 1-У5 ТЬг 11е Зег
340 345 350
Ьуз тЬг ьуз 61у 61 п РГО Агд 61 и Рго 61 п Уа! Туг ТЬг Ьеи РГО РГО
355 360 365
бег Агд 61 и 61 и Мег ТЬг Ьуз Азп 61 п Уа1 Зег Ьеи ТЬг суз Ьеи Уа1
370 375 380
Ьуз 61у РЬе туг Рго 5ег А5р 11е А1а Уа1 61 и Тгр С1и Зег Азп 61 у
385 390 395 400
61 η Рго 61 и АЗП А5П Туг ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго меь ьеи Азр Зег Азр
405 410 415
61 у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг 5ег Ьуз Ьеи ТЬг Уа! Азр ьуз 5ег Агд Тгр
420 425 430
61 η 61 п 61 у А5П Уа! РЬе 5ег Суз 5ег Уа1 МеЬ Нтз 61 и А1а Ьеи Нтз
435 440 445
Азп НТ5 Туг тЬг 61 π ьуз 5ег Ьеи 5ег ьеи Зег Рго б!у ьуз
450 455 460
<210>7 <211>717 <212> ДНК <213> человек <400>7 аЬддадасад асасасьссь дсьаьдддьд сьдсьдсьсь дддььссадд ыхсасаддь60 аасаЬЬдЬдЬ ЬдасссааЬс ЬссадсЫсЬ ььддсЬдтдь сьсьадддсь дадддссасс120 раде 7
- 36 015923
а±а£сседса дадссад£да аадХдХХдаХ аХХХаХддса аХадХХХХаХ дсасХддХас 180
садсадааас саддасадсс асссааасхс сХсаХсХаХс ХХдсаХссаа ссхадааХсх 240
ддддьсссьд ссаддсхсад хддсадхддд хсхаддасад астхсасссх сассаххдах 300
сстдьддадд сьдаьдаьдс Ьдсаассхах хасхдхсадс аааахаахда ддахссдхас 360
асдГ^сддад дддддассаа дсХддаааХа ааасдддсХд аХдсХдсасс аасХдХагсс 420
атсььсссас саьссадьда дсадххааса «хддаддхд ссхсадхсдт дхдсххсххд 480
аасаасььсг ассссааада сахсаахдхс аадхддаада ххдахддсад хдаасдасаа 540
ааТддсд^сс £даасадтъд дасХдаХсад дасадсааад асадсассХа садсаХдадс 600
адсассс1:са сдтьдассаа ддасдадхах даасдасаха асадсхахас схдхдаддсс 660
асТсасаада саХсаасНс асссаХХдХс аададсххса асаддааХда дХдХХда 717
<210> 8 <211> 238 <212> ПРТ <213> Человек <400> 8
Мех 1 61 и Тб Г АБр ТНг 5 ьеи ьеи Ьеи тгр Уа1 10 ьеи ьеи Ьеи Тгр Уа! 15 Рго
<31 у Бег Тб Г 01 у А5П 11е Уа1 Ьеи Тб Г 61 п Бег Рго А1а Бег Ьеи А1а
20 25 30
Уа1 Бег беи 35 С1у Ьеи Агд А1а Тб г 40 11 е Бег суз Агд А1а 45 Бег 61 и Бег
Уа1 АБр 50 11е Туг 61 у А5П Бег 55 Рбе мех Н1 5 тгр туг 60 61 η 61 η ЬуБ РГО
б1у 61п РГО РГО ЬУЗ ьеи ьеи 11е туг ьеи А1а Бег АБП ьеи 61и Бег
65 70 75 80
61 у Уа1 РГО А1а Агд 85 Рбе Бег 61 у Бег 61 у 90 Бег Агд Тб Г Азр Рбе 95 Тб г
Ьеи Тб г 11е А$р 100 РГО Уа1 61 и А1а АБр 105 АБр А1а А1а Тб Г Туг 110 Туг СуБ
б1п 61 η АБП А5П 61 и АБр РГО 35 тб г Рбе 61 у 61 у 61 у Тб г ьуз ьеи
115 125
61 и 11 е 1_У5 Агд А1а АБр А1а А1а РГО тб г Уа1 Бег 11 е Рбе Рго РГО
130 135 140
Бег Бег 61 и С1П ьеи Тб Г Бег С1у б1у А1а Бег νβΐ уа1 Сув Рбе Ьеи
145 150 155 160
А5П АБЛ Рбе туг РГО ЬУЗ АБр 11е А5П Уа1 ьуз тгр ьуз Не АБР 61 у
раде 8
- 37 015923
165 170 175
Зег 61 и Агд 61 η Азп 61 у Уа! Теи Азп Зег Тгр ТНг Авр б1п А5Р Зег
180 185 190
ЬУ5 АЗр Зег ТНг Туг зег ме! Зег зег ТНг Теи ТНг Теи тНг туз АЗр
195 200 205
<31 ч Туг 210 61 и Агд Н15 АЗП зег 215 туг тНг суз 61 и А1а 220 ТНг Н75 Туэ ТНг
5ег тНг зег РГО Т1е Уа1 ьуз зег рНе АЗП Агд АЗП 61 и суз
225 230 235
<210> 9 <211> 1401 <212> ДНК <213> Человек
<400> 9 аТдддаТдда дттдтатсат сстсгтсттд дТадсаасад стасаддтдт ссастсссад 60
дгдсаастдс адсадссгдд ддсгдадстд дгдаадссгд дддсстсадг даадагдгсс 120
ТдсааддсТТ стддстасас аТТТассадТ ТасааТатдс асТдддТааа дсадасасст 180
ддасадддсс тддаатддат тддадттатт ТаТТсаддаа атддтдатас ТТссТасаа! 240
садаадИса ааддсааддс сасаттдаст дсадасааат сстссадсас адсстасатд 300
сааатсааса дсстдасатс тдаддастст дсддгссатг астдтдсаад адададддат 360
астсдгтттд дТаасТдддд ссаадддаст сТддГсасТд ТсТсТдсадс саааасааса 420
дссссатсдд тстатссаст ддсссстдтд ТдтддадаТа саастддстс стсддтдаст 480
сТаддаТдсс тддтсааддд ГГаГЕТСССГ дадссадгда ссгтдассгд даасТсТдда 540
тссстдтсса дтддтдтдса сассттссса дстдтсстдс адтстдассг стасассстс 600
адсадсТсад тдастдтаас сТсдадсасс Тддсссадсс адТссатсас стдсаатдтд 660
дсссасссдд саадсадсас сааддтддас аадаааатсд адсссададд дсссасаатс 720
аадсссТдТс сГссаТдсаа атдсссадса сстаасстст !ддд!ддасс аТссд1с!1с 780
атстгсссгс сааадаТсаа ддаГдТасТс аТдаТсТссс ТдадссссаТ адГсасаТдт 840
дтддТддТдд атдтдадсда ддатдассса датдтссада ссадстддтт тдтдаасаас 900
дтддаадтас асасадстса дасасааасс сатадададд агсасаасад тастстссдд 960
дтддтсадтд ссстссссат ссадсассад дасхддатда дтддсаадда дттсааатдс 1020
ааддТсааса асааадасст сссадсдссс аТсдададаа ссатстсааа асссаааддд 1080
гсадтаадад стссасаддт а1агдтс«д сстссассад аадаададат дастаадааа 1140
саддтсасгс гдасстдсаг ддгсасадас ггсатдссгд аадасаттта сдтддадтдд 1200
ассаасаасд ддаааасада дстааастас аадаасастд аассадтсст ддасТсТдаТ 1260
ддТТсГТасТ ТсаТдТасад саадстдада дТддаааада адаасТдддТ ддааадааат 1320
раде 9
- 38 015923 адстасссст дттсадтддт ссасдадддТ стдсасаатс ассасасдас ТаададсТТс 1380 тсссддастс сдддтааатд а 1401 <210> 10 <211> 466 <212> ПРТ <213> человек <400> 10
мег 1 <31 у тгр Бег Су5 11 е Не теи Рбе теи Уа1 А1а тбг А1а тбг б1у
10 15
Уа! Н13 Бег 61 п 20 Уа! б1п Теи С1п 61 п 25 Рго 61 у А1а 61 и ьеи 30 Уа! суз
РГО 61 у А1а Бег Уа! ьуз мет Бег суз суз А1а Бег 61 у туг ТЬг Рбе
35 40 45
тЬг 5ег Туг АЗП мег нтз тгр Уа1 суз 61 п тбг РГО 61 у 61 π <31 у Теи
50 55 60
<31 и Тгр ΐ! е 61 у уа1 11 е туг Бег 61 у А5П 61 у АЗр Тбг Бег туг АЗП
65 70 75 80
й!п ЬУ5 РНе 1-У5 С1 у 85 Туз А1а тЬг Теи Тбг 90 А1а А5р Туз Бег Бег 95 Бег
ТЬг А1а Туг Мет С1п 11е Азп Бег Теи тбг Бег 61 и Азр Бег А! а Уа!
100 105 110
туг Туг Су5 А1а Агд 61 и Агд А5р Тб г Агд Рбе 61 у АЗП Тгр С1у 61 η
115 120 125
с! у ТНг ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Бег а! а А1а суз тбг Тбг А1а РГО зег Уа1
130 135 140
Туг Рго Ьеи А1а Рго Уа1 Суз 61у Азр Тбг тбг 61 у Бег Бег уа! Тбг
145 150 155 160
ьеи <31 у суз Теи Уа7 ьуз 61у Туг Рбе Рго 61 и Рго Уа! ТЬг ьеи Тбг
165 170 175
тгр АЗП Бег 61 у Бег ьеи Бег Бег 61 у Уа1 Н13 тбг Рбе Рго А1а Уа!
180 185 190
ьеи <31 п Бег Азр ьеи туг тбг ьеи Бег Бег Бег Уа1 тбг Уа! ТЬг Бег
195 200 205
Бег Тб Г тгр РГО $ег 61 п Бег 11 е тб г суз АЗП Уа1 А1а ΗΊ5 РГО А1а
210 215 220
5ег Бег тЬг ьуз Уа! Азр Туз ЬУ5 11 е 61 и РГО Агд 61 у Рго ТЬг 11е
раде 10
- 39 015923
225 230 235 240
1У5 РГО суз РГО рго суз ьуз суз рго А1а РГО АЗП ьеи ьеи 61 у 61 у
245 250 255
Рго 5ег Уа! РЬе 11е РЬе Рго РГО ьуз 11е ьуз Азр Уа! ьеи мег Не
260 265 270
5ег ьеи 5ег Рго Пе Уа! ТЬг Суэ Уа1 Уа! Уа1 Азр Уа! 5ег 61 и Азр
275 280 285
Азр РГО АЗр Уа! б1п Не 5ег тгр РЬе Уа! А$П Α5ΙΊ уа! с!и Уа1 ΗΊ3
290 295 300
ТНг А1а 61 п ТЬг 61 п ТЬг Нтз Агд 61 и Азр Туг Азп 5ег ТЬг Ьеи Агд
305 310 315 320
Уа1 Уа! 5ег А! а ьеи 325 Рго Не 61 п ΗΊ5 б!п 330 А5р тгр мех 5ег 61у 335 Ьуз
РЬе Ьуз Суз 1-уз Уа1 АЗП А5П ьуз Азр ьеи РГО А1а РГО Не 61 и
340 345 350
Агд тЬг 11е 5ег Ьу5 Рго Ьуз 61 у 5ег Уа1 Агд ΑΊ а Рго 61 п Уа1 туг
355 360 365
Уа1 ьеи РГО РГО РГО 61 и 61 и 61 и мех тЬг ьуз ЬУ5 61п Уа! тЬг ьеи
370 375 380
ТНг 385 Суз Мех Уа1 ТЬг Азр 390 РЬе мет Рго 61 и Не Туг Уа! 61 и Тгр 400
тЬг АЗП АЗП б! у ЬУ5 тЬг с! и ьеи АЗП Туг ьуз Азп ТЬг 61 и Рго Уа1
405 410 415
Сеи АЗр Зег Азр б!у 5ег туг рЬе мег туг зег ьуз ьеи Агд Уа1 С1и
420 425 430
Гуз Ьуз Азп Тгр Уа! 61 и Агд Азп 5ег туг 5ег Суз 5ег Уа! Уа1 ΗΊ5
435 440 445
61 и <51У ьеи ΗΊ5 Азп нтз ΗΊ5 тНг ТЬг ЬУ5 $ег РЬе 5ег Агд ТЬг Рго
450 455 460 у
465 ьуз раде 11

Claims (32)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Агент, который специфично связывает фактор стволовых клеток (с-Κίΐ), содержащий последовательность аминокислот гуманизированной легкой каппа-цепи, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕО ГО ΝΟ: 2.
  2. 2. Агент по п.1, содержащий последовательность аминокислот, на 95% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕО ГО ΝΟ: 2.
  3. 3. Агент по п.1, содержащий последовательность аминокислот, на 98% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕО ГО ΝΟ: 2.
  4. 4. Агент по п.1, который дополнительно содержит последовательность аминокислот гуманизированной агликозированной тяжелой цепи ЬдС1 8ЕО ГО ΝΟ: 4.
  5. 5. Агент по п.1, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты в участке, определяющем комплементарность, причем аффинность его связывания с-Κίΐ сохраняется.
  6. 6. Агент по п.5, отличающийся тем, что содержит одну консервативную замену аминокислоты.
  7. 7. Агент, который специфично связывает с-Κίΐ и который содержит последовательность аминокислот гуманизированной агликозированной тяжелой цепи ЬдС1, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕО ГО ΝΟ: 4.
  8. 8. Агент по п.7, содержащий 25 последовательность аминокислот, на 95% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕО ГО ΝΟ: 4.
  9. 9. Агент по п.7, содержащий последовательность аминокислот, на 98% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕО ГО ΝΟ:4.
  10. 10. Агент по п.7, который дополнительно содержит последовательность аминокислот 8ЕО ГО ΝΟ: 2.
    - 40 015923
  11. 11. Агент по п.7, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты в участке, определяющем комплементарность, причем аффинность его связывания сΚίΐ сохраняется.
  12. 12. Агент по п.11, отличающийся тем, что содержит одну консервативную замену аминокислоты.
  13. 13. Агент, который специфично связывает с-Κίΐ, содержащий последовательность аминокислот гуманизированной агликозированной тяжелой цепи ЬдС2, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8ЕО ГО N0: 6.
  14. 14. Агент по п.13, содержащий последовательность аминокислот, на 95% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 6.
  15. 15. Агент по п.13, содержащий последовательность аминокислот, на 98% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 6.
  16. 16. Агент по п.13, который дополнительно содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 2.
  17. 17. Агент по п.13, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты в участке, определяющем комплементарность, причем аффинность его связывания с-Κίΐ сохраняется.
  18. 18. Агент по п.17, отличающийся тем, что содержит одну консервативную замену аминокислоты.
  19. 19. Агент по любому из пп.1-18, который проявляет авидность к с-Κίΐ с кй меньше чем 10-2 при определении способом поверхностного плазмонного резонанса.
  20. 20. Нуклеиновая кислота, кодирующая специфически связывающий агент по любому из пп.1-19, при этом указанный агент содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности аминокислот, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 2, 4 или 6.
  21. 21. Нуклеиновая кислота, кодирующая специфически связывающий агент по любому из пп.1-19, которая содержит последовательность нуклеиновых кислот, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности нуклеиновых кислот, выбранной из группы, включающей 8Е0 ГО N0: 1, 3 или 5.
  22. 22. Вектор, который содержит нуклеиновую кислоту по любому пп.20, 21.
  23. 23. Клетка-хозяин, которая содержит вектор по п.22.
  24. 24. Способ получения агента, который специфично связывает с-Κίΐ-, включающий культивирование клетки-хозяина по п.23 таким образом, что происходит экспрессия указанной нуклеиновой кислоты с образованием указанного специфически связывающего агента.
  25. 25. Способ по п.24, дополнительно включающий этап выделения указанного специфично связывающего агента из культуры клеток-хозяев.
  26. 26. Способ уменьшения или лечения фиброза, воспаления, аутоиммунной реакции или рака, связанных с с-Κίΐ заболеваний или расстройств у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего агента по любому из пп.1-19.
  27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанное расстройство или заболевание представляет собой фиброзное расстройство.
  28. 28. Способ по п.26, отличающийся тем, что связывающий агент выбран из группы, состоящей из антитела человека, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, или фрагмента антитела.
  29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что связывающий агент содержит Ес домен.
  30. 30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанное фиброзное расстройство выбрано из группы, состоящей из склеродермии, интерстициального заболевания легкого, идиопатическего фиброза легкого, фиброза, обусловленного хроническим гепатитом В или С, индуцированного радиацией фиброза и фиброза, обусловленного заживлением раны.
  31. 31. Способ по п.30, дополнительно включающий введение второго антагониста профиброзного цитокина, при этом указанный цитокин выбран из трансформирующего фактора роста β (ТСЕ-β), интерлейкина-4 (1Ь-4), интерлейкина-5 (1Ь-5), интерлейкина-9 (1Ь-9), интерлейкина-13 (ГО-13), гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), фактора некроза опухолей альфа 20 (ФНО-α), интерлейкина-1 β (ГО-1С), фактора роста соединительной ткани (ФРСТ), интерлейкина-6 (ΙΕ6), онкостатина М (08М), фактора роста тромбоцитов (ТРФ), моноцитарного хемотаксического протеина 1 (ССЬ2/МСР-1) и хемокина, регулируемого легкими и активацией (ССЫ8/РАКС).
  32. 32. Фармацевтическая композиция для уменьшения или предотвращения фиброза у субъекта, страдающего от фиброзного расстройства, включающая терапевтически эффективное количество связывающего агента по п.1.
EA200802168A 2006-04-24 2007-04-24 ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К c-Kit И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ EA015923B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79477106P 2006-04-24 2006-04-24
PCT/US2007/010155 WO2007127317A2 (en) 2006-04-24 2007-04-24 Humanized c-kit antibody

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200802168A1 EA200802168A1 (ru) 2009-06-30
EA015923B1 true EA015923B1 (ru) 2011-12-30

Family

ID=38543531

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200802168A EA015923B1 (ru) 2006-04-24 2007-04-24 ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К c-Kit И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (22)

Country Link
US (3) US7915391B2 (ru)
EP (2) EP3453724A1 (ru)
JP (3) JP5094842B2 (ru)
KR (1) KR101110547B1 (ru)
CN (1) CN101472949A (ru)
AR (1) AR060583A1 (ru)
AU (1) AU2007243318B2 (ru)
BR (1) BRPI0712920A2 (ru)
CA (1) CA2648882C (ru)
CR (1) CR10444A (ru)
EA (1) EA015923B1 (ru)
ES (1) ES2705480T3 (ru)
IL (1) IL194776A (ru)
MX (1) MX2008013640A (ru)
MY (1) MY153710A (ru)
NO (1) NO20084878L (ru)
NZ (2) NZ594968A (ru)
PE (1) PE20080694A1 (ru)
TW (1) TWI395754B (ru)
UA (1) UA95478C2 (ru)
WO (1) WO2007127317A2 (ru)
ZA (1) ZA200809065B (ru)

Families Citing this family (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2006381T3 (en) 2006-03-31 2016-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS
TWI395754B (zh) * 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
RU2571225C2 (ru) 2008-04-11 2015-12-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная к многократному связыванию двух или более молекул антигена
WO2010028288A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
CA2778105C (en) 2009-10-23 2019-04-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2619329B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
CA2817216A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Subcutaneously administered anti-il-6 receptor antibody
BR112013013354A2 (pt) 2010-11-30 2020-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula de ligação ao antígeno capaz de se ligar a uma pluralidade de moléculas de antígeno repetidamente
KR102119187B1 (ko) 2011-01-10 2020-06-08 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간 줄기 세포 인자 억제제
EP3763740A1 (en) 2011-01-26 2021-01-13 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
CA3021845C (en) 2011-04-20 2022-03-29 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
AR086044A1 (es) 2011-05-12 2013-11-13 Imclone Llc Anticuerpos que se unen especificamente a un dominio extracelular de c-kit y usos de los mismos
WO2013033008A2 (en) 2011-08-26 2013-03-07 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013047748A1 (ja) 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TR201908439T4 (tr) 2011-10-14 2019-07-22 Amgen Inc Enjektör ve montaj yöntemi.
EA034989B1 (ru) 2011-10-28 2020-04-15 Тева Фармасьютикал Австралия Пти Лтд Полипептидная конструкция для применения при лечении рака, включающая аттенуированный альфа-интерферон
CA3078979C (en) * 2011-10-31 2022-10-11 Genentech, Inc. Formulation comprising an anti-il13 antibody having extended stability
CN104080909A (zh) 2011-11-30 2014-10-01 中外制药株式会社 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物
HUE049860T2 (hu) 2012-02-13 2020-11-30 Agency Science Tech & Res IL-ß-t neutralizáló, humán monoklonális antitestek
WO2013148232A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Methods of prognosing, diagnosing and treating idiopathic pulmonary fibrosis
KR101384360B1 (ko) * 2012-05-04 2014-04-14 아주대학교산학협력단 Ｓｃｆ 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물
BR112015001459B1 (pt) 2012-07-25 2023-02-14 Celldex Therapeutics, Inc Anticorpo isolado ou fragmento do mesmo, conjugado, usos dos mesmos, composição farmacêutica, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, célula isolada, kit, método in vitro para inibir atividade da kit, método para produzir um anticorpo
NZ705370A (en) 2012-08-24 2018-06-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
EP3072548B1 (en) 2012-11-21 2019-03-06 Amgen, Inc Drug delivery device
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
JP2016510755A (ja) 2013-03-06 2016-04-11 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 抗Ｃ−ＭＥＴタンデムＦｃ二重特異性抗体
EP3593839A1 (en) 2013-03-15 2020-01-15 Amgen Inc. Drug cassette
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
BR112015021134A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Novartis Ag conjugados de fármaco e anticorpo
US10850037B2 (en) 2013-03-22 2020-12-01 Amgen Inc. Injector and method of assembly
CA2908350C (en) 2013-04-02 2023-08-08 Futa Mimoto Fc region variant
WO2015006554A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Therapeutic antibodies and uses thereof
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
MX2016005315A (es) 2013-10-24 2016-08-11 Amgen Inc Sistema de administracion de farmacos con control sensible a la temperatura.
MX2016005312A (es) 2013-10-24 2016-08-11 Amgen Inc Inyector y metodo de montaje.
US9932410B2 (en) 2013-11-05 2018-04-03 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Human neutralizing anti-kit antibodies and uses thereof
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
ES2939760T3 (es) 2014-03-15 2023-04-26 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos
CA3193070A1 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
US10329556B2 (en) * 2014-05-13 2019-06-25 Bioatla, Llc Conditionally active biological proteins
MX2016014761A (es) 2014-05-16 2017-05-25 Amgen Inc Ensayo para detectar poblaciones celulares linfocitos t colaboradores 1 (th1) y linfocitos t colaboradores (th2).
EP3145543A4 (en) * 2014-05-23 2017-12-13 Celldex Therapeutics, Inc. Treatment of eosinophil or mast cell related disorders
US20170124285A1 (en) 2014-06-03 2017-05-04 Amgen Inc. Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
JP6532136B2 (ja) * 2014-06-09 2019-06-19 株式会社カネカ 抗体に結合する低分子化合物のスクリーニング方法
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
MX2021014323A (es) 2014-10-14 2023-02-02 Amgen Inc Dispositivo de inyección de fármaco con indicadores visuales y audibles.
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
WO2016100781A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
MX2017010466A (es) 2015-02-17 2018-06-06 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con sujecion asistida de vacio y/o respuestas.
WO2016138434A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2016154588A1 (en) 2015-03-25 2016-09-29 Children's Hospital Medical Center Use of kit inhibitors to condition subjects for a hematopoietic stem cell (hsc) transplantation
WO2016172583A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US10604577B2 (en) * 2015-10-22 2020-03-31 Allakos Inc. Methods and compositions for treating systemic mastocytosis
CN116334143A (zh) 2015-11-23 2023-06-27 诺华股份有限公司 优化的慢病毒转移载体及其用途
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
BR112018013074A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-11 Novartis Ag terapias de célula efetora imune com eficácia real-çada
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
US20200281973A1 (en) 2016-03-04 2020-09-10 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
ES2814287T3 (es) 2016-03-15 2021-03-26 Amgen Inc Reducir la probabilidad de rotura de cristal en dispositivos de administración de fármaco
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
CA3021027A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Novartis Ag Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
WO2017197222A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
KR20190038537A (ko) 2016-06-17 2019-04-08 마젠타 테라퓨틱스 인코포레이티드 Cd117+ 세포의 고갈을 위한 조성물 및 방법
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
SG11201900885VA (en) 2016-08-01 2019-02-27 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
JOP20190155A1 (ar) 2016-12-21 2019-06-23 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لإزالة خلايا جذعية مكونة للدم
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
JP7256744B2 (ja) 2017-01-20 2023-04-12 マジェンタ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｃｄ１３７＋細胞の枯渇のための組成物および方法
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
CN110312527A (zh) 2017-01-30 2019-10-08 小利兰·斯坦福大学托管委员会 用于干细胞移植的非基因毒性预处理方案
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
AU2018220538B2 (en) 2017-02-17 2023-12-14 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
EP3582829A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
US20200048359A1 (en) 2017-02-28 2020-02-13 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
AU2018231107B2 (en) 2017-03-06 2023-04-20 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
SG11201908058UA (en) 2017-03-07 2019-09-27 Amgen Inc Needle insertion by overpressure
CA3052310A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP2020513813A (ja) 2017-03-14 2020-05-21 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
FI3600491T3 (fi) 2017-03-28 2023-10-20 Amgen Inc Männänvarren ja ruiskukokoonpanon järjestelmä ja menetelmä
BR112019022912A2 (pt) 2017-05-05 2020-05-26 Allakos Inc. Métodos e composições para tratar doenças oculares alérgicas
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
CN110709121B (zh) 2017-06-08 2022-06-24 安进公司 扭矩驱动式药物递送装置
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
EP3641857A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MA49461A (fr) 2017-06-23 2020-04-29 Amgen Inc Dispositif électronique d'administration de médicament comprenant un bouchon activé par un ensemble commutateur
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
EP4292576A3 (en) 2017-07-21 2024-01-17 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
MA49677A (fr) 2017-07-25 2021-04-21 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec module d'engrenage et procédé d'assemblage associé
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
US20200164155A1 (en) 2017-08-09 2020-05-28 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
ES2971450T3 (es) 2017-10-06 2024-06-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con conjunto de enclavamiento y procedimiento de montaje correspondiente
WO2019074579A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A DRIVE ASSEMBLY AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
SG11202003415XA (en) 2017-10-18 2020-05-28 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
CA3079897A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd117+ cells
TW201922782A (zh) 2017-10-24 2019-06-16 美商麥珍塔治療學股份有限公司 去除cd117+細胞之組合物及方法
SG11202003177RA (en) 2017-10-25 2020-05-28 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20210040205A1 (en) 2017-10-25 2021-02-11 Novartis Ag Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
WO2019090079A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
US20200261648A1 (en) 2017-11-06 2020-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CA3079665A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
SG11202003004RA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Door latch mechanism for drug delivery device
EA202092286A1 (ru) 2018-03-26 2021-03-18 Эмджен Инк. Общие афукозилированные гликоформы антител, полученные в культуре клеток
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
US20210396739A1 (en) 2018-05-01 2021-12-23 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US20210123075A1 (en) 2018-06-08 2021-04-29 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
CN108822212B (zh) * 2018-06-08 2021-06-29 北京大学 选择性识别致癌性突变体kit itd的单克隆抗体及其应用
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
US12042645B2 (en) 2018-07-24 2024-07-23 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
AU2019347710A1 (en) 2018-09-24 2021-02-04 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Assembling a memory alloy ejector activation assembly for a drug delivery device
CN112805048B (zh) 2018-10-02 2023-09-22 安进公司 具有内部力传递的用于药物递送的注射系统
MX2021003491A (es) 2018-10-05 2021-06-18 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con indicador de dosis.
CA3112355A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
WO2020081480A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
US20200376135A1 (en) * 2018-10-23 2020-12-03 Magenta Therapeutics, Inc. Fc silenced antibody drug conjugates (adcs) and uses thereof
WO2020091981A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
AU2019386976B2 (en) 2018-11-26 2024-05-30 Forty Seven, Inc. Humanized antibodies against c-Kit
EP3886869A4 (en) 2018-11-28 2022-07-06 Forty Seven, Inc. GENETICALLY MODIFIED CSPH RESISTANT TO ABLATIVE TREATMENT
MX2021007392A (es) 2018-12-20 2021-08-24 Novartis Ag Regimen de dosificacion y combinacion farmaceutica que comprende derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona.
KR20210129671A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 3-(1-옥소-5-(피페리딘-4-일)이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
BR112021015672A2 (pt) 2019-02-15 2021-10-05 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona substituída e usos dos mesmos
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
WO2020219482A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
EP4017560A2 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Amgen, Inc Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
US20220349898A1 (en) 2019-09-26 2022-11-03 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
KR20210063782A (ko) * 2019-11-25 2021-06-02 주식회사 노벨티노빌리티 c-kit에 대한 항체 및 이의 용도
IL293834A (en) 2019-12-20 2022-08-01 Novartis Ag A combination of anti-tim-3 antibody mbg453 and anti, nis793 tgf-beta antibody with or without decitabine or anti-pd-1 antibody spratlizumab, for the treatment of myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
CA3165735A1 (en) 2019-12-24 2021-07-01 Carna Biosciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
KR20220142484A (ko) 2020-02-14 2022-10-21 조운스 테라퓨틱스, 인크. Ccr8에 결합하는 항체 및 융합 단백질, 및 이의 용도
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN116096862A (zh) 2020-06-11 2023-05-09 诺华股份有限公司 Zbtb32抑制剂及其用途
MX2022015852A (es) 2020-06-23 2023-01-24 Novartis Ag Regimen de dosificacion que comprende derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona.
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
KR20230087539A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 암젠 인크 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
WO2022081828A1 (en) * 2020-10-16 2022-04-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hematopoietic stem cell engraftment with a combination of agents
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AU2022267891A1 (en) 2021-04-27 2023-11-09 Novartis Ag Viral vector production system
WO2022246055A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2022261021A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
JP2024520593A (ja) 2021-06-23 2024-05-24 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ジアシルグリエルコール（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｅｒｃｏｌ）キナーゼ調節化合物
US11976072B2 (en) 2021-06-23 2024-05-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
WO2022271650A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
EP4359411A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
CA3233279A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
KR20240091056A (ko) 2021-10-28 2024-06-21 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 피리디진-3(2h)-온 유도체
CN118201941A (zh) 2021-10-29 2024-06-14 吉利德科学公司 Cd73化合物
CA3240527A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Universitat Basel Discernible cell surface protein variants of cd117 for use in cell therapy
WO2023122615A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023122581A2 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
WO2023164305A1 (en) * 2022-02-28 2023-08-31 Jasper Therapeutics, Inc. Compositions and methods for depletion of diseased hematopoietic stem cells
EP4245756A1 (en) 2022-03-17 2023-09-20 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202400138A (zh) 2022-04-21 2024-01-01 美商基利科學股份有限公司 Ｋｒａｓ ｇ１２ｄ調節化合物
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2024008910A1 (en) 2022-07-07 2024-01-11 Cimeio Therapeutics Ag Antibodies targeting cd117
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
US20240254118A1 (en) 2022-12-22 2024-08-01 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2024163905A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Genzyme Corporation Hsc-specific antibody conjugated lipid nanoparticles and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919911A (en) * 1991-04-05 1999-07-06 Board Of Regents Of The University Of Washington Monoclonal antibodies to stem cell factor receptors

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US7144731B2 (en) 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5545533A (en) 1991-05-25 1996-08-13 Boehringer Mannheim Gmbh Monoclonal antibodies against c-kit and method of detecting a malignancy using c-kit specific antibodies
CA2122732C (en) 1991-11-25 2008-04-08 Marc D. Whitlow Multivalent antigen-binding proteins
WO1993011794A1 (en) 1991-12-13 1993-06-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5807549A (en) 1993-05-21 1998-09-15 Research Corporation Technologies, Inc. Lymphocyte chemoattractant factor and uses thereof
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
DE19600589C1 (de) 1996-01-10 1997-01-16 Univ Eberhard Karls Antikörper A3C6E2
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
KR100483494B1 (ko) 1998-12-01 2005-04-15 프로테인 디자인 랩스 인코포레이티드 감마 인터페론에 대한 인간화 항체
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP4317010B2 (ja) 2001-07-25 2009-08-19 ピーディーエル バイオファーマ，インコーポレイティド ＩｇＧ抗体の安定な凍結乾燥医薬製剤
LT1434871T (lt) 2001-09-20 2017-04-10 Immunex Corporation Heteromerinius polipeptidus ekspresuojančių ląstelių atranka
JP2007533732A (ja) 2004-04-23 2007-11-22 アブ サイエンス 線維症を処置するためのｃ−ｋｉｔ阻害剤の使用法
TWI395754B (zh) * 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5919911A (en) * 1991-04-05 1999-07-06 Board Of Regents Of The University Of Washington Monoclonal antibodies to stem cell factor receptors

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASHMAN L. K. ET AL.: "EPITOPE MAPPING AND FUNCTIONAL STUDIES WITH THREE MONOCLONAL ANTIBODIES TO THE C-KIT RECEPTOR TYROSINE KINASE, YB5.B8, 17F11, AND SR-1", JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, LISS, NEW YORK, NY, US, vol. 158, no. 3, March 1994 (1994-03), pages 545-554, XP008045178, ISSN: 0021-9541, cited in the application, page 551, paragraph 2 *
DATABASE EPO Proteins [Online], 11 December 2001 (2001-12-11), "Sequence 28 from Patent WO0187981", XP002454753, retrieved from EBI accession no. EPOP:AX306528, Database accession no. AX306528, the whole document *
DATABASE Geneseq [Online], 20 May 2004 (2004-05-20), "BHA10 VL#2 protein plus heavy constant domain of human IgG1 SeqID 62", XP002454752, retrieved from EBI accession no. GSP:ADJ11354, Database accession no. ADJ11354, the whole document *
DATABASE Geneseq [Online], 22 February 2007 (2007-02-22), "Mouse sclerostin-specific antibody protein sequence, SEQ ID:347", XP002454754, retrieved from EBI accession no. GSP:AEM19172, Database accession no. AEM19172, the whole document *
DATABASE Geneseq [Online], 31 March 1999 (1999-03-31), "Human antiFc epsilon RI alpha chain antibody #1", XP002454751, retrieved from EBI accession no. GSP:AAW73873, Database accession no. AAW73873, the whole document *
RASPOLLINI M. R. ET AL.: "c-KIT expression and correlation with chemotherapy resistance in ovarian carcinoma: an Immunocytochemical study", ANNALS OF ONCOLOGY: OFFICIAL JOURNAL OF THE EUROPEAN SOCIETY FOR MEDICAL ONCOLOGY/ESMO APR 2004, vol. 15, no. 4, April 2004 (2004-04), pages 594-597, XP002454740, ISSN: 0923-7534, page 596, column 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW200808826A (en) 2008-02-16
JP5094842B2 (ja) 2012-12-12
UA95478C2 (ru) 2011-08-10
US20110223165A1 (en) 2011-09-15
JP5906120B2 (ja) 2016-04-20
JP2012126746A (ja) 2012-07-05
EP3453724A1 (en) 2019-03-13
NZ572397A (en) 2011-10-28
AU2007243318A1 (en) 2007-11-08
MY153710A (en) 2015-03-13
KR20090029190A (ko) 2009-03-20
US7915391B2 (en) 2011-03-29
IL194776A0 (en) 2009-08-03
AU2007243318B2 (en) 2011-07-28
CN101472949A (zh) 2009-07-01
CA2648882A1 (en) 2007-11-08
EP2010571A2 (en) 2009-01-07
TWI395754B (zh) 2013-05-11
EP2010571B1 (en) 2018-10-17
BRPI0712920A2 (pt) 2012-10-02
CR10444A (es) 2009-02-10
NO20084878L (no) 2008-11-19
PE20080694A1 (es) 2008-08-01
EA200802168A1 (ru) 2009-06-30
KR101110547B1 (ko) 2012-02-09
NZ594968A (en) 2013-03-28
AR060583A1 (es) 2008-06-25
IL194776A (en) 2012-10-31
US20070253951A1 (en) 2007-11-01
US20130288303A1 (en) 2013-10-31
MX2008013640A (es) 2008-11-04
WO2007127317A3 (en) 2008-02-07
WO2007127317A2 (en) 2007-11-08
ES2705480T3 (es) 2019-03-25
JP2015071649A (ja) 2015-04-16
US8436150B2 (en) 2013-05-07
JP2009534052A (ja) 2009-09-24
US8791249B2 (en) 2014-07-29
ZA200809065B (en) 2009-09-30
CA2648882C (en) 2015-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015923B1 (ru) ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К c-Kit И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
JP4761710B2 (ja) 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
US9200040B2 (en) Specific binding agents of human angiopoietin-2
ES2565189T3 (es) Anticuerpo monoclonal anti-IL-1R1 humano terapéutico
US20160038588A1 (en) Myostatin Antagonism in Human Subjects
JP2008106076A (ja) ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプター／免疫グロブリン定常領域融合タンパク質
MX2008007324A (es) Usos de antagonistas de miostatina.
JP2006517191A (ja) 共刺激因子を用いた併用療法
KR20010040497A (ko) 림프독소（ｌｔ）경로의 저해제를 사용하여 여포 림프종을치료하는 방법
JPH08507684A (ja) 腫瘍細胞死誘導法
BR112021008908A2 (pt) método para melhorar a cinética do peptídeo no sangue
US20040072745A1 (en) Therapeutic methods of use for lp229

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ RU