CN108822212B

CN108822212B - 选择性识别致癌性突变体kit itd的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN108822212B
Application number: CN201810588853.XA
Authority: CN
Inventors: 刘合力; 丁焕弟; 刘建梅; 梁文君; 徐飞; 林兆晗; 李志强
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2038-06-08
Also published as: CN108822212A

Abstract

本发明公开了一种选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体及其应用。所述抗体的重链和轻链的可变区中的高变区(CDRs)和框架区的特定序列共同决定了其对KIT ITD的选择性，可选择性抑制胃肠道间质瘤中致癌性突变体KIT ITD。利用此抗体的可变区序列以及框架区序列，可制备人‑鼠融合抗体或者人源化抗体，在临床上用于治疗KIT ITD类型的胃肠道间质瘤。

Description

选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，特别涉及一种选择性抑制胃肠道间质瘤中致癌性突变体KIT ITD功能的单克隆抗体及其应用。

背景技术

c-kit基因编码的细胞表面受体KIT(被称为CD117)，是第三类酪氨酸激酶家族的重要成员，在肥大细胞、正常造血干细胞等细胞中表达。作为单次跨膜蛋白，KIT胞内区为酪氨酸激酶区，胞外含5个Ig样的结构域(D1-D5)；其中第五个Ig样的结构域及胞外近膜区，由外显子9编码。我们以及国际同行的研究发现，KIT受体的N-端三个Ig结构域与配体SCF(干细胞生长因子)结合后，受体发生二聚化，且近膜区的第四及第五个Ig样结构域会发生较大的构象改变，从而使受体胞内激酶区发生自磷酸化，继而激活下游信号通路。

研究表明，在95％以上的胃肠道间质瘤(GIST)患者中可见c-kit的高表达或致癌性突变，因此，KIT是GIST的分子标志物，也是治疗GIST的药物靶标。2002年FDA批准的分子靶向药物伊马替尼，可抑制KIT受体的酪氨酸激酶活性，是治疗GIST的一线治疗药物。在GIST患者中，c-kit基因的致癌性突变主要发生在外显子9、11、13和17。其中，在外显子9的致癌性突变，绝大多数为第502-503位残基的内部串联重复突变(internal tandemduplication,ITD)；该类突变发生于10～15％的GIST患者中。KIT ITD最早被Lux等人于2000年发现，北京大学肿瘤医院的沈琳和李健研究团队在我国的GIST患者中亦发现该类突变。KIT ITD特异性地发生于小肠，对伊马替尼表现出原发性的耐药性。有文章报道，相对于其他类型的GIST病人，KIT ITD病人在术后表现出更高的转移特性，预后效果也更差。在离体细胞实验中，已发现KIT ITD具有不依赖SCF的持续酪氨酸激酶活性，并对伊马替尼表现低敏感性；KIT ITD类GIST病人的肿瘤组织，可以外种移植到小鼠成瘤。这些临床观察和实验结果表明：KIT ITD突变体可以作为一类GIST患者分子分型的标记物，亦是驱动胃肠道间质瘤发生的重要分子。选择性地抑制KIT ITD功能的药理学工具，可望成为治疗该类胃肠道间质瘤的精准药物。

KIT作为单次跨膜蛋白，人们试图发现针对其胞外区的、靶向治疗GIST等癌症的抗体类药物，这符合FDA批准单克隆抗体类抗癌药物逐年增多的趋势。KIT单抗的发现，早见于Broudy等人的工作，他们发现的SR-1单抗可以拮抗SCF与KIT的互作，削弱KIT信号转导，或降低GIST细胞表面KIT水平，或促进巨噬细胞对GIST的吞噬从而提高免疫细胞对GSIT细胞的清除效率。另外一种以KIT与SCF的结合区为抗原决定簇的抗体为人源化的CK6，由Lebron等人发现，它可以有效地抑制SCF介导的KIT自磷酸化以及下游的MAPK-AKT信号通路，从而在细胞或整体动物水平上抑制GIST的生长。由Reshetnyak等人发现的、识别KIT第四个结构域D4的抗体79D、KTN37和KNT0158，不仅可以有效抑制KIT稳转细胞的增殖，而且也可以抑制KIT ITD稳转细胞的增殖；Garton等人发现，KNT0158可以提高免疫检查点抗体(anti-CTLA-4和anti-PD-1)的抗肿瘤效果。由Le Gall等人发现的、识别KIT D5的抗体2D1和3G1可以通过诱导受体内化的机制，抑制稳定表达野生型KIT或者伊马替尼耐药的KIT D816V突变体的白血病细胞增殖。但是，上述针对KIT的抗体，尚未进入临床研究，亦不能选择性识别KITITD突变体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体，以用于治疗KIT ITD类胃肠道间质瘤的药物制备。

本发明用于开发个性化治疗胃肠道间质瘤药物的分子靶点是KIT ITD，其第502-505位氨基酸残基序列为AYAY，发生了内部串联重复突变。

本发明通过采用杆状病毒/哺乳动物细胞表达制备了高纯度的KIT ITD抗原，运用传统的杂交瘤技术获得了可选择性识别胃肠道间质瘤中致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体，其中一株命名为3G2。

本发明提供的可选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体是由存在于抗体重链和轻链可变区中的高变区(即互补决定区，CDRs)的特异性序列以及重链和轻链的框架区序列决定的。具体的，所述单克隆抗体的重链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GYSITSDYA、YISYSGSTS、TRWRYRYTLAMDY；轻链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SSISY、YEIYK、QWNYPFT；其重链参与KIT ITD识别的框架区序列为YNPSLKS，轻链参与KIT ITD识别的框架区序列为GSGT。

在本发明的一个实施例中，所获得的3G2抗体的重链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示，轻链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

编码上述3G2抗体重链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：3所示，轻链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：4所示。

本发明利用流式细胞术、表面等离子体技术证实所述单克隆抗体与野生型KIT以及KIT ITD的亲和力差异，并在离体细胞水平以及整体动物水平上评估了它们的有效性，证实其可以高效地选择性抑制KIT ITD介导的细胞增殖，说明KIT ITD可以作为胃肠道间质瘤个性化药物的靶标。在分子结构水平上，证实3G2抗体的重链和轻链的CDR区以及框架区共同识别KIT ITD。KIT ITD的氨基酸残基Thr417、Tyr418、Asp419、Arg420、Val422、Gln427、Val429、Pro467、Gln475、Lys383、Thr385、Gln414、Ile415、Leu416、Pro468、Lys471、Ala502、Tyr503、Tyr505和Asn507构成单克隆抗体识别的表位。在开发治疗GIST的精准药物中具有关键作用。

本发明的有益效果：

1.本发明制备了可选择识别KIT ITD的单克隆抗体。

采用杆状病毒-哺乳动物细胞表达技术，克隆、表达并纯化了含有KIT ITD的第四至第五结构域的蛋白；利用杂交瘤技术，制备了近50株单克隆抗体，并通过ELISA方法筛选出可选择性识别KIT ITD的单克隆抗体。

2.本发明证实所述单克隆抗体可以选择性识别KIT ITD。

本发明用电转法分别构建了稳定表达KIT WT及KIT ITD的Ba/F3细胞系，利用免疫印迹及流式技术进一步证实了稳定细胞系构建成功；利用流式细胞术证实了所述单抗可差异性地识别稳定表达KIT WT及KIT ITD的Ba/F3细胞系。

3.本发明证实所述单克隆抗体能有效地抑制KIT ITD细胞的增殖。

首先，我们评估了所述单抗对离体的、稳定表达KIT ITD的Ba/F3细胞增殖的抑制能力，其中3G2抗体的IC50为1.29±0.11nM。其次，我们将Ba/F3 KIT ITD稳转细胞系通过皮下接种至免疫缺陷裸鼠成瘤，发现3G2抗体在2mg/kg、4mg/kg两个浓度下都可以有效地抑制肿瘤的生长。

综上，本发明构建的KIT ITD Ba/F3细胞，在离体中可以不依赖IL-3而增殖，被接种至免疫缺陷小鼠体内可以成瘤。这些实验结果表明KIT ITD具有促细胞生长的功能，亦印证了临床上的观察，即KIT ITD是一种驱动GIST发生的分子。本发明获得的单克隆抗体在离体或活体水平上，都可以抑制KIT ITD介导的细胞生长；这种抑制能力可能源于抗体能诱导细胞的程序性凋亡。利用SPR技术、流式细胞术以及蛋白质晶体学技术，本发明证实所述抗体可以选择性识别KIT ITD。总之，本发明获得了一种可以选择性抑制胃肠道间质瘤驱动性突变KIT ITD功能的单克隆抗体，同时也证实了KIT ITD具备供选择性抗体识别的表位。利用此抗体的可变区序列以及框架区序列，可制备人-鼠融合抗体或者人源化抗体等。该发明有望衍生出首个治疗KIT ITD类型的胃肠道间质瘤的精准药物。

附图说明

图1为KIT WT及KIT ITD D4-D5蛋白的分子筛色谱图。

图2为KITWT及KIT ITD蛋白的SDS-PAGE分析结果图。

图3为用Protein G亲和层析法纯化的抗体的SDS-PAGE分析结果图。

图4为ELISA检测两种抗体(3G2、#1)识别KIT ITD和KIT WT的吸光度-浓度关系曲线图。

图5为3G2分别与KIT ITD和KIT WT互作的SPR传感图。

图6为Ba/F3细胞中KIT ITD或KIT WT表达水平的免疫印迹图。

图7为流式细胞术分析抗体(3G2和#1)识别KIT ITD和KIT WT Ba/F3细胞的结果图。

图8为抗体3G2的浓度对KIT ITD和KIT WT Ba/F3生存率的关系曲线图。

图9为流式细胞术分析抗体3G2诱导KIT ITD Ba/F3细胞调亡的结果图。

图10为抗体3G2抑制小鼠体内KIT ITD Ba/F3肿瘤生长的结果图。

图11为3G2抗体可变区的氨基酸序列分析图。

图12为3G2和KIT ITD D4-5结构域的复合物的晶体结构图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但不以任何方式限制本发明的范围。

1、免疫抗原重组蛋白的表达

材料包括：用于病毒扩增的sf9昆虫细胞；用于表达蛋白的HEK293细胞；Lonza昆虫细胞培养基；DMEM/F12(Gibco)哺乳动物细胞培养基；胎牛血清(Gibco)，青链霉和链霉素(sigma)；转染试剂Cellfectin(Invitrogen)。

实施步骤如下：

1.1利用昆虫细胞制备重组杆状病毒

(1)以人的c-kit基因(Genebank:S67773.1)为模板，通过PCR扩增KIT ITD或KITWT的第4、5个Ig结构域的编码序列，并在C-末端引入7-组氨酸标签；将cDNA片段克隆至BacMam载体，得到转移质粒；将2μg转移质粒与2μg BacVector-3000杆状病毒DNA混合，孵育5min，然后加入10μL Cellfectin转染试剂以及100μL无抗生素的Lonza昆虫培养基，置于室温孵育30min。

(2)用含有青霉素和链霉素(下文简称双抗)的Lonza培养基培养Sf9昆虫细胞；取0.5×10⁶个对数生长期的sf9细胞平铺于六孔板中，1小时后，弃去培养基以及未贴壁的细胞，添加无抗生素的Lonza培养基；将上述质粒混合液加入到细胞中，27℃孵育。

(3)6h后，弃去含有转染试剂的培养基，添加含有双抗的Lonza培养基，继续在27℃培养箱中静置培养。

(4)7d后，收获每孔的上清液，即获得P1代重组病毒。

(5)将P1病毒按1:1000的体积比感染对数生长期的sf9细胞，并让细胞在27℃培养箱中继续悬浮培养。

(6)感染约6d左右，当观察到细胞生长停滞、体积变大、且约半数细胞崩解时，收获细胞的上清，即得P2病毒，保存于4℃中以备使用。

(7)按照步骤(5)-(6)，利用P2病毒制备大批量的P3病毒。

1.2蛋白表达及纯化

(1)将HEK293细胞悬浮培养至密度约为3.0×10⁶个/毫升，并用台盼蓝染色法确证细胞存活率大于95％。

(2)将P3病毒按1:10体积比(病毒∶细胞)加入到HEK293细胞中，72h后，离心收集细胞上清。使用切向流超滤系统浓缩培养基，并交换至HBS缓冲液。

(3)用Ni²⁺-NTA亲和层析介质抓取目的蛋白，并依次用含有20mM、40mM以及300mM咪唑的HBS缓冲液(pH 7.5)洗脱介质，收集各个洗脱组分；用SDS-PAGE确定300mM咪唑的洗脱组分中含有目的蛋白。

(4)用HBS缓冲液预先平衡过的分子筛柱(Superdex-200)进一步纯化目的蛋白，并用SDS-PAGE分析洗脱峰中的蛋白成分。

实验结果如图1和图2所示，从图1可以看出，KIT WT及KIT ITD第4、5个结构域的分子筛色谱图都为一个尖锐的单峰，两者的洗脱体积都为16.2mL，说明两者都可以稳定存在于溶液中。如图2所示，KIT WT及KIT ITD在SDS-PAGE胶上呈现出四条带，这可能与两者的5个N-糖基化位点上的糖侧链不均一有关。

2、单克隆抗体制备

主要材料包括：8-16周龄BALB/c小鼠(购自北京大学医学部实验动物中心)；弗氏完全佐剂(sigma)；弗氏不完全佐剂(sigma)；聚苯乙烯酶标板(Corning)；HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Santa cruz)；TMB双组分显色液(Solarbio)；BSA牛血清白蛋白(Japan)；SP2/0细胞(购自中科院上海细胞库)；PEG 1450(sigma)；HAT培养基添加剂(50×)(sigma)；rProtein G Beads(Solarbio)。

实施步骤如下：

2.1动物免疫

(1)初次免疫：实验前，经小鼠眼球取血少许，作为血清抗体效价检测的阴性对照；将弗氏完全佐剂与免疫抗原KIT ITD D4-5蛋白的混合乳化液，经小鼠背部皮下以及腹股沟皮下多点注入小鼠体内。

(2)加强免疫：在初次免疫7-10天后，将弗氏不完全佐剂与免疫抗原的混合乳化液，以与(1)相同的途径免疫小鼠。之后，每隔7-10天加强免疫2-3次；当小鼠血清的抗体效价达到10⁴-10⁵，则进行冲击免疫，即通过尾静脉注射50μg KIT ITD D4-5蛋白(不加佐剂)，以备3天后的细胞融合实验。

2.2ELISA检测抗体效价或筛选单克隆抗体

(1)包被：将KIT WT D4-5或KIT ITD D4-5蛋白溶解于CB缓冲液(pH 9.6，0.05MNa₂CO₃/NaHCO₃)，使其终浓度为2μg/mL；包被蛋白于96孔聚苯乙烯酶标板，4℃过夜。

(2)封闭：用PBST缓冲液洗板3次；每孔加入含2％BSA的PBS溶液，37℃孵育2h后，再用PBST缓冲液洗板3次。

(3)孵育一抗：用0.2％BSA将小鼠血清(或者杂交瘤细胞分泌上清，亦或者纯化的抗体)倍比稀释成一系列浓度梯度，添加至酶标板，初次免疫前对小鼠进行眼球取血的血清为阴性对照，空白对照为含0.2％BSA的PBS溶液，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板3次。

(4)孵育二抗：加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h，用PBST缓冲液洗板3次。

(5)显色：将TMB底物显色A液、B液混合，每孔100μL，室温避光反应10min。

(6)终止：每孔加入100μL 2M H₂SO₄，终止显色反应。

(7)检测：酶标仪测定酶标板各孔的吸光值，检测波长为450nm。

2.3细胞融合及杂交瘤细胞的筛选

(1)SP2/0细胞制备：融合前将SP2/0细胞转移至15mL离心管，在1000rpm离心5min；用PBS重悬细胞，再次离心后将细胞悬浮至20mL的PBS中，计数细胞密度，待用；

(2)脾细胞制备：选取免疫效价高的BALB/c小鼠，经尾静脉冲击免疫3天后，将小鼠脱颈处死，取出脾脏，置于100mm细胞培养皿中；使用一次性注射器吸取RPMI 1640基础培养液，小心插入脾脏将内部细胞吹出，重复操作数次；收集脾细胞悬液，在1000rpm离心5min；弃上清，使用0.85％(w/v)NH₄Cl溶液除去红细胞，加入PBS缓冲液终止反应，在1000rpm离心5min；用RPMI 1640基础培养液重新悬浮细胞并计数；

(3)细胞混合：在离心管内将SP2/0细胞与脾细胞按1:3-1:5的比例混合，在1000rpm离心5min；弃去上清，轻轻敲击管底，使细胞混合物分散成糊状；

(4)融合：将在37℃预热过的PEG1450，沿离心管内壁缓缓加入，边滴加边转动离心管；置于37℃培养箱内静置2min，随即慢慢加入预热的RPMI 1640基础培养液，终止融合过程；

(5)铺板：在1000rpm离心5min，弃去上清；用HAT培养基悬浮细胞，并铺至96孔细胞培养板，置于37℃CO₂培养箱中培养；

(6)换HT：融合细胞生长到第8天后，换HT培养基，置于37℃CO₂培养箱中继续培养；

(7)当杂交瘤细胞生长至一定量时，将KIT WT和KIT ITD蛋白分别包被至96孔酶标板，以鼠抗KIT ITD血清为阳性对照，利用ELISA法检测杂交瘤细胞分泌上清中的抗体效价；

(8)挑选出阳性的杂交瘤细胞(对KIT ITD的效价较高，而对KIT WT的效价较低)，采用有限稀释法进行亚克隆筛选，10-12天左右，以ELISA法检测培养液是否含有目标抗体；

(9)选取ELISA检测中OD₄₅₀读值高、细胞生长状态好、形成集落单一的杂交瘤细胞，再重复进行3-5次有限稀释，直至克隆阳性率达100％；

(10)扩增阳性杂交瘤细胞，待其汇合度至80％左右，冻存细胞于液氮中备用。

2.4腹水的制备

(1)选取12-16周龄BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，每只注入0.5mL。

(2)7天后，腹腔接种杂交瘤细胞。收集对数生长期的杂交瘤细胞，在1000rpm离心5min；弃去上清，用RPMI 1640重新悬浮细胞，每只小鼠腹腔注射10⁶个细胞。

(3)7-10天后，收集腹水。将收集的腹水在11000rpm、4℃离心10min；离心后弃去上层油脂和底层组织细胞碎片，取中层清液待用。

2.5抗体的纯化和表征

向腹水清液中加入Protein G亲和层析介质，4℃混匀1h后离心收集介质；用pH2.7的甘氨酸溶液洗脱介质；洗脱液收集至预先加有pH 9.0的Tris中和缓冲液中。用SDS-PAGE电泳检测纯化出的抗体纯度。

再用ELISA检测不同浓度下抗体与KIT ITD或者KIT WT的结合能力：如前文述及，将KIT ITD或者KIT WT的D4-5结构域包被于96孔酶标板上，再加入浓度分别为66.67、22.22、7.41、2.47、0.82、0.27、0.09和0.03nM的抗体(作为实验组的3G2或#1，以及作为阴性对照的IgG)，孵育一段时间后，加入HRP标记的二抗进行显色反应。记录OD₄₅₀读值。本实验被重复三次；对于每个样品，设置三个复孔；数据为平均值±方差所示。

上述实验用KIT ITD的第4、5个结构域免疫小鼠，并用传统的杂交瘤技术获得了若干株单克隆抗体；用基于KIT WT蛋白的ELISA实验排除后，我们获得了若干株可选择性识别KIT ITD的单克隆抗体，其中一株命名为3G2抗体。如图3所示，自腹水纯化的3G2抗体以及不能选择性识别KIT ITD的1号(#1)抗体，纯度高，在考马斯亮蓝着色的SDS-PAGE胶上，均表现出如期的重链(分子量约为50kD)和轻链(分子量约为25kD)。在ELISA实验中，以实验组与阴性对照组的OD₄₅₀差值(纵坐标)对抗体浓度(横坐标)作图(如图4所示)，可见3G2能差异性识别KIT WT D4-5与KIT ITD D4-5蛋白，但#1抗体不能。

3、用表面等离子体技术(SPR)测定抗体和KIT蛋白的亲和常数

仪器：Biacore T200(GE Healthcare)；

材料：CM5芯片、醋酸钠(pH 5.0)、EDC、NHS和乙醇胺(GE)；含有0.02％Tween20的PBS(pH7.4)。

实施步骤：

采用氨基偶联法将IgG抗体偶联于芯片的第1通道上以作为参比，抗体3G2偶联于第2通道上；偶联条件为：10mM醋酸钠缓冲液；活化时间为420s；手动偶联模式进样；封闭时间为420s。依次将浓度为100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM的KIT WT D4-5或KITITD D4-5蛋白作为分析物流经芯片表面，记录第2通道与第1通道SPR信号随时间的变化值；分析物与芯片的结合时间为180s、解离时间为300s。再生条件为5mM NaOH，注入时间为60s。

用表面等离子体共振技术定性地测定3G2抗体分别与KIT WT D4-5和KIT ITD D4-5蛋白的亲和力的结果如图5以及表1所示，3G2与突变体的亲和力比与野生型的强一个数量级(1.71×10^-8对1.54×10^-7M)；而且从动力学上来看，这种亲和力的差异主要源于3G2与KIT ITD结合后解离速率度变慢了近一个数量级。

表1抗体3G2与KIT WT及KIT ITD的D4-5蛋白的亲和力常数统计

4、KIT ITD和KIT WT Ba/F3稳定细胞系的构建以及表征

为在细胞水平上评估抗体对KIT ITD的选择性以及药理作用，我们构建可以稳定表达全长KIT ITD或KIT WT的Ba/F3细胞系。

主要材料及试剂包括：Ba/F3细胞由中科院刘青松课题组提供；RPMI 1640培养基、胎牛血清均(Gibco)；IL3(Peprotech)；嘌呤霉素(HARVEYBIO)；Micro pulser电转仪(BioRad)，4mm电转杯(Bio-Rad165)；增强型ECL化学发光液(Biodragon)；PVDF膜(Millipore)；预染彩虹蛋白Marker(Novoprotein)；Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠IgG(中杉金桥)。

实施步骤如下：

4.1稳定细胞系筛选

(1)收集4×10⁶个Ba/F3细胞，用Opti-MEM培养基将细胞清洗2次，重悬细胞至密度为1×10⁷个/mL；

(2)将编码全长的KIT ITD和KIT WT的cDNA克隆至pMSCVpuro载体，得到表达质粒；将10μL表达质粒与Ba/F3细胞混匀，加入电转杯中，冰上孵育10min；

(3)电击1次(1kV，3μF)，室温孵育10s；在相同的条件下再电击一次；

(4)置冰上10min，用10mL完全培养基重悬细胞，铺至96孔板中，置37℃、5％CO₂培养箱。

(5)培养48h后，加入嘌呤霉素(1μg/mL)，以筛选稳定表达KIT的细胞系。

4.2免疫印迹(Western Blot，WB)

(1)收集稳转KIT ITD或KIT WT的Ba/F3细胞，加入500μL预冷的细胞裂解液，混匀，冰上放置裂解细胞30min；在11000rpm、4℃离心15min，收集裂解液，并用SDS-PAGE分析蛋白组成；

(2)转膜：将电泳好的凝胶放在转膜缓冲液中浸泡，PVDF膜置于转膜缓冲液中平衡。转膜装置依次按阳极板、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、阴极板的顺序放好，400mA恒流转膜90min。

(3)封闭：用含5％脱脂牛奶的TBST封闭，室温孵育2h。

(4)加入适当倍数稀释的一抗，室温孵育2h或4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜三次，每次5min。

(5)加入适当稀释倍数的HRP酶标二抗，室温孵育1h。用TBST缓冲液洗膜三次，每次5min。

(6)加入ECL底物孵育1-2min，显影。

4.3流式细胞术检测抗体与细胞表面KIT的互作

将10⁶个稳转KIT ITD或KIT WT的Ba/F3细胞收集至离心管中，用PBS缓冲液清洗一次；加入1mL 4％多聚甲醛，室温固定30min；离心弃上清，并用PBS洗2次；加入含2％BSA的PBS，室温封闭1h；用含2％BSA的PBS按照1∶400比例稀释抗体(3G2、#1)，并加入细胞悬液中，室温孵育2h，用PBS洗细胞4次；再用含有5％BSA的PBS按照1∶400比例稀释Alexa Fluor 488标记的二抗，室温避光孵育1h，用PBS洗4次；重悬细胞于200μL PBS中，通过流式细胞仪(Beckman Coulter)进行分析。以FITC荧光强度为横坐标，细胞数为纵坐标，调节电压参数使空白对照位于坐标轴的原点，每个样本记录10000个细胞的平均荧光读值。实验结果通过Cytexpert software软件进行处理。

实验结果如图6和图7所示，经WB证实，两种细胞的裂解产物均可见分子量约为130kD左右的两种KIT蛋白，这与多数文献报道的结果一致(图6)；在流式细胞术实验中，相对于空白对照而言，#1抗体能同等程度地识别KIT ITD或KIT WT Ba/F3细胞；3G2只识别KITITD Ba/F3细胞，而几乎不识别KIT WT的细胞(图7)。这不仅进一步表明Ba/F3稳转细胞系构建成功，而且说明KIT ITD确实可以选择性识别细胞表面的KIT ITD。

5、细胞增殖实验

主要材料包括：干细胞生长因子SCF(Genscript)；CCK 8试剂盒(Solarbio)公司；小鼠免疫球蛋白Mouse IgG(YEASEN)。

实验步骤如下：

(1)用含IL3的培养基培养稳定表达KIT WT及KIT ITD的Ba/F3细胞至对数期，撤去培养基中的IL-3；但对于KIT WT Ba/F3细胞，补加100ng/mL SCF。

(2)继续培养24h后，将细胞铺至96孔板中，每孔50000个细胞；

(3)对于给药组细胞，分别加入含有27.74nM、9.25nM、4.62nM、2.31nM、1.16nM、0.58nM、0.19nM、0.06nM、0.02nM 3G2或#1抗体的100μL培养基。对于阴性对照组细胞，则加入含有27.74nM IgG的培养基；对于空白对照组细胞，则加入100μL培养基。

(4)72h后，用CCK8试剂盒检测每孔细胞的OD₄₅₀值，并按照公式计算存活率。细胞存活率＝(给药组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100％。用软件GraphPad Prism分析细胞存活率与抗体浓度之间的关系，并计算IC50。本实验被重复三次；对于每个实验组，设置三个复孔；数据为平均值±方差所示。

抗体(3G2或#1)抑制离体的KIT ITD或KIT WT Ba/F3细胞生长的实验结果表明，3G2抗体可以有效地抑制KIT ITD细胞的生长(其IC₅₀为1.29nM)，但几乎不抑制KIT WT细胞的生长；作为对照，#1抗体对两种细胞的生长，均无明显的抑制作用(图8)。

6、抗体诱导细胞凋亡实验

为了探讨抗体抑制细胞生长的机制，我们以7-氨基放线菌素(7-AAD)和FITC标记的Annexin V为探针，运用流式细胞术分析抗体3G2或IgG处理过的细胞。

主要材料包括：AnnexinV-FITC/7-AAD凋亡检测试剂盒(Biolegend)。

实验步骤如下：

(1)用无IL3的培养基中培养KIT ITD或KIT WT Ba/F3细胞培养24h，对于KIT WT细胞则在培养基中补加100ng/mL SCF；将两种细胞分别铺在24孔板中，每孔10⁵个细胞；

(2)分别将10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0nM的3G2抗体加入到细胞中；以IgG为阴性对照；

(3)66h后，用AnnexinV-FITC/7-AAD试剂盒处理细胞，并用流式细胞仪进行分析。

实验结果如图9中A所示，对于10nM 3G2作用过的KIT ITD Ba/F3细胞，55.48％的出现程序性凋亡(第II、III象限)，其中41.01％的位于早期凋亡阶段(第II象限)，14.47％的处于晚期凋亡阶段(第III象限)；与上述细胞生长抑制实验结果一致，3G2抗体相对于与IgG，没有促进KIT WT Ba/F3细胞的凋亡(3G2的10.9％对IgG的13.5％)。相比之下，同浓度的IgG处理过的KIT ITD或KIT WT Ba/F3细胞，大部分(87.76％或83.42％)依然存活。在1.25～10nM浓度范围内，3G2促进KIT ITD Ba/F3细胞程序性凋亡的比例，呈递具有统计学意义的剂量依赖关系(图9中B)。

7、裸鼠荷瘤实验

为了在活体水平上考察抗体3G2的药理作用，我们在免疫缺陷小鼠皮下接种KITITD Ba/F3并使之成瘤。

主要材料包括：免疫缺陷裸鼠(购自北京大学医学部实验动物中心)；游标卡尺(数显)(Solarbio)；基质胶(BD Biosciences)。

实验步骤如下：

将2×10⁶个KIT ITD Ba/F3细胞与基质胶等体积混匀，经皮下接种至6周龄的免疫缺陷裸鼠右腋下；待肿瘤长到200-400mm³后，将小鼠随机分成三组，每组7只。对于给药组，将3G2分别按照2mg/kg、4mg/kg的剂量通过尾静脉注入小鼠体内，每周给药2次，累计给药5次。对于阴性对照组，则注入IgG，剂量为4mg/kg。每隔一天测量小鼠的体重、瘤体大小；第17天，处死小鼠，取出瘤体称重。

实验结果如图10所示，在长达17天的观察期中，静脉注入IgG或2mg/kg、4mg/kg3G2的小鼠体重基本保持不变(见图10中A)；IgG组的小鼠肿瘤尺寸持续增大，而给予两个剂量的3G2的小鼠肿瘤尺寸增大幅度较小(见图10中B)。在第17天，我们剥离出这些瘤体，发现IgG组小鼠比3G2组的瘤体普遍要大(见图10中C)，重量具有显著性差异(见图10中D)。

8、抗体Fab区氨基酸序列的确定

主要材料：Trizol(Invitrogen)；反转录试剂盒：GoScriptTM ReverseTranscription System(Promega)；Vent DNA polymerase(NEB)；PCR相关试剂(上海生工)。

8.1Trizol法提取RNA

收集10⁷个杂交瘤细胞，用PBS洗2遍；加入1mL Trizol，混匀，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温放置15min；在11000rpm、4℃离心15min，吸取上层水相至另一EP管中；加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；在11000rpm、4℃离心10min，弃上清；加入1mL 75％乙醇，洗涤沉淀，并在8000rpm、4℃离心5min，弃上清；室温晾干5-10min，加入30μL RNase free water，并在58℃孵育5min。用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定提取RNA；用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀，以判断其纯度。

8.2cDNA的合成

根据GoScriptTM Reverse Transcription System的实验指南，设置逆转录反应，并依次设定反应温度和时间：25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min；4℃，长时间保存。

8.3PCR扩增

设置50μL PCR反应体系，包括2μL的cDNA模板、正向引物和反向引物各5μL、0.5μLVent DNA polymerase。其中，正向和反向引物都含简并碱基，并分别含有限制性内切酶的识别位点。在95℃预加热5min后，PCR经历30个扩增循环，每个循环的温度和时间设置为：95℃，1min；55℃，1min；72℃，1min。最后，将PCR产物在72℃保持10min。

8.4PCR产物的克隆

将PCR产物克隆至BacMam载体中，挑选阳性克隆、提取质粒并做DNA测序。

通过RT-PCR，我们成功地克隆出编码3G2抗体可变区的cDNA序列，并获得该区域的氨基酸序列(图11)，其中CDR区以及参与KIT ITD识别的框架区序列已被标示。

9、KIT ITD与抗体3G2的复合物的晶体结构测定

主要材料包括：木瓜蛋白酶(SIGMA)；Wizard和Proplex结晶试剂盒；Endo H(NEB)。

实验步骤如下：

9.1复合物的重构

将适量的木瓜蛋白酶加入到自腹水纯化的单抗3G2，室温孵育3小时，终止反应；加入重组表达的KIT ITD D4-5结构域蛋白，4℃孵育1小时；用分子筛层析分离出KIT ITD D4-5与3G2 Fab区复合物。

9.2复合物的结晶

用Endo H除去复合物中的糖侧链，并将复合物浓缩到10mg/mL；用Wizard和Proplex结晶试剂盒筛选结晶条件；通过改变沉淀剂浓度、缓冲溶液的pH值而优化结晶条件。最终在结晶条件(21％PEG8000，10mM HEPES 7.0，0.72％的内消旋-赤藓醇)下获得单晶；用含有20～24％乙二醇的结晶溶液浸泡晶体，并将其淬冷于液氮中。

9.3衍射数据收集及结构解析

在上海同步辐射光源19U1线站收集衍射数据，用软件HEK2000处理数据，并用程序PHASER的分子置换法解析晶体结构。对于初始结构模型，用软件COOT调图，并用软件PHENIX进一步精修，以确保复合物模型的立体化学质量可靠。

如图12所示，A显示了KIT ITD D4-5与3G2 Fab复合物的晶体结构，其中：3G2 Fab重链的CDR2与KIT ITD的残基Thr417、Tyr418、Asp419、Arg420、Val422识别(见图12中C)；重链的CDR3与KIT ITD的残基Thr417、Asp419、Gln427、Val429、Pro467、Gln475识别(见图12中D)；轻链的CDR1、CDR2分别与KIT ITD的残基Thr385、Gln414、Pro467、Pro468、Lys471识别(见图12中E)；轻链的CDR3与KIT ITD的残基Gln414、Ile415、Leu416、Pro468、Ala502、Tyr503互作；位于轻链框架区的残基Ser66与KIT ITD的残基Lys383互作；位于重链框架区的残基Pro62、Lys65、Ser66以及轻链CDR3的残基Tyr92，与KIT ITD的Ala502、Tyr503、Tyr505、Asn507相互接触(距离小于

)(见图12中B)；其中KIT ITD的关键识别位点Tyr505的芳环基团与重链框架区的疏水残基Pro62以及Lys65的侧链形成氢键，从而有助于提高抗体与KIT ITD复合物的稳定性。对于KIT WT，位于第505号位的残基为亲水性的天门冬酰胺(Asn)，其将势必削弱这种效应，从而让3G2抗体与KIT WT容易解离。该复合物晶体结构很好地解释了3G2抗体与KIT ITD的亲和力高于KIT WT的内在原因，也说明了3G2的框架区和CDR区共同构成了识别KIT ITD的结构基础。其次，该晶体结构很直观地说明了KIT ITD的残基Thr417、Tyr418、Asp419、Arg420、Val422、Gln427、Val429、Pro467、Gln475、Lys383、Thr385、Gln414、Ile415、Leu416、Pro468、Lys471、Ala502、Tyr503、Tyr505和Asn507构成表位，用于抗体的选择性识别。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体及其应用

<130> WX2018-BY-006

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp

35 40 45

Val Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Arg Tyr Arg Tyr Thr Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

195 200 205

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Leu Arg Asp Cys Gly

210 215 220

<210> 2

<211> 212

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Ile Tyr Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Phe Thr Phe

85 90 95

Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr

100 105 110

Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala

115 120 125

Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val

130 135 140

Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser

145 150 155 160

Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr

165 170 175

Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys

180 185 190

Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn

195 200 205

Arg Asn Glu Cys

210

<210> 3

<211> 669

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

gaggttcagc tgcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcgctggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120

tttccgggaa acagactgga gtgggtgggc tacataagct acagtggtag cactagctac 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgggaca catcccagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtac aagatggcgg 300

tataggtata ccctcgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 420

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 480

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 540

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 600

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgctacgg 660

gactgcggc 669

<210> 4

<211> 636

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

gatattgtgc tcacccagtc tccagccatc acagctgcat ctctggggca aaaggtcacc 60

atcacctgca gtgccagctc aagtataagt tacatacact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaccatggat ttatgaaata tacaaactgg cttctggagt cccacctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca tttattattg ccagcagtgg aattatccat tcacgttcgg ctcggggaca 300

aagttggaaa taaaacgggc tgatgctgca ccaactgtat ccatcttccc accatccagt 360

gagcagttaa catctggagg tgcctcagtc gtgtgcttct tgaacaactt ctaccccaaa 420

gacatcaatg tcaagtggaa gattgatggc agtgaacgac aaaatggcgt cctgaacagt 480

tggactgatc aggacagcaa agacagcacc tacagcatga gcagcaccct cacgttgacc 540

aaggacgagt atgaacgaca taacagctat acctgtgagg ccactcacaa gacatcaact 600

tcacccattg tcaagagctt caacaggaat gagtgt 636

Claims

1.一种选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为GYSITSDYA、YISYSGSTS、TRWRYRYTLAMDY；轻链可变区中的三个高变区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SSISY、YEIYK、QWNYPFT；其重链参与KIT ITD识别的框架区序列为YNPSLKS，轻链参与KIT ITD识别的框架区序列为GSGT。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示，轻链Fab区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

3.一种抗体基因，编码权利要求1或2所述的选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的抗体基因，其特征在于，所述抗体基因编码重链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：3所示，轻链Fab区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：4所示。

5.权利要求1或2所述的选择性识别致癌性突变体KIT ITD的单克隆抗体在制备治疗KIT ITD类胃肠道间质瘤的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述KIT ITD类胃肠道间质瘤中存在致癌性突变体KIT ITD，其第502-505位氨基酸残基序列为AYAY。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述KIT ITD的氨基酸残基Thr417、Tyr418、Asp419、Arg420、Val422、Gln427、Val429、Pro467、Gln475、Lys383、Thr385、Gln414、Ile415、Leu416、Pro468、Lys471、Ala502、Tyr503、Tyr505和Asn507构成单克隆抗体识别的表位。

8.权利要求3或4所述抗体基因在制备治疗KIT ITD类胃肠道间质瘤的药物中的应用。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗体基因编码的蛋白质选择性识别KITITD的氨基酸残基Thr417、Tyr418、Asp419、Arg420、Val422、Gln427、Val429、Pro467、Gln475、Lys383、Thr385、Gln414、Ile415、Leu416、Pro468、Lys471、Ala502、Tyr503、Tyr505和Asn507构成的表位。