CN113368232A - 多特异性抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及多特异性抗原结合蛋白及其应用，具体涉及一种药物组合，包含组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子。本申请还提供一种可以同时结合组织因子和CD3抗原的蛋白以及上述药物组合的制备方法和在治疗癌症中的用途。

Description

多特异性抗原结合蛋白及其应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种多特异性抗原结合蛋白及其应用。
背景技术
在癌症治疗中，T细胞依赖的双特异性抗体(T cell engaged bispecificantibody，TCB)是T细胞免疫疗法的重要组成部分。目前TCB对血液瘤的治疗潜力已被多种临床试验证明。
在实体瘤中，促结缔组织增生的肿瘤基质和免疫抑制性微环境(缺氧和抑制性细胞)可有效阻碍T细胞的浸润和功能，导致TCB功效降低。尽管在临床试验中已经评估了数十种TCB(靶向EpCAM，her2，PSMA，CEA等)，但只有少数显示出早期的抗肿瘤活性。因此，在用TCB对实体瘤的治疗上，迫切需要开发出靶向新抗原、新表位或使用新分子形式的TCB，以提高治疗效果，同时满足生物安全性。
发明内容
本申请提供了一种抗原结合蛋白。本申请首次构建了一个同时靶向CD3和组织因子(tissue factor，TF)的双抗(TF-TCB)，该双抗可以具有IgG-[L]-scFv结构。体外实验中，TF-TCB可以有效杀伤多种TF阳性的肿瘤细胞。在小鼠体内试验中，TF-TCB在多种肿瘤模型中显示了较强的抗肿瘤活性，并且可以具有安全性。免疫组化表明TF-TCB可介导肿瘤T细胞浸润和TF阳性肿瘤细胞的清除。此外，TF-TCB与免疫检查点抑制剂联合用药具有协同作用。通过实验，本申请证明了同时靶向CD3和TF，且具有IgG-[L]-scFv的双抗具有抗肿瘤活性。
一方面，本申请提供了一种药物组合，其包含组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含多肽。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含组织因子特异性结合多肽。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述组织因子结合分子的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述组织因子结合分子的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含抗体重链恒定区。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区包含源自人抗体的重链恒定区。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含抗体轻链恒定区。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链恒定区包含源自人抗体的轻链恒定区。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含抗体重链，所述组织因子结合分子的所述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含抗体轻链，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子包含抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，其中所述抗体包含单克隆抗体。
在一些实施方式中，其中所述抗体选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一些实施方式中，其中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子包含多肽。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子包含CD3特异性结合多肽。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述CD3结合分子的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述CD3结合分子的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述VH与CD3结合分子的所述VL直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子的所述VH的C端与CD3结合分子的所述VL的N端直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述间接连接包含通过连接体连接。
在一些实施方式中，所述连接体的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在一些实施方式中，所述CD3结合分子包含抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，其中所述抗体包含单克隆抗体。
在一些实施方式中，其中所述抗体选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一些实施方式中，其中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子与CD3结合分子直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链与CD3结合分子直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子与CD3结合分子的所述VH直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链的C端与CD3结合分子的所述VH的N端直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述间接连接包含通过连接体连接。
在一些实施方式中，所述连接体的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
在一些实施方式中，所述药物组合包含双特异性抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述药物组合包含四价的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述药物组合能够介导组织因子阳性的细胞与CD3阳性的细胞间聚集。
在一些实施方式中，所述药物组合能够促进T细胞的激活。
在一些实施方式中，所述药物组合能够促进细胞因子释放。
在一些实施方式中，所述细胞因子包含IL-2和/或IFNγ。
在一些实施方式中，所述药物组合能够提高T细胞对靶细胞杀伤率。
在一些实施方式中，所述靶细胞包含肿瘤细胞。
在一些实施方式中，所述靶细胞包含组织因子阳性细胞。
在一些实施方式中，所述药物组合能够促进T细胞增殖。
在一些实施方式中，所述药物组合能够抑制肿瘤生长。
另一方面，本申请还提供了一种多肽，其包含本申请药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子。
在一些实施方式中，其包含融合蛋白。
另一方面，本申请还提供了一种核酸分子，其编码本申请药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或本申请的多肽。
另一方面，本申请还提供了一种载体，其包含本申请的核酸分子。
另一方面，本申请还提供了一种免疫缀合物，其包含本申请药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或本申请的多肽。
另一方面，本申请还提供了一种细胞，其包含和/或表达本申请药物组合、包含和/或表达本申请的多肽、包含本申请的核酸分子、包含本申请的载体和/或包含本申请的免疫缀合物。
另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包含本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物和/或本申请的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在一些实施方式中，所述药物组合还包含外周血单个核细胞。
在一些实施方式中，所述药物组合还包含免疫检查点抑制剂。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂。
在一些实施方式中，所述PD-1抑制剂包含纳武单抗(Nivolumab)的HCDR1-3以及LCDR1-3。
在一些实施方式中，PD-1抑制剂包含纳武单抗(Nivolumab)的VH以及VL。
在一些实施方式中，所述PD-1抑制剂包含纳武单抗(Nivolumab)。
如本申请的药物组合物，其中所述的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子与所述免疫检查点抑制剂在所述药物组合物中相互混合或相互不混合。
另一方面，本申请还提供了一种试剂盒，其包含本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
另一方面，本申请还提供了制备本申请药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或本申请的多肽的方法，包含在使得所述组织因子(TF)结合分子、所述CD3结合分子和/或所述多肽表达的条件下，培养本申请的细胞。
另一方面，本申请还提供了本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物在制备试剂盒中的用途。
另一方面，本申请还提供了本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
在一些实施方式中，其中所述疾病和/或病症包含增生性疾病。
在一些实施方式中，其中所述疾病和/或病症包含实体瘤和/或血液瘤。
在一些实施方式中，其中所述疾病和/或病症包含组织因子阳性肿瘤。
在一些实施方式中，其中所述疾病和/或病症包含组织因子高表达肿瘤。
在一些实施方式中，其中所述疾病和/或病症选自以下组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是，本申请的一种抗原结合蛋白的结构示意图。
图2显示的是，SDS-PAGE分析TF-TCB的表达结果图。
图3A-3B显示的是，通过流式细胞术测定的TF-TCB与细胞表面的TF抗原和CD3抗原的结合结果图。
图4显示的是，通过流式细胞术检测TF-TCB介导的CD3+Jurkat细胞与TF+AsPC-1细胞的交联结果图。
图5A-5B显示的是，TF-TCB介导的T细胞激活和细胞因子释放结果图
图6显示的是，TF-TCB介导T细胞对AsPC-1、MDA-MB-231和SKOV-3细胞的杀伤结果图。
图7A-7C显示的是，TF-TCB介导对肿瘤细胞的裂解与肿瘤细胞上TF表达量的关系结果图。
图8显示的是，TF-TCB介导的T细胞增殖结果图。
图9显示的是，AsPC-1细胞/PBMC混接模型中不同药物对肿瘤生长的抑制作用结果图。
图10显示的是，AsPC-1细胞/PBMC混接模型中不同药物对小鼠体重的作用结果图。
图11显示的是，AsPC-1肿瘤-PBMC尾静脉输入模型中不同药物对肿瘤生长的抑制作用结果图。
图12显示的是，NCI-H292肿瘤-PBMC尾静脉输入模型中不同药物对肿瘤生长的抑制作用结果图。
图13显示的是，NCI-H292肿瘤-PBMC尾静脉输入模型中肿瘤的免疫组化(IHC)分析结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常是指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的蛋白。本申请“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架可以包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。抗原结合蛋白的实例可以包括但不限于：人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，dAb，VHH，IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；和/或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中，术语“药物组合”通常是指两种或以上的药物活性成分的组合。例如，本申请的药物组合还可以包括一种包含了两种或以上的药物活性成分的物质，例如多特异性抗体。
在本申请中，术语“组织因子(tissue factor，TF)”通常是指一种蛋白分子。组织因子也称为因子III，促凝血酶原激酶或CD142，是一种47kDa跨膜糖蛋白，属于细胞因子受体超家族的II类。在本申请中，所述组织因子可以包括人组织因子或其变体、同种型以及物种同源物，以及与组织因子具有至少一个共同表位的类似物。组织因子的UniProt登录号可以为P13726。本申请的组织因子蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含组织因子蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“CD3”通常是指一种蛋白分子。在本申请中，所述CD3可以包括人CD3(hCD3)或其变体、同种型以及物种同源物，以及与hCD3具有至少一个共同表位的类似物。hCD3的gamma链的UniProt登录号可以为P09693。本申请的CD3蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含CD3蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“结合分子”通常是指一种具有结合能力的分子或分子片段。例如，本申请的结合分子可以是指抗原结合分子。当两种及以上的结合分子直接或间接连接时，本申请的结合分子也可以指这种连接后物质上各自的结合区段，例如抗原结合区。
在本申请中，术语“纳武单抗(Nivolumab)”通常是指一种抗原结合蛋白。例如，本申请的纳武单抗(Nivolumab)可以是指包含纳武单抗(Nivolumab)的HCDR1-3以及LCDR1-3的抗体或其抗原结合片段。。例如，本申请的纳武单抗(Nivolumab)可以是指包含纳武单抗(Nivolumab)的重链可变区以及轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。例如，纳武单抗(Nivolumab)的序列信息可以记载在PCT专利申请WO2006121168A1中。
在本申请中，术语“免疫检查点抑制剂”通常是指能够抑制免疫检查点生物学活性的任何试剂。在本申请中，所述免疫检查点(immune checkpoint)可以为在免疫系统中起抑制作用的调节分子。所述免疫检查点可以表达于免疫细胞上，抑制免疫细胞的功能。所述免疫检查点可以与肿瘤免疫逃逸相关。在本申请中，所述免疫检查点可以包括PD-1和/或PD-L1。在本申请中，所述抑制剂可以包括能够抑制配体和受体(例如PD-1和PD-L1)之间相互作用的任何试剂。在本申请中，所述试剂可以为化学试剂，也可以为蛋白质和/或多肽。例如，所述试剂可以包括抗体或其抗原结合片段。
在本申请中，术语“PD-1”通常是指CD28家族的免疫抑制受体。PD-1可以表达于预先活化的T细胞，并与两个配体PD-L1和/或PD-L2结合。在本申请中，所述PD-1可以包括人PD-1(hPD-1)或其变体、同种型以及物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。hPD-1的GenBank登录号为U64863。本申请的PD-1蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含PD-1蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“PD-L1”通常是指PD-1的一种细胞表面糖蛋白配体之一。所述PD-L1可以与PD-1结合。所述PD-L1可以与PD-1结合时下调T细胞的活化和/或细胞因子的分泌。在本申请中，所述PD-L1可以包括人PD-L(hPD-L1)或其变体、同种型以及物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。hPD-L1的GenBank登录号为Q9NZQ7。本申请的PD-L1蛋白还可以涵盖其功能活性片段，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含PD-L1蛋白功能活性片段的蛋白。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常是指抗体可变结构域中的区域，其序列可以是高度可变的和/或形成结构定义环。例如，抗体可以包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知。例如，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列编号可以按照IMGT编号方案。例如，所述抗原结合蛋白的CDR可以根据Kabat编号系统确定。
在本申请中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。例如，天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常是指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常可以是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且可以包含抗原结合位点。在本申请中，术语“可变”通常是指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原可以结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性可以并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它可以通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分可以称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自可以包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR可以通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成。
在本申请中，术语“抗体”通常是指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语可以包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也可以包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、VHH、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合本申请抗原)的其它抗体片段。通常，这样的片段可以包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元可以是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体可以由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体可以包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般可以为约150,000道尔顿。每个L链可以通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链可以通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还可以具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端可以具有重链可变区(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端可以具有轻链可变区(VL)，在其另一端可以具有恒定结构域。VL与VH可以对应，且轻链恒定区(CL)与重链的第一恒定结构域(CH1)可以相对应。特定的氨基酸残基可以被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL可以配对一起形成单个抗原结合位点。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链恒定区(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG例如IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4，和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指具有特异结合抗原(例如，本申请的抗原)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常是指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。
在本申请中，术语“F(ab)2”通常是指抗体的抗原结合片段。例如，F(ab)2可以是由两个Fab片段连接的。
在本申请中，术语“Fab′”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“F(ab')2”通常是指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv片段”通常是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域或VL域组成的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,TrendsBiotechnol.,2003,21(11)：484-490。
在本申请中，术语“VHH”通常是指包含重链抗体的可变抗原结合结构域的抗体(参见Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体可以是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”可以表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”可以保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人源抗体可能含有鼠糖链。类似地，“鼠源抗体”、“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成全人源抗体。可用于制造抗体的示例性技术是本领域已知的。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。本申请的“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的支架或构架部分。
在本申请中，术语“多肽分子”和“多肽”、“肽”可以互换使用，通常是指氨基酸残基的聚合物。术语“融合蛋白”通常是指具有至少两个共价连接在一起的部分的多肽。其中每个部分可以是具有不同特性的多肽。该特性可以是生物学性质，例如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质，例如与靶分子的结合，反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键或通过肽接头直接连接。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。一种载体可能含有多种控制表达的元件。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指所述其他试剂(例如，化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述抗体或其抗原结合片段缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂等合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下可以对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括合适的物质。指药剂学可接受的载剂(carrier)与基因工程中用于插入核酸的载体(vector)通常并不是同一物质。
在本申请中，术语“直接相连”可以与术语“间接相连”相对，术语“直接相连”通常是指直接连接。例如，所述直接相连可以为物质间没有间隔子而直接相连的情况。所述间隔子可以是连接子。例如，所述连接子可以为肽连接子。术语“间接相连”通常是指物质间不直接相连的情况。例如，所述间接相连可以为通过间隔子而连接的情况。例如，在本申请所述的分离的抗原结合蛋白中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端可以直接或间接相连。
在本申请中，术语“di-scFv”通常是指二价scFv，例如可以是两个scFv分子通过短接头缀合的分子。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常是指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合本申请抗原的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。例如，所述变体也可以为涵盖其功能活性片段的多肽，不限于在细胞中发生的加工和/或修饰后产生的包含所述蛋白功能活性片段的多肽。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合本申请抗原的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
一方面，本申请提供一种药物组合，所述药物组合可以包含组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子。例如，在本申请的药物组合中，组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子可以以分离的形式存在；例如，在本申请的药物组合中，组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子可以直接或间接连接，构成一种多特异性的抗原结合蛋白，如双特异性结合蛋白。例如，当本申请的药物组合为连接后多特异性的抗原结合蛋白的形式时，组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子也可以分别指这种多特异性的抗原结合蛋白的组织因子(TF)结合域(区)和CD3结合域(区)。
例如，所述组织因子结合分子可以包含多肽。例如，分离的多肽或多肽片段。
例如，所述组织因子结合分子可以包含组织因子特异性结合多肽。
例如，所述组织因子结合分子可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述组织因子结合分子的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
例如，所述组织因子结合分子的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
例如，所述组织因子结合分子的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
例如，所述组织因子结合分子或组织因子结合域可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示HCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示HCDR3。例如，所述组织因子结合分子或组织因子结合域可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述组织因子结合分子或组织因子结合域的重链可变区(VH)的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：7所示。
例如，所述组织因子结合分子的所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
例如，所述组织因子结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述组织因子结合分子的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
例如，所述组织因子结合分子的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
例如，所述组织因子结合分子的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
例如，所述组织因子结合分子或组织因子结合域可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的LCDR3。例如，所述组织因子结合分子或组织因子结合域包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述组织因子结合分子或组织因子结合域的轻链可变区(VL)可以如SEQ ID NO：8所示。
例如，所述组织因子结合分子的所述VL的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：8所示。
例如，所述组织因子结合分子或组织因子结合域可以包含氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的LCDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的LCDR3。例如，所述组织因子结合分子或组织因子结合域可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)、重链互补决定区3(HCDR3)以及轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述组织因子结合分子或组织因子结合域的重链可变区(VH)的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：7所示，以及所述组织因子结合分子或组织因子结合域的轻链可变区(VL)可以如SEQ ID NO：8所示。
例如，所述组织因子结合分子的所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，以及所述组织因子结合分子的所述VL的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：8所示。
例如，所述组织因子结合分子可以包含抗体重链恒定区。
例如，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区可以包含源自人抗体的重链恒定区。
例如，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区可以包含源自IgG的重链恒定区。
例如，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区的氨基酸序列可以如SEQ IDNO：9所示。
例如，所述组织因子结合分子可以包含抗体轻链恒定区。
例如，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链恒定区可以包含源自人抗体的轻链恒定区。
例如，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列可以如SEQ IDNO：10所示。
例如，所述组织因子结合分子可以包含抗体重链，所述组织因子结合分子的所述抗体重链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：23所示。
例如，所述组织因子结合分子可以包含抗体轻链，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：20所示。
例如，所述组织因子结合分子可以包含抗体或其抗原结合片段。
例如，其中所述抗体可以包含单克隆抗体。例如，其中所述抗体可以选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。例如，其中所述抗原结合片段可以选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
例如，所述CD3结合分子可以包含多肽。
例如，所述CD3结合分子可以包含CD3特异性结合多肽。
例如，所述CD3结合分子可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述CD3结合分子的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。
例如，所述CD3结合分子的所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：12所示。
例如，所述CD3结合分子的所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：11所示。
例如，所述CD3结合分子或CD3结合域可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示、所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：12所示以及所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：11所示。例如，所述CD3结合分子或CD3结合域可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述CD3结合分子或CD3结合域的所述VH的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：17所示。
例如，所述CD3结合分子的所述VH的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：17所示。
例如，所述CD3结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述CD3结合分子的所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：16所示。
例如，所述CD3结合分子的所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：15所示。
例如，所述CD3结合分子的所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：14所示。
例如，所述CD3结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ IDNO：16所示、所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：15所示以及所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：14所示。例如，所述CD3结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述CD3结合分子的所述VL的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：18所示。
例如，所述CD3结合分子的所述VL的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：18所示。
例如，所述CD3结合分子或CD3结合域可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)以及轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示、所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：12所示、所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：11所示以及所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQID NO：16所示、所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：15所示以及所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：14所示。例如，所述CD3结合分子或CD3结合域可以包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)以及轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述CD3结合分子或CD3结合域的所述VH的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：17所示，所述CD3结合分子的所述VL的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：18所示。
例如，所述CD3结合分子的所述VH的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：17所示，例如，所述CD3结合分子的所述VL的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：18所示。
例如，所述CD3结合分子的所述VH可以与CD3结合分子的所述VL直接或间接连接。
例如，所述CD3结合分子的所述VH的C端可以与CD3结合分子的所述VL的N端直接或间接连接。
例如，所述间接连接可以包含通过连接体连接。
例如，所述连接体的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：19所示。
例如，所述CD3结合分子可以包含抗体或其抗原结合片段。例如，其中所述抗体可以包含单克隆抗体。例如，其中所述抗体可以选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。例如，其中所述抗原结合片段可以选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
例如，本申请可以提供一种多特异性结合蛋白，如双特异性结合蛋白，作为药物组合的一种形式。其中，所述多特异性结合蛋白可以包含组织因子结合分子与CD3结合分子。或者也可以称，所述多特异性结合蛋白可以包含组织因子结合域与CD3结合域。当组织因子结合分子与CD3结合分子以连接形式存在时，所述术语“分子”与“域”可以相互替换使用。
例如，所述组织因子结合分子可以与CD3结合分子直接或间接连接。
例如，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链可以与CD3结合分子直接或间接连接。
例如，所述组织因子结合分子可以与CD3结合分子的所述VH直接或间接连接。
例如，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链的C端可以与CD3结合分子的所述VH的N端直接或间接连接。
例如，所述间接连接可以包含通过连接体连接。
例如，所述连接体的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：21所示。
例如，所述药物组合可以包含双特异性抗体或其抗原结合片段。
例如，所述药物组合可以包含四价的抗体或其抗原结合片段。
例如，本申请的多特异性结合蛋白的重链全长的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：23所示，核苷酸序列可以如SEQ ID NO：25所示。
例如，本申请的多特异性结合蛋白的轻链全长从N端到C端可以依次为SEQ ID NO：20所示TF结合域的抗体轻链-SEQ ID NO：21所示连接体2-SEQ ID NO：17所示CD3结合域的VH-SEQ ID NO：19所示连接体1-SEQ ID NO：18所示CD3结合域的VL。
例如，本申请的多特异性结合蛋白的轻链全长从N端到C端可以依次为SEQ ID NO：20所示TF结合域的抗体轻链-SEQ ID NO：21所示连接体2-SEQ ID NO：22所示CD3结合域。
例如，本申请的多特异性结合蛋白的轻链全长的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：24所示，核苷酸序列可以如SEQ ID NO：26所示。
例如，本申请还提供一种多特异性结合蛋白，其重链全长的氨基酸序列可以如SEQID NO：33所示，轻链全长的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：34所示。例如，这种多特异性结合蛋白可以具有CD3与CD22的双特异性。例如，这种多特异性结合蛋白可以包含SEQ ID NO：31所示重链可变区、SEQ ID NO：32所示轻链可变区以及CD3结合片段。
另一方面，本申请还提供一种分离的抗原结合蛋白，例如双特异性结合蛋白。抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述CDR可以由Kabat编号方案来确定。
例如，本申请的药物组合可以能够以约0.9nM或更低的KD值结合组织因子或其功能活性片段。例如，本申请的药物组合可以能够以约15nM或更低的KD值结合CD3或其功能活性片段。
例如，本申请的药物组合可以能够以约5.3nM或更低的EC50值结合组织因子或其功能活性片段。例如，本申请的药物组合可以能够以约11nM或更低的EC50值结合CD3或其功能活性片段。例如，本申请的药物组合可以能够介导组织因子阳性的细胞与CD3阳性的细胞间聚集。
例如，本申请的药物组合可以能够促进免疫细胞的激活。例如，本申请的免疫细胞可以包含外周血单个核细胞。例如，本申请的免疫细胞可以包含淋巴细胞。例如，本申请的免疫细胞可以包含T淋巴细胞。例如，本申请的药物组合可以能够提高CD69阳性细胞在CD4阳性和/或CD8阳性细胞中的比例。
例如，本申请的药物组合可以能够促进细胞因子释放。例如，本申请的细胞因子可以包含IL-2和/或IFNγ。
例如，本申请的药物组合可以提高靶细胞杀伤率。例如，本申请的药物组合可以提高T细胞对靶细胞杀伤率。例如，本申请的药物组合可以以约1.8ng/ml或更低的EC50值杀伤所述靶细胞。例如，本申请的药物组合可以以约0.01ng/ml至约1.8ng/ml或更低的EC50值杀伤所述靶细胞。
例如，本申请的靶细胞可以包含肿瘤细胞。例如，本申请的靶细胞可以包含组织因子阳性细胞。例如，本申请的药物组合可以促进免疫细胞增殖。例如，本申请的药物组合可以抑制肿瘤生长。
在另一方面，本申请还提供了一种多肽，其可以包含本申请的药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子。如本申请的多肽，其包含融合蛋白。例如，本申请的多肽可以包含本申请的TF结合域和CD3结合域。
在另一方面，本申请还提供了一种核酸分子，其可以编码本申请的药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或本申请的多肽。
在另一方面，本申请还提供了一种载体，其可以包含本申请的核酸分子。
在另一方面，本申请还提供了一种免疫缀合物，其可以包含本申请药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或本申请的多肽。
在另一方面，本申请还提供了一种细胞，其可以包含和/或表达本申请药物组合、包含和/或表达本申请的多肽、包含本申请的核酸分子、包含本申请的载体和/或包含本申请的免疫缀合物。
在另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其可以包含本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物和/或本申请的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
如本申请的药物组合物，所述药物组合还可以包含外周血单个核细胞。
如本申请的药物组合物，所述药物组合还可以包含免疫检查点抑制剂。
如本申请的药物组合物，所述免疫检查点抑制剂可以包含PD-1抑制剂。
如本申请的药物组合物，所述PD-1抑制剂可以包含纳武单抗(Nivolumab)的HCDR1-3以及LCDR1-3。
如本申请的药物组合物，PD-1抑制剂可以包含纳武单抗(Nivolumab)的VH以及VL。
如本申请的药物组合物，所述PD-1抑制剂可以包含纳武单抗(Nivolumab)。例如，纳武单抗(Nivolumab)的轻链可变区和重链可变区以及CDR区的序列信息可以记载在PCT专利申请WO2006121168A1中。
如本申请的药物组合物，其中所述的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子与所述免疫检查点抑制剂在所述药物组合物中可以相互混合或相互不混合。
在另一方面，本申请还提供了一种试剂盒，其可以包含本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物。
在另一方面，本申请还提供了制备本申请药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或本申请的多肽的方法，可以包含在使得所述组织因子(TF)结合分子、所述CD3结合分子和/或所述多肽表达的条件下，培养本申请的细胞。
在另一方面，本申请还提供了本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞和/或本申请的药物组合物在制备试剂盒中的用途。
在另一方面，本申请还提供了本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物可以用于预防和/或治疗疾病和/或病症。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含增生性疾病。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含实体瘤和/或血液瘤。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含组织因子阳性肿瘤。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含组织因子高表达肿瘤。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以选自以下组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌。
在另一方面，本申请还提供了本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒，其可以用于预防和/或治疗疾病和/或病症。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含增生性疾病。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含实体瘤和/或血液瘤。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含组织因子阳性肿瘤。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以包含组织因子高表达肿瘤。根据本申请的用途，其中所述疾病和/或病症可以选自以下组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌。
在另一方面，本申请还提供了一种预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，可以包括向有需要的受试者施用本申请药物组合、本申请的多肽、本申请的核酸分子、本申请的载体、本申请的免疫缀合物、本申请的细胞、本申请的药物组合物和/或本申请的试剂盒。根据本申请的方法，其中所述疾病和/或病症可以包含增生性疾病。根据本申请的方法，其中所述疾病和/或病症可以包含实体瘤和/或血液瘤。根据本申请的方法，其中所述疾病和/或病症可以包含组织因子阳性肿瘤。根据本申请的方法，其中所述疾病和/或病症可以包含组织因子高表达肿瘤。根据本申请的方法，其中所述疾病和/或病症可以选自以下组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌。
实施方案
1.一种药物组合，其包含组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子。
2.如实施方案1所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含多肽。
3.如实施方案1-2中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含组织因子特异性结合多肽。
4.如实施方案1-3中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述组织因子结合分子的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.如实施方案4所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
6.如实施方案4-5中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.如实施方案4-6中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
8.如实施方案1-7中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述组织因子结合分子的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
9.如实施方案8所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
10.如实施方案8-9中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
11.如实施方案8-10中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
12.如实施方案1-11中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含抗体重链恒定区。
13.如实施方案12所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区包含源自人抗体的重链恒定区。
14.如实施方案12-13中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区包含源自IgG的重链恒定区。
15.如实施方案12-14中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
16.如实施方案1-15中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含抗体轻链恒定区。
17.如实施方案16所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链恒定区包含源自人抗体的轻链恒定区。
18.如实施方案16-17中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
19.如实施方案1-18中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含抗体重链，所述组织因子结合分子的所述抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
20.如实施方案1-19中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含抗体轻链，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
21.如实施方案1-20中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含抗体或其抗原结合片段。
22.如实施方案21所述的药物组合，其中所述抗体包含单克隆抗体。
23.如实施方案21-22中任一项所述的药物组合，其中所述抗体选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
24.如实施方案21-23中任一项所述的药物组合，其中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
25.如实施方案1-24中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含多肽。
26.如实施方案1-25中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含CD3特异性结合多肽。
27.如实施方案1-26中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含重链可变区(VH)的重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述CD3结合分子的所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。
28.如实施方案27所述的药物组合，所述CD3结合分子的所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
29.如实施方案27-28中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子的所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
30.如实施方案27-29中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子的所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
31.如实施方案1-30中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含轻链可变区(VL)的轻链互补决定区1(LCDR1)，轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)，所述CD3结合分子的所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
32.如实施方案31所述的药物组合，所述CD3结合分子的所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
33.如实施方案31-32中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子的所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
34.如实施方案31-33中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子的所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
35.如实施方案1-34中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含VH和VL，所述CD3结合分子的所述VH与CD3结合分子的所述VL直接或间接连接。
36.如实施方案1-35中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含VH和VL，所述CD3结合分子的所述VH的C端与CD3结合分子的所述VL的N端直接或间接连接。
37.如实施方案36所述的药物组合，所述间接连接包含通过连接体连接。
38.如实施方案37所述的药物组合，所述连接体的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
39.如实施方案1-38中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含抗体或其抗原结合片段。
40.如实施方案39所述的药物组合，其中所述抗体包含单克隆抗体。
41.如实施方案39-40中任一项所述的药物组合，其中所述抗体选自以下组中的一种或多种：鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
42.如实施方案39-41中任一项所述的药物组合，其中所述抗原结合片段选自以下组中的一种或多种：Fab，Fab′，Fv片段，F(ab')2，F(ab)2，scFv，di-scFv，VHH和dAb。
43.如实施方案1-42中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子与CD3结合分子直接或间接连接。
44.如实施方案1-43中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含抗体轻链，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链与所述CD3结合分子直接或间接连接。
45.如实施方案1-44中任一项所述的药物组合，所述CD3结合分子包含VH，所述组织因子结合分子与所述CD3结合分子的所述VH直接或间接连接。
46.如实施方案1-45中任一项所述的药物组合，所述组织因子结合分子包含抗体轻链，所述CD3结合分子包含VH，所述组织因子结合分子的所述抗体轻链的C端与CD3结合分子的所述VH的N端直接或间接连接。
47.如实施方案46所述的药物组合，所述间接连接包含通过连接体连接。
48.如实施方案47所述的药物组合，所述连接体的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
49.如实施方案1-48中任一项所述的药物组合，所述药物组合包含双特异性抗体或其抗原结合片段。
50.如实施方案1-49中任一项所述的药物组合，所述药物组合包含四价的抗体或其抗原结合片段。
51.如实施方案1-50中任一项所述的药物组合，所述药物组合能够介导组织因子阳性的细胞与CD3阳性的细胞间聚集。
52.如实施方案1-51中任一项所述的药物组合，所述药物组合能够促进T细胞的激活。
53.如实施方案1-52中任一项所述的药物组合，所述药物组合能够促进细胞因子释放。
54.如实施方案53所述的药物组合，所述细胞因子包含IL-2和/或IFNγ。
55.如实施方案1-54中任一项所述的药物组合，所述药物组合能够提高T细胞对靶细胞杀伤率。
56.如实施方案55所述的药物组合，所述靶细胞包含肿瘤细胞。
57.如实施方案55-56中任一项所述的药物组合，所述靶细胞包含组织因子表达阳性细胞。
58.如实施方案1-57中任一项所述的药物组合，所述药物组合能够促进T细胞增殖。
59.如实施方案1-58中任一项所述的药物组合，所述药物组合能够抑制肿瘤生长。
60.一种多肽，其包含实施方案1-59中任一项所述药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子。
61.如实施方案60所述的多肽，其包含融合蛋白。
62.一种核酸分子，其编码实施方案1-59中任一项所述药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或实施方案60-61中任一项所述的多肽。
63.一种载体，其包含实施方案62所述的核酸分子。
64.一种免疫缀合物，其包含实施方案1-59中任一项所述药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或实施方案60-61中任一项所述的多肽。
65.一种细胞，其包含和/或表达实施方案1-59中任一项所述药物组合、包含和/或表达实施方案60-61中任一项所述的多肽、包含实施方案62所述的核酸分子、包含实施方案63所述的载体和/或包含实施方案64所述的免疫缀合物。
66.一种药物组合物，其包含实施方案1-59中任一项所述药物组合、实施方案60-61中任一项所述的多肽、实施方案62所述的核酸分子、实施方案63所述的载体、实施方案64所述的免疫缀合物和/或实施方案65所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
67.如实施方案66所述的药物组合物，所述药物组合还包含外周血单个核细胞。
68.如实施方案66-67中任一项所述的药物组合物，所述药物组合还包含免疫检查点抑制剂。
69.如实施方案68所述的药物组合物，所述免疫检查点抑制剂包含PD-1抑制剂。
70.如实施方案69所述的药物组合物，所述PD-1抑制剂包含纳武单抗(Nivolumab)的HCDR1-3以及LCDR1-3。
71.如实施方案69-70中任一项所述的药物组合物，所述PD-1抑制剂包含纳武单抗(Nivolumab)的VH以及VL。
72.如实施方案69-71中任一项所述的药物组合物，所述PD-1抑制剂包含纳武单抗(Nivolumab)。
73.如实施方案68-72中任一项所述的药物组合物，其中所述的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子与所述免疫检查点抑制剂在所述药物组合物中相互混合或相互不混合。
74.一种试剂盒，其包含实施方案1-59中任一项所述药物组合、实施方案60-61中任一项所述的多肽、实施方案62所述的核酸分子、实施方案63所述的载体、实施方案64所述的免疫缀合物、实施方案65所述的细胞和/或实施方案66-73中任一项所述的药物组合物。
75.制备实施方案1-59中任一项所述药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或实施方案60-61中任一项所述的多肽的方法，包含在使得所述组织因子(TF)结合分子、所述CD3结合分子和/或所述多肽表达的条件下，培养实施方案65所述的细胞。
76.实施方案1-59中任一项所述药物组合、实施方案60-61中任一项所述的多肽、实施方案62所述的核酸分子、实施方案63所述的载体、实施方案64所述的免疫缀合物、实施方案65所述的细胞和/或实施方案66-73中任一项所述的药物组合物在制备试剂盒中的用途。
77.实施方案1-59中任一项所述药物组合、实施方案60-61中任一项所述的多肽、实施方案62所述的核酸分子、实施方案63所述的载体、实施方案64所述的免疫缀合物、实施方案65所述的细胞、实施方案66-73中任一项所述的药物组合物和/或实施方案74所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
78.根据实施方案77所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含增生性疾病。
79.根据实施方案77-78中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含实体瘤和/或血液瘤。
80.根据实施方案77-79中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含组织因子阳性肿瘤。
81.根据实施方案77-80中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包含组织因子高表达肿瘤。
82.根据实施方案77-81中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症选自以下组：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的产品、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1
本申请的一种抗原结合蛋白(TF-TCB)制备
实验步骤：
TF-TCB的基因(TF-HC-D和TF-LC-CD3-scFv)序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成。将目的基因通过PCR的方式从原始的载体上克隆下来。引物由Invitrogen公司(中国)合成，目的基因和对应的引物如下：
Figure BDA0003096528980000291
将合成的含有目的基因的载体用蒸馏水溶解并稀释成5ng/μL，将合成好的引物用蒸馏水溶解并稀释成10μM，然后在200μL的PCR管中配置如下的体系：
目的基因所在质粒 1μL
Primerstar MAX(2×) 10.0μL
前引物 1.0μL
后引物 1.0μL
超纯水 7μL
共计 20.0μL
混合均匀后置于PCR仪中启动反应，反应程序如下：
Figure BDA0003096528980000292
反应完成后加入4μL 6x loading buffer混合均匀，并加入已经凝固好的含荧光染料(Goldenview)的1％琼脂糖凝胶中电泳分离，电泳完成后凝胶成像系统下观察DNA条带的大小，根据目的基因的大小将对应大小的目的片段切下来并使用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。在酶标仪上测定目的片段的浓度，用于下一步的连接反应。
pCDNA 3.4载体的酶切
选择在pCDNA 3.4载体的Hind III和Nhe I之间插入目的片段。酶切体系如下：
pCDNA 3.4载体 1500ng
快切酶对应的Buffer 10× 5.0μL
Hind III 1.0μL
Nhe I 1.0μL
蒸馏水 43μL
共计 50.0μL
在冰上在一个200μL PCR管中加入上述反应体系。混合均匀后将EP管放到37℃恒温水浴锅中酶切50分钟，酶切完成后，将该体系进行琼脂糖凝胶中电泳分离，电泳完成后凝胶成像系统下观察DNA条带的大小，切割大小在6000bp左右的条带并使用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。在酶标仪上测定切好的载体的浓度，用于下一步的连接反应。
将PCR克隆获得的目的基因片段和酶切后的载体进行连接
因为在目的片段克隆的时候引入了和载体的同源序列，因此采用同源重组的方法进行连接。使用诺唯赞的同源重组连接酶试剂盒。
连接体系(6μL)如下：
目的基因片段 0.06pM
酶切载体 0.03pM
Buffer(5x) 1.2μL
同源重组连接酶(10x) 0.6μL
超纯水 4.2μL
Total 6μL
在一个200μL PCR管中加入上述反应体系。混合均匀后置于PCR仪中37℃下连接30min，结束后冰上放置5min。
连接产物转化感受态大肠杆菌
(1)从-80℃的冰箱中取出DH5α感受态并放置在冰上，将1.1.4获得的连接产物在超净台中加入到DH5α感受态中，轻弹混匀，并在冰上放置30min.
(2)将Ampicillin抗性的LB平板从4℃拿出，并放到37℃培养箱中预热。
(3)将连接产物和DH5α感受态混合物轻放到42℃恒温水浴锅中，热激90s。热激结束后冰上放置5min。
(4)将上述混合物在超净台中加入到Ampicillin抗性的LB平板中，并用无菌涂布棒将混合物在平板中涂布均匀。
(5)将平板倒置放置在37℃的培养箱中过夜培养。
(6)次日挑取单个菌落并加入到500μL Ampicillin抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min培养5h。随后，取出100μL用于测序，剩余的加入200μL无菌的60％的甘油，混匀后放到-80℃中保存。
无内毒素质粒大量制备
将测序成功的阳性克隆按照OMEGA的无内毒素大抽质粒试剂盒进行质粒的抽提。将抽提好的质粒用酶标仪进行浓度的测定，并保存在-20℃冰箱中。
聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences)介导的瞬时转染FreeStyle 293-F细胞通过瞬时转染FreeStyle293-F细胞(Invitrogen)来表达抗体。具体步骤如下：
(1)转染前24h将FreeStyle 293-F细胞传代至6×105cells/mL；
(2)转染开始时测定细胞的密度和活力，要求细胞的活率大于95％，用FreeStyle293 Expression Medium(GE healthcare)将细胞稀释至1×106cells/mL。
(3)按照0.6μg/106cells计算所需要的质粒的量，在无菌离心管中用FreeStyle293 Expression Medium将质粒稀释至40ng/mL左右，震荡混匀5s；
(4)按照DNA:PEI为1:4(质量比)确定PEI量，加入质粒和培养基的混合物中，涡旋混匀15s，室温静置包裹10-15min，之后将混合物加入细胞中；
(5)在125rpm/min，37℃，5％CO2摇床上培养4-6天左右，至细胞活力下降到70％时，4℃下3,000rpm/min离心10min收集细胞培养上清，将上清在4℃下6,500rpm/min离心30min进一步去除上清中的细胞碎片。
Protein A亲和层析
抗体的纯化采用一步Protein A亲和层析纯化。Protein A亲和层析的缓冲液和待纯化的样品均通过0.22μm的滤膜过滤后使用。纯化采用AKTA快速液相系统(GEhealthcare)具体步骤如下：
(1)整个过程流速设定为1ml/min。将A泵放入超纯水中，B泵调为0％，用超纯水将体系中气体，保存液等排出，冲洗5个系统体积。将protein A的预装柱装入系统，冲洗柱子5个柱体积，去除里面的乙醇；
(2)将A泵放置于Protein A洗脱缓冲液(0.1M的柠檬酸缓冲液，pH 3)中，冲洗柱子，直至OD280的吸收稳定。
(3)A泵置于Protein A上柱缓冲液(20mM的磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.2)中，平衡柱子直至OD280吸收稳定；
(4)A泵置于细胞培养上清，流速设定为1mL/min；
(5)上样完成后，A泵置于Protein A上柱子缓冲液中，平衡柱子，直到OD280吸收值稳定；
(6)将A泵置于Protein A清洗缓冲液(0.1M的柠檬酸缓冲液，pH 5)中冲洗柱子，直到OD280吸收值稳定，以去除非特异性结合；
(7)将A泵置于Protein A洗脱缓冲液(0.1M的柠檬酸缓冲液，pH 2.8)中冲洗柱子；
(8)根据OD280的吸收值对洗脱峰进行收集，每2mL收集一管，管中预先加入400μL的中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)；
(9)将A泵放入100mM NaOH溶液中清洗柱子，清洗10倍柱体积；
(10)A泵置于Protein A上柱缓冲液(20mM的磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.2)中，平衡柱子直至OD280吸收稳定；
(11)将A泵放入超纯水中，1mL/min流速10倍柱体积清洗柱子；
(12)将A泵置于20％乙醇中保存柱子，冲洗10倍柱体积，柱子在4℃下长期保存；
每个收集组分，分别制备还原和非还原样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化结果。
实验结果
图1显示的是，本申请的一种抗原结合蛋白(TF-TCB)的结构示意图。
本申请的一种抗原结合蛋白TF-TCB是一个可以同时靶向T细胞上的CD3抗原和肿瘤细胞上TF抗原的双特异性抗体。靶向CD3抗原的抗体重链可变区的氨基酸序列可以如SEQID NO：17所示，靶向CD3抗原的抗体轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：18所示。TF-TCB靶向TF的抗体重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：7所示，TF-TCB靶向TF的抗体轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO：8所示。TF-TCB的结构中采用了IgG-[L]-scFv的结构，在IgG1的两条轻链的C端引入了两个scFv结构。通过引入链间二硫键(轻链可变区的G100C和重链可变区中的G44C)来稳定IgG1重链和轻链的相互作用，scFv中轻链和重链相互作用的稳定也采用这种方法。为了消除Fc介导的T细胞的非特异性激活，可以在TF-TCB的Fc区域引入P329G LALA突变(Leu234Ala/Leu235Ala，Pro329Gly)。
TF-TCB的两条链，分别命名为TF-HC-D(核苷酸序列可以如SEQ ID NO：25所示)和TF-LC-CD3-scFv(两条链中含有scFv的那一条链，核苷酸序列可以如SEQ ID NO：26所示)。
将TF-LC-CD3-scFv和TF-HC-D的基因插入到pCDNA 3.4载体上，并通过PEI介导的瞬时转染FreeStyle 293-F细胞来表达TF-TCB抗体。最后通过Protein A亲和层析来捕获和纯化上清中的TF-TCB。图2显示的是，TF-TCB可以被有效的表达，瞬时表达产量约为10mg/l；经过一步Protein A亲和层析后，洗脱液中TF-TCB的纯度约为82％。在还原条件下，TF-TCB仅在约50kDa处出现一个谱带，因为重链和轻链均具有相似的计算分子量。
实施例2
本申请的抗原结合蛋白的体外活性表征，抗体亲和力分析
实验步骤
表面等离子共振
通过表面等离子共振(Biacore 8K，GE Healthcare)评价分子水平上抗体和抗原的亲和力和结合动力学。
(1)Biacore 8K中安装CM-5芯片；
(2)固定抗原：用10mM醋酸钠(pH 4.5，GE Healthcare)将CD3D×CD3E异二聚体(义翘神州)和TF抗原(Peprotech)稀释到1ug/ml，使用常规的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)胺偶联方案将抗原固定在CM5芯片表面上。固定后抗原的表面密度为100至300RU。流动相使用过滤和脱气处理的PBS缓冲液。流速为10μl/min。
(3)抗体结合和解离分析：用HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)将待分析物(TF-TCB和TF-011，其中TF-011的重链氨基酸序列可以如SEQ ID NO：29所示，其中TF-011的轻链氨基酸序列可以如SEQ ID NO：30所示)进行2倍的梯度稀释，将HBS-EP缓冲液用作阴性对照。随后将稀释后的待分析物和阴性对照流经芯片，结合200s。随后解离180s，流速为30μl/min。
(4)芯片再生：用再生试剂10mM Glycine溶液(pH1.5，GE Healthcare)进行芯片的再生，再生时间30s，流速为30μl/min。再生处理之后用HBS-EP缓冲液平衡芯片，随后分析下一个样品。
(5)采集数据，以1∶1的结合模型计算结合速率Ka，解离速率Kd和亲和力KD。
流式细胞术
通过流式细胞术测定抗体与细胞上抗原的结合能力，具体步骤如下。
(1)将MDA-MB-231细胞(250,000个细胞/孔)或Jurkat细胞(250,000个细胞/孔)重悬于FACS缓冲液(PBS+10％FBS)后，置于96孔圆底板(Corning)中。
(2)将待测抗体用FACS缓冲液3倍梯度稀释，制备一系列3倍稀释的样品，并加到细胞中，保证总体积是100μl。
(3)在冰上孵育30分钟后，将细胞用FACS缓冲液洗涤3次，并重悬于100μl的含有二抗的FACS缓冲液中，其中二抗为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG(H+L)的多克隆抗体(Invitrogen)。
(4)将细胞在冰上再孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤3次，并重悬于200μl的FACS缓冲液中，接着在流式细胞仪(Beckmann)上分析细胞的平均荧光强度(meanfluorescence intensity，MFI)。
(5)基于MFI在GraphPad Prism中使用非线性回归分析计算得出结合EC50值。
细胞交联分析
将CD3+的Jurkat细胞和TF+的AsPC-1细胞分别用PKH26和羧基荧光素二乙酸丁二酰亚胺酯(CFSE)标记。
PKH26标记CD3+的Jurkat细胞
采用的试剂盒为Sigma的PKH26标记试剂盒，具体步骤如下：
(1)1500rpm/min离心5min收集处于对数生长期的Jurkat细胞。
(2)用RPMI1640培养基(Gibco)重悬细胞后计数，取出需要的细胞量并1500rpm/min离心5min，小心吸去培养基上清，保证细胞上剩余培养基不超过25μl；
(3)加0.5ml试剂盒提供的稀释液C并重悬细胞；
(4)用0.5ml稀释液C稀释PKH26至浓度为8μM，置于离心管中；
(5)将0.5ml的细胞加入到0.5ml的PKH26稀释液中，并混匀样品；
(6)室温孵育2min，上下温柔的颠倒离心管以保证充分混匀；
(7)加入等量FBS终止细胞标记，室温孵育1min；
(8)加入等量含完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)，1500rpm/min离心5min收集细胞；
(9)将细胞用完全培养基洗涤三次，用FACS缓冲液重悬，计数后调整细胞密度为1×106cells/ml。
CFSE标记AsPC-1细胞
采用的试剂盒为Invitrogen的CFSE标记试剂盒，具体步骤如下：
(1)将处于对数生长期的AsPC-1细胞用PBS洗一遍后加入胰酶，37℃下消化18min，加入完全培养基终止消化并1000rpm/min离心3min收集细胞，然后将细胞重悬于室温的FACS缓冲液中，轻轻吹打制备单细胞悬液，计数并将细胞密度调整为为1×106cells/mL；
(2)向AsPC-1细胞中加入CFSE至终浓度为0.05uM，混合均匀后将细胞放到37℃细胞培养箱中标记30min；
(3)加入5倍体积的预冷的完全培养基终止染色，冰上放置5min；
(4)于4℃，1,000rpm/min离心3min，吸去上清，用预冷的完全培养基洗3遍；
(5)将Aspc-1细胞用FACS缓冲液重悬，计数后调整细胞密度为1×106cells/ml。
将两种细胞等体积混合并分为三份，向三份混合细胞中分别添加TF-TCB(50ng/ml)，TF-011(50ng/ml)或PBS，并在37℃，5％CO2孵育30min。然后在流式分析仪上分析混合物。通过PKH26+/CFSE+细胞-细胞结合物的出现来评价细胞的交联。
T细胞激活和细胞因子释放
(1)将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于平底的96孔细胞培养板中，贴壁培养24小时。
(2)加入人外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)(E：T，10：1)。
(3)将待测药物用R-2培养基(RPMI 1640+2％灭活的FBS)制成一系列10倍梯度稀释的样品，并加入培养板中，共培养20小时。
(4)将上清及上清中的PBMC转移至新的一个96孔细胞培养板中，300g离心10min。将上清液转移至新的96孔细胞培养板中待测。
(5)配置FACS标记缓冲液：FACS缓冲液中加入FITC标记的抗人CD8抗体(义翘神州)，PE标记的抗人CD4抗体(义翘神州)和APC标记的抗人CD69抗体(BD Biosciences)，加入抗体的量依据抗体说明书。
(6)用FACS缓冲液将PBMC重悬，300g离心10min后吸去上清，用FACS标记缓冲液重悬PBMC并在冰上孵育30min。孵育完成后用FACS缓冲液洗PBMC 3次。用200μl的FACS缓冲液重悬细胞并在流式细胞仪上分析，计算CD4+和CD8+T细胞中CD69+细胞的百分比。
(7)使用IFNγ免疫测定试剂盒(R&D Systems)和IL-2免疫测定试剂盒(R&DSystems)测量上清液中IFNγ和IL-2，具体步骤可以参考试剂盒说明书。
T细胞增殖测定
(1)将CD3+T细胞通过Dynabeads FlowComp Human CD3 Kit(Invitrogen)从PBMC中分离出来，具体步骤见试剂盒说明书。
(2)将分离出来的CD3+T细胞用CFSE标记，标记方法见2.1.2。
(3)将AsPC-1细胞(12,000细胞/孔)接种到平底96孔细胞培养板中，没有AsPC-1细胞的组中加入R-10培养基代替。贴壁培养24小时。
(4)24小时后，96孔细胞培养板中加入1μg/ml的TF-TCB和CFSE标记的CD3+T细胞(E：T，5：1)，不加TF-TCB或者CFSE标记的CD3+T细胞的组加入等体积的R-10培养基代替。之后将96孔细胞培养板放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养96小时。
(5)96小时后，收获上清中的T细胞并在细胞仪上分析每组中T细胞上的荧光强度。
肿瘤细胞和CD3+T细胞上抗原相对表达量的测定
测定肿瘤细胞上TF的相对表达量:
(1)将肿瘤细胞用胰酶消化后重悬于FACS缓冲液中，计数后置于圆底96孔细胞培养板中(100,000/孔)；
(2)设置空白对照组和实验组，实验组中加入1μl FITC标记的抗TF的抗体(义翘神州)，空白对照组不加入抗体。4℃下孵育30分钟。
(3)用FACS缓冲液将细胞洗三遍，后用200μl FACS缓冲液重悬细胞。然后在流式细胞仪上分析细胞的FITC荧光强度，通过实验组和空白对照组的细胞荧光强度比对来判定细胞上TF抗原的相对表达。
肿瘤细胞的杀伤测定
体外肿瘤细胞的杀伤测定使用的是Promega的CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit)，将肿瘤细胞，待测药物和效应细胞(PBMC)放在一起孵育，孵育结束后通过测定上清中细胞裂解产生的乳酸脱氢酶的活性来判断待测药物介导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。具体实验步骤如下：
(1)将处于对数生长期的肿瘤细胞用胰酶消化后用R-5培养基重悬，并接种于平底的96孔细胞培养板中，贴壁培养24小时。
(2)24小时后，加入新分离获得的PBMC，5％CO2，37℃下孵育30min。
(3)将待测药物用R-2培养基进行稀释至目的浓度，并加入孔板中。5％CO2，37℃下孵育24h或36h。
(4)在孵育结束前20min，吸取22μL 10％Triton X-100加入到96孔细胞培养板的阳性对照孔中，37℃，5％CO2下，孵育20min。
(5)混匀阳性对照孔，在水平离心机中将96孔细胞培养板1,500rpm/min离心10min。
(6)离心完成后，取50μl上清到新的96孔细胞培养板中。
(7)配置新鲜的LDH基质液，并加入到上述只含有细胞上清的96孔细胞培养板中，每孔加入50μl，并混合均匀。
(8)室温孵育，直至混合液颜色变成接近砖红色。
(9)每孔加入50μl终止液终止显色反应。
(10)打开酶标仪，设定吸收波长为492nm，将显色终止后的96孔细胞培养板放入读数。
(11)肿瘤细胞裂解％＝(实验组裂解–PBMC自发裂解-肿瘤细胞自发裂解)/(最大肿瘤细胞裂解–肿瘤细胞自发裂解)×100。
实验结果
抗原结合蛋白的亲和力分析
本申请用表面等离子共振和流式细胞分析技术分别在分子水平和细胞水平上测定TF-TCB与CD3和TF抗原的亲和力。如表1所示，本申请的抗原结合蛋白TF-TCB可以具有双特异性。通过Biacore测定的TF-TCB与CD3和TF抗原的结合亲和力分别为14.9nM和0.839nM，与正在进行临床试验中的其他TCB的亲和力相当。TF-TCB对CD3的亲和力低于对TF抗原的亲和力，这因为其与CD3作用时具有一个较大的解离速率。
表1通过Biacore测定的TF-TCB对CD3和TF抗原的亲和力和结合动力学参数
Figure BDA0003096528980000371
使用了细胞系MDA-MB-231(TF+)和Jurkat(CD3+)，分析TF-TCB与细胞表面的TF抗原和CD3抗原的结合。
图3A和图3B显示的是，TF-TCB可以剂量依赖性的结合至这两种细胞。结合的EC50分别为10.56nM(Jurkat，图3A)和5.25nM(MDA-MB-231，图3B)。
TF-TCB介导细胞-细胞交联分析
TF-TCB介导TF+肿瘤细胞和CD3+T细胞的交联是TF-TCB发挥作用的必要条件。该交联可诱导T细胞活化，细胞内信号通路的转导以及免疫突触的形成，进而导致细胞因子释放，肿瘤细胞裂解以及随后的T细胞增殖。
为了表征TF-TCB介导TF+肿瘤细胞和CD3+T细胞的交联。本申请将TF+AsPC-1细胞用CFSE标记，CD3+T细胞用同样表达CD3的Jurkat细胞代替并用PKH26标记。然后将标记后的两种细胞等数量的混合并与不同的待测物一起孵育。
图4显示的是，两种细胞与TF-TCB共同孵育后，最右图出现了CFSE+PKH26+的细胞-细胞聚集物，说明TF-TCB可介导CD3+细胞-TF+细胞的交联。而两种细胞的单纯混合，以及与TF-011单抗共孵育均不能介导细胞交联。
TF-TCB介导T细胞的激活和细胞因子释放
为了评估TF-TCB介导的T细胞活化，将AsPC-1细胞贴壁培养24小时后与PBMC(E:T效靶比，10:1)和一系列十倍稀释的TF-TCB(或TF-011)共同孵育20小时。然后收集PBMC测定CD4+和CD8+T细胞中CD69+细胞的比例。CD69是T细胞活化的早期信号。
图5A-5B显示的是，与TF-011相比，随着TF-TCB剂量的增加，CD4+和CD8+T细胞中CD69+细胞的百分比也在增加，说明TF-TCB可剂量依赖性激活CD4+和CD8+T细胞。TF-TCB显示出类似的CD4+和CD8+T细胞激活能力，这表现在TF-TCB对两者具有接近的激活EC50(对CD4+T细胞为0.10ng/ml，对CD8+T细胞为0.23ng/ml)。在激活T细胞的同时，TF-TCB也诱导了较强的细胞因子(IL-2和IFNγ)的释放。
TF-TCB介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤
TF-TCB介导的肿瘤细胞和T细胞的交联可以激活T细胞并在两种细胞间形成突触，促使T细胞分泌穿孔素，颗粒酶等杀死肿瘤细胞。将肿瘤细胞贴壁培养24小时后与PBMC(效靶比为15:1)和一系列十倍稀释的TF-TCB孵育24小时(MDA-MBA-231)或36小时(AsPC-1和SKOV-3)后，测定肿瘤细胞的裂解。TF-011和CD22-TCB(CD22-TCB的重链全长氨基酸序列可以如SEQ ID NO：33所示，CD22-TCB的轻链全长包含scFv部分氨基酸序列可以如SEQ ID NO：34所示)作为对照，TF-011是一个靶向TF的单抗，与TF-TCB相比其缺少了靶向CD3抗原的抗体可变区，但是由于具有完整的Fc效应功能，TF-011可以通过ADCC效应裂解TF阳性的肿瘤细胞。CD22-TCB与TF-TCB具有相同的结构，除了其中TF抗原结合部位被CD22抗原结合部位代替。
图6显示的是，TF-TCB可以剂量依赖性的杀伤肿瘤细胞。而且相比于TF-011和CD22-TCB，TF-TCB具有较低的肿瘤细胞裂解EC50和更高的肿瘤裂解百分比。这说明TF-TCB的活性同时依赖于其CD3抗原和TF抗原结合部位。
为了研究肿瘤细胞上TF表达水平与TF-TCB介导的细胞裂解活性之间的关系，选用五株具有不同TF表达水平的肿瘤细胞系(CT-26，PANC-1，AsPC-1，SKOV-3和MDA-MB-231)，图7A显示的是各个细胞系的TF表达水平。将肿瘤细胞贴壁培养后与PBMC(效靶比为15:1)和一系列十倍稀释的TF-TCB抗体孵育36小时，然后测定肿瘤细胞的裂解。
图7B和7C显示的是，TF-TCB可以介导不同肿瘤来源的TF+肿瘤细胞的裂解，肿瘤细胞裂解的EC50为0.01ng/ml至1.71ng/ml。对于TF阴性肿瘤细胞，TF-TCB几乎不显示裂解活性，表明TF-TCB的细胞裂解活性具有靶点依赖性。综上，TF-TCB的肿瘤细胞裂解活性与肿瘤细胞上TF表达水平呈正相关，肿瘤细胞上的的TF表达水平越高，TF-TCB对其具有越强的杀伤活性。PANC-1的TF表达水平低于AsPC-1和SKOV-3，然而TF-TCB对PANC-1却具有较强的肿瘤细胞裂解活性，这可能是由于不同的细胞对T细胞毒性的敏感程度不同导致。
TF-TCB促进T细胞的增殖
T细胞的激活，细胞因子的释放，以及对肿瘤细胞的杀伤最终会导致T细胞的增殖。为测定TF-TCB介导的T细胞增殖，首先将CD3+的T细胞从PBMC中分离出来，并进行CFSE的标记。然后将标记的T细胞在不同的条件下(有或无AsPC-1细胞，加入或者不加入TF-TCB)培养96小时。通过T细胞上CFSE量的减少来判断T细胞的增殖。
图8显示的是，只有当T细胞与TF-TCB和AsPC-1细胞共孵育时，T细胞上的CFSE明显降低，T细胞增殖。T细胞只和TF-TCB或者AsPC-1细胞共孵育均不能促进T细胞增殖。说明TF-TCB可以介导T细胞的增殖，但是该过程可以具有靶点依赖性。TF-TCB介导的T细胞增殖可以支持其持久的肿瘤杀伤作用。
实施例3
本申请的抗原结合蛋白的体内活性表征。
实验步骤：
AsPC-1细胞/PBMC混接模型
选择30只6-8周的雌性NOD/SCID小鼠(维通利华)，提前准备用于荷瘤的AsPC-1细胞。荷瘤当天(将荷瘤当天记为第1天)，将AsPC-1细胞(2×106)和PBMC(2×106，采用常规的密度梯度离心法从健康献血者的新鲜血液中分离获得)混合，并皮下植入小鼠。根据体重将NOD/SCID小鼠分为五组(n＝6/组)。荷瘤4小时后尾静脉给予PBS，TF-011(1mg/kg)或TF-TCB(0.2mg/kg，1mg/kg或5mg/kg)，以后每周给药两次，总共给药6次。从第4天开始记录小鼠体重和肿瘤尺寸(长度和宽度)直至实验结束。使用以下公式估算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长×宽×宽)/2。
AsPC-1肿瘤—PBMC尾静脉输入模型
选择24只6-8周的雌性NOG小鼠(维通利华)，提前准备用于荷瘤的AsPC-1细胞，荷瘤当天(记为第0天)，将AsPC-1细胞(2×106)皮下植入小鼠。荷瘤第9天测量肿瘤尺寸，并估算肿瘤体积。根据肿瘤体积将小鼠分为四组(PBS/PBS组，PBS/吉西他滨组，PBMC/PBS组和PBMC/TF-TCB组，n＝6/组)。荷瘤第10天，对PBMC/PBS组和PBMC/TF-TCB组的小鼠静脉注射PBMC(5×106)。另外两组用PBS代替。在第11天，对PBMC/PBS组和PBMC/TF-TCB组的小鼠分别尾静脉给予PBS和TF-TCB(5mg/kg)，对PBS/PBS组，PBS/吉西他滨组分别腹腔给予PBS和吉西他滨(100mg/kg)，每周给药两次。每周测量一次肿瘤尺寸，并估算肿瘤体积。移植物抗宿主病是该肿瘤模型中的常见现象。当移植物抗宿主病症状明显时(包括小鼠精神状态不佳，体重下降)，研究终止。
NCI-H292肿瘤—PBMC尾静脉输入模型
选择32只6-8周的雌性NOG小鼠(维通利华)，提前准备用于荷瘤的NCI-292细胞。荷瘤当天(记为第0天)，将NCI-H292细胞(3×106)皮下植入小鼠。第3天对小鼠静脉注射5×106个PBMC。第9天测量肿瘤尺寸，估算肿瘤体积并根据肿瘤大小将小鼠分为四组。第10天每组小鼠分别给予不同的药物治疗：PBS，Nivolumab(10mg/kg，腹腔给药，每周给药一次)，TF-TCB(5mg/kg，静脉给药，每周给药两次)或Nivolumab(10mg/kg，腹腔给药，每周给药一次)联合TF-TCB(5mg/kg，静脉给药，每周给药两次)。测量肿瘤尺寸，并估算肿瘤体积。当移植物抗宿主病症状明显时(包括小鼠精神状态不佳，体重下降)，研究终止。
免疫组化
动物实验结束后将肿瘤剥离。将肿瘤固定，包埋切片。将肿瘤切片封闭后用PBST(含0.1％Tween-20的PBS)洗三遍后加入一抗(抗人CD3兔抗体(义翘神州)，抗人PD-L1兔抗体(Cell Signaling Technology)或抗人TF兔抗体(Cell Signaling Technology))在4℃孵育过夜。用PBST洗三遍后加入二抗(生物素化的山羊抗兔IgG(Servicebio))，并孵育50分钟。加入新鲜制备的DAB显色溶液，并用苏木精(Servicebio)对肿瘤切片进行复染。脱水和封片后使用OLYMPUS BX53显微镜采集图像。
实验结果：
为进一步的评价TF-TCB在体内的抗肿瘤效果，本申请构建了三种不同肿瘤模型。
AsPC-1细胞/PBMC混接模型
将PBMC(2×106)和人转移性胰腺癌细胞AsPC-1(2×106)预混后植入雌性NOD/SCID小鼠皮下(n＝6/组，共5组)。荷瘤4小时后每组尾静脉给予PBS，TF-011(1mg/kg)或TF-TCB(0.2mg/kg，1mg/kg或5mg/kg)，每周给药两次，总共给药6次。给药后第四天开始记录小鼠的肿瘤大小和体重。
图9显示的是，与PBS相比，TF-011单抗仅表现出轻微的肿瘤生长抑制作用。而TF-TCB，所有剂量组从第7天开始到研究结束，均观察到显著的肿瘤生长抑制。在研究结束时，2只小鼠(TF-TCB剂量为0.2mg/kg)身上没有发现肿瘤。不同剂量的TF-TCB组间无明显差异，各种剂量的本申请的TF-TCB可以用于肿瘤治疗。图10显示的是，在整个研究过程中，小鼠体重或其他生长条件指标均未受到任何治疗的影响。
AsPC-1肿瘤-PBMC尾静脉输入模型
在AsPC-1肿瘤-PBMC尾静脉输入模型中，本申请进一步评估了TF-TCB的疗效。在该模型中，PBMC不与AsPC-1肿瘤细胞共移植，TF-TCB介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤需要从血液中将T细胞招募到肿瘤部位。首先用AsPC-1细胞(2×106)接种雌性NOG小鼠。9天后，将荷瘤小鼠按肿瘤大小分为4组(n＝6/组)，其中两组接受5×106PBMC静脉注射，另外两组用PBS代替。接受PBMC的两组分别静脉给予PBS或TF-TCB(5mg/kg)，其他两组分别腹腔给予PBS或吉西他滨(100mg/kg)作为阴性或阳性对照，所有治疗每周给药两次，总共给药6次。吉西他滨是目前临床上治疗胰腺癌的主要化疗药物之一。
图11显示的是，吉西他滨在早期(第21天，第一次给药10天后)可以显著抑制肿瘤的生长。但其抑制活性随着肿瘤的生长而减弱，在研究结束时无明显的抑制肿瘤生长作用。在整个研究过程中，PBMC治疗只有微弱的肿瘤生长抑制作用，说明PBMC本身也对肿瘤有一定的抑制作用，但是该抑制作用有限。而PBMC联合TF-TCB(PBMC/TF-TCB)从给药第17天起直至实验结束显示出显著的肿瘤生长抑制作用。
NCI-H292肿瘤-PBMC尾静脉输入模型
NCI-H292是肺腺癌细胞，为了评价TF-TCB在体内对肺癌的抑制作用，本申请构建了NCI-H292肿瘤-PBMC尾静脉输入模型。同时在该模型中也评价了免疫抑制检查点Nivolumab和TF-TCB的联合用药效果。NCI-H292肿瘤-PBMC尾静脉输入模型的建立方法与AsPC-1肿瘤-PBMC尾静脉输入模型类似。
Nivolumab已被美国FDA批准用于治疗多种类型的癌症，其中包括肺癌。但是在该T细胞浸润低的肿瘤模型中，Nivolumab没有显著的抑制肿瘤生长(图12)。
从第21天开始到研究结束，单独使用TF-TCB和与Nivolumab的联合治疗均显著的抑制了肿瘤的生长甚至引起肿瘤的退化。另外，联合治疗具有比TF-TCB单独疗法更好的抗肿瘤活性，表明Nivolumab可进一步增强TF-TCB介导的T细胞活性。
实验结束后，将肿瘤取出并进行IHC分析，主要标记的是人的CD3，TF和PD-L1抗原。
图13显示的是，在TF-TCB+Nivolumab组中，肿瘤中已没有明显的TF阳性的细胞，显示TF阳性的肿瘤细胞几乎被完全消除。在TF-TCB组中，仅在肿瘤中心部位发现TF阳性肿瘤细胞。而在PBS和Nivolumab组中，整个肿瘤都有TF阳性的肿瘤细胞。CD3抗原的标记显示只在TF-TCB组和TF-TCB+Nivolumab组中T细胞被募集到肿瘤中。TF-TCB组中肿瘤的PD-L1的表达量高，表明TF-TCB可能诱导了炎性的肿瘤微环境的产生。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学, 杰库（上海）生物医药研究有限公司, 杰科（天津）生物医药有限公司
<120> 多特异性抗原结合蛋白及其应用
<130> 0093-PA-016
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg
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<220>
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<223> anti-TF 轻链恒定区
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Asp
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Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
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Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> linker-1
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> anti-TF LC
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> linker-2
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Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> anti-CD3
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
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100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro
180 185 190
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245 250 255
<210> 23
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-TCB HC prt
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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180 185 190
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225 230 235 240
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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-TCB LC prt
<400> 24
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser
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290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu
305 310 315 320
Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys
325 330 335
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
370 375 380
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
385 390 395 400
Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln
405 410 415
Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys
420 425 430
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
435 440 445
Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr
450 455 460
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly
465 470 475 480
Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
485
<210> 25
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-HC-D nt
<400> 25
gaggtgcagc tgctggagtc cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt tacattcagc aactacgcca tgtcctgggt gaggcaggcc 120
cctggcaagt gcctggagtg ggtgagctcc atctccggca gcggcgatta cacctactac 180
acagactccg tgaagggcag attcacaatc tccagagaca attccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga atagcctgag ggccgaggac acagccgtgt actactgtgc caggtccccc 300
tggggctact acctggatag ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctccgcgtcg 360
acgaaggggc ccagcgtgtt cccgctggcc cccagcagca agagcaccag cggcgggacc 420
gccgccctgg gctgcctcgt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcgtggaac 480
agcggcgcgc tgacgagcgg ggtccacacc ttcccggccg tgctgcagag cagcggcctc 540
tactcgctga gcagcgtggt caccgtgccc agcagcagcc tggggaccca gacgtacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc ctcgaacacc aaggtcgaca agaaggtgga gcccaagagc 660
tgcgacaaga cccacacctg cccgccctgc cccgcccccg aggccgccgg cgggcccagc 720
gtgttcctgt tcccgcccaa gcccaaggac acgctcatga tcagccgcac ccccgaggtc 780
acctgcgtgg tggtcgacgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtc 840
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccgcggg aggagcagta caactcgacg 900
taccgcgtcg tgagcgtgct gaccgtcctg caccaggact ggctcaacgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgggc gcgcccatcg agaagaccat cagcaaggcc 1020
aaggggcagc cccgggagcc gcaggtgtac accctgcccc ccagccgcga cgagctcacg 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtg aagggcttct acccctcgga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaacgggca gccggagaac aactacaaga ccaccccgcc cgtcctcgac 1200
agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgacggtgg acaagtcgcg gtggcagcag 1260
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtcatgcac gaggccctcc acaaccacta cacccagaag 1320
agcctgagcc tgagccccgg gtga 1344
<210> 26
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-LC-CD3-scFv nt
<400> 26
gatatccaga tgacccagtc ccctccctcc ctgtccgcca gcgctggaga tagagtgacc 60
atcacctgca gagccagcca gggcatctcc tccagactgg cctggtacca gcagaagccc 120
gagaaggccc ccaagagcct gatctacgcc gccagctccc tgcagtccgg cgtgcctagc 180
aggttctccg gctccggcag cggcacagat ttcacactga caatctccag cctgcagccc 240
gaggattttg ccacctacta ctgccagcag tacaactcct acccctacac cttcggctgc 300
ggcacaaagc tggagatcaa gagaaccgtg gccgccccca gcgtcttcat cttcccgccc 360
agcgacgagc agctgaagtc gggcacggcc agcgtggtgt gcctcctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg cgaaggtcca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg gaacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga ctcgaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtctacgcct gcgaggtgac ccaccagggg 600
ctctcgagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gcacctccgg aggaggaggc 660
tccggaggag gcggatccgg aggaggagga tcccaggtgc agctggtgca gtctggggga 720
ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgta aggcttctgg ctacaccttt 780
actaggtaca cgatgcactg ggtccgccag gctccaggca agtgcctgga gtggattgga 840
tacattaatc ctagccgtgg ttatactaat tacaatcaga agttcaagga ccgattcacc 900
atctccagag acaactccaa gaacacggcg tttctgcaaa tggacagcct gagacccgag 960
gacacgggtg tgtatttctg tgcgagatat tatgatgatc attactgtct tgactactgg 1020
ggccaaggca cccctgtcac agtctcctca ggcggaggcg gatctggcgg aggaggatct 1080
ggcggcggcg gatctggagg cggaggatct ggaggaggcg gcagcggagg cggaggttct 1140
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 1200
atcacttgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtatcagca gaccccaggg 1260
aaagccccta agcgctggat ctacgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg 1320
ttcagtggaa gtggatctgg gacagattat actttcacca tcagcagcct gcagcctgaa 1380
gatattgcaa catattactg tcagcagtgg agtagtaacc cattcacgtt tggctgtggt 1440
accaaactgc agattacccg ctga 1464
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-011 VH
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Trp Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-011 VL
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-011 HC
<400> 29
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Trp Gly Tyr Tyr Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-011 LC
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22-TCB VH
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22-TCB VL
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22-TCB HC
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Cys Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 34
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22-TCB LC
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
225 230 235 240
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
245 250 255
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
275 280 285
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
290 295 300
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
305 310 315 320
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
325 330 335
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
370 375 380
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
385 390 395 400
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr
405 410 415
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
420 425 430
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr
435 440 445
Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr
450 455 460
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys
465 470 475 480
Leu Gln Ile Thr Arg
485
<210> 35
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-HC-D LC F
<400> 35
gaggatcgaa cccttgctag caccatgggt tggagcctca t 41
<210> 36
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-HC-D R
<400> 36
agggatcgaa cccttaagct ttcacccggg gctcaggctc a 41
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TF-LC-CD3-scFv R
<400> 37
agggatcgaa cccttaagct ttcagcgggt aatctgcagt ttg 43

Claims (10)

1.一种药物组合，其包含组织因子(TF)结合分子和CD3结合分子。
2.一种多肽，其包含权利要求1所述药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子。
3.一种核酸分子，其编码权利要求1所述药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或权利要求2所述的多肽。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的核酸分子。
5.一种免疫缀合物，其包含权利要求1所述药物组合的所述组织因子(TF)结合分子和所述CD3结合分子和/或权利要求2所述的多肽。
6.一种细胞，其包含和/或表达权利要求1所述药物组合、包含和/或表达权利要求2所述的多肽、包含权利要求3所述的核酸分子、包含权利要求4所述的载体和/或包含权利要求5所述的免疫缀合物。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1所述药物组合、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的免疫缀合物和/或权利要求6所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
8.一种试剂盒，其包含权利要求1所述药物组合、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的免疫缀合物、权利要求6所述的细胞和/或权利要求7所述的药物组合物。
9.权利要求1所述药物组合、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的免疫缀合物、权利要求6所述的细胞和/或权利要求7所述的药物组合物在制备试剂盒中的用途。
10.权利要求1所述药物组合、权利要求2所述的多肽、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的免疫缀合物、权利要求6所述的细胞、权利要求7所述的药物组合物和/或权利要求8所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
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Citations (3)

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