MX2008007324A

MX2008007324A - Usos de antagonistas de miostatina.

Info

Publication number: MX2008007324A
Application number: MX2008007324A
Authority: MX
Inventors: Hq Han; Alexander Depaoli; John Zhao-Nian Lu; Jin Lin Wang
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2005-12-06
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2009-03-04
Also published as: JP2014224115A; WO2007067616A2; AU2010214673B2; US20140294866A1; EP1968621A2; AU2010214691A1; AU2006321906C1; JP2013028620A; AU2006321906B2; AU2010214691B2; US20070149458A1; CA2632544A1; AU2010214673A1; AU2006321906A1; US20110008375A1; CA2632544C; CA2856436A1; JP2009518422A; WO2007067616A3; JP2016094427A

Abstract

La presente invención proporciona los métodos para tratar los trastornos que se presentan a partir del hipogonadismo, caquexia reumatoide, caquexia debida a quemaduras, caquexia debida a la administración de agentes químicos, caquexia debida a diabetes, nefropatía diabética, síndrome de Prader Willi, TNF-( excesivo, y otros trastornos relacionados al músculo, trastornos metabólicos e inflamatorios, administrando antagonistas de miostatina a sujetos que padecen tales trastornos.

Description

USOS DE ANTAGONISTAS DE MIOSTATINA Campo de la Invención La invención se refiere a la transformación de la miostatina miembro de la familia del factor-ß de crecimiento (TGF-ß), los antagonistas de miostatina, y los usos de estos antagonistas para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Antecedentes de la Invención La miostatina, también conocida como el factor 8 de crecimiento/diferenciación (GDF-8 por sus siglas en inglés), es un miembro de la familia de transformación del factor-ß de crecimiento (TGF-ß) conocido para involucrarse en la regulación de la masa muscular esquelética. La mayor parte de los miembros de la familia TGF^-GDF es no específicamente expresa en muchos tipos de tejido y ejercen una variedad de acciones pleiotrópicas. Sin embargo, la miostatina es mayormente expresada en las células de desarrollarse y el tejido del músculo esquelético de adulto y juega un papel esencial en negativamente controlar el crecimiento del músculo esquelético (McPherron y colaboradores Nature (London) 387, 83-90 (1997)). Los estudios recientes indican que la expresión de la miostatina puede también medirse en tejidos cardiacos, adiposos y pre-adiposos. La proteína de miostatina se ha conservado evolucionaría altamente (McPherron y colaboradores PNAS USA 94: 12457-12461 (1997)). La región C-terminal biológicamente activa de la miostatina tiene 100 por ciento de identidad de secuencia entre secuencias humana, ratón, rata, vaca, pollo y pavo. La función de la miostatina también parece conservarse a través de especies igualmente. Esto es evidente de los fenotipos de animales que tienen una mutación en el gene de miostatina. Dos castas de ganado, el Belgian Blue (Hanset R., Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, eds, King, J.W.G. & enissier, F. (Nijhoff, The Hague, The Netherlands) pp. 437-449) y Piedmontese (Masoero, G. & Poujardieu, B, Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production., eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, The Hague, The Netherlands) pp. 450-459) son caracterizadas por un fenotipo de "musculatura doble" e incremento de masa muscular. Estas castas se mostraron por contener mutaciones en la región de codificación del gene de miostatina (McPherron y colaboradores PNAS (1997) supra). Además, los ratones que contienen una eliminación objeto del gen que codifica la miostatina (Mstn por sus siglas en inglés) demuestran un incremento dramático en masa muscular sin un incremento correspondiente en grasa. Los músculos individuales de ratones del Mstn"'" pesan aproximadamente 100 a 200 por ciento más que los de los animales control como resultado de hipertrofia e hiperplasia de fibras musculares (Zimmers y colaboradores Science 296, 1486 (2002)). Ahora se ha descubierto que los antagonistas de miostatina pueden utilizarse para tratar trastornos adicionales a los ya reconocidos. La presente invención proporciona métodos de tratamientos para estos trastornos adicionales usando antagonistas de miostatina. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos de tratamientos para varias condiciones de enfermedad. Estos tratamientos comprenden administrar a uno o más antagonistas de miostatina a sujetos en necesidad de tal tratamiento. Los antagonistas de miostatina pueden también administrarse profilácticamente para prevenir el desarrollo de tal condición, y pueden administrarse a un sujeto cualquiera antes o después de que una. condición se desarrolle, como sea necesario. La presente invención además proporciona el uso de antagonistas de miostatina en la preparación de una composición farmacéutica para tratar las condiciones listadas más adelante. En una modalidad, la invención proporciona un método para tratar los efectos del hipogonadismo en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinar con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. En una modalidad, el hipogonadismo resulta de la terapia de privación del andrógeno. En otra modalidad, el hipogonadismo resulta de la disminución relativa a la edad en funcionamiento gonadal.

La presente invención también proporciona un método para tratar caquexia reumatoide en un sujeto que sufre de tal condición que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. La presente invención también proporciona un método para tratar la caquexia debido a lesiones por quemadura en un sujeto en necesidad de tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable a| sujeto. La presente invención también proporciona un método para tratar la caquexia debido al tratamiento con agentes químicos tal como agentes quimioterapéuticos a un sujeto en necesidad tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. La presente invención también proporciona un método para tratar la caquexia debido a la diabetes a un sujeto en necesidad de tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto.

La presente invención también proporciona un método para tratar la nefropatía diabética en un sujeto que sufre de tal condición que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. La presente invención también proporciona un método alternativo de tratar enfermedades o condiciones tratadas actualmente por la hormona del crecimiento, factor-1 de crecimiento de insulina (IGF-1 por sus siglas en inglés), secretagogos de la hormona de crecimiento, y otros agentes relacionados con el eje de la hormona-IGF-1 de crecimiento. Los antagonistas de miostatina proporcionan un método para tratar tales enfermedades sin los efectos secundarios potencialmente peligrosos de la hormona del crecimiento. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar los efectos del síndrome de Prader-Willi en un sujeto que sufre de tal condición que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más antagonistas de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. La presente invención también proporciona un método para reducir el TNF-a en un sujeto que sufre de un trastorno inflamatorio que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más antagonistas de miostatina al sujeto. Para los métodos de tratamiento indicados anteriormente, los antagonistas de miostatina incluyen, pero no se limitan a los siguientes antagonistas: folistatina, prodominio de miostatina, prodominio GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen al receptor tipo HB de activina, receptor tipo DB de activina soluble, proteínas de fusión del receptor tipo HB de activina soluble, análogos de miostatina solubles, ol igonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina. Los agentes de unión de miostatina se describen extensivamente en la Descripción Detallada proporcionada más adelante. Como se describe en la presente el término "agente de unión de miostatina" incluye todos los agentes de unión descritos en la presente. Por ejemplo, un antagonista de miostatina útil para los tratamientos descritos en la presente es un agente de unión ejemplar que comprende por lo menos un péptido que comprende la secuencia de aminoácido WMCPP (SEC ID NO: 633). En otra modalidad, el agente de unión de miostatina que comprende la secuencia de aminoácido Caia?WaaW CPP-(SEC ID NO: 352), en donde ai, a2 y a3 se seleccionan de un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral o básico. En otra modalidad el agente de unión de miostatina que comprende la secuencia ID NO: 353), en donde bi se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de cualquiera de P, R y Q, y en donde el péptido está entre 10 y 50 aminoácidos en longitud, y las sales fisiológicamente aceptables del mismo. En otra modalidad, el agente de unión de miostatina que comprende la fórmula: CiC?C3C4C*cfiCc7cRWcQWMCPPCinCi-iC1 ?Ci3 (SEC ID NO: 354), en donde: c-i está ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; c3 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; c4 está ausente o es cualquier aminoácido; c5 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; c6 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; c7 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; c8 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; c9 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; y c10 a Ci3 es cualquier aminoácido; y en donde el péptido está entre 20 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. En otra modalidad el agente de unión de miostatina que comprende la fórmula: did?dad4dsClRCd7dnWdQWMCPPdindiiCli9di (SEC ID NO: 355), en donde: d2 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; d3 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; d4 está ausente o es cualquier aminoácido; d5 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; d6 está ausente o un aminoácido hidrofobico neutral, polar neutral, o acídico; d7 es seleccionado de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; d8 es seleccionado de cualquiera de uno de R, S, Q; d9 es seleccionado de cualquiera de uno de P, R y Q, y d10 a d 3 es seleccionado de cualquier aminoácido, y en donde el péptido está entre 20 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. Las modalidades adicionales de agentes de unión útiles como antagonistas de miostatina para el tratamiento de trastornos descritas en la presente comprenden por lo menos uno de los siguientes péptidos: (1) un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia (SEQ DD NO: 356) en donde e-, es P, S o Y, e2 es C o Q, y e3 es G o H, en donde el péptido está entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo; (2) un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia f EMLf?Lf¾f4LL, (SEQ DD NO: 455) , en donde f, es o I, f2 es cualquier aminoácido, f3 es L o F, f4 es E, Q o D; y en donde el péptido está entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo; (3) un péptido capaz de unir la miostatina en donde el péptido que comprende la secuencia (SEC ID NO: 456) , en donde g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, g4 es L, W, F, o Y, y en donde el péptido está entre 8 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo; (4) un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia (SEC ID NO: 457), en donde h2 es cualquier aminoácido, h3 es A, T, S o Q, h4 es L o M, h5 es L o S, h6 es cualquier aminoácido, h7 es F o E, h8 es W, F o C, hg es L, F, M o K, y en donde el péptido está entre 9 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. En otra modalidad, descrita más completamente en la Descripción Detallada más adelante, los agentes de unión útiles como antagonistas de miostatina comprenden por lo. menos un vehículo tal como un polímero o dominio Fe, y puede que además comprender por lo menos una secuencia enlazadora. En esta modalidad, los agentes de unión de la presente invención se construyen para que al menos un péptido de unión de miostatina se una a por lo menos un vehículo. El péptido o péptidos se une directa o indirectamente con una secuencia enlazadora, al vehículo en la N-terminal, C-terminal o una cadena lateral del aminoácido del péptido, de tal modo proporcionando pepticuerpos. En esta modalidad, los agentes de unión de la presente invención tienen la siguiente estructura generalizada: (X1)a-F1-(X2)b, o multímeros de los mismos; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 son cada uno seleccionado independientemente de -(L1)CP1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P -(L3)c-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)c-P3-(L4)f-P4; en donde P , P2, P3 y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina; y L1, L2, L3 y L4 son cada uno enlazadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que por lo menos uno de a y b es 1, y sales fisiológicamente aceptables de los mismos. Las modalidades de agentes de unión tienen esta estructura generalizada, los péptidos P , P2, P3 y P4 pueden seleccionarse independientemente de uno o más de cualquiera de las secuencias del péptido proporcionadas en la presente, como se describe en la Descripción Detallada más adelante. Por ejemplo, en modalidades ejemplares, P1, P2, P3 y P4 se seleccionan independientemente de uno o más péptidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias: SEC ID NO: 633, SEC ID NO: 352, SEC ID NO: 353, SEC ID NO: 354, SEQ DD NO: 355, SEC ID NO: 356, SEC ID NO: 455, SEC ID NO: 456, and SEC ID NO: 457. En otra modalidad, P , P2, P3, y P4 se seleccionan independientemente de uno o más péptidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias: SEC ID NO: 305 a 351 y SEC ID NO: 357 a 454. Las modalidades adicionales de agentes de unión de miostatina se proporcionan en la Descripción Detallada de la Invención a continuación. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticamente aceptable que comprenden uno o más antagonistas de miostatina para tratar el hipogonadismo, caquexia reumatoide, caquexia debido a quemaduras, caquexia debido a agentes químicos, caquexia debido a diabetes, nefropatía diabética, síndrome de Prader Willi, TNF-a excesivo en un sujeto, y otros trastornos. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra actividad como se midió mediante la actividad de luciferasa expresada miostatina según lo por la del (eje y) contra concentración (eje x) para el péptido TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEC ID NO: 32) y el pepticuerpo TN8-19 (pb) para determinar la Cl50 para cada uno que usa el ensayo de luciferasa C2C12 pMARE descrito en los Ejemplos más adelante. El pepticuerpo tiene un valor de Cl50 comparado con el péptido. La Figura 2 es una gráfica que muestra el incremento en el peso corporal total para ratones CDI nu/nu tratados con dosificaciones incrementadas del pepticuerpo 1:< mTN8-19-21 durante un período de catorce días comparados con ratones tratados con un control huFc, como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 3A muestra el incremento en la masa de la masa muscular gastrocnemio en la autopsia de ratones tratados en la Figura 2 (Ejemplo 8). La Figura 3B muestra el incremento en masa magra como se determinó por RMN en el día 0 comparado con el día 13 del experimento descrito en el Ejemplo 8. La Figura 4 muestra en masa corporal magra como para ratones CD1 nu/nu tratados con inyecciones bisemanalmente de dosificaciones incrementadas del pepticuerpo 1x mTN8-19-32 como se determinó por RMN el día 0 y día 13 del experimento en el Ejemplo 8 descrito. La Figura 5A muestra el incremento en el peso corporal para ratones CD1 nu/nu tratados con inyecciones bisemanalmente de 1x mTN8-19-7 comparado con 2x mTN8-19-7 y el animal control durante 35 días como se describe en el Ejemplo 8. La figura 5B muestra el incremento en peso corporal magro en la autopsia para las versiones 1x y 2x en 1 mg/kg y 3 mg/kg comparados con los animales que reciben el vehículo (huFc) (controles). La Figura 6 A muestra el incremento en masa muscular magra contra peso corporal para ratones mdx maduros tratados con cualquier afinidad del pepticuerpo 1x mTN8-19-33 maduró o vehículo huFc en 10 mg/kg subcutáneamente cada día por tres meses. La figura 6B muestra el cambio en la masa grasa comparada al peso corporal como se determinó por RMN para los mismos ratones después de 3 meses de tratamiento.

La Figura 7 muestra el cambio en masa corporal durante un tiempo en gramos para los animales con artritis inducida por colágeno (CIA por sus siglas en inglés) tratados con el pepticuerpo 2x mTN8-19-21/muFc o vehículo muFc, así como animales normales sin CIA. La Figura 8 muestra el cambio del peso corporal relativo durante un tiempo en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ por sus siglas en inglés) tratados con el pepticuerpo 2x mTN8-19-21/muFc o el control del vehículo muFc. La Figura 9 muestra el índice de eliminación de la creatina en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ) y ratones normales de edad comparable después del tratamiento con pepticuerpo 2x mTN8-19-21 /muFc o el vehículo muFc. La figura 10A muestra la excreción de la albúmina de orina en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ) y ratones normales de edad comparable después del tratamiento con el pepticuerpo 2x mTN8-19-21/muFc o el vehículo muFc. La figura 10B muestra el volumen de orina de 24 horas en ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ) y ratones normales de edad comparable después del tratamiento con el pepticuerpo 2x mTN8-19-21/muFc o el vehículo muFc. La Figura 11 muestra el cambio del peso corporal durante un tiempo para 4 grupos de ratones C57B1/6; 2 grupos pretratados durante 1 semana con pepticuerpo 2x mTN8-19-21/muFc, después tratados con 5-fluoruracilo (5-Fu) o vehículo (PBS); y 2 grupos pretratados durante 2 semanas con 2x mTN8-19-21/muFc, y después tratados con 5-fluorouracilo o vehículo (PBS). Los triángulos a lo largo en la parte inferior de la Figura muestran los tiempos de administración del tratamiento de 2 semanas de pretratamiento con 2x mTN8-19-21 /muFc, los tiempos de administración de 1 semana de pretratamiento con 2x mTN8-19-21/muFc, y tiempos de administración de 5-Fu. La Figura 12 muestra a los porcentajes del índice de supervivencia de los animales descritos en la Figura 11 anteriormente, mostrando ratones normales no tratados, animales tratados con 5-Fu solamente, animales pretratados con 2x mTN8-19-21/muFc durante 1 semana y después tratados con 5-Fu, y animales pretratados con 2x mTN8-19-21/muFc durante 2 semanas y después tratados con 5-Fu. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y métodos para tratar varios trastornos usando antagonistas de miostatina que incluyen los agentes de unión de miostatina. La invención proporciona un método para tratar los efectos del hipogonadismo en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina al sujeto en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad el hipogonadismo resulta de la terapia de privación del andrógeno. En una segunda modalidad, el hipogonadismo resulta de la disminución relacionada a la edad en funcionamiento gonadal. La presente invención también proporciona un método para tratar la caquexia reumatoide en un sujeto que sufre de tal condición que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina al sujeto en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también proporciona un método para reducir el TNF-a en un sujeto que sufre de una condición inflamatoria caracterizada por TNF-a excesivo. La presente invención también proporciona un método para tratar la caquexia debido a lesiones por quemadura en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina al sujeto en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también proporciona un método para tratar la caquexia debido al tratamiento con agentes químicos tal como agentes quimioterapéuticos a un sujeto en necesidad tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. La presente invención también proporciona un método para tratar la caquexia debido a la diabetes a un sujeto en necesidad de tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. La presente invención también proporciona un método para tratar la nefropatía diabética en un sujeto que sufre de tal condición que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto. La presente invención también proporciona un método alternativo para tratar enfermedades o condiciones anteriormente tratadas por la hormona de crecimiento, factor-1 del crecimiento de insulina (IGF-1), secretagogos de la hormona de crecimiento, y otros agentes relacionados con el eje de la hormona-IGF-1 de crecimiento. Los antagonistas de miostatina proporcionan un método para tratar tales enfermedades sin los efectos secundarios potencialmente peligrosos de estos agentes. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar los efectos del síndrome de Prader-Willi en un sujeto que sufre de tal condición que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un antagonistas de miostatina al sujeto en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. De acuerdo a la presente invención, los antagonistas de miostatina incluyen, pero no se limitan a, folistatina, prodominio miostatina, prodominio GDF-11, otras prodominios de TGF-ß proteínas de fusión de prodominio, los anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen al receptor de activina tipo IIB, receptor de activina tipo IIB soluble, proteínas de fusión del receptor tipo IBB de activina solubles, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina. Estos antagonistas se describen más completamente más adelante. En una modalidad, los antagonistas de miostatina son agentes de unión de miostatina, descritos más completamente más adelante. Miostatina La miostatina, un factor del crecimiento también conocido como GDF-8, es un miembro de la familia de TGF-ß. La miostatina es conocida por como un regulador negativo del tejido muscular esquelético. La miostatina es sintetizada como una preproproteína inactiva que es activada por división proteolítica (Zimmers y colaboradores, supra (2002)). La proteína precursora se divide para producir un prodominio inactivo NH2-terminal y aproximadamente proteína COOH-terminal de 109 aminoácidos en forma de un homodimero de aproximadamente 25 kDa, que es la forma madura, activa (Zimmers y colaboradores, supra (2002)). Ahora se cree que el dimero maduro circula en la sangre como un complejo latente inactivo unido al propéptido (Zimmers y colaboradores, supra (2002)). Como se describe en la presente el término "miostatina de longitud completa" se refiere a la secuencia de preproproteína humana de longitud completa descrita en McPherron y colaboradores PNAS USA 94, 12457 (1997), así como polipéptidos de longitud completa relacionados incluyendo variantes alélicas y homólogos de interepecies (McPherron y colaboradores supra (1997)). Como se describe en la presente, el término "prodominio" o "propéptido" se refiere la proteína NH2-terminal inactiva que es dividida para liberar la proteína COOH-terminal activa. Como se describe en la presente el término "miostatina" o "miostatina madura" se refiere al polipéptido COOH-terminal maduro, biológicamente activo, en el monómero, dímero, forma multimérica u otra forma. "Miostatina" o "miostatina madura" también se refiere a fragmentos de la miostatina madura biológicamente activa, así como polipéptidos relacionados incluyendo variantes alélicas, variantes de empalme, y péptidos y polipéptidos de fusión. La proteína COOH-terminal de miostatina madura se ha descrito por tener 100% de identidad de la secuencia entre muchas especies incluyendo humana, ratón, pollo, porcino, pavo y rata (Lee y colaboradores, PNAS 98, 9306 (2001)). La miostatina puede o no puede incluir residuos terminales adicionales tal como apuntar secuencias objeto, o residuos de metionina y lisina y/o secuencias de proteína objetos o fusión, dependiendo de cómo se preparen.

Antagonistas de Miostatina Como se utiliza en la presente el término "antagonista de miostatina" se utiliza alternativamente con "inhibidor de miostatina". Un antagonista de miostatina de acuerdo con la presente invención inhibe o bloquea por lo menos una actividad de la miostatina, o alternativamente, bloquea la expresión de miostatina o su receptor. La Inhibición o bloqueo de la actividad de la miostatina puede realizarse, por ejemplo, utilizando uno o más agentes inhibidores que interfieren con la unión de la miostatina a su receptor, y/o bloquea la transducción de la señal que resulta de la unión de la miostatina a su receptor. Los antagonistas incluyen agentes que unen a la miostatina por sí misma, o agentes que unen a un receptor de miostatina. Por ejemplo, los antagonistas de miostatina incluyen pero no se limitan al folistatina, prodominio de miostatina, prodominio del factor de crecimiento y diferenciación 11 (GDF-11), proteínas de fusión del prodominio, anticuerpos antagónicos que unen a la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen al receptor de activina tipo IlB, receptor de activina tipo IlB soluble, proteínas de fusión del receptor de activina tipo IlB solubles, análogos de miostatina solubles (ligandos solubles), oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina. Éstos se describen más detalladamente más adelante. La folistastina inhibe la miostatina, como se describe, por ejemplo, en Amthor y colaboradores, Dev Biol 270, 19-30 (2004), y Patente Norteamericana 6,004,937, la cual se incorpora en la presente por referencia. Otros inhibidores incluyen, por ejemplo, proteínas de unión de TGF-ß que incluyen proteína-1 de suero asociada al factor de crecimiento y diferenciación (GASP) como se describe en Hill y colaboradores, Mol. Endo. 17 (6): 1144-1 154 (2003). Los antagonistas de miostatina incluyen la región del propéptido de miostatina y proteínas de GDF relacionadas que incluyen GDF-11, como se describe en la publicación PCT WO 02/09641, la cual se incorpora en la presente por referencia. Los antagonistas de miostatina además incluyen propéptidos modificados y estabilizados que incluyen fusiones de Fe del prodominio como se describe, por ejemplo, en Bogdanovisch y colaboradores, FASEB J 19, 543-549 (2005). Los antagonistas de miostatina adicionales incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que unen a e inhiben o neutralizan la miostatina, que incluyen la proproteína de miostatina y/o proteína madura, la cual está en forma monomérica o dimérica. Tales anticuerpos se describen, por ejemplo, en la solicitud de Patente Norteamericana 2004/0142383, y solicitud de Patente Norteamericana 2003/1038422 y publicación PCT WO 2005/094446, publicación PCT WO 2006/116269, todas las cuales se incorporan por referencia en la presente. Los anticuerpos de miostatina antagónicos además incluyen anticuerpos que unen a la proproteína de miostatina y previenen la división en la forma activa madura. Como se describe en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos intactos que incluyen anticuerpos policlonales (ver, por ejemplo Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988)), y anticuerpos monoclonales (ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439, y 4,411,993, y Monoclonal Antibodies: A New Dimensión in Bioloqical Analysis. Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.) (1980)). Como se describe en la presente, el término "anticuerpo" también refiere a un fragmento de un anticuerpo tal como F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, Fc3 y anticuerpos de cadena sencilla, o combinaciones de éstos, que son producidas por técnicas de ADN recombinante o división enzimática o química de anticuerpos intactos. El término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos biespecíficos o bifuncionales que son un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por una variedad de métodos que incluyen fusión hibridomas o unión de fragmentos de Fab'. (Ver Songsivilai y colaboradores, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny y colaboradores, J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)). Como se describe en la presente el término "anticuerpo" también se refiere a anticuerpos quiméricos, es decir, los anticuerpos que tienen un dominio de inmunoglobulina del anticuerpo constante humano se combinan a uno o más de dominio de inmunoglobulina del anticuerpo variable no humano, o fragmentos de los mismos (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,595,898 y Patente Norteamericana No. 5,693,493). El término "anticuerpos" también se refiere a anticuerpos "humanizados" (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,816,567 y WO 94/10332), minicuerpos (WO 94/09817), fusiones de Fv-Fc de cadena sencilla (Powers y colaboradores, J Immunol. Methods 251:123-135 (2001)), y los anticuerpos producidos por animales transgénicos, en los cuales un animal transgénico que contiene una proporción del anticuerpo humano que produce genes pero un deficiente en la producción de anticuerpos endógenos son capaces de producir anticuerpos humanos (ver, por ejemplo, Méndez y colaboradores, Nature Genetics 15:146-156 (1997), y Patente Norteamericana No. 6,300,129). El término "anticuerpos" también incluye anticuerpos multiméricos, o un complejo de orden mayor de proteínas tal como anticuerpos heterodiméricos. Los "anticuerpos" también incluyen anticuerpos antiidiotípicos. Los antagonistas de miostatina adicionalmente incluyen receptores solubles que unen a la miostatina e inhiben por lo menos una actividad. Como se describe en la presente el término "receptor soluble" incluye versiones truncadas o fragmentos del receptor de miostatina, modificados o de otra manera, capaces de específicamente unir la miostatina, y bloquear o inhibir la transducción de la señal de la miostatina. Estas versiones truncadas del receptor de miostatina, por ejemplo, incluyen dominios solubles que ocurren naturalmente, así como variaciones debido a la proteólisis de N- o C-terminal. El dominio soluble incluye todo o una parte del dominio extracelular del receptor, solo o unido a los péptidos adicionales o modificaciones. Los receptores de activina unidos a miostatina que incluyen el receptor de activina tipo IIB (ActRIIB por sus siglas en inglés) y el receptor de activina tipo NA (ActRIIA por sus siglas en inglés), como se describe en Lee y colaboradores, PNAS 98 (16), 9306-9311 (2001). Las proteínas de fusión del receptor solubles también pueden actuar como antagonistas, por ejemplo el receptor soluble de Fe como se describe en la publicación de la solicitud de patente Norteamericana 2004/0223966, y publicación PCT WO 2006/012627, las cuales se incorporan en la presente por referencia. Los antagonistas de miostatina adicionalmente incluyen ligandos solubles que compiten con la miostatina para unirse a receptores de miostatina. Como se describe en la presente el término "antagonista del ligando soluble" se refiere a péptidos, polipéptidos o peptidomiméticos solubles capaces de unir el receptor de activina tipo IIB de miostatina (o ActRIIA por sus siglas en inglés) y de bloquear el transducción de la señal del receptor de miostatina compitiendo con la miostatina. Los antagonistas del ligando solubles incluyen variantes de miostatina, también referidas como "análogos de miostatina" que mantienen la homología sustancial a, pero sin la actividad del ligando, que incluyen truncamientos tal como truncamientos N- o C-terminal, las sustituciones, eliminaciones y otras alteraciones en la secuencia de aminoácido, tal como sustituyendo un peptidomimético ácido sin amino para un residuo de aminoácido. Los antagonistas del ligando solubles, por ejemplo, pueden ser capaces de unir el receptor, pero no permiten la transducción de la señal. Para los propósitos de la presente invención una proteína es "sustancialmente similar" a otra proteína si son por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 90%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% idénticas entre sí en secuencia de aminoácidos. Los antagonistas de miostatina adicionalmente incluyen antagonistas de polinucleótido. Estos antagonistas incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de polinucleótido de una sola hebra (o ARN o ADN) capaz de unir al ARNm marcado (sentido) o secuencias de ADN (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido, de acuerdo a la invención, comprenden los fragmentos de la secuencia del polinucleótido marcado que codifica la miostatina o su receptor, factores de transcripción u otros polinucleótidos involucrados en la expresión de la miostatina o su receptor. Tal fragmento generalmente comprende por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, normalmente de manera aproximada 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La habilidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, basado sobre una secuencia del ácido nucleico que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein and Cohén, Cáncer Res. 48:2659, 1988, y van der Krol y colaboradores BioTechniques 6:958, 1988. La unión de los oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias del ácido nucleico objetos resulta de la formación de dúplex que bloquean o inhiben la expresión de la proteína por uno varios medios, que incluyen degradación mejorada del ARNm por ARNse H, inhibición de empalme, terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden así utilizarse para bloquear la expresión de proteínas. Los oligonucleótidos antisentido o sentido adicionalmente comprenden oligonucleótidos que tienen columnas vertebrales de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otros uniones de azúcar, tal como se describe en WO 91/06629) y en donde tales uniones de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con uniones resistentes de azúcar son estable ¡n vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero conservan la especificidad de la secuencia para poder unirse a las secuencias del nucleótido objeto. Otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido incluyen los oligonucleótidos que covalente se unen a las porciones orgánicos, tal como los descritos en el documento WO 90/10448, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia del ácido nucleico objeto, tal como poli-(L)-lisina. Además aún, los agentes de intercalado, tal como elipticina, y agentes de alquilación y complejos de metal pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de nucleótidos objeto. Los oligonucleótidos antisentido o sentido puede introducirse en una célula que contiene el ácido nucleico objeto por cualquier método de transferencia de gen, que incluye, por ejemplo, lipofección, transfección de ADN mediada por CaP04, electroporación, o usando vectores de transferencia de gene tal como virus de Epstein-Barr o adenovirus. Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene el ácido nucleico objeto mediante la formación de una conjugación con una molécula de unión al ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión al ligando adecuada incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular, factores del crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que unen a los receptores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no interfiere sustancialmente con la habilidad de la molécula de unión al ligando para unir su molécula o receptor correspondiente, o bloquee de entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un oligonucleótido sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene el ácido nucleico objeto mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo del oligonucleótido-lípido sentido o antisentido es disociado preferiblemente dentro de la célula por una lipasa endógena. Los métodos adicionales para prevenir la expresión de la miostatina o receptores de miostatina son interferencia del ARN (ARNi) producida por la introducción del ARN de interferencia pequeña específica (ARNsi), como se describe, por ejemplo en Bosher y colaboradores, Nature Cell Biol 2, E31-E36 (2000). Las moléculas del ácido nucleico antagónicas de acuerdo con la presente invención son capaces de inhibir o eliminar la actividad funcional de la miostatina in vivo o ¡n vitro. En una modalidad, el antagonista selectivo inhibirá la actividad funcional de la miostatina por al menos aproximadamente 10%, en otra modalidad por al menos aproximadamente 50%, en otra modalidad por al menos aproximadamente 80%. Los antagonistas de miostatina adicionalmente incluyen antagonistas de molécula pequeña que unen a la miostatina o a su receptor. Las moléculas pequeñas son seleccionadas por tamizado para unir a la miostatina o su receptor seguido por elusiones específicas y no específicas similarmente a la selección de agentes de unión descritos en la presente. Los agentes de unión de miostatina se describen más adelante.

Como se utiliza en la presente el término "capaz de unir a la miostatina" o "que tiene una afinidad de unión para la miostatina" se refiere a un antagonista de miostatina tal como un agente de unión descrito en la presente que une a la miostatina como se demuestra por el ensayo de ELISA de fago, el ensayo de BIAcore® o KinExA™ descrito en los Ejemplos más adelante. Como se describe en la presente, el término "capaz de modificar la actividad de la miostatina" se refiere a la acción de un agente como un agonista o antagonista con respecto a por lo menos una actividad biológica de la miostatina. Como se describe en la presente, el "agonista" o actividad "mimética" se refiere a un agente que tiene actividad biológica comparable con una proteína que interactúa con la proteína de interés, como se describe, por ejemplo, en la solicitud internacional WO 01/83525, presentada el 2 de mayo, 2001, la cual se incorpora en la presente por referencia. Como se describe en la presente, el término "actividad de la miostatina que inhibe" o "actividad de la miostatina antagonizante" se refiere a la habilidad del antagonista de miostatina para reducir o bloquear la actividad de la miostatina o señalización como se demostró o ensayo in vitro tal como, por ejemplo, el ensayo de actividad de la miostatina basado en células pMARE C2C12 o por animal in vivo probados como se describe más adelante. La presente invención contempla el uso de combinaciones de antagonistas de miostatina por ejemplo, los descritos en la presente, en una composición farmacéutica para tratar los trastornos discutidos en la presente. Agentes de Unión de Miostatina Los agentes de unión de miostatina de la presente invención comprenden por lo menos un péptido de unión de la miostatina. En una modalidad, los agentes de unión de la presente invención comprenden por lo menos un péptido de unión de miostatina tal covalentemente unido por al menos a un vehículo un polímero o un dominio de Fe. La adhesión de los péptidos de unión a miostatina a por lo menos un vehículo se desea para incrementar la eficacia del agente de unión como un terapéutico incrementando la actividad biológica del agente y/o disminuyendo la degradación in vivo, incremento la vida promedio in vivo, reduciendo la toxicidad o inmunogenicidad in vivo. Los agentes de unión pueden que comprender además una secuencia enlazadora que conecta el péptido y el vehículo. El péptido o péptidos se une directamente o indirectamente con una secuencia enlazadora al vehículo en el N-terminal, C-terminal o una cadena lateral del aminoácido del péptido. En esta modalidad, los agentes de unión de la presente invención tienen la siguiente estructura: (X1 )a-F1-(X2)b, o multímeros de la misma; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 son cada uno seleccionado independientemente de (L1)c-P1; (L1)c-P1-(L2)d-P2; (L )c-P1-(L2)d-P2 -(L3)e-P3; y (L1)c-P1-(L2)d-P2 -(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina; y L , L2, L3 y L4 son cada uno enlazadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que por lo menos uno de a y b sea 1. Cualquier péptido que contiene un residuo de cisteinilo puede reticularse con otro péptido que contiene Cys, cualquiera o ambos de los cuales puede ligarse a un vehículo. Cualquier péptido que tiene más de un residuo Cys puede formar un enlace de disulfuro del intrapéptido, igualmente. En una modalidad, el vehículo es un dominio Fe, definido más adelante. Esta modalidad se refiere a como un "pepticuerpo". Como se describe en la presente, el término "pepticuerpo" se refiere a una molécula que comprende un dominio del anticuerpo Fe unido a por lo menos un péptido. La producción de pepticuerpos se describe generalmente en la publicación PCT WO 00/24782, publicada del 4 de mayo, 2000, la cual se incorpora en la presente por referencia. Los pepticuerpos ejemplares se proporcionan como las configuraciones 1x y 2x con una copia y dos copias del péptido (unido en tándem) respectivamente, como se describe en los Ejemplos más adelante.

Péptidos Como se describe en la presente el término "péptido" se refiere a las moléculas de aproximadamente 5 a aproximadamente 90 aminoácidos ligados por los enlaces del péptido. Los péptidos de la presente invención son preferiblemente entre aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y 30 aminoácidos en longitud, y más preferiblemente entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos en longitud, y son capaces de unir a la proteína de la miostatina. Los péptidos de la presente invención pueden comprender parte de una secuencia de proteínas que ocurren naturalmente, pueden ser secuencias aleatorizadas derivadas de las proteínas que ocurren naturalmente, o pueden ser secuencias enteramente aleatorizadas. Los péptidos de la presente invención se pueden generar por cualquier método conocido en la técnica que incluyen síntesis química, digestión de proteínas, o tecnología recombinante. La exhibición fago e identificación del ARN-péptido, y otras técnicas de identificación de afinidad son particularmente útiles para generar los péptidos capaces de unir la miostatina. La tecnología exhibición de fago se describe, por ejemplo, en Scott y colaboradores Science 249: 386 (1990); Devlin y colaboradores, Science 249: 404 (1990); Patente Norteamericana No. 5,223,409, expedida el 29 de junio, 1993; Patente Norteamericana No. 5,733,731, expedida el 31 de marzo, 1998; Patente Norteamericana No. 5,498,530, expedida 12 de marzo, 1996; Patente Norteamericana No. 5,432,018, expedida el 11 de julio, 1995; Patente Norteamericana No. 5,338,665, expedida el 16 de agosto, 1994; Patente Norteamericana No. 5,922,545, expedida el 13 de julio, 1999; WO 96/40987, publicada el 19 de diciembre, 1996; y WO 98/15833, publicada el 16 de abril, 1998, cada una de las cual se incorpora en la presente por referencia. Usando bibliotecas en fago, las secuencias del péptido aleatorias son exhibidas por fusión con proteínas de revestimiento del fago filamentoso. Normalmente, los péptidos exhibidos son eluídos por afinidad específicamente o no específicamente contra la molécula objeto. Los fagos conservados pueden enriquecerse por redondeos sucesivos mediante purificación de afinidad y repropagación. Los mejores péptidos de unión son seleccionados por análisis adicional, por ejemplo, usando ELISA de fago, descritos más adelante, y después secuenciados. Opcionalmente, las bibliotecas de mutagénesis pueden crearse e identificarse para además optimizar la secuencia de los mejores aglutinantes (Lowraan, Ann Rev Biophys Biomol Struct 26:401-24 (1997)). Otros métodos para generar los péptidos de unión de la miostatina incluyen técnicas de selección de afinidad adicionales conocidas en la técnica. Una biblioteca del péptido puede fusionarse en el carboxilo terminal del represor lac y expresado en E. coli. Otro método basado en E. coli permite la exhibición en la membrana externa celular por fusión con una lipoproteína asociada con peptidoglican (PAL por sus siglas en inglés). Más adelante, este y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "exhibición de E. coli." En otro método, la traducción del ARN aleatorio es interrumpida antes de la liberación de la ribosoma, dando por resultado una biblioteca de polipéptidos con su ARN asociado todavía unido. Más adelante, este y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "exhibición de ribosoma." Otros métodos utilizan la unión química de los péptidos a ARN. Ver, por ejemplo, Roberts and Szostak, Proc Nati Acad Sci USA, 94: 12297-303 (1997). Más adelante, esto y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "identificación del ARN-péptido." Los métodos de identificación de doble híbrido de levadura también pueden utilizarse para identificar péptidos de la invención que unen a la miostatina. Además, se han desarrollado bibliotecas de péptido químicamente derivadas en las cuales los péptidos se inmovilizan en materiales estables, no-biológicos, tal como barras de polietileno o resinas de solvente-permeables. Otra biblioteca de péptido químicamente derivada utiliza fotolitografía para explorar los péptidos inmovilizados en diapositivas de vidrio. Más adelante, este y los métodos relacionados se refieren colectivamente como "identificación del péptido químico." La identificación del péptido químico puede ser ventajosa en que permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos, así como elementos de no-péptido.

Se revisan los métodos biológicos y químicos en Wells and Lowman, Curr Opin Biotechnol 3:355-62 (1992). Adicionalmente, los péptidos seleccionados capaces de unir la miostatina pueden además mejorarse con el uso del "diseño racional". En este proceso, los cambios etapa por etapa se realizan en una secuencia del péptido y el efecto de la sustitución en la afinidad de unión o especificidad del péptido o una cierta otra propiedad del péptido se observa en un ensayo apropiado. Un ejemplo de esta técnica es sustituir un solo residuo a la vez con alanina, referida como una "trayectoria de alanina" o una "exploración de alanina". Cuando se sustituyen dos residuos, se refiere a una "trayectoria de alanina doble". El péptido resultante que contiene sustituciones del aminoácido se prueba para la actividad mejorada o una cierta propiedad ventajosa adicional. Además, el análisis de la estructura de una interacción de proteína-proteína puede también utilizarse para sugerir péptidos que imiten la interacción de una proteína más grande. En tal análisis, la estructura de cristal de una proteína puede sugerir la identidad y orientación relativa de los residuos críticos de la proteína, de la cual un péptido puede diseñarse. Ver, por ejemplo, Takasaki y colaboradores, Nature Biotech 15:1266 (1977). Estos métodos también pueden utilizarse para investigar la interacción entre una proteína objeto y péptidos seleccionados par la exhibición de fago u otros procesos de selección de afinidad, de tal modo sugiriendo otras modificaciones de péptidos para incrementar la afinidad de unión y la habilidad del péptido de inhibir la actividad de la proteína. En una modalidad, los péptidos de la presente invención se generan como familias de péptidos relacionados. Los péptidos ejemplares son representados por la SEC ID NO: 1 a 132. Estos péptidos ejemplares fueron derivados con un proceso de selección en el cual los mejores aglutinantes generados por tecnología de exhibición de fago además se analizaron por ELISA de fago para obtener péptidos candidato por una técnica de selección de afinidad tal como tecnología de exhibición de fago como se describe en la presente. Sin embargo, los péptidos de la presente invención pueden producirse por cualquier número de métodos conocidos que incluyen síntesis química como se describe más adelante. Los péptidos de la presente invención pueden además mejorarse por el proceso de "maduración de afinidad". Este procedimiento se dirige para incrementar la afinidad o la actividad del los péptidos y pepticuerpos de la presente invención usando la exhibición de fago u otras tecnologías de selección. De acuerdo con una secuencia de consenso, las bibliotecas de exhibición de fago secundarias dirigidas, por ejemplo, pueden generarse en las cuales los aminoácidos "núcleo" (determinados de la secuencia de consenso) son constante mantenidos o afectados en frecuencia de ocurrencia. Alternativamente, una secuencia de péptido individual puede utilizarse para generar una biblioteca de exhibición de fago alterada, dirigida. El cribado de tales bibliotecas bajo condiciones más rigurosas puede producir péptidos con unión mejorada a la miostatina, unión selectiva a la miostatina, o con una cierta propiedad deseada adicional. Sin embargo, los péptidos que tienen las secuencias maduradas de afinidad pueden después producirse por cualquier número de métodos conocidos que incluyen síntesis química o recombinante. Estos péptidos se utilizan para generar agentes de unión tal como pepticuerpos de varias configuraciones que exhiben mayor actividad inhibidora en ensayos basados en células y ensayos in vivo. El ejemplo 6 más adelante describe la maduración de afinidad de los péptidos de "primera ronda" descritos anteriormente para producir péptidos madurados con afinidad. Los pepticuerpos madurados con afinidad ejemplar se presentan en las Tablas IV y V. Los pepticuerpos 1x y 2x resultantes hechos de estos péptidos son después adicionalmente caracterizados para afinidad de unión, habilidad para neutralizar la actividad de la miostatina, especificidad a miostatina en comparación con ciertos otros miembros de la familia TGF-ß tal como activina, y para actividad in vitro e in vivo adicional, como se describe más adelante. Los péptidos y pepticuerpos Madurados con afinidad son referidos por el prefijo "m" antes de su nombre de familia para distinguirlos de los péptidos de primera ronda de la misma familia.

Los péptidos de primera ronda ejemplares elegidos para la maduración de afinidad adicional de acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes péptidos: TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEC ID NO: 33), y péptidos lineales Linear-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEC ID NO: 104), Linear-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEC ID NO: 117), Linear-17, RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEC ID NO: 119), Linear-20 YREMSMLEGLLD VLERLQHY (SEC ID NO: 122), Linear-21 HNSSQ LLSELIMLVGSMMQ (SEC ID NO: 123), Linear-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEC ID NO: 126). Las familias maduradas con afinidad de cada uno de éstos se presentan más adelante en las Tablas IV y V. Los péptidos de la presente invención también comprenden variantes y derivados de los péptidos seleccionados que son capaces de unir la miostatina. Como se describe en la presente el término "variante" se refiere a péptidos que tienen uno o más aminoácidos insertados, eliminados, o sustituidos en la secuencia de aminoácidos original, y que siguen siendo capaces de unir a la miostatina. Las variantes de inserción y sustitución pueden contener aminoácidos naturales así como aminoácidos que no ocurren naturalmente. Como se describe en la presente el término "variante" incluye fragmentos de los péptidos que todavía conservan la habilidad de unir a la miostatina. Como se describe en la presente, el término "derivado" se refiere a péptidos que se han modificado químicamente de alguna manera distinta de las variantes de inserción, eliminación y sustitución. Las variantes y derivados de los péptidos y pepticuerpos de la presente invención se describen más completamente más adelante. Vehículos Como se describe en la presente el término "vehículo" se refiere a una molécula que puede unirse a uno o más péptidos de la presente invención. Preferiblemente, los vehículos confieren por lo menos una propiedad deseada a los agentes de unión de la presente invención. Los péptidos solamente son probables de eliminarse in vivo por la filtración renal, por mecanismos de eliminación celular en el sistema reticuloendotelial, o por degradación proteolítica. La adhesión a un vehículo mejora el valor terapéutico de un agente de unión reduciendo la degradación del agente de unión y/o incrementando la vida promedio, reduciendo la toxicidad, reduciendo la inmunogenicidad, y/o incrementado la actividad biológica del agente de unión. Los vehículos ejemplares incluyen los dominios Fe; polímeros lineales tal como polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrán; un polímero de cadena ramificada (Ver por ejemplo Patente Norteamericana No. 4,289,872 de Denkenwalter y colaboradores, expedida el 15 de septiembre, 1981; Patente Norteamericana No. 5,229,490 de Tam, expedida el 20 de mayo, 1993; WO 93/21259 por Frechet y colaboradores, publicada el 28 de octubre de 1993); un lípido; un grupo de colesíerol (tal como un esteroide); un carbohidrato o oligosacárido; o cualquier proteína, polipéptido o péptido natural o sintético que une a un receptor de recuperación. En una modalidad, los agentes de unión de miostatina de la presente invención tienen por lo menos un péptido unido a por lo menos un vehículo (F1, F2) con la N-terminal, C-terminal o una cadena lateral de uno de los residuos del aminoácido del péptido(s). Los vehículos múltiples también pueden utilizarse; por ejemplo como un dominio Fe en cada terminal o un dominio Fe en una terminal y un grupo PEG en la otra terminal o una cadena lateral. Un dominio Fe es un vehículo preferido. Como se describe en la presente, el término "dominio Fe" que comprende las moléculas y secuencias variables Fe nativo y Fe como se define más adelante. Como se describe en la presente el término "Fe nativo" se refiere a un fragmento de unión no-antígeno de un anticuerpo o la secuencia de aminoácidos del fragmento que es producido por técnicas de ADN recombinante o por la división enzimática o química de anticuerpos intactos. Un Fe preferido es un Fe completamente humano y puede originar de cualquiera de las inmunoglobulinas, tal como I gG 1 e lgG2. Sin embargo, las moléculas de Fe que son parcialmente humanas, u originan de especie no humana también se incluyen en la presente. Las moléculas de Fe nativo se componen de polipéptidos monoméricos que pueden unirse en formas diméricas o multimérica por asociación covalente (es decir enlaces de disulfuro) y no covalente. El número de enlaces de disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas de Fe nativo van de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclase (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, IgAl, lgGA2). Un ejemplo de un Fe nativo es un dímero de disulfuro-enlazado que resulta de la digestión de la papaína de un IgG (Ver Ellison y colaboradores (1982), Nucí Acids Res 10: 4071-9). El término "Fe nativo" como se describe en la presente se utiliza para referir a las formas monomérica, dimérica y multimérica. Como se describe en la presente, el término "variante de Fe" se refiere a una forma modificada de una secuencia de Fe nativo que une al receptor de recuperación se mantiene, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 97/34631 y WO 96/32478, que se incorporan en la presente por referencia. Las variantes Fe pueden construirse por ejemplo, residuos de sustitución o eliminación, residuos de inserción o porciones truncadas que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos también pueden ser aminoácidos alterados, tal como ácidos peptidomiméticos o D-amino. Las variantes Fe pueden ser deseables por un número de razones, varias de las cuales se describen más adelante. Las variantes Fe ejemplares incluyen moléculas y secuencias en las cuales: 1. Los sitios involucrados en la formación del enlace de disulfuro se eliminan. Tal eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula hospedadora usada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, el segmento que contiene cisteína en el N-terminal puede truncarse o los residuos de cisteína pueden eliminarse o sustituirse con otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo). Incluso cuando se eliminan los residuos de cisteína, los dominios de cadena de Fe solos pueden aún formar un dominio Fe dimérico que se ligue no covalentemente. 2. Un Fe natural es modificado para hacerlo más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, uno puede eliminar la secuencia de PA cerca del N-terminal de un Fe nativo normal, que puede reconocerse por una enzima digestiva en E. coli tal como iminopeptidasa de prolina. Uno puede también agregar un residuo de metionilo N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa recombinantemente en una célula bacteriana tal como E. coli. 3. Una porción del N-terminal de un Fe nativo se elimina para prevenir la heterogeneidad del N-terminal cuando se expresa en una célula hospedadora seleccionada. Para este propósito, uno puede eliminar cualquiera de los primeros 20 residuos de aminoácidos en el N-terminal, particularmente en estas posiciones 1 , 2, 3, 4 y 5. 4. Se eliminan uno o más sitios de glicosilación. Los residuos que son normalmente glicosilados (por ejemplo, asparagina) pueden conferir la respuesta citolítica. Tales residuos pueden eliminarse o sustituirse con residuos no glicosilados (por ejemplo, alanina). 5. Los sitios involucrados en la interacción con el complemento, tal como el sitio de unión C1q, se eliminan. Por ejemplo, uno puede eliminar o sustituir la secuencia EKK de I gG 1 humano. La selección del complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención y así puede evitarse con tal variante Fe. 6. Se eliminan los sitios que afectan la unión a los receptores Fe con excepción de un receptor de recuperación. Un Fe nativo puede tener sitios para la interacción con ciertas células blancas de la sangre que no se requieran para las moléculas de fusión de la presente invención y así pueden eliminarse. 7. Se elimina el sitio ADCC. Los sitios ADCC se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Motee Immunol 29 (5):633-9 (1992) con respecto a los sitios ADCC en lgG1. Estos sitios, también, no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y así pueden eliminarse. 8. Cuando el Fe nativo se deriva de un anticuerpo no humano, el Fe nativo puede ser humanizado. Normalmente, para humanizar un Fe nativo, uno sustituirá los residuos seleccionados en el Fe nativo no humano con los residuos que se encuentran normalmente en el Fe nativo humano. Las técnicas para la humanización del anticuerpo son bien conocidas en la técnica. El término "dominio Fe" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, es digerido del anticuerpo entero o producido por otros medios. Como se describe en la presente el término "multímero" como se aplica a dominios o moléculas Fe que comprenden dominios Fe se refiere a moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptido asociadas covalentemente, no covalentemente, o por interacciones covalentes y no covalentes. Las moléculas IgG normalmente forman los dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros, o tetrámeros. Los multímeros pueden formarse explotando la secuencia y actividad resultante de la fuente de Ig nativa del Fe o derivatizando tal Fe nativo. El término "dímero" como se aplica para los dominios o moléculas Fe que comprenden los dominios Fe se refiere a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptido asociadas covalentemente o no covalentemente. Adicionalmente, un vehículo alternativo de acuerdo con la presente invención es una proteína del dominio no Fe, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o una molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de unir a un receptor de recuperación. Por ejemplo, uno podrá utilizar como un vehículo un polipéptido como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,739,277, expedida el 14 de abril, 1998 para Presta y colaboradores. Los péptidos también podrán seleccionarse por exhibición de fago para unirse al receptor de recuperación FcRn. Tales compuestos de unión el receptor de recuperación también se incluyen dentro del significado de "vehículo" y están dentro del alcance de esta invención. Tales vehículos deben seleccionarse para la vida promedio incrementada (por ejemplo, evitando las secuencias reconocidas por proteasas) e inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, favoreciendo las secuencias no inmunogenéticas, como se descubrió en la humanización del anticuerpo). Además, los vehículos del polímero también pueden utilizarse para construir los agentes de unión de la presente invención. Varios medios para unir las porciones químicas útiles como los vehículos que están actualmente disponibles, ver, por ejemplo, Patent Cooperation Treaty ("PCT") Publicación Internacional No. WO 96/11953, titulada "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods," incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Esta publicación PCT describe, entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros solubles en agua al N-terminal de proteínas. Un vehículo de polímero preferido es polietilenglicol (PEG). El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular adecuado y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG preferiblemente irá de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, de manera más preferible de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG serán unidos generalmente a los compuestos de la invención vía la acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo en la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo en el compuesto inventivo (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster). Una estrategia útil para la PEGilación de péptidos sintéticos consiste de la combinación, con la formación de una unión conjugada en solución, un péptido y una porción PEG, cada uno produce una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva entre sí. Los péptidos pueden prepararse fácilmente con síntesis de fase sólida convencional como se conoce en la técnica. Los péptidos son "preactivados" con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores se purifican y caracterizan completamente antes de reaccionar con la porción PEG. La ligación del péptido con PEG generalmente ocurre en fase acuosa y puede supervisarse fácilmente por CLAR analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden purificarse fácilmente por CLAR preparativa y caracterizarse por CLAR analítica, análisis de aminoácido y espectrometría de masas láser de desorción. Los polímeros del polisacárido son otro tipo de polímero soluble en agua que puede utilizarse para la modificación de la proteína. Los dextranos son polímeros de polisacárido que comprenden de subunidades individuales de glucosa predominantemente ligadas por los ligados a1-6. El dextrán por sí mismo está disponible en muchos intervalos de peso molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 70 kDa. El dextrán es un polímero soluble en agua adecuado para uso en la presente invención como vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe). Ver, por ejemplo, documentos WO 96/11953 y WO 96/05309. Se ha descrito el uso del dextrán conjugado por inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico; Ver, por ejemplo, Publicación de Patente Europea No. 0 315 456, la cual se incorpora por este medio por referencia. El dextrán de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa se prefiere cuando el dextrán se utiliza como un vehículo de acuerdo con la presente invención. Enlazadores Los agentes de unión de la presente invención pueden opcionalmente comprender un grupo "enlazador". Los enlazadores sirven sobre todo como espaciador entre un péptido y los vehículos o entre dos péptidos de los agentes de unión de la presente invención. En una modalidad, el enlazador se compone de aminoácidos enlazados juntos por enlaces de péptido, preferiblemente de 1 a 20 aminoácidos ligados por enlaces de péptido, en donde los aminoácidos se seleccionan de 20 aminoácidos que ocurren naturalmente. Uno o más de estos aminoácidos puede glicosilarse, como es entendido por los expertos en la técnica. En una modalidad, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferiblemente, un enlazador se compone de una mayoría de los aminoácidos que son estéricamente ininterrumpidos, tal como glicina y alanina. Así, los enlazadores ejemplares son poliglicinas (particularmente (Gly)5, (Gly)8), poli(Gly-Ala) y polialaninas. Como se describe en la presente, la designación "g" se refiere a enlazadores de homopéptido de glicina. Como se muestra en la Tabla II, "gn" se refiere al enlazador 5x gly en N-terminal, mientras que "ge" se refiere al enlazador 5x gly en C-terminal. Las combinaciones de Gly y Ala también se prefieren. Una secuencia de enlazador ejemplar útil para construir los agentes de unión de la presente invención es la siguiente: gsgsatggsgstassgsgsatg (SEC ID NO: 305). Esta secuencia del enlazador se refiere como la secuencia "k" o 1k. Las designaciones "kc", como se encuentran en la Tabla II, se refieren al enlazador k en C-terminal, mientras que la designación "kn", se refiere al enlazador k en N-terminal. Los enlazadores de la presente invención también pueden ser enlazadores sin péptido. Por ejemplo, pueden utilizarse enlazadores alquilo por ejemplo -N H-(CH2)S-C(0)-, en donde s = 2-20. Estos enlazadores alquilo pueden sustituirse adicionalmente por cualquier grupo no estéricamente ininterrumpido tal como alquilo inferior (por ejemplo, 1 a 6 átomos de carbono) acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc. Un enlazador ejemplar sin péptido es un enlazador de PEG, y tiene un peso molecular de 100 a 5000 kDa, preferiblemente 100 a 500 kDa. Los enlazadores del péptido se pueden alterar para formar derivados de manera similar como anteriormente. Agentes de Unión Ejemplares Los agentes de unión descritos en la presente comprenden por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina. En una modalidad, el péptido de unión de miostatina está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, en otra, entre aproximadamente 10 y 30 aminoácidos en longitud, y en otra, entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos en longitud. En una modalidad el péptido de unión de la miostatina que comprende la secuencia de aminoácidos WMCPP (SEC ID NO: 633). En la otra modalidad, el péptido de unión de la miostatina que comprende la secuencia de aminoácidos Ca a? Wa^WMCPP (SEC ID NO: 352), en donde a1 a2 y a3 se seleccionan de un aminoácido neutral hidrofóbico, polar neutral, o básico. En otra modalidad el péptido de unión de miostatina comprende la secuencia de aminoácidos Cbi b? Wb3WMCPP (SEC ID NO: 353), en donde bi se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido está entre 10 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. En otra modalidad, el péptido de unión de la miostatina comprende la fórmula: C C7C^C4C^CRCc7CftWcQWMCPPcinCiiCi9C^ (SEC ID NO: 354), en donde: c-i está ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o acídico; c3 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o acídico; c4 está ausente o es cualquier aminoácido; c5 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o acídico; c6 está ausente o es un aminoácido hidrofób.ico neutral, polar neutral, o acídico; c7 es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o básico; c8 es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o básico; c9 es un aminoácido polar o básico hidrofóbico, neutral básico; y Ci0 a Ci3 es cualquier aminoácido; y en donde el péptido está entre 20 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. En una modalidad relacionada el péptido de unión de la miostatina comprende la fórmula: d1d2d3d4d5d6Cd7d8^9WMCPPd1od11dl2d13 (SEC ID NO: 355), en donde: di está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o acídico; d3 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o acídico; d4 está ausente o es cualquier aminoácido; d5 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o acídico; d6 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o básico; d7 es seleccionado uno de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; d8 es seleccionado uno de cualquiera de R, S, Q; d9 es seleccionado uno de cualquiera de P, R y Q, y di0 a d13 es seleccionado de cualquier aminoácido, y en donde el péptido está entre 20 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. Las modalidades adicionales de agentes de unión comprenden por lo menos uno de los siguientes péptidos: (1) un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia WYe,e?Ye^G, (SEC ID NO: 356) en donde ß? es P, S o Y, e2 es C o Q, y e3 es G o H, en donde el péptido está entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. (2) un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia fiEMI_f?SLf,f4LL. (SEC ID NO: 455), en donde f, es M o I, f2 es cualquier aminoácido, f3 es L o F, f4 es E, Q o D; y en donde el péptido está entre 7 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. (3) un péptido capaz de unir la miostatina en donde el péptido comprende la secuencia (SEC ID NO: 456), en donde g1 es Q, D o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, g4 es L, W, F, o Y, y en donde el péptido está entre 8 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. (4) un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia hi h2h3h h5h6h7h8h9 (SEC ID NO: 457), en donde h, es R o D, h2 es cualquier aminoácido, h3 es A, T, S o Q, h4 es L o M, h5 es L o S, h6 es cualquier aminoácido, h7 es F o E, h8 es W, F o C, h9 es L, F, M o K, y en donde el péptido está entre 9 y 50 aminoácidos en longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. En una modalidad, los agentes de unión de la presente invención tienen la siguiente estructura generalizada: (X )a-F1-(X2)b, o multíme/os del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 son cada uno seleccionados independientemente de -(L1)CP1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)c-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P -(L3)c-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina; y L1, L2, L3 y L4 son cada uno enlazadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que por lo menos uno de a y b es 1. En una modalidad los agentes de unión tienen esta estructura generalizada, los péptidos P1, P2, P3, y P4 pueden seleccionarse de los péptidos proporcionados pueden seleccionarse de uno o más péptidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias: SEC ID NO: 633, SEC ID NO: 352, SEC ID NO: 353, SEC ID NO: 354, SEC ID NO: 355, SEC ID NO: 356, SEC ID NO: 455, SEC ID NO: 456, o SEC ID NO: 457. En otra modalidad, P , P2, P3, y P4 se seleccionan independientemente de uno o más péptidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias: SEC ID NO: 305 a 351 y SEC ID NO: 357 a 454. En una modalidad adicional, los vehículos de los agentes de unión que tienen la fórmula general anterior son los dominios Fe. Los péptidos por lo tanto están fusionados a un dominio Fe, directa o indirectamente, de tal modo proporcionando pepticuerpos. Los pepticuerpos de la presente invención exhiben una afinidad de unión alta para la miostatina y pueden inhibir la actividad de la miostatina como se demuestra por ensayos in vitro e in vivo probados en animales proporcionados en la presente. La presente invención también proporciona moléculas del ácido nucleico que comprenden polinucleótidos que codifican los péptidos, pepticuerpos y variantes de péptido y pepticuerpo y derivados de la presente invención. Las secuencias de nucleótidos ejemplares se dan más adelante. Variantes y Derivados de Péptidos y Pepticuerpos Los agentes de unión descritos en la presente también comprenden variantes y derivados de los péptidos y pepticuerpos descritos en la presente. Puesto que los péptidos y pepticuerpos de la presente invención pueden describirse en términos de su secuencia de aminoácidos, los términos "variantes" y "derivados" pueden mencionarse para aplicarse a un solo péptido, o un péptido como componente de un pepticuerpo. Como se utiliza en la presente, el término "variantes del péptido" se refiere a péptidos o pepticuerpos que tienen uno o más residuos de aminoácidos insertados, eliminados o sustituidos en la secuencia de aminoácidos original y que conservan la habilidad de unir a la miostatina y modificar su actividad. Como se describe en la presente, los fragmentos de los péptidos o pepticuerpos se incluyen dentro de la definición de " variantes". Se entiende que cualquier péptido o pepticuerpo dado puede contener un o dos o tres tipos de variantes. Las variantes insercionales y sustitutivas pueden contener aminoácidos naturales, así como aminoácidos que no ocurren naturalmente o ambos. Las variantes del péptido y pepticuerpo también incluyen péptidos y pepticuerpos maduros en donde se eliminan las secuencias líder o señal, y las proteínas resultantes tienen residuos amino terminal adicionales, donde los aminoácidos pueden ser naturales o no-naturales. Los pepticuerpos con un residuo de metionilo adicional en la posición -1 del aminoácido (Met"1-pepticuerpo) son contemplados, al igual que los pepticuerpos con residuos de metionina y lisina adicionales en las posiciones -2 y -1 (Met"2-I_ys"1-). Las variantes que tienen residuos Met, Met-Lys, Lys (o uno o más residuos básicos, en general) son particularmente útiles para la producción de la proteína recombinante mejorada en células hospedadoras bacterianas. Las variantes de péptido o pepticuerpo de la presente invención también incluye péptidos que tienen residuos de aminoácidos adicionales que resultan del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, el uso de vectores comercialmente disponibles que expresan un polipéptido deseado como parte del producto de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un residuo de glicina adicional en la posición-1 del aminoácido después de la división del componente de GST del polipéptido deseado. Las variantes resultantes de la expresión en otros sistemas del vector también se contemplan, que incluyen aquéllas en donde los marcados de histidina se incorporan en la secuencia de aminoácidos, generalmente en el carboxi y/o amino terminal de la secuencia. En un ejemplo, se proporcionan las variantes insercionales en donde uno o más residuos de aminoácidos, o aminoácidos que ocurren naturalmente o que no ocurren naturalmente, se agregan a una secuencia de aminoácidos del péptido. Las inserciones pueden situarse en cualquiera o ambas terminales de la proteína, o pueden colocarse dentro de las regiones internas de la secuencia de aminoácidos del pepticuerpo. Las variantes insercionales con residuos adicionales en cualquier o ambas terminales pueden incluir, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen marcados u objetos de aminoácidos. Las variantes insercionales incluyen péptidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos se agregan a la secuencia de aminoácidos del péptido o fragmento de los mismos. Las variantes insercionales también incluyen proteínas de fusión en donde la amino y/o carboxi terminal del péptido o pepticuerpo está fusionada a otro polipéptido, un fragmento del mismo o aminoácidos que no se reconocen generalmente para ser parte de ninguna secuencia de proteína específica. Los ejemplos de tales proteínas de fusión son polipéptidos inmunogenéticos, proteínas con vidas promedio de circulación largas, tal como regiones constantes de inmunoglobulina, proteínas del marcador, proteínas o polipéptidos que faciliten la purificación del péptido o pepticuerpo deseado, y secuencias del polipéptido que promuevan la formación del promotor de proteínas multimérica (tal como motivos cremallera de leucina que son útiles en la formación/estabilidad del dímero). Este tipo de variante ¡nsercional tiene generalmente toda o una porción sustancial de la molécula nativa, ligada en la N- o C-terminal, todo o una porción de un segundo polipéptido. Por ejemplo, las proteínas de fusión utilizan normalmente secuencias líder de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un huésped heterólogo. Otra proteína de fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítope de anticuerpo, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de división en o cerca de la unión de fusión facilitará la eliminación del polipéptido extraño después de la purificación. Otras fusiones útiles incluyen uniones de dominios funcionales, tal como sitios activos de enzimas, dominios de glicosilación, señales de marcado celular o regiones transmembrana. Existen varios sistemas de expresión de la proteína de fusión comercialmente disponibles que pueden utilizarse en la presente invención. Particularmente los sistemas útiles incluyen pero no se limitan al sistema glutationa-S-transferasa (GST) (Pharmacia), el sistema de proteína de unión a maltosa (NEB, Beverley, MA), el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), y el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estos sistemas son capaces de producir péptidos recombinantes y/o pepticuerpos que llevan solamente un número pequeño de aminoácidos adicionales, que son poco probables de afectar significativamente la actividad del péptido o pepticuerpo. Por ejemplo, el sistema FLAG y el sistema 6xHis agregan solamente secuencias cortas, de las cuáles se conocen por ser pobremente antigénicas y de las cuáles no afecta adversamente el plegado de un polipéptido a su conformación nativa. Otra fusión N-terminal que se contempla para ser útil es la fusión de un dipéptido Met-Lys en la región N- terminal de la proteína o péptidos. Tal fusión puede producir incrementos beneficiosos en la expresión o actividad de la proteína. Otros sistemas de fusión producen híbridos del polipéptido donde es deseable eliminarse para suprimir al asociado de fusión del péptido o pepticuerpo deseado. En una modalidad, una el asociado de fusión está ligado al pepticuerpo recombinante por una secuencia del péptido que contiene una secuencia de reconocimiento específica para una proteasa. Los ejemplos de secuencias adecuadas son los reconocidos por la proteasa del Tobacco Etch Virus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) o factor XA (New England Biolabs, Beverley, MA). La invención también proporciona polipéptidos de fusión que comprenden todo o una parte de un péptido o pepticuerpo de la presente invención, en combinación con el factor de tejido truncado (tTF por sus siglas en inglés). tTF es un agente de marcado vascular que consiste en una forma truncada de una proteína que induce la coagulación humana que actúa como un agente de coagulación del vaso sanguíneo del tumor, como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos.: 5,877,289; 6,004,555; 6,132,729; 6,132,730; 6,156,321; y patente Europea No. EP 0988056. La fusión de tTF al pepticuerpo o péptido anti-miostatina, o fragmentos del mismo facilita la liberación de antagonistas anti-miostatina a células objeto, por ejemplo, células del músculo esquelético, células del músculo cardíaco, fibroblastos, pre-adipocitos, y posiblemente adipocitos. En otro aspecto, la invención proporciona variantes de eliminación en donde uno o más residuos de aminoácidos en un péptido o pepticuerpo se eliminan. Las eliminaciones pueden efectuarse en uno o ambo terminal del pepticuerpo, o de la eliminación de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos del pepticuerpo. Las variantes de eliminación necesariamente incluyen todos los fragmentos de un péptido o pepticuerpo. En aún otro aspecto, la invención proporciona las variantes de sustitución de péptidos y pepticuerpos de la invención. Las variantes de sustitución incluyen los péptidos y pepticuerpos en donde uno o más residuos de aminoácidos se eliminan y sustituyen por uno o más aminoácidos alternativos, donde los aminoácidos pueden ocurrir naturalmente o no ocurrir naturalmente. Las variantes sustitutivas generan péptidos o pepticuerpos que son "similares" al péptido o pepticuerpo original, en donde las dos moléculas tienen cierto porcentaje de aminoácidos que son idénticos. Las variantes de sustitución incluyen sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 y 20 aminoácidos dentro de un péptido o pepticuerpo, en donde el número de sustituciones puede ser de hasta diez por ciento de los aminoácidos del péptido o pepticuerpo. En un aspecto, las sustituciones son conservadoras en naturaleza, sin embargo, la invención contiene las sustituciones que también son no- conservadoras y también incluye aminoácidos poco convencionales. La identidad y similaridad de los péptidos y pepticuerpos relacionados pueden calcularse fácilmente por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); y Carillo y colaboradores, SIAMJ. Applied Math., 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad de relación o por ciento de dos péptidos o polipéptidos, o un polipéptido y un péptido, se diseñan para dar la igualación más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos del programa de computadora preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa de GCG, que incluyen GAP (Devereux y colaboradores, Nucí. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, adison, Wl, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul etal, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX está públicamente disponible del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes manual (BLAST Manual, Altschul y colaboradores NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul y colaboradores, supra (1990)). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido puede también utilizarse para determinar la identidad. Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en la igualación de solamente una región corta de las dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener la identidad de la secuencia muy alta aunque no hay relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, en ciertas modalidades, el método de alineación seleccionado dará lugar a una alineación que se extienda por lo menos diez por ciento de la longitud completa del polipéptido objeto que es comparado, es decir, por lo menos 40 aminoácidos contiguos donde las secuencias de por lo menos 400 aminoácidos se compararán, 30 aminoácidos contiguos donde las secuencias de por lo menos 300 a aproximadamente 400 aminoácidos se compararán, por lo menos 20 aminoácidos contiguos donde las secuencias de 200 a aproximadamente 300 aminoácidos se compararán, y por lo menos 10 aminoácidos contiguos donde las secuencias de aproximadamente 100 a 200 aminoácidos se compararán. Por ejemplo, usando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl), dos polipéptidos para los cuales el porcentaje de identidad de la secuencia a determinarse se alinean para la igualación óptima de sus aminoácidos respectivos (la "extensión de igualación", como se determinó por el algoritmo). En ciertas modalidades, una alteración de la abertura de espacio (que se calcula normalmente como 3x la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que es utilizada; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada igualación perfecta del aminoácido por la matriz de comparación particular) y una de extensión de espacio (que es generalmente 1/10 veces la alteración de la abertura de espacio), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan en combinación con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff y colaboradores, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sc¡ USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se utiliza por el algoritmo. En ciertas modalidades, por ejemplo, los parámetros para una comparación de la secuencia del polipéptido pueden hacerse con lo siguiente: Algoritmo: Needleman y colaboradores, J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y colaboradores, supra (1992); Alteración de Espacio: 12; Alteración de Longitud de Espacio: 4; Umbral de Similaridad: 0, junto con ninguna alteración para los espacios finales. En ciertas modalidades, los parámetros para las comparaciones de la secuencia de la molécula de polinucleótido (como se contrapone a una secuencia de aminoácidos) pueden hacerse con lo siguiente: Algoritmo: Needleman y colaboradores, supra (1970); Matriz de comparación: igualaciones = +10, desigualaciones = 0; Alteración de Espacio: 50: Alteración de Longitud de Espacio: 3. Otros algoritmos ejemplares, alteraciones de abertura de espacio, alteraciones de extensión de espacio, matrices de comparación, umbrales de similaridad, etc. pueden utilizarse, incluyendo los indicados en el Program Manual, Wisconsin Package, Versión 9, septiembre de 1997. Las opciones particulares que se harán serán evidentes para los expertos en la técnica y dependerán de la comparación específica que se hará, tal como ADN-a-ADN, proteína-a-proteína, proteína-a-ADN ; y además, si la comparación está entre los pares dados de secuencias (en el caso que GAP o BestFit se prefieren generalmente) o entre una secuencia y una base de datos grande de secuencias (en el caso que FASTA o BLASTA se prefieran). Los esteroisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales (que no ocurren naturalmente), aminoácidos que no ocurren naturalmente tal como aminoácidos a-, a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los péptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos que no ocurren naturalmente incluyen, por ejemplo: ácido aminoadípico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido aminobutírico, ácido piperidínico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminoisobutírico, ácido aminopimélico, ácido diaminobutírico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, a110-hidroxilisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, n-metilvalina, norvalina, norleucina, oritina, 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetillisina, e-?-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina , 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina, y otros aminoácidos similares y aminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). Los residuos que ocurren naturalmente pueden dividirse en (traslapado) clases basadas en propiedades de cadena lateral comunes: 1) hidrofóbico neutral: Met, Ala, Val, Leu, He, Pro, Trp, Met, Phe; 2) polar neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Gly; 3) acidic: Asp, Glu; 3) acídico: Asp, Glu; 4) básico: His, Lys, Arg; 5) residuos que influyen la orientación de cadena: Gly, Pro; y 6) aromático: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras, que producen péptidos que tienen características funcionales y químicas similares a las del péptido original. Las sustituciones del aminoácido conservadoras involucran intercambiar un miembro de una de las clases anteriores para otro miembro de la misma clase. Los cambios conservadores pueden comprender residuos de aminoácidos poco convencionales, que se incorporan normalmente por síntesis química del péptido así como por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de porciones del aminoácido. Las sustituciones no-conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de estas clases para un miembro de otra clase. Estos cambios pueden dar lugar a la modificación sustancial en las características funcionales y/o químicas de los péptidos. En la elaboración de tales cambios, de acuerdo a ciertas modalidades, el índice hidropático de aminoácidos puede considerarse. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base de sus características de hidrofobicidad y carga. Estas son: isoleucina ( + 4.5); valina ( + 4.2); leucina ( + 3.8); fenilalanina ( + 2.8); cisteína/cistina ( + 2.5); metionina ( + 1.9); alanina ( + 1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofán (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparragina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). La importancia del índice del aminoácido hidropático en conferir la función biológica interactiva en una proteína se entiende en la técnica. Kyte y colaboradores, J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Se conoce que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o grado hidropático similar y aún conservan una actividad biológica similar. En realizar los cambios basados sobre el índice hidropático, en ciertas modalidades, la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2 se incluye. En ciertas modalidades, los que están dentro de ±1 se incluyen, y en ciertas modalidades, los que están dentro de ±0.5 se incluyen. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse eficazmente en base de la hidrofilicidad, particularmente donde el pepticuerpo o péptido biológicamente funcional de tal modo creado se desea para uso en modalidades inmunológicas, como en el presente caso. En ciertas modalidades, la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, como se estableció por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, correlacionados con su inmunogenicidad y antigenicidad , es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácidos: arginina ( + 3.0); Usina ( + 3.0); aspartato ( + 3.0 ± 1); glutamato ( + 3.0 ± 1); serina ( + 0.3); asparagina ( + 0.2); glutamina ( + 0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptofán (-3.4). En realizar los cambios basados sobre los valores de hidrofilicidad similares, en ciertas modalidades, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 se incluyen, en ciertas modalidades, los que están dentro de ±1 se incluyen, y en ciertas modalidades, los que están dentro de ±0.5 se incluyen. Uno puede también identificar epítopes de secuencias primarias del aminoácido en base de la hidrofilicidad. Estas regiones también se refieren como "regiones de núcleo epitópico." Las sustituciones de aminoácido ejemplares se indican en la Tabla 1 a continuación.

Sustituciones de Aminoácidos Residuos Originales Sustituciones Ejemplares Sustituciones Preferidas Ala Val, Leu, He Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln, Glu, Asp Gln Asp Glu, Gln, Asp Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn, Glu, Asp Asn Glu Asp, Gln, Asn Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg lie Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu 'Norleucina , He, Val, Met, Ala, Phe lie Lys Arg, Acido 1 ,4 diamino-butírico, Gln, Asn Arg Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Val, lie, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val lie, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu El experto en la técnica podrá producir variantes de los péptidos y pepticuerpos de la presente invención mediante sustitución aleatoria, por ejemplo, y probando el péptido resultante o pepticuerpo para la actividad de unión usando los ensayos descritos en la presente. Adicionalmente, el experto puede revisar los estudios de estructura-función o el análisis estructural tridimensional para identificar residuos en los polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de tal comparación, uno puede predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponden a los residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. El experto en la técnica puede optar por las sustituciones del aminoácido químicamente similares para tales residuos de aminoácidos importantes previstos. Las variantes pueden después identificarse usando ensayos de actividad como se describe en la presente. Un número de publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaría. Ver Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou y colaboradores, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou y colaboradores, Biochemistry, 113(2):211 -222 (1974); Chou y colaboradores, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol . , 47:45-148 (1978); Chou y colaboradores, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 and Chou y colaboradores, Biophys. J., 26:367-384 (1979). Por otra parte, los programas de computadora están actualmente disponibles para auxiliar con predecir la estructura secundaría. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor de 30%, o similaridad mayor de 40% tienen a menudo topologías estructurales similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructural de la proteína (PDB) ha proporcionado predecibilidad mejorada de la estructura secundaria, que incluyen el número potencial de dobleces dentro de la estructura de una proteína. Ver Holm y colaboradores, Nucí. Acid. Res., 27(l):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner y colaboradores, Curr. Op. Struct. Biol, 7(3):369-376 (1997)) que existe un número limitado de dobleces en una proteína dada y que una vez que un número crítico de estructuras se ha resuelto, la predicción estructural llegarán a ser dramáticamente más exactos. Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "roscado" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol, 7(3):377-87 (1997); Sippl y colaboradores, Structure, 4(1):15-19 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie y colaboradores, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov y colaboradores, Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sel, 84(13):4355-4358 (1987)), y "unión evolutiva" (Ver Holm, supra (1999), and Brenner, supra (1997)). En ciertas modalidades, las variantes del péptido o pepticuerpo incluyen variantes de glicosilación en donde uno o más sitios de glicosilación tal como un sitio de glicosilación religado, se han agregado al pepticuerpo. Un sitio de glicosilación N-ligado es caracterizado por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácidos señalado como X puede ser cualquier residuo de aminoácidos excepto la prolina. La sustitución o adición de los residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un sitio nuevo potencial para la adición de una cadena de carbohidrato N-ligado. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminarán una cadena de carbohidrato N-ligado existente. También se proporciona una reordenación de las cadenas de carbohidrato N-ligado en donde uno o más sitios de glicosilación N-ligado (normalmente los que estén ocurriendo naturalmente) se eliminan y se crean uno o más sitios N-ligado nuevos. La invención también proporciona "derivados" de los péptidos o pepticuerpos de la presente invención. Como se describe en la presente el término "derivado" se refiere a modificaciones con excepción, o en adición a, inserciones, o eliminaciones, o sustituciones de residuos de aminoácidos que conservan la habilidad de unir a la miostatina. Preferiblemente, las modificaciones hechas a los péptidos de la presente invención para producir derivados son covalentes en naturaleza, e incluyen por ejemplo, enlace químico con polímeros, lípidos, otros porciones orgánicas, e inorgánicas. Los derivados de la invención pueden prepararse para incrementar la vida promedio circulante de un pepticuerpo, o pueden diseñarse para mejorar la capacidad de marcado para el pepticuerpo a células, tejidos u órganos deseados. La invención además contiene agentes de unión derivados covalentemente modificados para incluir una o más uniones del polímero solubles en agua, tal como polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol, como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos.: 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337. Aún otros polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen monometoxi-polietilenglicol , dextrán, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un óxido de polipropileno/copolímero de óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol de polivinilo, así como las mezclas de estos polímeros. Particularmente se prefieren pepticuerpos covalente modificados con subunidades de polietilenglicol (PEG). Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse a posiciones específicas, por ejemplo en el amino terminal de los pepticuerpos, o unir aleatoriamente a una o más cadenas laterales del polipéptido. El uso de PEG para mejorar la capacidad terapéutica para los agentes de unión, por ejemplo pepticuerpos, y para anticuerpos humanizados en particular, se describe en la Patente Norteamericana No. 6,133,426 para Gonzales y colaboradores, publicada el 17 de octubre, 2000. La invención también contempla derivatizar la porción del péptido y/o vehículo de los agentes de unión de miostatina. Tales derivados pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida promedio biológica, y los similares de los compuestos. Las porciones pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto secundario indeseable de los compuestos y similares. Los derivados ejemplares incluyen compuestos en los cuales: 1. El derivado o una cierta porción del mismo es cíclica. Por ejemplo, la porción del péptido puede modificarse para contener dos o más residuos Cys (por ejemplo, en el enlazador), que podría ciclizarse por formación del enlace de disulfuro. 2. El derivado es reticulado o es capaz de reticularse entre las moléculas. Por ejemplo, la porción del péptido puede modificarse para contener un residuo Cys y de tal modo para poder formar un enlace disulfuro intermolecular con una molécula similar. El derivado puede también reticularse con su C-terminal. 3. Una o más uniones [-C(0)NR-] de peptidilo (enlaces) son sustituidas por una unión no-peptidilo. Las uniones de no-peptidilo ejemplares son -CH2-carbamato [-CH2-OC(0)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(0)2NR-], urea [-N HC(0)NH-], -CH2-amina secundaria, y péptido alquilado [-C(0)NRs-en donde R6 es alquilo inferior]. 4. La N-terminal es derivatizada. Normalmente, la N-terminal puede ser acilada o modificada a una amina sustituida. Los grupos derivados de N-terminal ejemplar incluyen -NRRT (con excepción de -NH2), -NRCÍOJRL -NRCÍOJORL -NRS(0)2RI, -NHC(0)NHR1, succinimida, o benciloxicarbonil-NH-(CBZ-NH-), en donde R y R, son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo inferior y en donde el anillo fenilo puede sustituirse con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, cloro y bromo. 5. La C-terminal Ubre se derivatiza. Normalmente, la C-terminal es esterificada o amidada. Por ejemplo, uno puede utilizar los métodos descritos en la técnica para agregar (NH-CH2-CH2-NH2)2 a los compuestos de esta invención en la C-terminal. Asimismo, uno puede utilizar los métodos descritos en la técnica para agregar -NH2 (o "tapar" con un grupo -NH2) a los compuestos de esta invención en la C-terminal. Los grupos derivados de C-terminal ejemplar incluyen, por ejemplo, -C(0)R2 en donde R2 es alcoxi inferior o -NR3R4 en donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono (preferiblemente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono). 6. Un enlace de disulfuro se sustituye por otro, preferiblemente más estable, porción reticulada (po> ejemplo, un alquileno). Ver, por ejemplo, Bhatnagar y colaboradores, J Med Ghent 39: 3814-9 (1996), Alberts y colaboradores, Thirteenth Am Pep Symp, 357-9 (1993). 7. Se modifican uno o más residuos de aminoácidos individuales. Varios agentes de derivatizacion se conocen con para reaccionar específicamente con las cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales, como se describe detalladamente más adelante. Los residuos de lisinilo y residuos amino terminal pueden hacerse reaccionar con anhídridos de ácido succínicos u otro carboxílico, que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para la derivatizacion de los residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tal como picolinimidato metílico; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencensulfónico; O-metilisourea; 2,4 pentandiona; y reacción catalizada de transaminasa con glioxilato. Los residuos de arginilo pueden modificarse por la reacción con cualquier o combinación de varios reactivo convencionales, que incluyen fenilglioxal , 2,3-butandiona, 1 ,2-ciclohexandiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginilo requiere que la reacción sea realizada en condiciones alcalinas debido al pKa alto del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivo pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo epsilón-amino de arginina. La modificación específica de los residuos de tirosilo se ha estudiado extensivamente, con interés particular en introducir objetos espectrales en residuos de tirosilo por reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, N-acetilimidizol y tetranitrometano se utilizan para formar las especies O-acetil tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los grupos de cadena lateral carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden modificarse selectivamente por la reacción con carbodiimidas (R'-N = C = N-R') tal como 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, el aspartilo y residuos de glutamilo pueden convertirse a residuos de asparaginilo y glutaminilo por la reacción con iones de amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo pueden desaminarse a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos son desaminados bajo condiciones suavemente acídicas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.

Los residuos de cisteinilo pueden sustituirse por residuos de aminoácidos u otras porciones estabilizar para eliminar el enlace de disulfuro o, inversamente, para estabilizar la reticulación. Ver, por ejemplo, Bhatnagar y colaboradores, (supra). La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros vehículos macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1 , 1 -bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésterss homobifuncionales, que incluyen ésteres de disuccinimidilo tal como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tal como bis-N-maleimido-1 ,8-octano. Los agentes de derivatización tal como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato proporcionan los intermediarios fotoactivatables que son capaces de formar reticulaciones en la presencia de la luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas tal como carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y sustratos reactivos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 se utilizan para la inmovilización de la proteína. Los grupos carbohidrato (oligosacárido) se pueden unirse adecuadamente a sitios que se conocen por ser sitios de glicosilación en proteínas. Generalmente, los oligosacáridos O-ligados se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) mientras los oligosacáridos N-ligado se unen a residuos de asparragina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos que ocurren naturalmente con excepción de la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-ligados y O-ligados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentre comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (referido como ácido siálico). El ácido siálico es normalmente el residuo terminal de los oligosacáridos N-ligados y O-ligados y, en virtud de su carga negativa, pueden conferir propiedades acídicas al compuesto glicosilado. Tal sitio(s) puede incorporarse en el enlazador de los compuestos de esta invención y es preferiblemente glicosilado por una célula durante la producción recombinante de los compuestos del polipéptido (por ejemplo, en células mamíferas tal como CHO, BHK, COS). Sin embargo, tales sitios pueden además glicosilarse por procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica. Otras modificaciones posibles incluyen la hidroxilación de la prolina y lisina, fosforilación de grupos oxhidrilo de los residuos serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina, y cadenas laterales de histidina [Ver, Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983)]. Los compuestos de la presente invención pueden cambiarse en el nivel del ADN, también. La secuencia de ADN de cualquier porción del compuesto puede cambiarse a codones más compatibles con la célula hospedadora elegida. Para E. coli, que es la célula hospedadora preferida, los codones optimizados se conocen en la técnica. Los codones pueden sustituirse para eliminar los sitios de restricción o para incluir los sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el proceso del ADN en la célula hospedadora seleccionada. El vehículo, enlazador y secuencias de ADN del péptido pueden modificarse para incluir cualquiera de los cambios de la secuencia anteriores. Los derivados adicionales incluyen análogos no péptido que proporcionan una estructura estabilizada o disminuyeron la biodegradación, también se contemplan. Los análogos miméticos del péptido que pueden prepararse basados en un péptido inhibidor seleccionado por reemplazo de uno o más residuos por porciones no-péptido. Preferiblemente, las porciones no-péptido permiten que el péptido conserve su confirmación natural, o estabilizan uno preferido, por ejemplo, bioactivo, la confirmación que conserva la habilidad de reconocer y unir la miostatina. En un aspecto, el análogo/mimético resultante exhibe la afinidad de unión incrementado para la miostatina. Un ejemplo de métodos para la preparación de análogos miméticos no-péptido de los péptidos se describe en Nachman y colaboradores, Regul Pept 57:359-370 (1995). Si se desea, los péptidos de la invención pueden modificarse, por ejemplo, por glicosilación, amidación, carboxilación, o fosforilación, o por la creación de sales de adición ácida, amidas, ésteres, en particular ésteres C-terminal, y derivados N-acilo de los péptidos de la invención. Los pepticuerpos también pueden modificarse para crear derivados del péptido formando complejos covalentes o no covalentes con otras porciones. Los complejos covalentemente unidos puede preparase ligando las porciones químicas a grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos que comprenden los pepticuerpos, o en las N- o C-terminal. En particular, se anticipa que los péptidos pueden conjugarse a un grupo reportero, que incluyen, pero no se limitan a un radiomarcado, un marcado fluorescente, una enzima (por ejemplo, que cataliza una reacción colorimétrica o fluorométrica), un sustrato, una matriz sólida, o un portador (por ejemplo, biotina o avidina). La invención por consiguiente proporciona una molécula que comprende una molécula de pepticuerpo, en donde la molécula preferiblemente además comprende un grupo reportero seleccionado del grupo que consiste de un radiomarcado, un marcado fluorescente, una enzima, un sustrato, una matriz sólida, y un portador. Tales marcados son bien conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, los marcados de biotina se contemplan particularmente. El uso de tales marcados es bien conocido por el experto en la técnica y se describe en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,996,345; y 4,277,437. Otros marcados que serán útiles incluyen pero no se limitan a marcados radiactivos, marcados fluorescentes y marcados quimioluminescentes. Las Patentes Norteamericanas con relación al uso de tales marcados incluyen, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,996,345; y 4,277,437. Cualquiera de los pepticuerpos de la presente invención puede comprender uno, dos, o más de cualquiera de éstos marcados. Métodos para Elaborar Péptidos y Pepticuerpos Los péptidos de la presente invención pueden generarse usando una variedad amplia de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, tales péptidos pueden sintetizarse en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Varios sintetizadores automáticos están comercialmente disponibles y pueden utilizarse de acuerdo con protocolos conocidos. Ver, por ejemplo, Stewart and Young (supra); Tarn y colaboradores, J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The peptides. Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany y colaboradores, Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987); y Patente Norteamericana No. 5,424,398, cada una incorporada en la presente por referencia. Los métodos de síntesis del péptido de fase sólida utilizan un copoli(estireno-divinilbenceno) que contiene 0.1-1.0 mM aminas/g polímero. Estos métodos para la síntesis del péptido utilizan la protección butiloxicarbonilo (t-BOC) o 9-fluorenilmetiloxi-carbonil(FMOC) de grupos alfa-amino. Ambos métodos involucran síntesis etapa por etapa por lo cual un solo aminoácido es agregado en cada paso iniciando con la C-terminal del péptido (Ver, Coligan y colaboradores, Curr Prot Immunol, Wiley I nterscience, 1991, Unidad 9). En la terminación de la síntesis química, el péptido sintético puede desprotegerse para eliminar el aminoácido t-BOC o FMOC que bloquea los grupos y dividirse del polímero por el tratamiento con ácido a temperatura reducida (por ejemplo, HF líquido- 0% de anisol para aproximadamente 0.25 a aproximadamente 1 hora a 0°C). Después de la evaporación de los reactivo, los péptidos se extraen del polímero con 1% de solución de ácido acético que después se I i of i liza para producir el material crudo. Esto puede purificarse normalmente por técnicas tal como filtración en gel en Sephadex G-15 usando 5% de ácido acético como solvente. La liofilización de las fracciones apropiadas de la columna producirá los derivados de péptidos o péptido homogéneos, que pueden después caracterizarse por técnicas estándares como análisis de aminoácido, cromatografía de capa fina, cromatografía líquida de alto rendimiento, espectroscopia de absorción ultravioleta, rotación molar, solubilidad, y cuantificarse por la degradación de Edman de fase sólida. Las técnicas exhibición de fago pueden ser particularmente efectivas en identificar los péptidos de la presente invención como se describe anteriormente. Brevemente, una biblioteca de fago es preparada .(usando el fago por ejemplo mi 13, fd, o fago lambda), exhibiendo los insertos de 4 a aproximadamente 80 residuos de aminoácidos. Los insertos pueden representar, por ejemplo, un arreglo completamente degenerado o alterado. Los insertos producidos del fago que unen al antígeno deseado se seleccionan y este proceso se repite durante varios ciclos de reselección del fago que unen al antígeno deseado. El secuenciado de ADN se conduce para identificar ¡as secuencias de los péptidos expresados. La porción lineal mínima de la secuencia que une al antígeno deseado puede determinarse de esta manera. El procedimiento puede repetirse usando una biblioteca alterada que contiene los insertos que contienen parte o toda la porción lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales corriente arriba o corriente abajo del mismo. Estas técnicas pueden identificar los péptidos de la invención con aún mayor afinidad de unión para la miostatina donde los agentes ya se identificaron en la presente. Sin importar la manera de la cual los péptidos son preparados, una molécula de ácido nucleico que codifica cada péptido puede generarse usando procedimientos de ADN recombinante estándares. La secuencia de nucleótidos de tales moléculas puede manipularse como sea apropiada sin cambiar la secuencia de aminoácidos que codifican para explicar la degeneración del código del ácido nucleico así como para explicar la preferencia del codón en células hospedadoras particulares. La presente invención también proporciona moléculas del ácido nucleico que comprenden las secuencias del polinucleótido que codifican los péptidos y pepticuerpos de la presente invención. Estas moléculas del ácido nucleico incluyen vectores y constructos que contienen polinucleótidos que codifican los péptidos y pepticuerpos de la presente invención, así como las el variantes de péptido y pepticuerpo y derivados. Las moléculas ejemplares del ácido nucleico ejemplares se proporcionan en los Ejemplos más adelante. Las técnicas de ADN recombinante también proporcionan un método adecuada para preparar pepticuerpos de longitud completa y otros agentes de unión de polipéptido mayor de la presente invención, o fragmentos de los mismos. Un polinucleótido que codifica el pepticuerpo o fragmento puede insertarse en un vector de expresión, que a su vez se inserta en una célula hospedadora para la producción de los agentes de unión de la presente invención. La preparación de pepticuerpos ejemplares de la presente invención se describe en el Ejemplo 2 más adelante. Una variedad de sistemas del vector de expresión/huésped puede utilizarse para expresar los péptidos y pepticuerpos de la invención. Estos sistemas incluyen pero no se limitan a microorganismos tal como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN del plásmido o cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión del virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transfectadas con vectores de expresión del virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico de tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Una línea de célula hospedadora preferida es la cepa de E.coli 2596 (ATCC # 202174), usada para la expresión de pepticuerpos como se describe más adelante en el Ejemplo 2. Las células mamíferas que son útiles en producciones de la proteína recombinante incluyen pero no se limitan a líneas de células VERO, células HeLa, célula de ovario de hámster chino (CHO), células COS (tal como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293. El término "vector de expresión" se refiere a un plásmido, un fago, un virus o un vector, para expresar un polipéptido de una secuencia de polinucleótido. Un vector de expresión puede comprender una unidad transcripcional que comprende un ensamble de (1) un elemento genético o elementos que tienen un papel regulador en la expresión del gene, por ejemplo, promotores o mejoradores, (2) una estructura u secuencia que codifique el agente de unión que se transcribe en ARNm y se traduce un proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de transcripción apropiadas. Las unidades estructurales deseadas para uso en levadura o sistemas de expresión eucarióticos preferiblemente incluyen una secuencia líder permitiendo la secreción extraceiular de la proteína traducida por una célula hospedadora. Alternativamente, donde la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o transporte, puede incluir un residuo de metionilo amino terminal. Este residuo puede o no puede posteriormente dividirse de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto de péptido final. Por ejemplo, los péptidos y pepticuerpos pueden recombinantemente expresarse en levadura usando un sistema de expresión comercialmente disponible, por ejemplo, el Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), seguido de las instrucciones del fabricante. Este sistema también confía en la secuencia pre-pro-alfa para dirigir la secreción, pero la transcripción del inserto es conducida por el promotor de alcohol oxidasa (AOXI) sobre la inducción por metanol. El péptido secretado se purifica del medio de crecimiento de levadura usando los métodos usados para purificar el péptido de sobrenadantes de célula bacteriana y mamífera. Alternativamente, el ADNc que codifica el péptido y pepticuerpos puede clonarse en el vector de expresión del baculovirus pVL1393 (Phar ingen, San Diego, CA). Este vector puede utilizarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante (PharMingen) para infectar células Spodoptera frugiperda en medio sin proteína sF9 y para producir la proteína recombinante. La proteína recombinante puede purificarse y concentrarse del medio usando una columna de heparina-Sefarosa (Pharmacia). Alternativamente, el péptido o pepticuerpo puede expresarse en un sistema de insecto. Los sistemas de insecto para la expresión de la proteína son bien conocidos por los expertos en la técnica. En un tal sistema, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) puede utilizarse como un vector para expresar genes extranjeros en células Spodoptera frugiperda o en larvas Trichoplusia. El péptido que codifica la secuencia puede clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gene de polihedrina, y ponerse bajo control del promotor de polihedrina. La inserción acertada del péptido hará el gen de polihedrina inactivo y producirá el virus recombinante que carece de la capa de proteína de capa. Los virus recombinante pueden utilizarse para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las cuales se expresa el péptido (Smith y colaboradores, J Virol 46: 584 (1983); Engelhard y colaboradores, Proc Nat Acad Sci (USA) 91:3224-7 (1994)). En otro ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el péptido puede amplificarse por PCR y clonarse en un vector apropiado por ejemplo, pGEX-3X (Pharmacia). El vector pGEX se diseñó para producir una proteína de fusión que comprende glutationa-S-transferasa (GST), codificado por el vector, y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los cebadores para PCR pueden generarse por incluir por ejemplo, un sitio de división apropiado. Donde la porción de fusión se utiliza solamente para facilitar la expresión o de otra manera no es deseable como una unión al péptido de interés, la proteína de fusión recombinante puede después dividirse de la porción de GST de la proteína de fusión. El constructo del péptido del agente de unión del pGEX-3X/específico se transforma en células E. coli XL-I Blue (Stratagene, La Jolla CA), y transformantes individuales aislados y crecidos. El ADN del plásmido de los transformantes individuales puede purificarse y secuenciarse parcialmente usando un secuenciador automatizado para confirmar la presencia del agente de unión específico deseado que codifica el inserto del ácido nucleico en la orientación apropiada. La proteína de fusión, que puede producirse como un cuerpo de inclusión insoluble en las bacterias, puede purificarse como sigue. Las células hospedadoras son recolectadas por centrifugación; lavadas en 0.15 M de NaCI, 10 mM de Tris, pH 8, 1 mM de EDTA; y tratadas con 0.1 mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El Usado puede limpiarse por sonicación, y los fragmentos de la célula pueden granularse mediante centrifugación durante 10 minutos a 12.000 X g. El granulado que contiene la proteínas de fusión puede suspenderse de nuevo en 50 mM de Tris, pH 8, y 10 mM de EDTA, cubierto encima de 50% de glícerol, y centrifugado durante 30 min. a 6000 X g. El granulado pueden suspenderse de nuevo en la solución salina amortiguada de fosfato estándar (PBS) libre de Mg + + y Ca + + . La proteína de fusión puede adicionalmente purificarse fraccionando el granulado en un SDS-PAGE desnaturalizado (Sambrook y colaboradores, supra). El gel puede impregnarse en 0.4 M de KCI para visualizar la proteína, que puede eliminarse y electroeluirse en amortiguador que produce gel carente de SDS. Si la proteína GST/fusión se produce en bacterias como la proteína soluble, puede purificarse usando el GST Purification Module (Pharmacia). La proteína de fusión puede someterse a digestión para dividir el GST del péptido de la invención. La reacción de digestión (20-40 mg de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg, Sigma) en 0.5 mi de PBS puede incubarse 16-48 horas a temperatura ambiente y cargarse en un gel SDS-PAGE desnaturalizado para fraccionar los productos de reacción. El gel puede impregnarse en 0.4 M de KCI para visualizar las bandas de proteína. La identidad de la banda de proteína que corresponde al peso molecular esperado del péptido puede confirmarse por análisis de la secuencia de aminoácidos usando un secuenciador automatizado (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA). Alternativamente, la identidad puede confirmarse realizando CLAR y/o espectrometría de masa de los péptidos. Alternativamente, una secuencia de ADN que codifica el péptido puede reproducirse en un plásmido que contiene un promotor y, opcionalmente, una secuencia líder (Better y colaboradores, Science 240:1041-43 (1988)). La secuencia de este constructo puede confirmarse por secuenciado automatizado. El plásmido puede después transformarse en la cepa de E. coli MC1061 usando procedimientos estándares que utilizan la incubación CaC12 y tratamiento por choque por calor de las bacterias (Sambrook y colaboradores, Supra). Las bacterias transformadas pueden hacerse crecer en medio LB complementado con carbenicil ina, y la producción de la proteína expresada puede inducirse por crecimiento en un medio adecuado. Si se presenta, la secuencia líder puede efectuar la secreción del péptido y dividirse durante la secreción.

Los sistemas huésped mamíferos para la expresión de péptidos y pepticuerpos recombinantes son bien conocido por los expertos en la técnica. Las cepas de célula hospedadora pueden elegirse por una habilidad particular para procesar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones post-traducción que sean útiles en proporcionar la actividad de la proteína. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Diferentes células hospedadoras tal como CHO, HeLa, MDCK, 293, WT38, y similares tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades post-translación y pueden elegirse para asegurar la modificación y proceso correctos de la proteína introducida, extranjera. Es preferible que las células transformadas se utilicen para la producción a largo plazo, de la proteína de alto rendimiento. Una vez que tales células son transformadas con vectores que contienen marcadores seleccíonables así el como cásete de expresión deseado, las células pueden permitirse crecer durante 1-2 días en medio enriquecido antes de que se cambien al medio selectivo. El marcador seleccionable es diseñado para permitir el crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente la secuencia introducida. Las aglomeraciones resistentes de células transformadas estables pueden proliferarse usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para la línea celular utilizada.

Un número de sistemas de selección pueden utilizarse para recuperar las células que se han transformado para la producción recombinante de la proteína. Tales sistemas de selección incluyen, pero no se limitan a, timidina cinasa de HSV, genes hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa y adenina fosforibosiltransferasa, en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También, la resistencia a anti-metabolito puede utilizarse como la base de selección para el dhfr que confiere resistencia a metotrexato; gpt que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo que confiere resistencia a aminoglicósido G418 y confiere resistencia a clorsulfuron; y hygro que confiere resistencia a higromicina. Los genes seleccionables adicionales que pueden ser útiles incluyen trpB, que permite las células para utilizar indol en lugar de triptofán, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Los marcadores que dan una indicación visual para la identificación de transformantes incluyen antocianinas, ß-glucuronidasa y su sustrato, GUS, y luciferasa y su sustrato, luciferina. Purificación y Replegado de Agentes de unión En algunos casos, los agentes de unión tal como los péptidos y/o pepticuerpos de esta invención pueden necesitar ser "replegados" y oxidarse en una estructura terciaria apropiada y los enlazados de disulfuro generados para ser biológicamente activos. El replegado puede lograrse usando un número de procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, exponer el agente del polipéptido solubilizado a un pH normalmente sobre 7 en presencia de un agente caotrópico. La selección del caotrope es similar a las opciones usadas para la solubilidad del cuerpo de inclusión, no obstante un caotrope se utiliza normalmente en una concentración inferior. Los agentes caotrópicos ejemplares son guanidina y urea. En la mayoría de los casos, la solución de replegado/oxidación también contendrá un agente de reducción más su forma oxidada en un índice específico para generar un potencial redox particular que permita al disulfuro reorganizarse para ocurrir para la formación de puentes de cisteína. Algunos redox acoplados comúnmente usados incluyen cisteína/cistamina, glutationa/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. En muchos casos, un co-solvente puede utilizarse para incrementar la eficacia del replegado. Los cosolventes comúnmente usados incluyen glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares, y arginina. Puede deseablemente purificarse los péptidos y pepticuerpos de la presente invención. Las técnicas de purificación de la proteína son bien conocidas por el experto en la técnica. Estas técnicas involucran, en un nivel, el fraccionamiento crudo de las fracciones proteicas y no-proteicas. La separación del péptido y/o pepticuerpo de otras proteínas, el péptido o polipéptido de interés puede ser purificado adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para llevar a cabo la purificación parcial o completa (o purificación a homogeneidad). Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de pepticuerpos y péptidos o de la presente invención son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión; electrofóresis en gel de poliacrilamida; enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficiente para purificar los péptidos es la cromatografía líquida de proteína rápida o aún CLAR. Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en modalidades particulares, la purificación sustancial, de un pepticuerpo o péptido de la presente invención. El término "pepticuerpo o péptido purificado" como se describe en la presente, se desea para referir a una composición, aislable de otros componentes, en donde el pepticuerpo o péptido se purifica a cualquier grado con relación a su estado naturalmente obtenible. Un péptido o pepticuerpo purificado por lo tanto también se refiere a un pepticuerpo o péptido que está libre en el ambiente en el cual puede ocurrir naturalmente. Generalmente, "purificado" se refiere a una composición de péptido o pepticuerpo que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar otros componentes, y cuya composición sustancialmente conserva su actividad biológica expresada. Donde el término "sustancialmente purificado" se utiliza, esta designación se referirá a una composición de péptido o pepticuerpo en la cual el pepticuerpo o péptido forma el componente principal de la composición, tal como constituye de aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de las proteínas en la composición. Varios métodos para cuantificar el grado de purificación del péptido o pepticuerpo se conocen por el experto en la técnica en la luz de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, la determinación de la actividad de unión específica de una fracción activa, o la valoración de la cantidad de péptido o pepticuerpo dentro de una fracción por análisis de SDS/PAGE. Un método preferido para valorar la pureza de una fracción de péptido o pepticuerpo es calcular la actividad de unión de la fracción, para compararla a la actividad de unión del extracto inicial, y para así calcular el grado de purificación, en la presente valoración por un "número de purificación de pliegue." Las unidades actuales usadas para representar la cantidad de actividad de unión, por supuesto, serán dependientes sobre la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación y si o no el pepticuerpo o péptido exhibe una actividad de unión perceptible. Varias técnicas adecuadas para uso en la purificación son bien conocidas por el experto en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos (inmunoprecipitación) y similares o por desnaturalización por calor, seguida por centrifugación; etapas de cromatografía por ejemplo cromatografía de afinidad (por ejemplo, Proteína-A- Sefarosa), intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatita y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electrofóresis en gel; y combinaciones de tales y otras técnicas. Como se conoce generalmente en la técnica, se desea que la orden de conducir las varias etapas de purificación puede cambiarse, o que ciertas etapas pueden omitirse, y aún resulte en un método adecuado para la preparación de un agente de unión sustancialmente purificado. No hay requisito general que los agentes de unión de la presente invención se proporcionen siempre en su estado purificado. De hecho, se contempla que los productos del agente de unión menos sustancialmente purificados tendrán utilidad en ciertas modalidades. La purificación parcial puede lograrse usando pocas etapas de purificación en combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de CLAR dará lugar generalmente a una mayor purificación del "-pliegue" donde la misma técnica que utiliza un sistema de cromatografía de baja presión. Los métodos que exhiben un grado inferior de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del péptido o pepticuerpo, o en mantener la actividad de unión del péptido o pepticuerpo. Se conoce que la migración de un péptido o polipéptido puede variar, a veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi y colaboradores, Biochem Biophys Res Comm, 76: 425 (1977)). Por lo tanto se apreciará que bajo condiciones de electrofóresis diferenciadas, los pesos moleculares evidentes de productos de expresión del agente de unión purificado o parcialmente purificado pueden variar. Actividad de Agentes de Unión de Miostatina y Otros Antagonistas Los antagonistas que incluyen agentes de unión descritos en la presente se probaron por su habilidad para unir la miostatina e inhibir o bloquear la actividad de la miostatina. Cualquier número ensayos o pruebas animales puede utilizarse para determinar la habilidad del agente para inhibir o bloquear la actividad de la miostatina. Varios ensayos usados para caracterizar los péptidos y pepticuerpos de la presente invención se describen en los Ejemplos más adelante. Un ensayo es el ensayo C2C12 pMARE-luc que hace uso de una línea celular de miostatina-responsiva (mioblastos C2C12) transfectados con un vector reportero de luciferasa que contiene los elementos de respuesta de miostatina/activina (MARE). Los pepticuerpos ejemplares son ensayados preincubando una serie de diluciones del pepticuerpo con miostatina, y después exponiendo las células a la mezcla de incubación. Se determinó la actividad de la luciferasa resultante, y una curva de titulación se genera de la serie de diluciones del pepticuerpo. La Cl50 (la concentración del pepticuerpo para alcanzar 50% de inhibición de actividad de la miostatina como se midió por actividad de luciferasa) después se determinó. Un segundo ensayo descrito más adelante es un ensayo de BIAcore® para determinar los parámetros cinéticos ka (constante de velocidad asociación), kd (constante de velocidad de disociación), y KD (constante de equilibrio de disociación) para los agentes de unión de miostatina y otros antagonistas tal como anticuerpos capaces de unir la miostatina y su receptor. Las constantes de equilibrio de disociación inferior (KD, expresada en nM) indicaron una mayor afinidad del pepticuerpo para la miostatina. Los ensayos adicionales incluyen ensayos de bloqueo, para determinarse si un agente de unión tal como un pepticuerpo es neutralizando (previene unir la miostatina a su receptor), o no-neutralizado (no previene unir la miostatina a su receptor); los ensayos de selectividad, que determinan si los agentes de unión de la presente invención unen selectivamente a la miostatina y no a ciertos otros miembros de la familia TGF-ß; y el ensayo de KinEx A™ o ensayos de equilibrio basados en solución, que también determinan KD y se consideran por ser más sensibles en algunas circunstancias. Estos ensayos se describen en el Ejemplo 3. La Figura 1 muestra la Cl50 de un péptido comparado con la Cl50 de la forma pepticuerpo del péptido. Esto muestra que el pepticuerpo es considerablemente más eficaz en inhibir la actividad de la miostatina que el péptido solo. Además, los pepticuerpos de afinidad-madurada generalmente exhiben valores de Cl50 y KD mejorados comparados con los péptidos y pepticuerpos madre. Los valores de Cl50 para un número de pepticuerpos madurados de afinidad ejemplar se muestran en la Tabla VII, Ejemplo 7 más adelante. Además, en algunos casos, haciendo una versión 2x de un pepticuerpo, donde dos péptidos se unen en tándem, incrementa la actividad del pepticuerpo ambos in vi tro e in vivo. Las actividades in vivo se muestran en los Ejemplos más adelante. Las actividades de los agentes de unión incluyen pero no se limitan a masa muscular magra incrementada, fuerza muscular incrementada, y masa grasa disminuida con respecto al peso corporal total en modelos animales tratados. Las actividades in vivo descritas en la presente además incluyen atenuación de perder masa muscular magra y fuerza en modelos animales que incluyen modelos de hipogonadismo, caquexia reumatoide, caquexia por cáncer, e inactividad. Usos de Antagonistas de Miostatina La presente invención proporciona métodos y tratamientos para el músculo con relacionados y otros trastornos administrando una cantidad terapéutica de un antagonista de miostatina o antagonistas a sujetos en necesidad de tal tratamiento. Los antagonistas de miostatina también pueden administrarse profilácticamente para proteger contra pérdida de músculo futura y trastornos relacionados en un sujeto en necesidad de tal tratamiento. Como se describe en la presente el término "sujeto" se refiere a cualquier animal que incluye mamíferos, e incluye sujetos humanos en necesidad del tratamiento para los trastornos relacionados con la miostatina. En una modalidad, los antagonistas de miostatina son los agentes de unión descritos en la presente. Estos trastornos relacionados con la miostatina incluyen, pero no se limitan a, varias formas de pérdida de músculo, así como trastornos metabólicos tal como diabetes y trastornos relacionados, y enfermedades degenerativas óseas tal como osteoporosis. Los antagonistas de miostatina también pueden utilizarse para tratar trastornos que resultan del hipogonadismo, trastornos que resultan de inactividad, trastornos que serán tratados de otra manera por hormonas de crecimiento o secretagogos de la hormona de crecimiento, y varias caquexias que incluyen caquexia relacionada con el tumor, caquexia reumatoide, y caquexia que resulta de quemaduras. Como se muestra en los ejemplos más adelante, los antagonistas de miostatina tal como los pepticuerpos ejemplares descritos en la presente dramáticamente incrementan la masa muscular magra, disminuyen la masa grasa, alteran el índice de músculo a grasa, e incrementan la fuerza muscular. Los trastornos de pérdida de músculo incluyen distrofias musculares y trastornos neuromusculares. Estos trastornos incluyen pero no se limitan a distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular tipo de Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Erb, distrofia muscular de Emery Dreifuss, distrofia muscular de la faja del miembro, síndrome de espina dorsal rígida, enfermedad del músculo-ojo-cerebro, esclerosis lateral amiotrófica, distrofia muscular facioscapulohumeral, distrofia muscular congénita, distrofia muscular neuroaxonal infantil, distrofia miotónica (enfermedad de Steinert), miotonía no distrófica, atrofia muscular espinal de parálisis periódica, neuropatía motora y sensorial hereditaria, enfermedad de Carcot-Marie-Tooth, neuropatía inflamatoria crónica, miopatía distal, miopatía miotubular/centronuclear, miopatía nemalina, enfermedad de mini núcleo, enfermedad de núcleo central, desminopatía, miositis por cuerpo de inclusión, miopatía mitocondrial, síndrome miasténico congénito, disfunción del músculo post-polio, y trastornos descritos en Emery Lancet 359:687-695 (2002) y Khurana y colaboradores, Nat. Rev. Drug Disc 2:379-386 (2003). Estos trastornos pueden ser tratados administrando una cantidad terapéutica de uno o más antagonista de miostatina a un sujeto en necesidad del mismo. Esto es demostrado administrando un pepticuerpo ejemplar en un modelo de ratón mdx maduro, como se describe en el Ejemplo 11 más adelante. Los antagonistas de miostatina son también útiles para tratar trastornos metabólicos que incluyen diabetes tipo 2, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hiperglicemia, y obesidad. Por ejemplo, la miostatina puede influenciar el desarrollo de la diabetes en ciertos casos. Se conoce que, por ejemplo, la resistencia del músculo esquelético a absorción de glucosa estimulada por insulina es la manifestación conocida temprana de la diabetes mellitus no dependiente de insulina (tipo 2) (Corregan y colaboradores Endocrinology 128: 1682 (1991)). Se ha mostrado que la carencia de miostatina parcialmente atenúa los fenotipos de la obesidad y diabetes de dos modelos de ratón, el amarillo letal de agouti (Ay) (Yen y colaboradores FASEB J. 8:479 (1994)), y obesidad (Lepob/ob). La acumulación de grasa y peso corporal total del ratón doble muíante Ay/a, Mstn"'" se redujeron dramáticamente comparados con el ratón Ay aMstn+/+ (McFerroh y colaboradores, (2002) Supra). Además, los niveles de glucosa en sangre en el ratón Ay/a, stn"'" fue dramáticamente menor que en el ratón Ay/aMstn+ + seguido de la carga de glucosa exógena, indicando que la carencia de miostatina mejoró el metabolismo de glucosa. Similarmente el ratón Lepob/obMstn"y" mostró acumulación de grasa disminuida en comparación con el fenotipo Lepob/obMstn+/+. Se demostrado en los Ejemplos más adelante que la disminución o bloqueo de la actividad de la miostatina administrando el pepticuerpo ejemplar disminuye la grasa a proporción muscular en un modelo animal maduro. Por lo tanto, los individuos que sufren de los efectos de la diabetes, obesidad, y condiciones hiperglicémicas pueden tratarse con una dosis terapéuticamente efectiva de uno o más antagonista de miostatina, tal como agentes de unión de miostatina descritos en la presente. Otras complicaciones de la diabetes incluyen caquexia así como nefropatía diabética debido a la glucosa alta en la sangre y otros efectos de la diabetes. Como puede verse en el Ejemplo 15 más adelante, la administración de un antagonista de miostatina ejemplificado por 2x mTN8-19-21 significativamente atenuó la pérdida de peso corporal y preservó la masa muscular esquelética y masa corporal magra en ratones diabético inducidos con STZ. Además de un incremento en el músculo esquelético y masa magra, el antagonista atenuó la hipertrofia del riñon, el incremento en el índice de eliminación de creatinina y volumen de orina de 24 horas recudido y excreción de albúmina urinaria en ratones diabéticos inducido con STZ. Esto muestra la función del riñon mejorada en la etapa anterior del desarrollo de la nefropatía diabética. Por lo tanto los antagonistas de miostatina son útiles para tratar la caquexia causada por la diabetes, y para tratar la nefropatía diabética. Además los trastornos de pérdida de músculo se originan de la enfermedad crónica que incluyen enfermedad pulmonar obstructora congestiva (COPD) y fibrosis cística (caquexia pulmonar), enfermedad o falta cardiaca (caquexia cardiaca), cáncer (caquexia relacionada con cáncer o tumor), pérdida debido al SIDA, pérdida debido a falla renal, caquexia asociada con diálisis, uremia cardiaca, y artritis reumatoide (caquexia reumatoide). Por ejemplo, el suero y concentraciones intramusculares de la proteína miostatina-inmunoreactiva se encuentran por incrementarse en hombres que exhiben perdía de músculo relacionada con SIDA y son inversamente relacionados con la masa sin grasa (Gonzalez-Cadavid y colaboradores, PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)). Como se describe en la presente el término "caquexia" se refiere a la condición de la pérdida de músculo acelerado y pérdida de masa corporal magro que resulta de un número de enfermedades tal como las descritas anteriormente. El tratamiento de la caquexia se demostró tratando un modelo de ratón con caquexia tumoral usando un pepticuerpo ejemplar. El ratón macho Balb/c (Charles River Labs, Wilmington, MA) ubicó tumores generados por inoculación con la línea celular de adenocarcinoma colon-24 murina (ATCC # CRL 2639) se tratados con 2x mTN8-19-21 unido a Fe murino (2x mTN8-19-21 /muFc) o un vehículo Fe murino. Los animales tratados con el pepticuerpo mostraron una atenuación de pérdida de peso corporal, masa corporal magra, y la preservación de la masa muscular esquelética comparada con los animales control tratados con un vehículo Fe. Esto ocurrió en el ratón joven (3 meses) y maduro (12 meses). Esto demostró que la caquexia tal como caquexia por cáncer puede tratarse con una dosificación terapéutica de uno o más antagonistas de miostatina, tal como agentes de unión de miostatina descritos en la presente. Además, la caquexia puede ser causada por los mismos agentes quimioterapéuticos. El Ejemplo 16 más adelante muestra el desarrollo de un modelo animal con caquexia de quimioterapia usando 5-fluorouracilo (5-Fu). Los antagonistas de miostatina ejemplificados por 2x mTN8-19-21 /muFc atenuaron la pérdida de peso corporal en este modelo e incrementaron la supervivencia en los animales tratados con 5-Fu (ver Ejemplo 16 y Figuras 11 y 12). Los agentes quimioterapéuticos se refieren a todos los agentes químicos usados para tratar el cáncer. Tratamiento de Caquexia Relacionada a Inflamación Los antagonistas de miostatina que incluyen agentes de unión descritos en la presente pueden utilizarse para tratar la caquexia debido a inflamación u otras inmunorespuestas que incluyen artritis reumatoide. La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad autoinmune sistémica común que conduce a inflamación articular, erosión de cartílago/ósea progresiva, y caquexia reumatoide. La caquexia reumatoide se describe como una pérdida de masa celular corporal, particularmente masa muscular, que puede ocurrir en pacientes con artritis reumatoide (Rail y colaboradores, Rheumatology 43, 1219-1223 (2004), Roubenoff y colaboradores, J Clin Invest 93, 2379-2386 (1994)). La artritis inducida por colágeno (CIA por sus siglas en inglés) es un modelo de ratón comúnmente usado para RA. El Ejemplo 12 describe el tratamiento en el ratón CIA con un pepticuerpo ejemplar el cual previene la pérdida de peso corporal rápida debido a la caquexia encontrada en el control, como se muestra en la Figura 7. Este ejemplo demuestra que los antagonistas de miostatina, que incluyen pepticuerpos descritos en la presente, son útiles para tratar la caquexia reumatoide. Además, los antagonistas de miostatina también han demostrado niveles disminuidos de TNF-a (factor-a de necrosis tumoral) en animales tratados con LPS (lipopolisacárido E. coli). Este experimento se describe en el Ejemplo 14 más adelante. Esto muestra que los antagonistas de miostatina también son útiles para tratar el componente inflamatorio de los trastornos inmunes tal como RA. Además, las lesiones debido a quemaduras se han encontrado por contribuir a un incremento en la miostatina de ARNm en animales (Land y colaboradores, FASEB 15 1807-1809 (2001). Los antagonistas de miostatina que incluyen agentes de unión descritos en la presente son útiles para el tratamiento de individuos de pérdida que resulta de lesiones por quemaduras. Las condiciones adicionales que dan por resultado la pérdida muscular o atrofia pueden presentarse originarse de la inactividad debido a la incapacidad tal como el confinamiento en una silla de ruedas o reposo en cama prolongado. El reposo en cama o inactividad prolongada puede ser debido al ataque al corazón, enfermedad cardíaca, otra enfermedad crónica, lesión acorde a la espinal, coma, fractura o trauma ósea, debilidad debido a la vejes o demencia, y recuperación de cirugías tal como reemplazo de cadera o rodilla. Por ejemplo, la proteína inmunoreactiva de miostatina en plasma se encontró para incrementarse después del reposo en cama prolongado (Zachwieja y colaboradores J Gravit Physiol. 6(2): 11(1999)). La prevención de la pérdida de peso corporal, en particular masa corporal magra, se ha demostrado en un modelo de ratón de atrofia por desuso, un modelo de suspensión de extremidad posterior. La cola del ratón macho C57B1/6 se suspendió y recibió placebo o un pepticuerpo 2x TN8-19-21 en 3 mg/kg cada 3 días durante 14 días. El tratamiento con el pepticuerpo ejemplar atenuó la pérdida de masa corporal magra y fuerza muscular en el ratón suspendido comparado con el ratón control suspendido que recibió un placebo. Otras condiciones que dan por resultado pérdida del músculo son exposición a un ambiente de microgravedad (vuelo espacial). Se encontró, por ejemplo, que los músculos de ratas expuestas a un ambiente de microgravedad durante un vuelo lanzado al espacio expresaron una cantidad incrementado de miostatina comparada con los músculos de las ratas que no fueron expuestas (Lalani y colaboradores, J. Endocrin 167 (3): 417-28 (2000)). Por lo tanto, los antagonistas de miostatina que incluyen los agentes de unión de miostatina descritos en la presente pueden utilizarse para prevenir la pérdida muscular y debilidad debido al vuelo espacial. Además, la debilidad/sarcopenia relacionada a la edad puede tratarse con antagonistas de miostatina que incluye los agentes de unión de miostatina descritos en la presente. Estos efectos incluyen incrementos relacionados a la edad en grasa a proporciones musculares, y atrofia muscular relacionada a la edad y debilidad. Como se utiliza en la presente el término "sarcopenia" se refiere a la pérdida de masa muscular que ocurra con la edad. La proteína de miostatina-inmunoreacti va en suero promedio incrementado con la edad en grupos de hombres y mujeres jóvenes (19-35 año de edad), edad mediana (36-75 edad), y mayores (76-92 año viejo), puesto que la masa muscular promedio y la masa sin grasa declinaron con la edad en estos grupos (Yarasheski y colaboradores J Nutr Aging 6(5): 343-8 (2002)). También se ha mostrado que los incrementos con relación a la edad en tejido adiposo y -disminución de masa muscular fueron proporcionales a los niveles de miostatina, como se determinó por una comparación de la masa grasa y muscular en el ratón Mstn+ + cuando se comparó con el ratón knockout adulto Mstn"'" (McFerron y colaboradores J. Clin. Invest 109, 595 (2002)). El ratón Mstn"'" mostró la acumulación de grasa disminuida con la edad comparada con el ratón Mstn+/+. La reducción de los niveles de miostatina en el músculo del corazón puede mejorar la recuperación del músculo del corazón después del infarto, puesto que los niveles de miostatina se expresan en los niveles bajos en el músculo del corazón y la expresión es sobreregulada en cardiomiocitos después del infarto (Sharma y colaboradores, J Cell Physiol. 180 (l):1-9 (1999)). Además, el incremento de masa muscular reduciendo los niveles de miostatina puede mejorar la fuerza ósea y reduce la osteoporosis y otras enfermedades óseas degenerativas. Se ha encontrado, por ejemplo, que el ratón deficiente de miostatina muestra el contenido mineral incrementado y densidad del húmero de ratón y contenido mineral incrementado del hueso trabecular y cortical en las regiones donde los músculos se unen, así como la masa muscular incrementada (Hamrick y colaboradores Calcif Tissue Int 71(l):63-8 (2002)). Tratamiento Alternativo para la Hormona de Crecimiento Los antagonistas de miostatina que incluyen los agentes de unión de la presente invención pueden además utilizarse como un tratamiento alternativo para trastornos tratado actualmente por la hormona de crecimiento (GH), factor-1 de crecimiento de insulina, secretagogos de la hormona de crecimiento, o andrógenos. El tratamiento con GH o secretagogos de la hormona de crecimiento es el tratamiento anabólico clásico para el crecimiento y trastornos relacionados con músculos tal como la enfermedad de Prader-Willi descrita más adelante. Sin embargo, el tratamiento de GH tendrá a menudo efectos negativos. Los antagonistas de miostatina son útiles como una alternativa para este tratamiento, produciendo una respuesta muscular más selectiva sin los efectos secundarios peligrosos de terapias relacionadas con GH. Los antagonistas de miostatina son también útiles para tratar una población resistente a GH, o individuos que envejecen que se han hecho resistentes a GH.

Los antagonistas de miostatina son útiles, por ejemplo, para trata el síndrome de Prader-Willi, un trastorno genético que generalmente involucra el cromosoma 15. Prader-Willi es caracterizado por la obesidad, hipotonía, o tono muscular pobre, y retraso del desarrollo significativo en niños afectados con este trastorno (Wattendorf y colaboradores, Amer Fam Physician 72 (5), 827-830 (2005)). Este trastorno genético se trata actualmente con la hormona de crecimiento, que puede ser peligrosa para infantes. (Riedl y colaboradores, Acta Paedriatr 94(7):97407 (2005), Miller J, J Clin Endocrino! Metab epub Nov 29 (2005)). Los antagonistas de miostatina que incluyen los agentes de unión descritos en la presente incrementan la masa muscular y fuerza así como disminuyen la proporción de grasa muscular, y por lo tanto es útil para tratar esta condición. Tratamiento del Hipogonadismo Los antagonistas de miostatina que incluyen los agentes de unión de la presente invención pueden utilizarse para tratar los resultados del hipogonadismo en sujetos en necesidad de tal tratamiento. Como se describe en la presente, el término "hipogonadismo" se refiere a la gónada inadecuada o reducida que funciona en varones y mujeres, que resulta de deficiencias en los órganos sexuales o secreción reducida de las hormonas gonadales. Como se utiliza en la presente el hipogonadismo incluye los resultados de la castración química o quirúrgica (también designada como orquiectomía o pérdida da uno o ambos testículos), e hipogonadismo con relación a la edad. La terapia de privación del andrógeno con castración química o quirúrgica se utiliza para tratar cáncer de próstata, otros cánceres relacionados al órgano sexual tal como cáncer ovárico, cáncer de mama, así como endometriosis, y otros trastornos. El hipogonadismo puede dar lugar en peso corporal disminuido, en particular por masa corporal magra disminuida y masa grasa incrementada en un cierto plazo, y fuerza muscular disminuida. El tratamiento del ratón orquiectomizado con un antagonista de miostatina se describe en el Ejemplo 13 más adelante. Los animales orquiectomizados tratados con el antagonista del pepticuerpo de miostatina muestran una atenuación o revocación de la pérdida de masa corporal magra en comparación con los animales tratados con el vehículo Fe. Esto muestra que los antagonistas de miostatina son útiles para tratar los efectos del hipogonadismo, que incluyen pacientes sometidos a terapia de privación de andrógeno. Los antagonistas de miostatina también pueden prevenir incrementos en masa grasa en sujetos que sufren de hipogonadismo. La presente invención también proporciona métodos y composiciones para incrementar la masa muscular en animales de alimento administrando una dosificación efectiva de antagonistas de miostatina tal como los agentes de unión de miostatina descritos en la presente al animal. Puesto que el polipéptido de miostatina C-term¡nal maduro es idéntico en todas las especies probadas, se espera que los antagonistas de miostatina sean efectivos para incrementar la masa muscular y reduzcan la grasa en cualquier especie agrícolamente importante que incluye ganado, pollo, pavos, y cerdos. Los antagonistas de miostatina de la presente invención pueden utilizarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para mejorar sus efectos terapéuticos o disminuyan los efectos secundarios potenciales. Los agentes de unión son antagonistas de miostatina ejemplares. Los agentes de unión de la presente invención poseen una o más combinación deseable pero la combinación de propiedades inesperada para mejorar el valor terapéutico de los agentes. Estas propiedades incluyen actividad incrementada, solubilidad incrementada, degradación reducida, vida promedio incrementada, toxicidad reducida, e inmunogenicidad reducida. Así los agentes de unión de la presente invención son útiles para los regímenes de tratamiento extendidos. Además, las propiedades de hidrofilicidad e hidrofobicidad de los compuestos de la invención son bien balanceados, de tal modo mejorando su utilidad para usos ¡n vitro y especialmente ¡n vivo. Específicamente, los compuestos de la invención tienen un grado apropiado de solubilidad en medio acuoso que permite la absorción y biodisponibilidad en el cuerpo, mientras que también tienen un grado de solubilidad en lípidos que permite que los compuestos atraviesen la membrana celular a un sitio putativo de acción, tal como una masa muscular particular. Los agentes de unión de la presente invención son útiles para tratar un "sujeto" o cualquier animal, que incluyen humanos, cuando se administran en dosificaciones efectivas en una composición adecuada. Además, los agentes de unión de miostatina de la presente invención son útiles para detectar y cuantificar la miostatina en un número de ensayos. Estos análisis se describen más detalladamente más adelante. En general, los agentes de unión de la presente invención son útiles como agentes de captura para unir e inmovilizar la miostatina en una variedad de ensayos, similar e los descritos, por ejemplo, en Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology. Academic Press, Inc., New Cork (1993). El agente de unión puede marcarse de una cierta manera o puede reaccionar con una tercera molécula tal como un anticuerpo del agente anti-unión el cual es marcado para permitir a la miostatina detectarse y cuantificarse. Por ejemplo, un agente de unión o una tercera molécula puede modificarse con una porción detectable, tal como biotina, que puede después enlazarse por una cuarta molécula, tal como estreptavidina de enzima-marcada, u otras proteínas. (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997)). A través de cualquier ensayo particular, las etapas de incubación y/o lavado pueden requerirse después de cada combinación de reactivo. Los etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferiblemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato del ensayo, volumen de la solución, concentraciones, y similares. Generalmente, los ensayos serán realizados a temperatura ambiente, aunque pueden ser conducidos sobre un intervalo de temperaturas. Ensayo de unión no competitivos: Los ensayos de unión pueden ser del tipo no competitivo en el cual cantidad de miostatina capturada se mide directamente. Por ejemplo, en un ensayo -tipo "sandwich" preferido, el agente de unión puede limitarse directamente a un sustrato sólido donde se inmoviliza. Estos agentes inmovilizados después unen a la miostatina presente en la muestra de prueba. La miostatina inmovilizada después es enlazada con un agente de marcado, tal como un anticuerpo marcado contra la miostatina, que puede detectarse. En otro ensayo tipo "sandwich" preferido, un segundo agente específico para el agente de unión puede agregarse el cual contiene una porción detectable, tal como biotina, al cual una tercera molécula marcada puede específicamente unirse, por ejemplo estreptavidina. (Ver, Harlow and Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Sprinq Harbor Laboratory. NY (1988), la cual se incorpora en la presente por referencia). Ensayo de Unión Competitivo: El ensayo de unión puede ser del tipo competitivo. La cantidad de miostatina presente en la muestra es medida indirectamente midiendo la cantidad de miostatina desplazada, o completada lejos, de un agente de unión por la miostatina presente en la muestra. En un ensayo de unión competitivo preferido, una cantidad conocida de miostatina, generalmente marcada, se agrega a la muestra y la muestra después se pone en contacto con el agente de unión. La cantidad de miostatina marcada enlazada al agente de unión es inversamente proporcional a la concentración de la miostatina presente en la muestra, (seguido de los protocolos encontrados en, por ejemplo Harlow and Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual. Ch 14, pp. 579-583, Supra). En otro ensayo de unión competitivo preferido, el agente de unión es inmovilizado en un sustrato sólido. La cantidad de miostatina enlazada al agente de unión puede determinarse o midiendo la cantidad de miostatina presente en un complejo del agente de miostatina/unión, o alternativamente midiendo la cantidad de miostatina no compleja restante. Otro Ensayo de Unión La presente invención también proporciona métodos Western blot para detectar o cuantlficar la presencia de la miostatina en una muestra. La técnica generalmente comprende la separación de las proteínas de muestra por electrofóresis en gel en base del peso molecular y transferencia de las proteínas a un soporte sólido adecuado, tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, o filtro de nylon derivatizado. La muestra se incuba con agentes de unión o fragmentos del mismo que unen la miostatina y el complejo resultante es detectado. Estos agentes de unión pueden directamente marcarse o alternativamente pueden detectarse posteriormente usando anticuerpos marcados que específicamente unen al agente de unión. Ensayo de Diagnóstico Los agentes de unión o fragmentos de los mismos de la presente invención pueden ser útiles para la diagnóstico de condiciones o enfermedades caracterizadas por cantidades incrementadas de miostatina. El ensayo de diagnóstico para altos niveles altos de miostatina incluye métodos que utilizan un agente de unión y un marcado para detectar la miostatina en fluidos corporal humanos, extractos de células o extractos de tejido específicos. Por ejemplo, los niveles en suero de la miostatina pueden medirse en un individuo durante cierto tiempo para determinar el inicio de la pérdida muscular asociada con el envejecimiento o inactividad, como se describe, por ejemplo, en Yarasheski y colaboradores, Supra. Los niveles de miostatina incrementados se muestran para correlacionarse con la masa muscular disminuida promedio y masa sin grasa en grupos de hombres y mujeres de edades avanzada (Yarasheski y colaboradores, Supra). Los agentes de unión de la presente invención pueden ser útiles para supervisar los incrementos o disminuciones en los niveles de miostatina con un individuo dado en un cierto tiempo, por ejemplo. Los agentes de unión pueden utilizarse en tal ensayo con o sin modificación. En un ensayo de diagnóstico preferido, los agentes de unión serán marcados por unión, por ejemplo, un marcado o una molécula reportero. Una variedad amplia de marcados y moléculas reportero se conoce, algunas de las cuales se han descrito ya en la presente. En particular, la presente invención es útil para el diagnóstico de la enfermedad humana. Una variedad de protocolos para medir proteínas de miostatina que utilizan agentes de unión de miostatina se conoce en la técnica. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunosorbente unido a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertas modalidades los agentes de unión de la presente invención normalmente se marcaran con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directamente o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, o 125l, un compuesto fluorescente o quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante (Bayer y colaboradores, Meth Enz, 184: 138 (1990)).

Composiciones Farmacéuticas La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas de uno o más antagonistas de miostatina descritos en la presente para tratar condiciones de la enfermedad objeto. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más antagonista de miostatina en combinación con un agente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas comprenden antagonistas que inhiben la miostatina parcial o completamente en combinación con un agente farmacéuticamente aceptable. Normalmente, los antagonistas se purificarán suficientemente para la administración a un animal. La composición farmacéutica puede contener materiales de la formulación para de modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad , olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparragina, arginina o Usina); antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno-sulfito de sodio); amortiguadores (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos, otros ácidos orgánicos); agentes de voluminosidad (tal como manitol o glicina), agentes de quelación (tal como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)); agentes de complejo (tal como cafeína, pol'ivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) ; rellenos; monosacáridos; disacáridos y otros carbohidratos (tal como glucosa, mañosa, o dextrinas); proteínas (tal como albúmina, gelatina o inmunoglobulinas en suero); colorante; agentes saborizantes y de dilución; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de peso molecular bajo; contraiones formadores de sal (tal como sodio); conservadores (tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, fenetil alcohol, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); solventes (tal como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tal como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tal como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitan, polisorbatos tal como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes mejoradores de estabilidad (sucrosa o sorbitol); agentes mejoradores de tonicidad (tal como haluros alcalino-metálicos (preferiblemente cloruro de sodio o potasio, sorbitol de manitol); vehículos de liberación; diluyentes; excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). La composición farmacéutica óptima se determinará por el experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta deseada de administración, formato de liberación, y dosificación deseada. Ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Supra. Tales composiciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, proporción de liberación in vivo, e índice de eliminación in vivo del agente de unión. El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser acuoso o no acuoso en naturaleza. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral. Los mezclados de solución salina o solución salina amortiguada neutral con albúmina en suero son además vehículos ejemplares. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden el amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o amortiguador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, que puede además incluir sorbitol o un sustituyente adecuado del miso. En una modalidad de la presente invención, las composiciones del agente de unión pueden prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, Supra) en la forma una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, el producto del agente de unión puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tal como sucrosa. Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para la liberación parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para liberación enteral tal como oral, aural, optálmica, rectal o vaginal. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la habilidad de la técnica. Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables al sitio de administración. Por ejemplo, los amortiguadores se utilizan para mantener la composición a pH fisiológico o a pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden estar en la forma de una solución acuosa libre de pirógeno, parenteralmente aceptable que comprende el agente de unión deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual un agente de unión se formula como una solución estéril, isotónica, correctamente preservada. Aún otra preparación puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erodibles, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), gránulos, o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto que puede después liberarse vía una inyección con depósito. El ácido hialurónico puede también utilizarse, y éste puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otro medio adecuado para la introducción de la molécula deseada incluye dispositivos de liberación de fármaco implantable. En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tal como solución de Hanks, solución de ringer, o solución salina fisiológicamente amortiguada. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrán. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección aceitosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, tal como aceite de sésamo, o ésteres de ácido graso sintéticos, tal como oleato de etilo, triglicéridos, o liposomas. Los polímeros amino policatiónicos de no-lípido también pueden utilizarse para la liberación. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes para incrementar la solubilidad de los compuestos y para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En otra modalidad, una composición farmacéutica pueden formularse para inhalación. Por ejemplo, un agente de unión puede formularse como un polvo seco para inhalación. El polipéptido o soluciones de inhalación de la molécula de ácido nucleico también pueden formularse con un propulsor para la liberación en aerosol. En aún otra modalidad, las soluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe además en la Solicitud PCT No. PCT/US94/001875, que describe la liberación pulmonar de proteínas químicamente modificadas. También se contempla que ciertas formulaciones pueden administrarse oralmente. En una modalidad tal como de la presente invención, las moléculas del agente de unión que se administran de esta manera pueden formularse con o sin los portadores usados habitualmente en la composición de las formas de dosificación sólidas como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Los agentes adicionales pueden incluirse para facilitar la absorción de la molécula del agente de unión. Los diluyentes, saborizantes, ceras de punto de fusión bajo, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de desintegración de tabletas, y aglutinantes también pueden utilizarse. Las composiciones farmacéuticas para la administración oral también pueden formularse usando portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales portadores permiten a las composiciones farmacéuticas formularse como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, mezclas, suspensiones, y similares, para ingestión por el paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse combinando los compuestos activos con el excipiente sólido y procesando la mezcla resultante de gránulos (opcionalmente, después del molido) para obtener tabletas o núcleos de gragea. Los auxiliares adecuados pueden agregarse, si se desea. Los excipientes adecuados incluyen rellenos de carbohidrato o proteína, tal como azúcares, que incluyen lactosa, sucrosa, manitol y sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa, u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximétilcelulosa de sodio; gomas, que incluyen arábica y tragacanto; y proteínas, tal como gelatina y colágeno. Si se deseada, agentes de desintegración o solubilización pueden agregarse, tal como pirrolidona de polivinilo reticulada, agar y ácido algínico o una sal de los mismos, por ejemplo alginato de sodio. Los núcleos de gragea pueden utilizarse en combinación con revestimientos adecuados, tal como soluciones de azúcar concentradas, que también pueden contener goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol , y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solvente. Los colorantes o pigmentos pueden agregarse a las tabletas o revestimientos de gragea para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, dosificación. Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente también incluyen cápsulas ajustadas por presión hechas de gelatina, así como cápsulas suaves, selladas hechas de gelatina y un revestimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas ajustadas por presión pueden contener los ingredientes activos mezclados con rellenos o aglutinantes, tal como la lactosa o almidones, lubricantes, tal como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas suaves, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tal como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores. Otra composición farmacéutica puede involucrar una cantidad efectiva del agente de unión en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. Disolviendo las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones pueden prepararse en forma de dosis única. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes de unión, tal como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tal como estearato del magnesio, ácido esteárico, o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes al experto en la técnica, que incluyen formulaciones que involucran moléculas del agente de unión en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Las técnicas para formular una variedad otros medios de liberación sostenida o controlada, tal como portadores de liposoma, micropartículas bioerodibles o gránulos porosos e inyecciones de depósito, también se conocen por el experto en la técnica. Ver por ejemplo, PCT/US93/00829 que describe liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la liberación de composiciones farmacéuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (Patente Norteamericana 3,773,919, documento EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y colaboradores, Biopolimers, 22:547-556 (1983), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer y colaboradores, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer y colaboradores, Chem. Tech., 12:98-105(1982)), etilenvinilacetato (Langer y colaboradores, supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Eppstein y colaboradores, PNAS (USA), 82:3688 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949. La composición farmacéutica ha utilizarse para la administración in vivo normalmente debe ser estéril. Esto se puede lograr por la filtración a través de membranas de filtración estériles. Donde la composición se liofiliza, la esterilización que utiliza este método puede conducirse antes de o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en la solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un envase que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para utilizarse o en una forma (por ejemplo, liofilizado) que requiere reconstitución antes de la administración. En una modalidad específica, la presente invención se dirige a kits para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los kits pueden cada uno contener un primer envase que tiene una proteína seca y un segundo envase que tiene una formulación acuosa. También incluido dentro del alcance de esta invención los están los kits que contienen jeringas prerrellenas de una sola y multi-cámaras (por ejemplo, jeringas para líquido y liogeringas).

Una cantidad efectiva de una composición farmacéutica para utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán así dependiendo, en parte, de la molécula liberada, la indicación para la cual la molécula del agente de unión se utiliza, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el médico puede titular la dosificación y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación normal puede ir de aproximadamente 0.1 mg/kg hasta a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras modalidades, la dosificación puede ir de 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales tal como ratón, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. Un modelo animal también puede utilizarse para determinar el intervalo de concentración apropiado y ruta de administración. Tal información puede después utilizarse para determinar la dosis y rutas útiles para la administración en humanos. La dosificación exacta será determinada en la luz de los factores relacionados con el tratamiento que requiere el sujeto. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden considerase incluyen la severidad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso y género del sujeto, tiempo y frecuencia de la administración, combinación(es) del fármaco, sensibilidades de reacción, y respuesta a terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción larga pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana o bisemanalmente dependiendo de la vida promedio e índice de eliminación de la formulación particular. La frecuencia de la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula del agente de unión en la formulación usada. Normalmente, se administrará una composición hasta que una dosificación se alcance que logre el efecto deseado. La composición puede por lo tanto administrarse como una sola dosis, o como dosis múltiples (en la misma o diferentes concentraciones/dosificaciones), durante el tiempo, o como una infusión continua. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace rutinariamente. Las dosificaciones apropiadas pueden comprobarse con el uso de los datos de dosis-respuesta apropiados. La ruta de la administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo oralmente, a través de inyección por las rutas intravenosa, intraperitoneal , intracerebral (intra-parenquimal), ¡ntracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermal, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, uretral, vaginal o rectal, por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. Donde se desee, las composiciones pueden administrarse por inyección de bolo o continuamente por infusión, o por el dispositivo de implantación. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede administrarse localmente vía la implantación de una membrana, esponja, u otro material apropiado en el cuál la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Donde se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la liberación de la molécula deseada puede ser vía difusión, bolo de liberación medida, o administración continua. En algunos casos, puede ser deseable utilizar composiciones farmacéuticas de una manera ex vivo. En tales casos, las células, tejidos u órganos que se han eliminado del paciente se exponen a las composiciones farmacéuticas después de lo cual las células, tejidos y/u órganos se implantaron posteriormente de nuevo en el paciente. En otros casos, un antagonista de miostatina tal como un pepticuerpo puede suministrase implantando ciertas células que se han diseñado genéticamente, usando métodos tal como los descritos en la presente, para expresar y secretar el polipéptido. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenoganeicas. Opcionalmente, las células pueden inmortalizarse. Para disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulacion son compartimientos o membranas poliméricas normalmente biocompatible, semipermeables que permiten la liberación del producto(s) de proteína pero previenen la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores dañinos de los tejidos circundantes. Las composiciones farmacéuticas que contienen los antagonistas de miostatina de la presente invención pueden administrarse a un sujeto en necesidad del mismo para tratar cualquier trastorno relacionado con la miostatina. Estos incluyen trastornos de pérdida muscular que incluyen pero no limitan a distrofia muscular, pérdida muscular en cáncer, SIDA, atrofia muscular, artritis reumatoide, falla renal/uremia, paro cardíaco crónico, reposo en cama prolongado, lesión acorde a la espinal, ataque al corazón, y sarcopenia relacionada a envejecimiento. Además estas composiciones pueden administrarse para tratar la obesidad, diabetes, hiperglicemia, y densidad ósea incrementada. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse a un sujeto en necesidad de las mismas para tratar los efectos del hipogonadismo, caquexia reumatoide, TNF-a excesivo, caquexia debido a lesiones por quemaduras, diabetes, exposición química tal como quimioterapia, nefropatía diabética y tratamiento de trastornos actualmente tratados con GH o agentes relacionado con GH, tal como síndrome de Prader-Willi. Además, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en combinación con tratamientos existentes para los trastornos indicados anteriormente. Estos incluyen, por ejemplo, denosomaub usado para la osteoporosis ósea y debilidad, en combinación con antagonistas de miostatina. La invención se ha descrito, los siguientes Ejemplos se ofrece por ilustración, y sin limitación. Ejemplo 1 Identificación de Péptidos de Unión de Miostatina Tres bibliotecas de fagos filamentosos, TN8-IX (5X109 transformantes independientes) TN12-I (1.4X109 transformantes independientes), y lineal (2.3X109 transformantes independientes) (Dyax Corp.) se utilizan para seleccionar el fago de unión de miostatina. Cada biblioteca se incubó en la superficies revestida con miostatina y se sometió a diferentes condiciones de cribado: elución no específica, y elución específica usando la quimera del receptor IIB/Fc de activina humana recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), o elución del propéptido de miostatina como se describe más adelante. Para las tres bibliotecas, los fagos se eluyeron de una manera no especifica para la primera ronda de selección, mientras el receptor y promiostatina se utilizaron en la segunda y tercera rondas de selección. Los procedimientos de selección se realizaron como se describe más adelante. Preparación de Miostatina La proteína de miostatina se produjo recombinantemente en la cepa E. coli K-12 2596 (ATCC # 202174) como sigue. Los polinucleótidos que codifican la molécula de promiostatina humana se clonaros en el vector de expresión pAMG21 (ATCC No. 98113), que se derivó del vector de expresión pCFM1656 (ATCC No. 69576) y el sistema del vector de expresión descrito en la Patente Norteamericana No. 4,710,473, por el siguiente procedimiento descrito en la Solicitud de Patente Internacional publicada WO 00/24782. Los polinucleótidos que codifican la promiostatina se obtuvieron de un vector de expresión mamífero. La región de clonación se amplificó usando un método de PCR estándar y los siguientes cebadores PCR para introducir el sitio de restricción para Nde\ y fíamHI. cebador 5': 5'-GAGAGAGAGCATATGAATGAGAACAGTGAGCAAAAAG-3' (SEC ID NO: 292) cebador 3': 5'-AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC-3' (SEC ID NO: 293). El producto PCR y vector se digerieron con ambas enzimas, se mezclaron y ligaron. El producto de ligadura se transformó en la cepa de E. coli # 2596. Las colonias solas se comprobaron microscópicamente por expresión de proteína recombinante en la forma de cuerpos de inclusión. El plásmido se aisló y secuenció con la región de codificación del gene recombinante para verificar la fidelidad genética. La pasta bacteriana se generó de una fermentación de 10 I usando un método de lote a 37°C. El cultivo se indujo con HSL a una densidad celular de 9.6 OD60o y cosechó seis horas después de una densidad de 104 OD600- La pasta se almacenó a -80°C. la pasta de E. coli que expresa la promiostatina se liso en un microfluidizador a 16,000 psi, se centrifugó para aislar la fracción del cuerpo de inclusión insoluble. Los cuerpos de inclusión se suspendieron de nuevo en clorhidrato de guanidina que contiene ditiotreitol y se solubilizaron a temperatura ambiente. Estos después se diluyeron 30 veces en un amortiguador acuoso. La promiostatina replegado después se concentró y el amortiguador se intercambió en 20 mM de Tris pH 8.0, y se aplicó a una columna de intercambio aniónico. La columna de intercambio aniónico se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio incrementado. Las fracciones que contienen promiostatina se combinaron. La promiostatina producida en E. coli se ausentó de los primeros 23 aminoácidos e inició con una metionina antes del residuo 24 de asparragina. Para producir miostatina madura, la promiostatina reunida se dividió enzimáticamente entre el propéptido y la miostatina madura C-terminal. La mezcla resultante después se aplicó a una columna C4-rpCLAR usando un gradiente incrementado de acetonitrilo que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético. Las fracciones que contienen miostatina madura se combinaron y secaron en un velocidad-vac. La miostatina madura recombinante producida a partir de E. coli se probó en el mioblasto C2C12 basado en el ensayo descrito más adelante y se encontró por ser completamente activo cuando se comparó con la miostatina murina recombinante producida comercialmente en un sistema de célula mamífera (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota). La miostatina madura producida por E. coli se utilizó la exhibición de fago y el ensayo de identificación descrito más adelante. Preparación de Tubos Revestidos con Miostatina La miostatina se inmovilizó en Immuno™ Tubes de 5 mi (NUNC) en una concentración de 8 ug de proteína de miostatina en 1 mi de amortiguador de carbonato de sodio 0.1M (pH 9.6). El Immuno™ Tube revestido con miostatina se incubó con agitación orbital durante 1 hora a temperatura ambiente. El Immuno™ Tube revestido con miostatina después se bloqueó agregando 5 mi de 2% de leche-PBS e incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con rotación. El Immuno™ Tube revestido con miostatina resultante después se lavó tres veces con PBS antes de someterse a los procedimientos de selección. Además Immuno™ Tubes también se prepararon por selecciones negativas (sin miostatina). Para cada condición de cribado, cinco a diez Immuno™ Tubes se sometieron al procedimiento anterior a menos que los Immuno™ Tubes se revistan con 1 mi de 2% de BSA-PBS en vez de la proteína de miostatina. Selección Negativa Para cada condición de cribado, aproximadamente 100 equivalentes de biblioteca aleatorios para las bibliotecas de TN8-IX y TN12-I (5X1011 pfu para TN8-IX, y 1.4X1011 pfu para TN12-I) y aproximadamente 10 equivalentes de biblioteca aleatorios para la biblioteca lineal (2.3X1010 pfu) se sometieron con alícuotas de la reserva de biblioteca y se diluyeron a 1 mi con PBST (PBS con 0.05% de Tween-20). Se agregó 1 mi de reserva de biblioteca diluida al Immuno™ Tube preparado para la selección negativa, e incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación orbital. El sobrenadante de fago se derivó y agregó al segundo Immuno™ Tube para otra etapa de selección negativa. De esta manera, cinco a diez etapas de selección negativas se realizaron. Selección para la Unión de Miostatina Después de la última etapa de selección negativa anterior, el sobrenadante de fago se agregó a Immuno™ Tubes cubiertos con miostatina preparados. El Immuno™ Tube se incubó con agitación orbital durante una hora a temperatura ambiente, permitiendo que el fago específico una la miostatina. Después el sobrenadante se desechó, el Immuno™ Tube se lavó aproximadamente 15 veces con 2% de leche-PBS, 10 veces con PBST y dos veces con PBS para las tres rondas de selección con las tres bibliotecas (TN8-IX, TN12-1, y bibliotecas lineales) excepto para la segunda ronda de selecciones con TN8-IX y bibliotecas TN12-I, el Immuno™ Tube se lavó aproximadamente 14 veces con 2% de leche-PBS, dos veces con 2% de BSA-PBS, 10 veces con PBST y una vez con PBS. Elución no Específica Después de la última etapa de lavado, los fagos unidos se eluyeron a partir del Immuno™ Tube agregando 1 mi de 100 mM de solución de trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) con incubación de 10-minutos con agitación orbital. El pH de la solución que contiene el fago después se neutralizó con 0.5 mi de Tris-HCI 1 M (pH 7.5). Elución del Receptor (Receptor de Activina Humana) del Fago Unido Para la ronda 2 y 3, después de la última etapa de lavabo, los fagos unidos se eluyeron a partir de Immuno™ Tube agregando 1 mi de 1 µ? de la proteína del receptor (quimera de receptor IIB/Fc de activina humana recombinante, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) con una incubación de una hora para cada condición. Elución del Propéptido del Fago Unido Para la ronda 2 y 3, después de la última etapa de lavado, los fagos unidos se eluyeron del Immuno™ Tubo agregando 1 mi de 1 µ? de proteína del propéptido (hecha como se describe anteriormente) con un incubación de una hora para cada condición. Amplificación del Fago El cultivo de E. col¡ fresco (XL-1 Blue MRF') se hizo crecer a OD60o = 0.5 en medio LB que contiene 12.5 ug/ml de tetraciclina. Para cada condición de cribado, 20 mi de este cultivo se enfriaron en hielo y centrifugaron. El granulado bacterial se suspendió de nuevo en 1 mi de la solución de sales min A. Cada mezcla de diferentes métodos de elución se agregó a una muestra de bacterias concentradas e incubó a 37°C durante 15 minutos. 2 mi del medio de NZCYM (2x NZCYM, 50 ug/ml de ampicilina) se agregaron a cada mezcla e incubaron a 37°C durante 15 minutos. 4 mi de la solución resultante se colocaron en placas en una placa de agar NZCYM grande que contenía 50 ug/ml de ampicilina e incubaron durante la noche a 37°C. Cada uno de la mezcla de bacteria/fago que se hizo crecer durante la noche en una placa de agar NZCYM grande se raspó en 35 mi de medio LB, y la placa de agar además se enjuagó con 35 mi de medio LB adicional. La mezcla de bacteria/fago resultante en medio LB se centrifugó para granular las bacterias fuera. Se transfirieron 50 ul del sobrenadante de fago a un tubo nuevo, y se agregaron 12.5 mi de la solución de PEG (20% PEG8000, 3.5M de acetato de amonio) e incubaron en hielo durante 2 horas para precipitar los fagos. Los fagos precipitados se centrifugaron más adelante y suspendieron de nuevo en 6 mi del amortiguador de resuspension de fago (250 mM de NaCI, 100 mM de Tris pH8, 1 mM de EDTA). Esta solución de fago además se purificó centrifugando fuera las bacterias restantes y precipitando el fago por segunda vez agregando 1.5 mi de la solución de PEG. Después de una etapa de centrifugación, el granulado de fago se suspendió de nuevo en 400 ul de PBS. Esta solución se sometió a una centrifugación final para librarse de la bacteria restante. La preparación del fago resultante se tituló por un ensayo de formación de placa estándar (Molecular Cloning, Maniatis y colaboradores, 3a Edición). Rondas Adicionales de Selección y Amplificación En la segunda ronda, el fago amplificado (1011 pfu) de la primera ronda se utilizó como el fago de entrada para realizar las etapas de selección y amplificación. El fago amplificado (1011 pfu) de la segunda ronda a su vez se utilizó como el fago de entrada para realizarse ta tercera ronda de selección y amplificación. Después de las etapas de elución de la tercera ronda, una fracción pequeña del fago eluido se colocó en placas como en el ensayo de formación de placa anterior. Las placas individuales se eligieron y colocaron en placas de microtitulación de 96 pozos que contenían 100 ul de amortiguador de TE en cada pozo. Estas placas principales se incubaron a 4°C durante la noche para permitir a los fagos eluirse en amortiguador de TE. Análisis Clonal ELISA de Fago Los clones de fago se sometieron a ELISA de fago y después se secuenciaron. Las secuencias se alinearon como se discute más adelante. El ELISA de fago se realizó como sigue. Un cultivo XL-I Blue MRF' de E. coli hasta que OD600 alcance 0.5. 30 ul de este cultivo se sometió a alícuotas en cada pozo de la placa de microtituiacion de 96 pozos. 10 ul del fago enluido se agregó a cada pozo y se dejó infectar de bacterias durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aproximadamente 120 ul del medio LB que contenían 12.5 ug/ml de tetraciclina y 50 ug/ml de ampicilina se agregaron a cada pozo. La placa de microtituiacion después se incubó con agitación durante la noche a 37°C. La proteína de miostatina (2 ug/ml en 0.1M de amortiguador de carbonato de sodio, pH 9.6) se dejó par cubrirse sobre placas axisorp™ de 96 pozos (NUNC) durante la noche a 4°C. Como un control, una placa de Maxisorp™ separada se cubrió con 2% de BSA preparado en PBS. Al siguiente día, el líquido en las placas Maxisorp™ cubiertas con proteína se desechó, se lavaron tres veces con PBS y cada pozo se bloqueó con 300 ul de 2% de solución de leche a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de leche se desechó, y los pozos se lavaron tres veces con solución de PBS. Después de la última etapa de lavado, aproximadamente 50 ul de leche PBST-4% se agregó a cada pozo de las Maxisorp™ revestidas con proteína. Aproximadamente 50 ul de cultivos durante la noche de cada pozo en la placa de microtituiacion de 96 pozos se transfirió a los pozos correspondientes de las placas revestidas con miostatina así como las placas revestidas de 2% de BSA control. 100 ul de la mezcla en dos clases de placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El líquido se desechó de las placas Maxisorp™, y los pozos se lavaron aproximadamente tres veces con PBST seguido por dos veces con PBS. El anticuerpo anti-M13 de HRP-conjugado (Amersham Pharmacia Biotech) se diluyó a aproximadamente 1:7.500, y 100 ul de la solución diluida se agregaron a cada pozo de las placas Maxisorp™ durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente. El líquido se desechó otra vez y los pozos se lavaron aproximadamente tres veces con PBST seguido por dos veces con PBS. 100 ul de sustrato quimioluminescente LumiGlo™ (KPL) se agregaron a cada pozo de las placas Maxisorp™ e incubaron por aproximadamente 5 minutos para que ocurra la reacción. La unidad quimioluminescente de las placas Maxisorp™ se leyó en un lector de placa (Lab System).

Secuenciado de Clones de Fago Para cada clon de fago, la plantilla de secuenciación se preparó por un método de PCR. El siguiente par de oligonucleótido se utilizó para amplificar un fragmento de nucleótido 500: cebador # 1: 5'- CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3' (SEC ID NO: 294) y cebador # 2: 5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3' (SEC ID NO: 295). La siguiente mezcla se preparó para cada clon.

Un termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem) se utilizó para operar el siguiente programa: [94°C durante 5min; 94°C durante 30 seg, 55°C durante 30 seg, 72°C durante 45 seg] x30 ciclos; 72°C durante 7 min; enfriado a 4°C. El producto de PCR de cada reacción se limpió usando el kit QIAquick Multiwell PCR Purification (Qiagen), seguido del 'protocolo del fabricante. El producto limpiado de PCR se comprobó produciendo 10 ul de cada mezcla de reacción de PCR con 1 ul de tinte (10X BBXS tinte cargado de gel de agarosa) en 1% de gel agarosa. El producto restante después se secuenció usando el secuenciador ABI 377 (Perkin Elmer) seguido por el protocolo recomendado del fabricante.

Clasificación v Análisis de la Secuencia Las secuencias del péptido que fueron traducidas de las secuencias del nucleótido fueron correlacionadas a los datos de ELISA. Los clones que muestran unidades quimioluminescentes altas en los pozos revestido con miostatina y unidades quimioluminescentes bajas en pozos revestidos con de 2% de BSA se identificaron. Las secuencias que ocurrieron en tiempos múltiples se identificaron. Las secuencias candidato elegidas basadas en estos criterios se sometieron a análisis adicional como pepticuerpos. Aproximadamente 1200 clones individuales se analizaron. De estos aproximadamente 132 péptidos se eligieron para generar los pepticuerpos de la presente invención. Estos se muestran en la Tabla I más adelante. Los péptidos que tienen la SEC ID NO: 1 a 129 se utilizaron para generar pepticuerpos del mismo nombre. Los péptidos que tienen la SEC ID NO: 130 a 141 se muestran en la Tabla 1 comprendiendo dos o más péptidos de la SEC ID NO: 1 a 132 unidos por una secuencia enlazadora. La SEC ID NO: 130 a 141 también se utilizó para generar pepticuerpos del mismo nombre. Las secuencias de consenso se determinaron para el grupo derivado TN-8 de péptidos. Estas son como sigue: KDXCXXWHWMCKPX (SEC ID NO: 142) WXXCXXXGFWCXNX (SEC ID NO: 143) IXGCXWWDXXCYXX (SEC ID NO: 144) XXWCVSPXWFCXXX (SEC ID NO: 145) XXXCPWFAXXCVDW (SEC ID NO: 146) Para todas las secuencias de consenso anteriores, las "secuencias de núcleo" de cada secuencia de consenso son el aminoácido que ocurren siempre en esta posición. "X" se refiere a cualquier aminoácido que ocurren naturalmente o modificado. Las dos cisteínas contenidas con las secuencias de núcleo son aminoácidos fijos en la biblioteca de TN8-IX.

TABLA I NOMBRE DEL PEPTICUERPO SEC ID NO. SECUENCIA DEL PEPTIDO iostatina -TNS-Conl 1 KD OMWHWMCKPP iostatina -TN8-Con2 2 DLCAMWHWMC PP Miostatina -TN8-Con3 3 LCKMWKWMC PP Miostatina -TN8-Con4 4 KDLCKMWHWMCKPK Miostatina -TN8-Con5 5 WYPCYEFHFWCYDL Miostatina -TN8-Con6 6 WYPCYEGHFWCYDL Miostatina -TN8-CCKl7 7 IFGCKWWDVQCYQF Miostatina -TN8-Con8 8 IFGCKWWDVDCYQF Miostatina -TN8-Con9 9 ADWCVSP WFCMVM Miostatina .TN8-ConlO 10 H FCPWWALFCWDF Miostatina -??8-1 11 mC MWHWMC PP Miostatina -TN8-2 12 IDKCAI GWMCPPL Miostatina -TN8-3 13 WYPCGEFGMWCLNV Miostatina -TN8-4 14 WFTCL CDNE Miostatina -TN8-5 15 HTPCPWFAPLCVEW Miostatina -TN8-6 16 ICEWCWRWKWMCKPE Miostatina -TN8-7 17 FETCPSWAYFCLDI Miostatina -TN8-8 18 AYKCEANDWGCWWL M¡ostatina-T 8-9 19 NSWCEDQWH CWWL M¡ostatina-TN8-10 20 WSACYAGHFWCYDL Mlostatiña-T S-ll 21 ANWCVSPNWFCMVM Míostatma-TN8-12 22 WTECYQQEFWCWNL Mipstatina-TN8-13 23 ENTCERWKWMCPPK Miostatina-TN8-l4 24 WLPCHQEGFWCMNF iostatina-TN8-15 25 STMCSQWHWMCNPF Miostatina-TN8-16 26 IFGCHWWDVDCYQF Miostatina-TN8-17 27 IYGCKW DIQCYD1 Miostat¡na N8-18 28 PDWCEDPDWWCKFW Miostatina-TNS-19 29 OGHCTRWPWMCPPY Miostatina-TN8-20 30 WQECYREGFWCLQT Miostatina-TN8-21 31 WFDCYGPGFKCWSP M¡ostatina-TN8-22 32 GVRCPKGHLWCLYP Miostatiña-TN8-23 33 HWACGY PWSC WV Míostatiña-TN8-24 34 GPACHSPWWWCVFG M¡pstat¡na-TN8-25 35 TTWCISPMWFCSQO Miostatina-TN8-26 36 HKFCPPWAIFCWDF M¡ostatina-TN8-27 37 PDWCVSPRWYCNMW M¡ stat¡na.TN8-28 38 VWKCHWFGMDCEPT Mipstatina-TN8-29 39 KHCQIWTWMCAPK iostatina-TN8-30 40 WFQCGSTLFWCYNL Miostatiña-T 8-31 41 WSPCYDHYFYCYTI M¡ostatina-T 8-32 42 SW CGFFKEVCMWV Miostatina-TN8-33 43 EMLCMIHPVFC PH Miostatina-T 8-34 44 LKTCNLWPWMCPPL Miostatina-TN8-35 45 WGC WYEAWCYN M¡ostatina-TN8-36 46 PIHCTOWAWMCPFr Mipstatina-TN8-37 47 DSNCPWYFLSCVEF iostatina-TN8-38 48 HIWC LA M CVEM Mipstatina-TN8-39 49 NLOCIYFLG CIYF Mipstatina-TN8-40 50 AWRCMWFSDVCTPG Miostatina-TN8-41 51 WFRCFLDADWCTSV i o s t a t i n a - N8-42 52 EKICQMWSWMCAPP Miostatina-TN8-43 53 WFYCHLNKSECTEP íostatiria-TN8-44 54 FWRCA IGIDKC R V Míostat¡ña-TN8-45 55 NLGC WYEVWCFTY M¡ostat¡na-TN8^*6 56 EDLCNMWDGMCYPP Miostatina-TN8-47 57 EMPCNr GWMCPPV Miostatina-TN12-l 58 WFRCVLTGIVDWSECFGL iostat¡na-TN12-2 59 GFSCTFGLDEFYVDCSPF iostatina-TN12-3 60 LPWCHDQVNADWGFCMLW M¡ostat¡na-TN12-4 61 YPTCSE PW1YGOTCVLW Miostatiña-TN12-5 62 LGPCPIHHGPWPOYCVYW Miostatina-TN12-6 63 PFPCETHQISWLGHCLSF MÍ ?taJÍ -TNl 2-7 64 HWGCEDLMWSWHPLCRRP Miostatina-TN12-8 65 LPLCDADMMPTIGFCVAY ipstatina-TN12-9 66 SHWCETTFWMNYAKCVHA Miostat¡na-TNI2-10 67 LPKCTHVPFDOG GFCLWY Miostat¡na-TNl2-l 1 68 FSSCWSPVSRQDMFCVFY ¡ stat¡na-TN12-13 69 SHKCEYSGWLOPLCYRP Miostatina-TN12-14 70 PWWCOD YVQHMLHCDSP M¡ostatma-TN12-l5 71 WF CMLMNSFDAFQCVSY iostatina-TN12-16 72 PDACRDQPWYMFMGCMLG ¡ostatina-TN12- -17 73 FLACFVEFELCFDS iostatina-TN12-18 74 SAYCIITESDPYVLCVPL Miostat¡na-TN12-19 75 PSICESYSTMWLPMCQHN Miostat¡na-TN12-20 76 WLDCHDDSWAWTKMCRSH Miostat¡na-TN12-21 77 YLNCVMMNTSPFVECVF M¡ostat¡na-TN12-22 78 YPWCDGFMIOOGI CMFY Miostatina-TN12-23 79 FDYCTWLNGFKDW CWSR Miostatina-TN12-24 80 LPLCNLKEISHVQACVLF iostat¡na-TN12-2S 81 SPECAFARWLGDBQCQRD Miostatina-TN12-26 82 YPQCFNLHLLEWTECDWF Miostatina-TN12-27 83 RWRCEIYDSEFLP CWFF M¡ostatina-TN12-28 84 LVGCDNVWHRC LF M¡ostatina-TN12-29 85 AGWCHVWGEMFGMGCSAL Miostatina-TN12-30 86 HHECEWMARWMSLDCVGL Mipstat¡na-TN12-31 87 FPMCG1AGMKDFDFCVWY Miostatina-T 12-32 88 RDDCTFWPEWLW LCERP Miostatina-TN12-33 89 YNFCSYLFGVS EACQLP Mi statina-T 12-34 90 AHWCEQGPWRYGNICMAY Mipstatina-TN12-3S 91 NLVCGKISAWGDEACARA Miostat¡ña-TN12-36 92 HNVCTDV1GPSMXWFCWND ipstat¡na-TN12-37 93 NDLCAMWGWTR TIWCQNS Mipstatina-TN12-38 94 PPFCQND DMLQSLC LL Mipstatina-TN12-39 95 WYDCNVP ELLSGLCRLF M¡pstatina-TN12-40 96 YGDCDONHWM WPFTCLS L Miostatina-TN12-41 97 GWMCHFDLHDWGATCQPD Miostatina-TN12-42 98 WHCMFGGHEFEVHCESF Miostatina-TN 12-43 99 AYWC HGQCVRF Miostatina-Lineal -1 100 S EH WTFTDWDGNEWWVRPF Miostatina-Lineal -2 101 MEMLDSLFELLKDMVPISKA Miostatina-Lineal -3 102 SPPEEALMEWLG OYG FT Miostatina-Lineal -4 103 SPE LLNDLYILMT QEWYG Miostatina-Lineal -5 104 FHWEEGIPFtíVVTPYSYDR Miostatina-Lineal -6 105 LRLLEQFMNDLAELVSGHS Miostatina-Lineal -7 106 DTRDALFOEFYEFVRSRLVI Miostatina-Lineal r-8 107 RMSAAPRPLTYRDIMDQYWH Miostatina-Lineal -9 108 NDKAHFFEMFMFDVHNFVES Miostatina-Lineal -10 109 QTQAQKIDGt.WELLOSIR- Q Miostatina-Lineal -11 110 MLSEFEEFLGNLVHRQEA Miostatina-Lineal -12 111 ?tp?MGS?wts wl·[mHYL· Miostatina-Lineal -13 112 LNDTLLREL MVLNSLSDMK Miostatina-Lineal -14 113 FDVERDLMRWLEGFMQSAAT Miostatina-Lineal -15 114 HHGWNYLR GSAPQWFEAWV Miostatina-Lineal -16 115 VESI.HQLQMWLDQ LASGPH Miostati na-Lineal '-17 116 RATLLKDFWQLVEGYGDN Miostati na- Lineal '-18 117 EELLREFYRFVSAFDY Miostati na-Lineal -19 118 GLLDEFSHFIAEQFYQ PGG Miostati na-LÍneal -20 119 YREMSMLEGLLDVLERLQHY Miostati na-Lineal -21 120 H SSO LLSELIMLVGSM O . Miostat na-Lineal -22 12 WREHFLNSDYIRD LIAIDG Miostat na-Lineal -23 122 QFPFYVFDDLPAQLEYWTA . Miostat na-Lineal -24 123 EFFHWLH HRSEV HWLD N '. Miostat na-Lineal -25 124 EALFQNFFRDVLTLSE EY ' Miostat na-Lineal -26 125 QYWEQQWMTYFKENGLHVQY Miostati na-Lineal '-27 126 NORMMLEDLWRIMTP FG S Miostat na-Lineal -29 127 FLDELKAELSRHY ALDDLDE Miostati na-Lineal "-30 128 GKLEEGLLNELMQLETFMPD Miostat na-Lineal -31 129 ILLLDEY DWKSWF Miostat ¡na.2xTN8-19kc 130 QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRV/PWM CPPY M¡ostatina-2xXN8-'con6 131 WYPCYEGHFWCYDLGSGSTASSG SGSATGWYPCYEGHFWCYDL Miostatina-2xTN8-5kc 132 HTPCPWFAPLCVEWGSGSATGGSG STASSGSGSATGHTPCPWFAPLCV EW Mlostatiria-2xT 8-18kc 133 PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGS GSTASSGSGSATGPDWCIDPDWW CKFW M¡ostatina-2xTN8-llkc 134 A WCVSPN FCMVMGSGSATGG SGSTASSGSGSATGANWCVSPNWF CMVM Miostatina-2xTN8-25kc 135 PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGS GSTASSGSGSATGPDWCIDPDWW CKFW M¡ostatina-2xTNS-23kc 136 HWACGYWPWSCKWVGSGSATGG SGSTAS SGSGS ATGHWACGYWP W SCKWV Miostatina-TN8-29-19 kc 137 KKHCQrWTWMCAPKGSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRV/PWM CPPY Miostatina-TN8-19-29 kc 138 QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGS GSTASSGSGSATGKKHCQIWTWM CAPK Miostatina-TN8-29-19 kn 139 KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRWPWM CPPY Miostatina.TN8-29-19-8g 140 KKHCQIWTWMCAPKGGGGGGGG QGHCTRWPWMCPPY iostat¡na-TN8-19-29-6gc 141 QGHCTRWPWMCPPYGGGGÍJGKK HCQIWTWMCAPK Ejemplo 2 Generación de Pepticuerpos Construcción del ADN que codifica proteínas de fusión del péptido-Fc Los péptidos capaces de unir la miostatina se utilizaron solos o en combinación con dada una de las proteínas de fusión del constructo en las cuales un péptido se fusionó al dominio Fe del lgG1 humano. La secuencia de aminoácidos de la porción Fe de cada pepticuerpo es como sigue (del amino terminal al carboxilo terminal): DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (SEC ID NO: 296) El péptido se fusionó en la configuración N (el péptido se unió al N-terminal de la región Fe), la configuración C (el péptido se unió al C-terminal de la región Fe), o la configuración N, C (el péptido unió ambos N y C terminal de la región Fe). Los vectores separados se utilizaron para expresar las fusiones N-terminal y fusiones C-terminal. Cada uno pepticuerpo se construyó recociendo los pares de oligonucleótidos ("oligos") al ácido nucleico del fago seleccionado para generar una secuencia de nucleótidos de dos hebras que codifica el péptido. Estas moléculas de polinucleótidos se construyeron como los fragmentos ApaL a Xho\. Los fragmentos se ligaron en el vector N-terminal pAMG21-Fc para la orientación N-terminal, o el vector pAMG21 -Fc-C-terminal para la orientación C-terminal la cual se digerido previamente con ApaL y Xho\. Las mezclas de ligadura resultante se transformaron por electroporacion en células 2596 ó 4167 de la cepa de E. coli (un hsdR-variante de células 2596 de la cepa) usando procedimientos estándares. Los clones se seleccionaron por la habilidad de producir el producto de proteína recombinante y por poseer la fusión del gene que tiene una secuencia de nucleótidos correcta. Un solo clon se seleccionó para cada uno de los péptidos modificados. Muchos de los constructos se crearon usando un vector alternativo señalado pAMG21 -2xBs-N(2eoR) Fe. Este vector es similar al vector descrito antes a menos que la digestión del vector se realice con BsmB\. Algunos constructos fusionaron las secuencias del péptido a ambos extremos del Fe. En estos casos el vector fue un compuesto de pAMG21 -2xBs-N(ZeoR) Fe y pAMG21-2xBs-C-Fc.

Constructo de PAMG21 El plásmido de expresión pAMG21 (ATCC No. 98113) se derivó del vector de expresión pCFM1656 (ATCC No. 69576) y el sistema del vector de expresión descrito en la Patente Norteamericana No. 4,710,473, por seguir el procedimiento describió en la Solicitud de Patente Internacional publicada WO 00/24782, las cuales se incorporan en la presente por referencia.

Vector N-Terminal de Fe El vector N-terminal de Fe se construyó usando el vector pAMG21 Fc_Gly5_Tpo como una plantilla. Un cebador de PCR 5' (más adelante) se diseñó para eliminar la secuencia del péptido Tpo en pAMG Tpo Gly5 y sustituirlo por un polienlazador que contiene los sitios ApaL y Xho\. Usando este vector como una plantilla, PCR se realizó con Expand Long Polimerase, usando el siguiente cebador 5' y un cebadores 3' universal: cebador 5": 5'-ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCG GCCGCAAAAAAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGAC A-3" (SEC ID NO: 297) cebador 3': 5'-GGTCATTACTGGACCGGATC-S' (SEC ID NO: 298) El producto PCR resultante fue gel purificado y digerido con enzimas de restricción A/del y BsrG\. El plásmido y el polinucleótido que codificaba el péptido de interés junto con su enlazador donde el gel purificado utiliza columnas de giro de purificación de gel Qiagen (Chatsworth, CA). El plásmido e inserto después se ligaron usando procedimientos de ligadura estándares, y la mezcla de ligadura resultante se transformó en células de E. coli (cepa 2596). Los clones sencillos se seleccionaron y el ADN secuenciado se realizó. Un clon correcto se identificó y este fue utilizó mientras que una fuente del vector para los péptidos modificados se describió en la presente. Construcción del Vector C-terminal de Fe El vector C-terminal de Fe se construyó usando el vector pAMG21 Fc_Gly5_Tpo como una plantilla. Un cebador de PCR 3' se diseñó para eliminar la secuencia del péptido Tpo y para sustituirla por un polienlazador que contiene los sitios ApaL\ y Xho\. El PCR se realizó con Expand Long Polimerase usando un cebador universal 5' y el cebador 3'. cebador 5': 5'-CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3' (SEC ID NO: 299) cebador 3': 5'-TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTITTTTTGCG 0??60???0?0??0?00?00??0?00?00????0-3· (SEC ID NO: 300) El producto de PCR resultante fue gel purificado y digerido con enzimas de restricción físrGI y Bam l. El plásmido y el polinucleótido que codifican cada uno de los péptidos de interés con su enlazador fue gel purificado vía columnas de giro de purificación de gel Qiagen. El plásmido e inserto después se ligaron usando procedimientos de ligadura estándares, y la mezcla de ligadura resultante se transformó en células de E. coli (cepa 2596). La cepa 2596 (ATCC # 202174) es una cepa de E. coli K-12 modificada para contener el promotor lux y dos represores termosensibles lambda, el cl857s7 y el represor lac lQ. Los clones sencillos se seleccionaron y el ADN secuenciado se realizó. Un clon correcto se identificó y utilizó como una fuente de cada pepticuerpo descrito en la presente. Expresión en E. coli. Los cultivos de cada uno de los constructos de fusión pAMG21-Fc en la cepa 2596 de E. coli se hicieron crecer a 37°C en medio Terrific Broth (Ver Tartof and Hobbs, "Improved media for growing plasmid and cosmid clones", Bethesda Research Labs Focus, Volumen 9, página 12, 1987, citado en la referencia la Sambrook y colaboradores anteriormente mencionada). La inducción de la expresión del producto de gene del promotor luxPR se realizó seguido de la adición del autoinductor sintético, lactona de N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserina, al medio de cultivo a una concentración final de 20 nanogramos por mililitro (ng/ml). Los cultivos se incubaron a 37°C por unas seis horas adicionales. Los cultivos bacterianos después se examinaron por microscopía para la presencia de cuerpos de inclusión y se recolectaron por centrifugación. Los cuerpos de inclusión retráctiles se observaron en cultivos inducidos, indicando que las Fc-fusiones se produjeron muy probablemente en la fracción insoluble en E. coli. Los granulados celulares se lisaron directamente por resuspensión en amortiguador de muestra Laemmli que contenía 10% de ß-mercaptoetanol y después se analizaron por SDS-PAGE. En más casos, una banda manchada de coomassie intensa de peso molecular apropiado se observada en un gel de SDS-PAGE.

Plegado y Purificación de Pepticuerpos Las células se quebraron en agua (1/10 volumen por volumen) por homogeneización de presión alta (3 pasos a 15,000 PSI) y los cuerpos de inclusión se cosecharon por centrifugación (4000 RPM en J-6B durante 30 minutos). Los cuerpos de inclusión se solubilizaron en guanidina 6 M, 50 mM de Tris, 8 mM de DTT, pH 8.0 durante 1 hora a una proporción 1/10 a temperatura ambiente. La mezcla solubilizada se diluyó 25 veces en urea 4 M, 20% de glicerol, 50 mM de Tris, 160 mM de arginina, 3 mM de cisteína, 1 mM de cistamina, pH 8.5. La mezcla se incubó durante la noche en frío. La mezcla después se dializó contra 10 mM de Tris pH 8.5, 50 mM de NaCI, urea 1.5 M. Después de una diálisis durante la noche el pH del dializado se ajustó a pH 5 con ácido acético. El precipitado se eliminó por centrifugación y el sobrenadante se cargó en una columna SP-Sepharose Fast Flow equilibrada en 10 mM de NaAc, 50 mM de NaCI, pH 5, 4°C). Después de cargar la columna se lavó para la línea base con 10 mM de NaAc, 50 mM de NaCI, pH 5.2. La columna se desarrolló con un gradiente de 20 volúmens de columna de 50 mM -500 mM de NaCI en el amortiguador de acetato. Alternativamente, después del lavado a la línea de base, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna a partir de 10 mM de fosfato de sodio pH 7.0 y la columna se desarrolló con un gradiente de 15 volúmenes de columna a partir de 0-400 mM de NaCI en amortiguador de fosfato. Las fracciones de la columna se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones que contenían el pepticuerpo dimérico se combinaron. Las fracciones también se analizaron por filtración de gel para determinarse si cualquier agregado estaba presente. Un número de pepticuerpos se preparó a partir de los péptidos de la Tabla I. Los péptidos se unieron a la molécula lgG1 Fe humana para formar los pepticuerpos en la Tabla II. Con respecto a los pepticuerpos en la Tabla II, la configuración C indica que el péptido nombrado se unió a la C-terminal del Fe. La configuración N indica que el péptido nombrado se unió en el N-terminal del Fe. La configuración N, C indica que un péptido se unió el N-terminal y uno al C-terminal de cada molécula de Fe. La designación 2x indica en que los dos péptidos nombrados se unieron en tándem entre sí y también se unieron al N o C terminal, o ambos N, C del Fe, separados por el enlazador indicado. Dos péptidos unidos en tándem se separaron por un enlazador, como se indica, por ejemplo, como Miostatina-TN8-29-19-8g, que indica que el péptido TN8-29 se unió vía un enlazador (gly)e al péptido TN8-19. El péptido(s) se unió al Fe vía un enlazador (gly)s a menos que se especifique lo contrario. En algunos casos el péptido(s) se unió vía un enlazador k. El enlazador designado k o 1k que se refiere a la secuencia del enlazador gsgsatggsgstassgsgsatg (SEC ID NO: 301), con el kc referido al enlazador unido al C-terminal del Fe, y kn que se refiere al enlazador unido al N-terminal del Fe. En la Tabla II más adelante, la columna 4 se refiere a la secuencia del enlazador que conecta el Fe con el primer péptido y la quinto columna se refiere a la configuración N o C o ambas. Puesto que la molécula de Fe dimerizada en solución, pepticuerpo construido para así tener un péptido será actualmente un dímero con dos copias del péptido y dos moléculas de Fe, y la versión 2x que tiene dos péptidos en tándem serán actualmente un dímero con cuatro copias del péptido y dos moléculas de Fe. Puesto que los pepticuerpos dados en la Tabla II se expresan en E. coli, el primer residuo de aminoácidos es Met (M). Por lo tanto, los pepticuerpos en la configuración N son Met-péptido-enlazador-Fc, o Met-péptido-en lazad o r-pépti do-enlazado r-Fc, por ejemplo. Los pepticuerpos en la configuración C se arregla como Met-Fc-enlazador-péptido o Met-Fc-enlazador-péptido-enlazador-péptido, por ejemplo. Los pepticuerpos en la configuración C, N es una combinación de ambos, por ejemplo, M et-péptido-en I azad o r-Fc-en lazad o r-pépti do. Las secuencias del nucleótido que codifican pepticuerpos ejemplares se proporcionan más adelante en la Tabla II. Las secuencias de polinucleótidos que codifican un pepticuerpo ejemplar de la presente invención incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del polipéptido de Fe tal como sigue: 5-GACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTC CTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA-3' (SEC ID NO: 301) Además, se incluyen los polinucleótidos que codifican el enlazador ggggg tal como sigue: 5'-GGTGGAGGTGGTGGT-3' (SEC ID NO: 302) El polinucleótido que codifica el pepticuerpo también incluye el codón que codifica la metionina ATG y un codón de detención tal como TAA. Por lo tanto, la estructura del primer pepticuerpo en la Tabla II es TN8-Conl con una configuración C y un enlazador (gly )5 es como sigue: M-Fc-GGGGG-KDKCKMWHWMCKPP (SEC ID NO: 303). Los polinucleótidos ejemplares que codifican estos pepticuerpo serán: 5'-ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAA CTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC CCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAG CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTAAGACAA ATGCAAAATGTGGCACTGGATGTGCAAACCGCCG-3' (SEC I D NO : 304) TABLA I I ;Miostat¡na.TN8- WYPCYEGHFWCYDL TGGTACCCGTGCTACGAAGGTCACTT 5giy C confi CTGGTGCTACGACCTG (¡Sec ID No: 153) Miostatina-TN8- WYPCYEGHFWCYDL TGGTACCCGTGCTACGAAGGTCACTT 5giy N con6 CTGGTGCTACGACCTG (Sec ID No: 154) Miostatina-TNS- DFGCKWWDVQCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT 5giy C con7 TCAGTGCTACCAGTTC (:Sec ID No: 155) Miostat¡na-TN8- IFGCKW WD VDCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT 5gly c con8 TGACTüCfACCAGTTC (¡Sec ID No: 156) Miostatina.XJSJg. IFGC WWD VDCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT 5giy N con8 TGACTGCTACCAGTTC (¡Sec ID No: 157) iostat¡na-TN8- ADWCVSP WFCMVM GCTGACTGGTGCGTTTCCCCGAACTG 5giy C con9 GTTCTGCATGGTTATG (ÍSecIDNo: 158) ¡ostati na -T 8- HKFCPW ALFCWDF CACAAATTCTGCCCGTGGTGGGCTCT iy c conlO GTTCTGCTGGGACTTC (ISecIDNo: 159) ¡ostat¡na..TN8-l KDLC MWHWMC PP AAAGACCTGTGCAAAATGTGGCACTG 5gly c GATGTGCAAACCGCCG (¡Sec ID No: 160 ¡ o s t a t i n a i-TN 8-2 IDKCAIWGWMCPPL ATCGACAAATGCGCTATCTGGGGTTG sgly c GATGTGCCCGCCGCTG (¡Sec ID No: 161) M ¡ostati na.TN8-3 WYPCGEFG fWOLNV TGGTACCCGTGCGG GAATTCGGTAT 5gly c GTGGTGCCTGAACG'IT (¡Sec ID No: 162) Miostatina.TN8-4 WFTCLWNCDNE TGGTTCACCTGCCTGTGGAACTGCGA 5giy c CAACGAA (:Sec ID No: 163) M ¡ostati na. TN8-5 HTPCPWFAPLCVEW CACACCCCGTGCCCGTGGTTCGCrCC gly c GCTGTGCGTTGAATGG (Sec ID No: 164) ;Miostatina.TN8-6 EWCWRWKWMCKPE AAAGAATGGTGCTGGCGTTGGAAATG 5giy c GATGTGCAAACCGGAA (¡Sec ID No: 165) Miostatina-XN8-7 FETCPSWAYFCLDI TTCGAAACCTGCCCGTCCTGGGCTTA sgly c CTTCTGCCTGGACATC (¡Sec ID No: 166) M ¡ostati na -TN8-7 FETCPSWAYFCLDI TTCGAAACCTGCCCGTCCTGGGCTTA gly N CTTCTGCCTGGACATC (¡Sec ID No: 167) M ¡ostati na "N8-8 AYKCEA D GCW L GCTTACAAATGCGAAGCTAACGACTG ly c GGGTTGCTGGTGGCTG ( Sec ID No: 1G8) Miostatina."TN8-9 NSWCEDQWHRCWWL AACTCCTGGTGCG AAG A CCAGTGGCA 5gly c CCGTTGCTGGTGGCTG ( Sec ID No: 169) M ¡ostati na-TN8-lO WSACYAGHFWCYDL TGGTCCGCTTGCTACGCTGGTCACITC 5gly c TGGTGCTACGACCTG (¡Sec ID No: 170) Miostatina-TNS-l l ANWCVSPNWFCMVM GCrAACTGGTGCGTTTCCCCGAACTG 5 ly c GTTCTGCATGGTTATG (;SecIDNo: 171) Miostat¡na.TN8-12 WTECYQQEFWCW L TGGACCGAATGCTACCAGCAGGAATT sgl c CTGGTGCTGGAACCTG (ISec ID No: 172) M¡ostatina-TN8-13 ENTCERWKWMCPPK GAAAACACCTGCGAACGTTGGAAATG 5 ly c GATGTGCCCGCCGAAA (ISecIDNo: 173) Miostatina-XN8-14 WLPCHQEGFWCMNF TGGCTGCCGTGCCACCAGGAAGGTTT gly c CTGGTGCATGAACTTC (;Sec ID No: 174) Miostat¡na-TJ^8-J5 STMCSQWHW CNPF TCCACCATGTGCTCCCAGTGGCACTG s ly c GATGTGCAACCCGTrC CSec ID No: 175) Miostatina-TN8-16 IFGCHWWD VDCYQF ATCTTCGGTTGCCACTGGTGGGACGT 5giy c TGACTGCTACCAGTTC (¡Sec ID No: 32 BRP TGGCTTTGGAAACTTTGTGAACGTCC A {Sec ID No: 238) ;Miostatina-T 12- Y FCSYLFGVSKEACQ TATAATTTI GTTCTTATCT TTTGGTG Sgiy N 33 LP TTTCTAAAGAAGCTTGTCAACTTCCA (SecIDNo: 239) M¡ostatina- N12- AHWCEQGPWRYGNIC GCTCATTGGTGTGAACAAGGTCCATG 5giy N 34 MAY GCGTTATGGTAATATTTGTATGGCTTA C T (SecIDNo: 240) Miostatina-TN12- NLVCGKISAWGDEACA AATCTTGTTTGTGGTAAAAT TCTGCT 5giy N 35 RA TGGGGTGATGAAGCTTGTGCTCGTGC T (SecIDNo: 241) Miostatina-TN12- HNVCTIMGPSM FC CATAATGTTTGTACTATTATGGGTCCA 5giy N 36 WND TCTATGAAATGGTTTTGTTGGAATGAT C (SecIDNo: 242) íostat¡na-TNl2- NDLCAMWGWRNTT C AATGATC TTGTGCTATGTGGGGTTGG 5giy N 37 QNS CGTAATACTATTTGGTGTCAAAATTCT C (SecIDNo: 243) M¡ostatina-TN12- PPFCQ DNDMLQSLCK CCACGATT-TGTCAAAATGATAATGA 5 iy N 38 LL TATGCrrcAATCTCrriGTAAACTTCT T (SecIDNo: 244) Miostatina_XNi2- WYDCNVPNELLSGLCR TGGTATGATTGTAATGTTCCAAATGA sgly N 39 LF Aí- TCTTTC GGTCTTTG CGT . 'l I (SecIDNo: 245) iostat¡na-TN|2- YGDCDQNHWMWPFTC TATGGTGATTGTGATCAAAATCATTG 5giy N 40 LSL GATGTGGCCATTTACTTGTC FTCTCT C T ( Sec ID No: 246) M¡ostatiha-TN12- GWMCHFDLHDWGAT GGTTGG ATGTGTCATTTT G ATCTTCAT sgly N 41 CQPD GATTGGGGTGCTACTTGTCAACCAGA T (SecIDNo: 247) ; ¡ostatina-TN"12- YFHC FGGHEFEVHCE TATTTTCATTGTATGTTTGGTGGTCAT 5giy N 42 SF GAATTTGAAGTTCATTGl'GAATCTTTT C (SecIDNo: 248) ¡ostat¡na-TNl2- AYWCWHGQCVRF GCTTATTGGTGTTGGCATGGTCAATGT 5giy N 43 GTTCGTTTT (Sec ID No: 249) Miostatina-Lineal - SEHWTFTDWDGNEW TCCGAACACTGGACCTTCACCGACTG 5gi N 1 " WV PF GGACGGTAACGAATGGTGGGTTCGTC CGTTC (SecIDNo: 250) Miostatina-Lineal - MEMLDSLFELLKDMVP ATGGAAATGCTGGACTCCCTGTTCGA 5giy N 2 ' ISKA ACTGCTGAAAGACATGGTTCCGATCT CCAAAGCT (SecIDNo: 251) Miostatina-Lineal - SPPBEALMEWLGWQY TCCCCGCCGGAAGAAGCTCTGATGGA 5giy N 3 ' GKFT ATGGCTGGGTTGGCAGTACGGTAAAT TCACC (SecIDNo: 2S2) Miostatina-Lineal - SPENLLNDLYILMTKQ TCCCCGGAAAACCTGCTGAACGACCT sgly N 4 EWYG GTACATCCTGATGACCAAACAGGAAT GGTACGGT (SecIDNo: 253) IMiostatina-Lineal - FHWEEGIPFHWTPYS TTCCACTGGGAAGAAGGTATCCCGTT 5giy N 5 YDRM CCACGTTGTTACCCCGTACTCCTACGA CCGTATG (Sec ID No: 254) Miostatina-Lineal - KRLLEQFMNDLAELVS AAACGTCTGCTGGAACAGTTCATGAA Sgly M 6 GHS CGACCTGGCTGAACTGGTTTCCGGTC ACTCC (SecIDNo: 255) Miostatina-Lineal - DTRDALFQEFYEFVRS GACACCCGTGACGCTCTGTTCCAGGA 5giy N 7 * RLVI ATTCTACGAATTCGTTCCrrrCCCGTCT GGTTATC (Sec ID No: 256) Miostatina-Lineal - RMSAAPRPLTYRDIMD CGT ATGTCCGCTGCTCCG CGTCCG CTG 5 iy N 8 QYWH ACCTACCGTGACATCATGGACCAGTA CTGGCAC ( Sec ID No: 257) Miostatina-Lineal - NDKAHFFEMFMFDVH AACGACAAAGCTCACTTCTTCGAAAT 5 giy N 9 " NFVES GTTCATGTTCGACGTTCACAACTTCGT GAATCC (Sec ID No: 258) Miostatina-Lineal - QTQAQKIDGLWELLQS CAGACCCAGGCTCAGAAAATCGACGG 5 giy N 10* IRNQ TCTGTGGGAACTGCTGCAGTCCATCC GTAACCAG (Sec ID No: 259) Miostatina-Lineal - MLSEFEEFLGNLVHRQ ATGCTGTCCGAATTCGAAGAATTCCT 5 gly N l f EA GGGTAACCTGGTTCACCGTCAGGAAG CT (Sec ID No: 260) Miostatina-Lineal - YTPKMGSEWTSFWH TACACCCCGAAAATGGGTTCCGAATG 5 giy N 12 RIHYL GACCTCCTTCTGGCACAACCGTATCC ACTACCTG (Sec ID No: 261) Miostatina-Lineal ¦ L DTLLREL MVLNSL CTGAACGACACCCTGCTGCGTGAACT 5 giy N 13 SDMK GAAAATGGTTCTGAACTCCCTGTCCG ACATGAAA (Sec ID No: 262) Miostatina-Lineal - FDVERDLM LEGFM TTCGACGTTGAACGTGACCTGATGCG 5 giy N 14 QSAAT TTGGCTGGAAGGTTTCATGCAGTCCG CTGCTACC (iSec ID No: 263) Miostatina-Lineal - HHGWNYLRXGSAPQW CACCACGGTTGG A ACTACCTG CGTAA 5 gly N 15" FEAWV AGGTTCCGCTCCGCAGTGGTTCGAAG CTTGGGTT (Sec ID No: 264) Miostatina-Lineal - VESLHQLQ WLDQKL GTTGAATCCCTGCACCAGCTGCAGAT 5 gly N 16 ASGPH GTGGCTGGACCAGAAACTGGCTTCCG GTCCGCAC (Sec ID No: 265) Miostatina-Lineal - RATLLKDFWQLVEGY CGTGCTACCCTGCTGAAAGACTTCTG 5 gly N 17 GDN GCAGCTGGTTGAAGGTTACGGTGACA AC ( Sec ID No: 266) Miostatina-Lineal - EELLREFYRFVSAFDY GAAGAACTGCTGCGTGAATTCTACCG 5 giy N 18 TTTCXjTTTCCGCTTTCGACTAC (Sec ID No: 267) Miostatina-Lineal - GLLDEFSHFIAEQFYQ GGTCTGCTGGACGAATTCTCCCACTTC 5 ly N 1 PGG ATCGCTGAACAGTTCTACCAGATGCC GGGTGGT (Sec ID No: 268) Miostatina-Lineal - YREMS LEGLLDVLER TACCGTGAAATGTCCATGCTGGAAGG 5 giy N 20 LQHY TCTGCTGGACGTTCTGGAACGTCTGC AGCACTAC (Sec ID No: 269) Miostatina-Lineal - HNSSQMLLSELIMLVG CACAACTCCTCCCAGATGCTGCTGTC 5 giy N 21 SMMQ CGAACTG ATCATGCTGGTTG GTTCC A TGATGCAG (Sec ID No: 270) Miostatina-Lineal - WREHFL SDYIRDKLI TGGCGTGAACACTTCCTG\ACTCCGA 5 iy N 22 AIDG CTACATCCGTGACAAACTGATCGCTA TCGACGGT (Sec ID No: 273 ) Miostatina-Lineal - QFPFYVFDDLPAQLEY CAGTTCCCGTrCTACGTTTTCGACGAC 5 giy N 23* WIA CTGCCGGCTCAGCTGGAATACTGGAT CGCT (Sec ID No: 272) Miostatina-Lineal - EFFHWLHNHRSEVNH GAATTCTTCCACTGGCTGCACAACCA s iy N 24 WLDMN CCGTTCCGAAGTTAACCACTGGCTGG ACATGAAC (Sec ID No: 273) Miostatina-Lineal - EALFQNFFRDVLTLSER GAAGCTCirTITCAAAATTTTTTTCGT 5 ly N 25 EY GATGTTCTTACTCTTTCTGAACGTGAA C TAT (Sec ID No: 274) Miostatina-Lineal QYWEQQWMTYFRENG CAATATTGGGAACAACAATGGATGAC s iy N -26 LHVQY TTATTTTCGTGAAAATGGTCTTCATGT TCAATAT (Sec ID No: 275) Miostatina-Lineal - NQRMMLEDLWRI TP AATCAACGTATGATGCT GAAGATCT 5 giy N 27 MFGRS TTGGCGTATTATGACTCCÍLATGTTTGG C TCGTTCT CSec ID No: 276) Miostatina-Lineal - FLDEL AELSRHYALD TTTCITGATGAAC-TAAAGCTGAACTT 5 giy N 29 DLDE CTCGTCATTATGCTCTTGATGATCTT GATGAA ( Sec ID No: 277) Miostatina-Lineal - GKLIEGLLNELMQLETF GGTAAACTTATTGAAGGTCrTCTTAAT 5 giy N 30 MPD GAACTTATGCAACTTGAAACl'l l' 1 ATG C CCAGAT (Sec ID No: 278) Miostatina-Lineal - ILLLDEYKKDW SWF ATTCT CTTCTTGATGAATATAAAAAA 5 giy N 31 GATTGGA AATCTTGGTTT ( Sec ID No: 279) Miostatina- QGHCT WPWMCPPYG CAGGGCCACTGTACTCGCTGGCCGTG lk N 2XTN8-19 kc SGSATGGSGSTASSGSG GATGTGCCCGCCGTACGGTTCTGGTT SATGQGHCTRWPWMC CCGCTACCGGTGGTTCTGGTTCCACTG PPY CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCTACTG GTCAGGGTCACTGCACTCGTTGGCCA TGGATGTGTCCACCGTAT (:Sec ID No: 280) Miostati na- WYPCYEGHFWCYDLG TGGTATCCGTGTTATGAGGGTCACTTC 5 giy C 2XTN8-CON6 SGSTASSGSGSATGWY TGGTGCTACGATCTGGGTTCTGGTTCC PCYEGHFWCYDL ACTGCTTCTTCTGGTTCCG GTTCCGCT ACTGGTTGGTACCCGTGCTACGAAGG TCACTTTTGGTGTTATGATCTG (Sec ID No: 281) Miostati na - HTPCPWFAPLCVEWOS CACACTCCGTGTCCGTGGTTTGCTCCG lk C 2XT 8-5 kc GSATGGSGSTASSGSGS CTGTGCGTTGAATGGGG1TCTGGTTCC ATGH PCPWFAPLCVE GCTACTGGTGGTTCCGGTTCCACTGCT W TCTTCTGGTTCCGGTTCTGCAACTGGT CACACCCCGTGCCCGTGGTTTGCACC GCTGTGTGT AG AGTGG (;Sec ID No: 282) iostati na. PDWCIDPDWWCKFWG CCGGATTGGTGTATCGACCCGGACTG lk c 2XTN8-18 kc SGSATGGSGSTASSGSG GTGGTGCAAATTCTGGGGTTCTGGTTC SATGPDWCIDPDWWC CGCTACCGGTGGTTCCGGTTCCACTG KFW CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCAACTG GTCCGGACTGGTGCATCGACCCGGAT TGGTGG GT AATTTTGG (Sec ID No: 283) M iostati na. ANWCVSPN FCMVM CCGGATTGGTGTATCGACCCGGACTG lk c 2XTN8-11 kc GSGSATGGSGSTASSGS GTGGTGCAAATTCTGGG<jTTCTGGTTC GSATGANWCVSPNWF CGCTACCGGTGGTTCCGGTTCCACTG CMVM CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCAACTG GTCCGGACTGGTGCATCGACCCGGAT TGGTGGTGT AAATTTTGG (Sec ID No: 284) Miostati na. PDWCIDPDWWCKFWG ACCACTTGGTGCATCTCTCCGATGTG lk c 2XTN8-25 kc SGSATGGSGSTASSGSG GTTCTGCTCTCAGCAGGGTTCTGGTTC SATGPDWCIDPDWWC CACTGCTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGC KFW AACTGGTACTACTTGGTGTATCTCTCC AATGTGGTTTTGTTCTCA GCAA ( Sec ID No: 285) Miostati na . HWACGYWPWSCKWV CACTGGGCATGTGGCTATTGGCCGTG lk c 2XTN8-23 kc GSGSATGGSGSTASSGS GTCCTGCAAATGGGTTGGTTCTGGTTC GSATGHWACGYWPWS CGCTACCGGTGGTTCCGGTTCCACTG CKWV CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCA ACTG GTCACTGGGCTTGCGGTTACTGGCCG TGGTCTTGTAAATGGGTT (:Sec ID No: 286) ¡ostatina-TN8- KKHCQIWTW CAPKG AAAAAACACTGTCAGATCTGGACTTG C 29-1 kc SGSATGGSGSTASSGSG GATGTGCGCTCCGAAAGGTTCTGGTT SATGQGHCTRWPWMC CCGCTACCGGTGGTTCTGGTTCCACTG PPY CI C TCTGGTTCCGGTTCCGCTACTG GTCAGGGTCACTGCACTCGTTGGCCA TGGATGTGTCCGCCGTAT (ÍSec ID No: 287) Miostatina-TN8- QGHCTRWPWMCPPYG CAGGGTCACTGCACCCGTTGGCCGTG lk C 19-29 kc SGSATGGSGSTASSGSG GATGTGCCCGCCGTACGGTTCTGGTT SATG-OOíCQrWTWMC CCGCTACCXJGTGGTTCTGGTTCCACTG AP CT CTTCTGGrrCCGGTTClGCTACTG GTAAAAAACACTGCCAGATCTGGACT TGGATGTGCGCTCCGAAA (ÍSec ID No- 288) M¡ostatina_TN8- KKHCQIWTWMCAPKG AAAAAACACTGTCAGATCTGGACTTG lk N 29-1 kn SGSATGGSGSTASSGSG GATGTGCGCTCCGAAAGGTTCTGGTT SATGQGHCTRWPWMC CCGCTACCGGTGGTrCTGGTTCCACTG PPY CITCTTCTGGTTCCGGTTCCGCTACTG GTCAGGGTCACTGCACTCGTTGGCCA TGGATGTGTCCGCCGTAT (ÍSec ID No: 289) iostat¡na-TN8- KKHCQIWTWMCAPKG AAAAAACACTGCCAGATCTGGACTTG 8gly C 29-1 -8g GGGGGGGQGHCTRWP GATGTGCGCTCCGAAAGGTGGTGGTG WMCPPY GTGGTGGCGGTGGCCAGGGTCACTGC ACCCGTTGGCCGTGGATGTGTCCGCC GTAT (¡SecIDNo: 290) M¡ostatina-TN8- QGHCTRWPWMCPPYG CAGGGTCACTGCACCCGTrGGCCGTG 6gly C 19-29-6gc GGGGGKKHCQIWTWM GATGTGCCCGCCGTACGGTGGTGGTG CAPK GTGGTGGCAAAA AACACI GCCAGATC TGG ACTTGG ATGTGCGCTCCG A AA (;SecIDNo: 291) Ejemplo 3 Análisis in vitro Análisis de la actividad de la miostatina basada en células C2C12 Este análisis demuestra la capacidad de neutralización de miostatina del inhibidor que es probado midiendo el grado al cual se inhibe la unión de la miostatina a su receptor. Una línea de células reporteras sensible a la miostatina fue generada por la transfección de las células mioblásticas C2C12 (ATCC No: CRL-1772) con un constructo de pMARE-luc. El constructo de pMARE-luc fue hecho clonando doce repeticiones de la secuencia CAGA, representando así los elementos de respuesta de miostatina/activina (Dennler y col. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) en un vector reportero de pLuc-MCS (Stratagene cat# 219087) hacia arriba desde la caja TATA. Las células mioblásticas C2C12 expresan naturalmente receptores de miostatina/activina en su superficie celular. Cuando la miostatina une los receptores celulares, se activa la trayectoria de Smad, y Smad fosforilada se une al elemento de respuesta (Macias-Silva y col. Cell 87:1215 (1996)), dando por resultado la expresión del gen de lucerasa. La actividad de luciferasa entonces se mide usando un kit comercial de análisis del reportero de luciferasa (cat# E4550, Promega, Madison, Wl) de acuerdo al protocolo del fabricante. Una línea estable de células C2C12 que habían sido transfectadas con pMARE-luc (clon de C2C12/pM ARE #44) fue utilizada para medir la actividad de la miostatina de acuerdo al siguiente procedimiento. Las mismas cantidades de células reporteras (clon de C2C12/pMARE #44) fueron colocadas en placas con 96 pozos para su cultivo. Una primera ronda de análisis usando dos diluciones de pepticuerpos, fue realizada con la concentración de miostatina fijada a 4 nM. La miostatina madura recombinante fue pre-incubada durante 2 horas a temperatura ambiente con pepticuerpos a 40 nM y 400 nM, respectivamente. El cultivo de la célula reportera fue tratado con miostatina con o sin pepticuerpos durante seis horas. La actividad de miostatina fue medida determinando la actividad de luciferasa en los cultivos tratados. Este análisis fue utilizado para identificar inicialmente los efectos del pepticuerpo que inhibieron la actividad de señalización de miostatina en el análisis del reportero. Posteriormente, una curva de titulación de nueve puntos fue generada con la concentración de miostatina fijada a 4 nM. La miostatina fue pre-incubada con cada una de las siguientes nueve concentraciones de pepticuerpos: 0.04 mM, 0.4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM, 2 uM y 4 uM durante dos horas antes de agregar la mezcla al cultivo de la célula reportera. Los valores Cl50 para un número de pepticuerpos ejemplares se proporcionan en las tablas III y para pepticuerpos maduros de afinidad, en la tabla VIII. Análisis BIAcore® Un análisis de la afinidad de cada pepticuerpo de miostatina candidato fue realizado en un aparato BIAcore® 3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), usando el chip sensor CM5, y 0.005 por ciento de tensioactivo P20 (Biacore, Inc.) como amortiguador de ejecución. La proteína de miostatina madura recombinante fue inmovilizada en un chip sensor CM5 de grado de búsqueda (Biacore, Inc.) vía grupos amina primaria usando el kit de acoplador de amina (Biacore, Inc.) de acuerdo al protocolo sugerido del fabricante. Los análisis de unión directa fueron utilizados para analizar y clasificar los pepticuerpos en el orden de su capacidad para unirse a la miostatina inmovilizada. Los análisis de unión fueron realizados por la inyección de dos concentraciones (40 y 400 nM) de cada pepticuerpo de unión de miostatina candidato a la superficie de miostatina inmovilizada a un caudal de 50 µ?/min durante 3 minutos. Después de periodo de disociación de 3 minutos, la superficie fue regenerada. Las curvas de unión fueron comparadas de manera cualitativa para determinar la intensidad de la señal de unión, así como para determinar los índices de disociación. Los parámetros cinéticos de unión de pepticuerpo incluyendo ka (constante de índice de asociación), kd (constante de índice de disociación) y KD (constante de equilibrio de disociación), fueron determinados usando el programa de computadora BIA evaluation 3.1 (Biacore, Inc.). Cuanto más bajas sean las constantes de equilibrio de disociación (expresadas en nM), mayor será la afinidad del pepticuerpo a la miostatina. Los ejemplos de valores KD del pepticuerpo se muestran más adelante en la tabla III y en la tabla VI para los pepticuerpos maduros de afinidad. Análisis de bloqueo en la superficie de ActRIIB/Fc Los análisis de bloqueo fueron realizados usando ActRIIB/Fc inmovilizada (R&D Systems, Minneapolis, MN) y miostatina en presencia y ausencia de pepticuerpos con el sistema de análisis de Biacore®. Los análisis fueron utilizados para clasificar pepticuerpos como no neutralizantes (los que no previnieron la unión de miostatina a ActRIIB/Fc) o neutralizantes (los que previnieron la unión de miostatina a ActRIIB/Fc). La unión de línea base de miostatina-ActRIIB/Fc primero fue determinada en ausencia del pepticuerpo. Para los estudios de análisis anticipado, los pepticuerpos fueron diluidos a 4 nM, 40 nM, y 400 nM en amortiguador de muestra y se incubaron con 4 nM de miostatina (también diluida en el amortiguador de muestra). El pepticuerpo: las mezclas de ligando se dejaron alcanzar el equilibrio a temperatura ambiente (durante lo menos 5 horas) y después se inyectaron sobre la superficie inmovilizada de ActRIIB/Fc durante 20 a 30 minutos a un caudal de 10 ul/min. Una respuesta de unión aumentada (sobre-control de unión sin pepticuerpo) indicó que la unión de pepticuerpo a la miostatina no neutralizante. Una respuesta de unión disminuida (comparada al control) indicó que la unión de pepticuerpo a la miostatina bloqueó la unión de miostatina a ActRIIB/Fc. Los pepticuerpos seleccionados fueron caracterizados adicionalmente usando el análisis de bloqueo de una serie completa de concentración para derivar los valores IC50 (para los pepticuerpos neutralizantes) o CE50 (para los pepticuerpos no neutralizante). Las muestras de pepticuerpo fueron diluidas en serie de 200 nM a 0.05 mM en amortiguador de muestra y se incubaron con 4 mM de miostatina a temperatura ambiente para alcanzar el equilibrio (mínimo de cinco horas) antes de inyectarse sobre la superficie inmovilizada de ActRIIB/Fc durante 20 a 30 minutos a un caudal de 10 ul/min. Después de la inyección de la muestra, el ligando de unión se dejó disociar del receptor durante 3 minutos. Graficando la señal de unión contra la concentración del pepticuerpo, se calcularon los valores CI5Q para cada pepticuerpo en presencia de 4 nM de miostatina. Se encontró, por ejemplo, que los pepticuerpos TN8-19, L2 y L17 inhibieron la actividad de miostatina en el análisis basado en células, pero la unión de TN-8-19 no bloqueó las interacciones de la miostatina/ActRI IB/Fc, indicando que TN-8-19 se une a un diferente epítope del observado para los otros dos pepticuerpos.

Unión de epítope para los pepticuerpos Un pepticuerpo purificado fue inmovilizado en un chip BIAcore para capturar la miostatina antes de la inyección de un segundo pepticuerpo, y fue determinada la cantidad de pepticuerpo secundario unido a la miostatina capturada. Solamente los pepticuerpos con epítopes distintos se unirán a la miostatina capturada, permitiendo así la unión de los pepticuerpos con propiedades de unión de epítope similares o distintas. Por ejemplo, fue mostrado que los pepticuerpos TN8-19 y L23 se unen a diferentes epítopes en la miostatina.

Análisis de selectividad Estos análisis fueron realizados usando la tecnología del BIAcore®, para determinar la selectividad de unión de los pepticuerpos a otros miembros de la familia TGFB. ActRITO/Fc, TGFBRI l/Fc y BMPR-1A/Fc (todos obtenidos de R&D Systems, Minneapolis, MN) se acoplaron de manera covalente para identificar el grado de los chips sensor de acuerdo al protocolo sugerido del fabricante. Debido a que los análisis BIAcore detectan los cambios en el índice de refracción, la diferencia entre la respuesta detectada con la inyección sobre las superficies inmovilizadas del receptor en comparación a la respuesta detectada con la inyección sobre la superficie de control en ausencia de cualquier pepticuerpo, representan la unión real de la Activina A, ?T?ß?, TGF 3, y BMP4 a los receptores, respectivamente. Con la pre-incubación de los pepticuerpos y moléculas TGFP, un cambio (aumentado o disminuido) de la respuesta de unión, indica la unión del pepticuerpo a la familia TGFp de las moléculas. Los pepticuerpos de la presente invención todos se unen a la miostatina pero no a la Activina A, TGF l, TGF 3, o BMP4.

Análisis de equilibrio KinExA™ Los análisis de unión de equilibrio basados en solución usando la tecnología KinExA™ (Sapidyne Instruments, Inc.) fueron utilizados para determinar el equilibrio de disociación (KD) de la unión de miostatina a las moléculas del pepticuerpo. Este análisis basado en solución en algunos casos se considera más sensible que el análisis BIAcore. Reacti-Gel™ 6X fue recubierto previamente con aproximadamente 50 ug/ml de miostatina durante la noche, y después se bloqueó con BSA. 30 pM y 100 pM de muestras de pepticuerpo fueron incubadas con varias concentraciones (0.5 pM a 5 nM) de miostatina en amortiguador de muestra a temperatura ambiente durante 8 horas antes de procesarse a través de los gránulos revestidos con miostatina. La cantidad de pepticuerpo unido al gránuio fue cuantificada por el anticuerpo anti-humano-Fc de cabra etiquetado fluorescente (Cy5) a 1 mg/ml en el superbloque. La señal de unión es proporcional a la concentración de pepticuerpo libre en equilibrio con una concentración de miostatina dada. KD se obtuvo de la regresión no lineal de las curvas de competencia usando un modelo de unión homogénea de un solo sitio de curva dual proporcionado en el software KinExA™ (Sapidyne Instruments, Inc.).

Ejemplo 4 Comparación de inhibidores de miostatina La capacidad de tres pepticuerpos unidos primero ejemplares de unir (KD) e inhibir (Cl50), fue comparada con los valores KD y Cl50 obtenidos para la proteína de fusión receptora soluble actRIIB/Fc (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN). Los valores Cl50 fueron determinados usando el análisis basado en células pMARE luc descrito en el ejemplo 3 y los valores KD fueron determinados usando el análisis Biacore® descrito en el ejemplo 3.

Tabla III Los pepíicuerpos tienen un IC50 que es mejorado con respecto al receptor/inhibidor Fe y a las afinidades de unión que son comparables en dos pepticuerpos con el receptor/Fc. Ejemplo 5 Comparación de la capacidad del péptido y pepticuerpo de inhibir la miostatina La siguiente secuencia del péptido: QGHCTRWPW CPPY (TN8-19) (SEC ID NO: 33) fue utilizada para construir el pepticuerpo TN8-19(pb) correspondiente de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 2 anterior. El péptido solamente y el pepticuerpo fueron analizados para determinar la actividad de inhibición de miostatina usando el análisis basado en C2C12 descrito en el ejemplo 3 anterior. Se puede observar a partir de la Figura 1 que la Cl50 (concentración efectiva del cincuenta por ciento de inhibición de miostatina) para el pepticuerpo es significativamente menor que la del péptido, y así la capacidad del péptido para inhibir la actividad de la miostatina ha sido mejorada sustancialmente colocándola en la configuración del pepticuerpo.

Ejemplo 6 Generación de los péptidos y pepticuerpos de afinidad madura Varios de los péptidos de la primera ronda usados para la generación del pepticuerpo se eligieron para la maduración de la afinidad. Los péptidos seleccionados incluyeron los siguientes: la cisteína inhibida TN8-19, QGHCTRWPWMCPPY (SEC ID NO: 33), y los péptidos lineales Lineal-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEC ID NO: 104); Lineal-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEC ID NO: 117); Lineal-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEC ID NO: 119); Lineal-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEC ID NO: 122), Lineal-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEC ID NO: 123), Lineal-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEC ID NO: 126). De" acuerdo con una secuencia de consenso, fueron generadas las bibliotecas secundarias de exhibición de fago dirigido, en donde los "aminoácidos base" (determinados a partir de la secuencia de consenso) fueron mantenidos constantes o se alteraron en la frecuencia de ocurrencia. Alternativamente, una secuencia de péptido individual se podría utilizar para generar una biblioteca alterada que exhibe el fago dirigido. La alteración de tales bibliotecas bajo condiciones más rigurosas puede producir péptidos con una unión mejorada a la miostatina, unión selectiva a miostatina, o con una cierta propiedad deseada adicional. Producción de oligos neutralizados para las bibliotecas Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de ADN que fue 91% "neutralizado" en las secuencias base, es decir, cada solución fue 91% de la base representada (A, G, C, o T), y 3% de cada uno de los otros 3 nucleótidos. Para la familia TN8-19, por ejemplo, un 91% de oligo neutralizado usado para la construcción de una biblioteca secundaria de fago fue el siguiente: 5'-CAC AGT GCA CAG GGT NNK NNK NNK caK ggK caK tgK acK cgK tgK ccK tgK atK tgK ccK ccK taK NNK NNK NNK CAT TCT CTC GAG ATC A-3' (SEC ID NO: 634) en donde "N" indica que cada uno de los cuatro nucleótidos A, T, C, y G fue representado igualmente, K indica que G y T fueron representados igualmente, y la letra minúscula representa una mezcla de 91% la base indicada y 3% de cada uno de las otras bases. La familia de oligonucleótidos preparados de este modo fue amplificado por PCR según lo descrito anteriormente, ligada a los vectores de un fagemido, por ejemplo, un plásmido pCES1 modificado (Dyax), o cualquier vector fagemido disponible de acuerdo al protocolo descrito anteriormente. Las bibliotecas secundarias de fago secundario generadas estuvieron todas 91% neutralizadas y tuvieron entre 1 y 6.5x 109 transformantes independientes. Las bibliotecas fueron alteradas como se describe anteriormente, pero con las siguientes condiciones: Ronda 1 de alteración: Número de entrada de fago: 1012 -1013 cfu de fagemido Método de selección: Selección del tubo Nunc-lmmuno Selección negativa: 2 X con los tubos Nunc-lmmuno recubiertos con 2% BSA a 10 min. cada uno Recubrimiento de alteración: Recubrir con 1 pg de proteína miostatina en 1 mi de 0.1M amortiguador de carbonato de sodio (pH 9.6) Tiempo de unión: 3 horas Condiciones de lavado: 6 X 2%-Milk-PBST; 6 X PBST; 2 X PBS Condición de elución: 100 mM elución de TEA Ronda 2 de alteración: Número de entrada de fago: 1011 cfu de fagemido Método de selección: Selección del tubo Nunc-lmmuno Selección negativa: 2 X con los tubos Nunc-lmmuno recubiertos con 2% BSA a 30 min. cada uno Recubrimiento de alteración: Recubrir con 1 pg de proteína miostatina en 1 mi de 0.1M amortiguador de carbonato de sodio (pH 9.6) Tiempo de unión: 1 hora Condiciones de lavado: 15 X 2%-Milk-PBST; 1 X -Milk-PBST durante 1 hora, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X 2%-BSA-PBST durante 1 hora, 10 X PBST y 3 X PBS Condición de elución: 100 mM elución de TEA Ronda 3 de alteración: Número de entrada de fago: 1010 cfu de fagemido Método de selección: Selección del tubo Nunc-lmmuno Selección negativa: 6 X con los tubos Nunc-lmmuno recubiertos con 2% BSA a 10 min. cada uno Recubrimiento de alteración: Recubrir con 1 µg de proteína miostatina en 1 mi de 0.1M amortiguador de carbonato de sodio (pH 9.6) Tiempo de unión: 1 hora Condiciones de lavado: 15 X 2%-Milk-PBST; 1 X 2%-Milk-PBST durante 1 hora, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X 2%-BSA-PBST durante 1 hora, 10 X PBST y 3 X PBS Condición de elución: 100 mM elución de TEA La alteración de las bibliotecas secundarias produjo los péptidos con una unión mejorada a la miostatina. Los clones individuales seleccionados se sometieron al ELISA de fago, como se describe anteriormente, y se secuenciaron. La siguiente familia TN8-19 de afinidad madura de los péptidos se muestra en la tabla IV más adelante.

Tabla IV La secuencia de consenso derivada de TN-8-19-1 de afinidad madura con a través de Con2 (excluyendo las secuencias mTN8 con6) mostrada anteriormente es: (SEC ID NO: 352). Todos estos péptidos comprenden la secuencia WMCPP (SEC ID NO: 633). Los aminoácidos subrayados representan los aminoácidos base presentes en todas las modalidades, y a^, a2 y a3 se seleccionan de un aminoácido neutral hidrofóbico, polar neutral, o básico. En una modalidad de esta secuencia de consenso, Cbib?Wb3WMCPP (SEC ID NO: 353), b-¡ se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; y b3 se selecciona de P, R y Q. Todos los péptidos comprenden la secuencia WMCPP (SEC ID NO: 633). Un análisis más detallado de las secuencias TN8 de afinidad madura que comprende la SEC ID NO: 352 proporciona la siguiente fórmula: CiC?C3C4cRcfiCc7CcHWcQWMCPPci nCiiCi?Cn (SEC ID NO: 354), en donde: d está ausente o es cualquier aminoácido; c2 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; c3 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; c4 está ausente o es cualquier aminoácido; c5 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; c6 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; c7 es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; c8 es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; c9 es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; y en donde C10 a C13 es cualquier aminoácido. En una modalidad de la formulación anterior, b7 se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; b8 se selecciona de R, S, Q; y b9 se selecciona de P, R y Q. Esto proporciona la siguiente secuencia: did?dad.idfidRCd7dBWdQW CPPdindiidi9di¾ (SEC ID NO: 355). di está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; Ó2 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; d3 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; d4 está ausente o es cualquier aminoácido; ds está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; d6 está ausente o es un aminoácido hidrofóbico neutral, polar neutral, o ácido; d7 se selecciona de cualquiera de los aminoácidos T, I, o R; d8 se selecciona de R, S, Q; dg se selecciona de P, R y Q y d-?? a d se seleccionan de cualquier aminoácido. La secuencia de consenso de la serie mTN8 con6 es (SEC ID NO: 356) en donde ei es P, S o Y; e2 es C o Q, y e3 es G o H. Además de la familia TN-19 de afinidad madura, los péptidos de afinidad madura adicionales fueron producidos a partir de los péptidos de la primera ronda lineales L-2, L-15, L-17, L-20, L-21, y L-24. Estas familias se presentan a continuación en la tabla V. Tabla V Pepticuerpo SEC ID Secuencia de péptido de afinidad NO: madura L2 104 MEMLDSLFELLKDMVPISKA mL2-Con1 357 RMEMLESLLELLKEIVPMSKAG mL2-Con2 358 RM EMLESLLELLKEI PMSKAR mL2-1 359 RMEMLESLLELLKDIVPMSKPS mL2-2 360 GMEMLESLFELLQEIVPMSKAP mL2-3 361 RMEMLESLLELLKDIVPISNPP mL2-4 362 RIEMLESLLELLQEIVPISKAE rnL2-5 363 RME LQSLLELLICDIVP SNAR mL2-6 364 RM EMLESLLELLKEI VPTSNGT mL2-7 365 RM EMLESLFELLKEIVPMSKAG mL2-8 • 366 RMEMLGSLLELLKEI VPMSKAR Pepticuerpo SEC ID Secuencia de péptido de afinidad NO: madura ml_2-9 367 QM ELLDSLFELLKEI VPKSQPA ml_2-10 368 R EMLDSLLELLKEIVPMSNAR mL2-1 369 RMEMLESLLELLHEIVPMSQAG mL2-12 370 QMEMLESLLQLLKEIVPMSKAS mL2-13 371 RMEMLDSLLELLICDMVPMITGA mL2-14 372 RIEMLESLLELLKDMVPMANAS mL2-15 373 RMEMLESLLQLLNEIVPMSRAR mL2-16 374 RMEMLESLFDLLKELVPMSKGV mL2-17 375 Rl E LESLLELLKDI VPIQKAR mL2-18 376 RMELLESLFELLKDMVPMSDSS mL2-19 377 RMEMLESLLEVLQEI'VPRAKGA ml_2-20 378 RMEMLDSLLQLLNEIVPMSHAR mL2-21 379 RM EMLESLLELLKDI VPMSNAG mL2-22 380 RM EMLQSLFELLKGM VPISKAG mL2-23 381 RMEMLESLLELLKEIVPNSTAA mL2-24 382 RMEMLQSLLELLKEI VPISKAG mL2-25 383 RIEMLDSLLELLNELVPMSKAR L-15 117 HHGWN YLRKGSAPQWFEAWV mL15-con 1 384 QVESLQQLLMWLDQKLASGPQG mL15-1 385 RM ELLESLFELLKEM VPRSKAV ml_15-2 386 QAVSLQHLLMWLDQKLASGPQH Pepticuerpo SEC ID Secuencia de péptido de afinidad NO: madura ml_15-3 387 DEDSLQQLLMWLDQKLASGPQL ml_15-4 388 PVASLQQLLI WLDQKLAQGPHA ml_15-5 389 EVDELQQLLNWLDHKLASGPLQ ml_15-6 390 DVESLEQLLMWLDHQLASGPHG mL15-7 391 QVDSLQQVLLWLEHKLALGPQV mL15-8 392 GDESLQHLLMVVLEQKLALGPHG mL15-9 393 QIEMLESLLDLLRDMVPMSNAF mL15-10 394 EVDSLQQLLMWLDQKLASGPQA mL15-11 395 EDESLQQLLIYLDKMLSSGPQV ml_15-12 396 AMDQLHQLLIWLDHKLASGPQA mL15-13 397 Rl EMLESLLELLDEI ALI PKAW mL15-14 398 EVVSLQHLLMWLEHKLASGPDG mL15-15 399 GGESLQQLLMWLDQQLASGPQR ml_15-16 400 GVESLQQLLI FLDHMLVSGPHD mL15-17 401 NVESLEHLMMWLERLLASGPYA mL15-18 402 QVDSLQQLLI WLDHQLASGPKR ml_15-19 403 EVESLQQLLMWLEHKLAQGPQG mL15-20 404 EVDSLQQLLMWLDQICLASGPHA mL15-21 405 EVDSLQQLLMWLDQQLASGPQK mL15-22 406 GVEQLPQLLMWLEQKLASGPQR mL15-23 407 GEDSLQQLLMWLDQQLAAGPQV Pepticuerpo SEC ID Secuencia de péptido de afinidad NO: madura ml_15-24 408 ADDSLQ QLLMWLDRKLASGPHV mL15-25 409 PVDSLQQLLIWLDQKLASGPQG L-17 119 RATLLKDFWQLVEGYGDN mL17-con1 410 DWRATLLKEFWQLVEGLGDNLV ml_17-con2 411 QSRATLLKEFWQLVEGLGDKQA mL17-1 412 DGRATLLTEFWQLVQGLGQKEA mL17-2 413 LARATLLKEFWQLVEGLGEKVV mL17-3 414 GSRDTLLKEFWQLVVGLGDMQT mL17-4 415 DARATLLKEFWQLVDAYGDRM V mL17-5 416 NDRAQLLRDFWQLVDGLGVKSW mL17-6 417 GVRETLLYELWYLLKGLGANQG mL17-7 418 QARATLLKEFCQLVGCQGDKLS mL17-8 419 QERATLLKEFWQLVAGLGQNMR mt_17-9 420 SGRATLLKEFWQLVQGLGEYRW mL17-10 421 TMRATLLKEFWLFVDGQREMQW mL17-11 422 GERATLLNDFWQLVDGQGDNTG ml_17-12 423 DERETLLKEFWQLVHGWGDNVA mL17-13 424 GGRATLLKELWQLLEGQGANLV mL17-14 425 TARATLLNELVQLVKGYGDKLV mL17-15 426 GMRATLLQEFWQLVGGQGDNWM mL17-16 427 STRATLLN DLWQLMKGWAEDRG Pepticuerpo SEC ID Secuencia de péptido de afinidad NO: madura mL17-17 428 SERATLLKELWQLVGGWGDNFG ml_17-18 429 VGRATLLKEFWQLVEGLVGQSR mL17-19 430 EIRATLLKEFWQLVDEWREQPN mL17-20 431 QLRATLLKEFLQLVHGLGETDS mL17-21 432 TQ RATLLKEFWQLI EGLGGKHV ml_17-22 433 HYRATLLKEFWQLVDGLREQG V mL17-23 434 QSRVTLLREFWQLVESYRPIVN mL17-24 435 LSRATLLNEFWQFVDGQRDKRM mL17-25 436 WDRATLLNDFWHLMEELSQKPG mL17-26 437 QERATLLKEFWRMVEGLGKNRG mL17-27 438 NERATLLREFWQLVGGYGVNQR L-20 122 YREMSMLEGLLDVLERLQHY mL20-1 439 HQRDMSMLWELLDVLDGLRQYS mL20-2 440 TQRDMSMLDGLLEVLDQLRQQR mL20-3 441 TSRDMSLLWELLEELDRLGHQR mL20-4 442 MQHDMSMLYGLVELLESLGHQI mL20-5 443 WNRDMRMLESLFEVLDGLRQQV mL20-6 444 GYRDMSMLEGLLAVLDRLGPQL mL20 con1 445 TQRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR ml_20 con2 446 WYRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR L-21 123 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ Pepticuerpo SEC ID Secuencia de péptido de afinidad NO: madura mL21-1 447 TQNSRQMLLSDFMMLVGSMIQG ml_21-2 448 MQTSRHILLSEFMMLVGSIMHG ml_21-3 449 HDNSRQMLLSDLLHLVGT IQG mL21-4 450 ENSRQ LLRELIMLVGNMSHQ ml_21-5 451 QDTSRHMLLREFMNILVGEMIQG mL21 con1 452 DQNSRQMLLSDL ILVGSMIQG L-24 126 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN mL24-1 453 NVFFQWVQKHGRVVYQWLDINV ml_24-2 454 FDFLQWLQNHRSEVEHWLVMDV Los péptidos de afinidad madura proporcionados en tablas IV y V entonces se montan en los pepticuerpos según lo descrito anteriormente y se prueban usando los análisis in vivo. Los péptidos L2 de afinidad madurada comprenden una secuencia de consenso de (SEC ID NO: 455), en donde es M o I; f2 es cualquier aminoácido; f3 es L o F; y f4 es E, Q o D. La familia de péptido L15 de afinidad madura que comprende la secuencia LqiO,?LLq,3q_.L, (SEC ID NO: 456) en donde es Q, D o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, y g4 es L, W, F, o Y. La familia L17 de afinidad madurada que comprende la secuencia: h-, haha uhshel hs g (SEC ID NO: 457) en donde h ? es R o D; h2 es cualquier aminoácido; h3 es A, T S o Q; h4 es L o M; h5 es L o S; h6 es cualquier aminoácido; h7 es F o E; h8 es W, F o C; y h9 es L, F, M o K. Las secuencias se consenso también se pueden determinar para las familias mL20, mL21 y mL24 de péptidos mostradas anteriormente. Los pepticuerpos fueron construidos a partir de estos péptidos de afinidad madura según lo descrito anteriormente, usando un enlace unido al dominio Fe de IgGI humano, que tiene la SEC ID NO: 296, en la terminal N (configuración N), en la terminal C (configuración C) del Fe, o en las terminales N y C (configuraciones N,C), según lo descrito en el ejemplo 2 anterior. Los péptidos nombrados fueron unidos a las terminales C o N vía una secuencia enlace 5 glicina (5G), 8 glicina o k. En la versión del pepticuerpo 2X, los péptidos fueron unidos con enlaces tal como 5 gly, 8 gly o k. Los péptidos de afinidad madura y los pepticuerpos se designan con una "m" minúscula tal como por ejemplo mTN8-19-22. Los pepticuerpos de la presente invención además contienen dos sitios de unión donde los péptidos se unen en los vectores fagemido. La posición de estos sitios de unión es AQ — péptido — LE. Los pepticuerpos generalmente incluyen estos aminoácidos adicionales (aunque no se incluyen en las secuencias de péptido listadas en las tablas). En algunos pepticuerpos los aminoácidos LE fueron removidos de las secuencias de péptido. Estos pepticuerpos se designan como —LE.

Los pepticuerpos ejemplares, y las secuencias de polinucleótido ejemplares que los codifican, se proporcionan en la siguiente tabla VI. Esta tabla incluye los ejemplos de secuencias de pepticuerpo (en comparación a solamente el péptido), tal como 2x mTN8-19-7 (SEC ID NO: 615) y el pepticuerpo con las secuencias LE removidas (SEC ID NO: 617). A modo de explicación, las secuencias enlazadoras en las versiones 2x se refieren al enlace entre los péptidos tándem. Estas secuencias de pepticuerpo contienen las secuencias Fe, enlazadoras, AQ y LE. La secuencia de nucleótido anexa codifica la secuencia de péptido además de las secuencias enlazadoras AQ/LE, si se presenta, pero no codifica el enlace designado. TABLA VI Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mL2-Con1 R EMLESLL CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N ELLKEI VPMS AATCTCTTCTTGAACTT KAG CTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTGGT (SEC ID NO: 458) mL2-Con2 RMEMLESLL CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N ELLKEIVPMS AATCTCTTCTTGAACTT KAR CTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEC ID NO: 459) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_2-1 RMEMLESLL CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N ELLKDI VPMS AATCTCTTCTTGAACTT KPS CTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAAACCATCT (SEC ID NO: 460) ml_2-2 GMEMLESLF GGTATGGAAATGCTTG 5 gly N ELLQEIVPMS AATCTCTTTTTGAACTT KAP CTTCAAGAAATTGTTC CAATGTCTAAAGCTCC A (SEC ID NO: 461) mt_2-3 RMEMLESLL CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N ELLKDIVPIS AATCTCTTCTTGAACTT NPP CTTAAAGATATTGTTCC AATTTCTAATCCACCA (SEC ID NO: 462) mL2-4 RIEMLESLLE CGTATTGAAATGCTTG 5 gly N LLQEIVPISK AATCTCTTCTTGAACTT AE CTTCAAGAAATTGTTC CAATTTCTAAAGCTGA A (SEC ID NO: 463) Nombre de Péptido Secuencia de nucteótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_2-5 RMEMLQSLL CGTATGGAAATGCTTC 5 gly N ELLKDIVPMS AATCTCTTCTTGAACTT NAR CTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAATGCTCGT (SEC ID NO: 464) ml_2-6 RMEMLESLLE CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N LLKEI VPTSN AATCTCTTCTTGAACTT GT CTTAAAGAAATTGTTC CAACTTCTAATGGTAC T (SEC ID NO: 465) mL2-7 RME LESLFE CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N LLKEI VPMSK AATCTCTTTTTGAACTT AG CTTAAAGAAATTGTTC CAATGTCTAAAGCTGG T (SEC ID NO: 466) ml_2-8 RMEMLGSLL CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N ELLKEIVPMS GTTCTCTTCTTGAACTT KAR CTTAAAGAAATTGTTC CAATGTCTAAAGCTCG T (SEC ID NO: 467) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_2-9 QMELLDSLFE CAAATGGAACTTCTTG 5 gly N LLKEI VPKSQ ATTCTCTTTGAACTTCT PA AAAGAAATTGTTCCAA AATCTCAACCAGCT (SEC ID NO: 468) ml_2-10 RMEMLDSLL CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N ELLKEI VPMS ATTCTCTTCTTGAACTT NAR CTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAATGCTCGT (SEC ID NO: 469) mL2-11 R EMLESLLE CGTATGGAAATGCTTG 5 gly N LLHEIVPMSQ AATCTCTTCTTGAACTT AG CTTCATGAAATTGTTCC AATGTCTCAAGCTGGT (SEC ID NO: 470) mL2-12 QMEMLESLL CAAATGGAAATGCTTG 5 gly N AATCTCTTCTTCAACTT QLLKEIVPMS CTTAAAGAAATTGTTCC KAS AATGTCTAAAGCTTCT (SEC ID NO: 471) mL2-13 RMEMLDSLL CGTATGGAAATGCTTGATTC 5 gly N TCTTCTTGAACTTCTTAAAGA ELLKDMVPM TATGGTTCCAATGACTACTG TTGA GTGCT (SEC ID NO: 472) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mL2-14 RIE LESLLE 5 gly N CGTATTGAAATGCTTG LLK AATCTCTTCTTGAACTT DMVPMANAS CTTAAAGATATGGTTC CAATGGCTAATGCTTC T (SEC ID NO: 473) mL2-15 RMEMLESLL 5 gly N CGTATGGAAATGCTTG QLLNEIVPMS AATCTCTTCTTCAACTT RAR CTTAATGAAATTGTTCC AATGTCTCGTGCTCGT (SEC ID NO: 474) ml_2-16 RMEMLESLF 5 gly N CGTATGGAAATGCTTG DLLKELVPMS AATCTCTTTITGATCTT KGV CTTAAAGAACTTGTTC CAATGTCTAAAGGTGT T (SEC ID NO: 475) mL2-17 RIEMLESLLE 5 gly N CGTATTGAAATGCTTG LLK AATCTCTTCTTGAACTT DIVPIQKAR CTTAAAGATATTGTTCC AATTCAAAAAGCTCGT (SEC ID NO: 476) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_2-18 R ELLESLFE 5 gly N CGTATGGAACTTCTTT LLK GAATCTCTTTTTGAACT DMVPMSDSS TCTTAAAGATATGGITC CAATGTCTGATTCTTCT (SEC ID NO: 477) mL2-19 RMEMLESLLE 5 gly N CGTATGGAAATGCTTG VLQEI VPRAK AATCTCTTCTTGAAGTT GA CTTCAAGAAATTGTTC CACGTGCTAAAGGTGC T (SEC ID NO: 478) ml_2-20 RMEMLDSLL 5 gly N CGTATGGAAATGCTTG QLLNEIVPMS AATCTCTTCTTCAACTT HAR CTTAATGAAATTGTTCC AATGTCTCATGCTCGT (SEC ID NO: 479) mL2-21 RMEMLESLLE 5 gly N CGTATGGAAATGCTTG LLKDI VPMSN AATCTCTTCTTGAACTT AG CTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAATGCTGGT (SEC ID NO: 480) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace termina! pepticuerpo (SEC ID No) ml_2-22 RMEMLQSLF 5 gly N CGTATGGAAATGCTTC ELLKGM VPIS AATCTCTTTTTGAACTT KAG CTTAAAGGTATGGTTC CAATTTCTAAAGCTGG T (SEC ID NO: 481 ) ml_2-23 RMEMLESLLE 5 gly N CGTATGGAAATGCTTG LLKEI VPNST AATCTCTTCTTGAACTT AA CTTAAAGAAATTGTTCC AAATTCTACTGCTGCT (SEC ID NO: 482) ml_2-24 RMEMLQSLL 5 gly N CGTATGGAAATGCTTC ELLKEIVPISK AATCTCTTCTTGAACTT AG CTTAAAGAAATTGTTCC AATTTCTAAAGCTGGT (SEC ID NO: 483) mL2-25 RIEMLDSLLE 5 gly N CGTATTGAAATGCTTG LLN ATTCTCITCTTGAACTT ELVPMSKAR CTTAATGAACTTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEC ID NO: 484) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_17- DWRATLLKEF 5 gly N GATTGGCGTGCTACTC Con1 WQLVEGLGD TTCTTAAAGAATTTTGG NLV TGATAATCTTGTT (SEC ID NO: 485) mL17-1 DGRATLLTEF 5 gly N GATGGTCGTGCTACTC WQLVQGLGQ TTCTTACTGAAMTGGC KEA AACTTGTTCAAGGTCT TGGTCAAAAAGAAGCT (SEC ID NO: 486) mL17-2 LARATLLKEF 5 gly N CTTGCTCGTGCTACTC WQLVEGLGE TTCTTAAAGAATGGCA KVV ACTTGTTGAAGGTCT TGGTGAAAAAGTTGTT (SEC ID NO: 487) mL17-3 GSRDTLLKEF 5 gly N GGTTCTCGTGATACTC WQLVVGLGD TTCTTAAAGAATTGGC MQT AACTTGTTGTTGGTCTT GGTGATATGCAAACT (SEC ID NO: 488) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) tnL17-4 DARATLLKEF 5 gly N GATGCTCGTGCTACTC WQLVDAYGD TTCTTAAAGAATTTTGG RMV CAACTTGTTGATGCTT ATGGTGATCGTATGGT T (SEC ID NO: 489) ml_17-5 NDRAQLLRD 5 gly N AATGATCGTGCTCAAC FWQLVDGLG TTCTTCGTGATTTTTGG KSW CAACTTGTTGATGGTC TTGGTGTTAAATCTTG G (SEC ID NO: 490) ml_17-6 GVRETLLYEL 5 gly N GGTGTTCGTGAAACTC WYLLKGLGA TTCTTTATGAACTTTGG NQG TATCTTCTTAAAGGTCT TGGTGCTAATCAAGGT (SEC ID NO: 491) ml_17-7 QARATLLKEF 5 gly N CAAGCTCGTGCTACTC CQLVGCQGD TTCTTAAAGAATTTTGT KLS CAACTTGTTGGTTGTC AAGGTGATAAACTTCT (SEC ID NO:N 492) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mL17-8 QERATLLKEF 5 gly N CAAGAACGTGCTACTC WQLVAGLGQ TTCTTAAAGAAMTGGC NMR AACTTGTTGCTGGTCT TGGTCAAAATATGCGT (SEC ID NO: 493) ml_17-9 SGRATLLKEF 5 gly N TCTGGTCGTGCTACTC WQLVQGLGE TTCTTAAAGAAT'TITGG YRW CAACTTGTTCAAGGTC TTGGTGAATATCGTTG G (SEC ID NO: 494) mL17-10 TMRATLLKEF 5 gly N ACTATGCGTGCTACTC WLFVDGQRE TTCTTAAAGAATGGCTT MQW TTGTTGATGGTCAACG TGAAATGCAATGG (SEC ID NO: 495) mL17-11 GERATLLNDF 5 gly N GGTGAACGTGCTACTC WQLVDGQGD TTCTTAATGATTTTTGG NTG CAACITGTTGATGGTCA AGGTGATAATACTGGT (SEC ID NO: 496) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mL17-12 DERETLLKEF 5 gly N GATGAACGTGAAACTC WQLVHGWG TCTTAAAGAATITTGGC DN VA AACTTGTTCATGGTGG GGTGATAATGTTGCT (SEC ID NO: 497) ml_17-13 GGRATLLKEL 5 gly N GGTGGTCGTGCTACTT WQLLEGQGA CTTAAAGAACMGGCAA NLV CTTCTTGAAGGTCAAG GTGCTAATCTTGTT (SEC ID NO: 498) mL17-14 TARATLLNEL 5 gly N ACTGCTCGTGCTACTC VQLVKGYGD TTCTTAATGAACTTGTT KLV CAACTTGTTAAAGGTT ATGGTGATAAACTTGT T (SEC ID NO: 499) ml_17-15 GMRATLLQE 5 gly N GGTATGCGTGCTACTC FWQLVGGQG TTCTTCAAGAATTTTGG DN WM CAACTTGTTGGTGGTC AAGGTGATAATTGGAT G (SEC ID NO: 500) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) 2x mTN8- FC-5G-AQ- 1K C TGGTATCCGTGTTATG Con6-(C)- WYPCYEGHF AGGGTCACTTCTGGTG 1K WCYDL- CTACGATCTGGGTTCT GSGSATGGS GSTASSGSG GGTTCCACTGCTTCTT SATG- CTGGTTCCGGTTCCGC WYPCYEGHF TACTGGTTGGTACCCG WCYDL-LE TGCTACGAAGGTCACT (SEC ID NO: TFTGGTGTTATGATCT 506) G(SEC ID NO: 507) 2x mTN8- M-GAQ- 1 K N ATCTTTGGCTGTAAAT Con7- (N)- IFGCKWWDV GGTGGGACGITCAGTG 1K QCYQF- CTACCAGTTCGGITCTG GSGSATGGS GSTASSGSG ATTCCACTGCTT'CITCT SATG- GGTTCCGGTTCCGCTA IFGCKWWDV CTGGTATCTTCGGTTG QCYQF-LE- CAAGTGGTGGGATGTA 5G-FC (SEC CAGTGTATCAGTTTT ID NO: 508) (SEC ID NO: 509) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) 2x mTNS- FC-5G-AQ- ATCTTTGGCTGTAAAT 1 K C IFGCKWWDV GGTGGGACGTTCAGTG Con7-(C)- QCYQF- CTACCAGTTCGGTTCT 1K GSGSATGGS GGTTCCACTGCTFCTT GSTASSGSG CTG GTTCCGGTTCCGC SATG- TACTGGTATCTTCGGT IFGCKWWDV TGCAAGTGGTGGGATG QCYQF-LE TACAGTGTTATCAGTTT (SEC ID NO: (SEC ID NO: 511) 510) 2x mTN8- M-GAQ- ATCTTTGGCTGTAAGT 1 K N IFGCKWWDV GGTGGGACGTTGACTG Con8-(N)- DCYQF- CTACCAGTTCGGTTCT 1 K GSGSATGGS GGTTCCACTGCTTCTT GSTASSGSG CTG GTTCCGGTTCCGC SATG- TACTGGTATCTTCGGT IFGCKWWDV TGCAAATGGTGGGACG DCYQF-LE- TTGATTGTTATCAGTTT 5G-FC(SEC (SEC ID NO: 513) ID NO: 512) 2x mTN8- FC-5G-AQ- ATCTITGGCTGTAAGTG 1 K C IFGCKWWDVDC GTGGGACGTTGACTGC Con8-(C)- YQF- TACCAGTTCGGTTCTG 1 K GSGSATGGSGS GTTCCACTGCTTCTTC TASSGSGSATG TGGTTCCGGTTCCGCT - ACTGGTATCTTCGGTT IFGCKWWDVDC GCAAATGGTGGGACGT YQF-LE (SEC ID TGATTGTTATCAGTTT NO: 514) (SEC ID NO: 515) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ML15- QVESLQQLL 5 gly C CAGGTTGAATCCCTGC Con1 MWLDQICLAS AGCAGCTGCTGATGTG GP QG GCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGG GT (SEC ID NO: 516) ML15-1 RMELLESLFE 5 gly C CGTATGGAACTGCTGG LLKEMVPRSK AATCCCTGTTCGAACT AV GCTGAAAGAAATGGTT CCGCGTTCCAAAGCTG TT (SEC ID NO: 517) mL15-2 QAVSLQHLL 5 gly C CAGGCTGTTTCCCTGC MW AGCACCTGCTGATGTG LDQKLASGP GCTGGACCAGAAACTG QH GCTTCCGGTCCGCAGC AC(SEC ID NO: 518) mL15-3 DEDSLQQLL 5 gly C GACGAAGACTCCCTGC MWLDQKLAS AGCAGCTGCTGATGTG GPQL GCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGC TG(SEC ID NO: 519) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_15-4 PVASLQQLLI 5 gly C CCGGTTGCTTCCCTGC WLDQKLAQG AGCAGCTGCTGATCTG PHA GCTGGACCAGAAACTG GCTCAGGGTCCGCAC GCT (SEC ID NO: 520) ml_15-5 EVDELQQLLN 5 gly C GAAGTTGACGAACTGC WLDHKLASG AGCAGCTGCTGAACTG PLQ GCTGGACCACAAACTG GCTTCCGGTCCGCTGC AG(SEC ID NO: 521) ml_15-6 DVESLEQLL 5 gly c GACGTTGAATCCCTGG WLDHQLASG AACAGCTGCTGATGTG PHG GCTGGACCACCAGCTG GCTTCCGGTCCGCACG GT (SEC ID NO: 522) mL15-7 QVDSLQQVLL 5 gly c CAGGTTGACTCCCTGC WLEHKLALG AGCAGGTTCTGCTGTG PQV GCTGGAACACAAACTG GCTCTGGGTCCGCAG GTT (SEC ID NO: 523) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_15-8 GDESLQHLL 5 gly C GGTGACGAATCCCTGC MWLEQKLAL AGCACCTGCTGATGTG GPHG GCTGGAACAGAAACTG GCTCTGGGTCCGCACG GT (SEC ID NO: 524) ml_15-9 QIEMLESLLD 5 gly C CAG ATCGAAATGCTGG LLR AATCCCTGCTGGACCT D VPMSNAF GCTGCGTGACATGGTT CCG ATGTCCAACGCTT TC(SEC ID NO: 525) ml_15-10 EVDSLQQLL 5 gly C GAAGTTGACTCCCTGC WLDQKLAS AGCAGCTGCTGATGTG GPQA GCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGG CT (SEC ID NO: 526) ml_15-11 EDESLQQLLI 5 gly C GAAGACGAATCCCTGC YLDKMLSSG AGCAGCTGCTGATCTA PQV CCTGGACAAAATGCTG TCCTCCGGTCCGCAGG TT (SEC ID NO: 527) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_15-12 A DQLHQLLI 5 gly C GCTATGGACCAGCTGC WLDHKLASG ACCAGCTGCTGATCTG PQA GCTGGACCACAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGG CT (SEC ID NO: 528) ml_15-13 RIEMLESLLE 5 gly C CGTATCGAAATGCTGG LLDEIALIPKA AATCCCTGCTGGAACT W GCTGGACGAAATCGCT CTGATCCCGAAAGCTT GG(SEC ID NO: 529) ml_15-14 EVVSLQHLLM 5 gly c GAAGTTGTTTCCCTGC WLEHKLASG AGCACCTGCTGATGTG PDG GCTGGAACACAAACTG GCTTCCGGTCCGGACG GT (SEC ID NO: 530) mL15-15 GGESLQQLL 5 gly c GGTGGTGAATCCCTGC MWLDQQLAS AGCAGCTGCTGATGTG GPQR GCTGGACCAGCAGCTG GCTTCCGGTCCGCAGC GT (SEC ID NO: 531) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_15-16 GVESLQQLLI 5 gly C GGTGTTGAATCCCTGC FLDHMLVSG AGCAGCTGCTGATCTT PHD CCTGGACCACATGCTG GTTTCCGGTCCGCACG AC (SEC ID NO: 532) ml_15-17 NVESLEHLM 5 gly C AACGTTGAATCCCTGG MWLERLLAS AACACCTGATGATGTG GPYA GCTGGAACGTCTGCTG GCTTCCGGTCCGTACG CT (SEC ID NO: 533) ml_15-18 QVDSLQQLLI 5 gly c CAGGTTGACTCCCTGC WLDHQLASG AGCAGCTGCTGATCTG PICR GCTGGACCACCAGCTG GCTTCCGGTCCGAAAC GT (SEC ID NO: 534) mL15-19 EVESLQQLLM 5 gly c GAAGTTGAATCCCTGC WLEHKLAQG AGCAGCTGCTGATGTG PQG GCTGGAACACAAACTG GCTCAGGGTCCGCAG GGT (SEC ID NO: 535) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_15-20 EVDSLQQLL 5 gly C GAAGTTGACTCCCTGC MWLDQKLAS AGCAGCTGCTGATGTG GPHA GCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCACG CT (SEC ID NO: 536) ml_15-21 EVDSLQQLL 5 gly C GAAGTTGACTCCCTGC MWLDQQLAS AGCAGCTGCTGATGTG GPQK GCTGGACCAGCAGCTG GCTI'CCGGTCCGCAGA AA(SEC ID NO: 537) mL15-22 GVEQLPQLL 5 gly C GGTGTTGAACAGCTGC MWLEQKLAS CGCAGCTGCTGATGTG GPQR GCTGGAACAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGC GT (SEC ID NO: 538) mL15-23 GEDSLQQLL 5 gly C GGTGAAGACTCCCTGC MWLDQQLAA AGCAGCTGCTGATGTG GPQV GCTGGACCAGCAGCTG GCTGCTGGTCCGCAG GTT (SEC ID NO: 539) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_15-24 ADDSLQQLL 5 gly C GCTGACGACTCCCTGC MWLDRKLAS AGCAGCTGCTGATGTG GPHV GCTGGACCGTAAACTG GCTTCCGGTCCGCACG TT (SEC ID NO: 540) ml_15-25 PVDSLQQLLI 5 gly C CCGGTTGACTCCCTGC WLDQKLASG AGCAGCTGCTGATCTG PQG GCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGG GT (SEC ID NO: 541) ml_17- QSRATLLKEF 5 gly c CAGTCCCGTGCTACCC Con2 WQLVEGLGD TGCTGAAAGAATTCTG KQA GCAGCTGGTTGAAGGT CTGGGTGACAAACAGG CT (SEC ID NO: 542) mL17-19 EIRATLLKEF 5 gly c GAAATCCGTGCTACCC WQLVDEWRE TGCTGAAAGAATTCTG QPN GCAGCTGGTTGACGAA TGGCGTGAACAGCCGA AC(SEC ID NO: 543) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mL17-20 QLRATLLKEF 5 gly C CAGCTGCGTGCTACCC LQLVHGLGET TGCTGAAAGAATTCCT DS GCAGCTGGTTCACGGT CTGGGTGAAACCGACT CC(SEC ID NO: 544) ml_17-21 TQRATLLKEF 5 gly C ACCCAGCGTGCTACCC WQLIEGLGG TGCTGAAAGAATTCTG KHV GCAGCTGATCGAAGGT CTGGGTGGTAAACACG TT (SEC ID NO: 545) ml_17-22 HYRATLLKEF 5 gly c CACTACCGTGCTACCC WQLVDGLRE TGCTGAAAGAATTCTG QGV GCAGCTGGTTGACGGT CTGCGTGAACAGGGTG TT (SEC ID NO: 546) mL17-23 QSRVTLLREF 5 gly c CAGTCCCGTGTTACCC WQLVESYRPI TGCTGCGTGAATTCTG VN GCAGCTGGTTGAATCC TACCGTCCGATCGTTA AC(SEC ID NO: 547) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_17-24 LSRATLLNEF 5 gly C CTGTCCCGTGCTACCC WQFVDGQRD TGCTGAACGAATTCTG KRM GCAGTTCG'TTGACGGT CAGCGTGACAAACGTA TG(SEC ID NO: 548) ml_17-25 WDRATLLND 5 gly C TGGGACCGTGCTACCC FWHLMEELS TGCTGAACGACTTCTG QKPG GCACCTGATGGAAGAA CTGTCCCAGAAACCGG GT (SEC ID NO: 549) ml_17-26 QERATLLKEF 5 gly c CAGGAACGTGCTACCC WRMVEGLGK TGCTGAAAGAATTCTG NRG GCGTATGGTTGAAGGT CTGGGTAAAAACCGTG GT (SEC ID NO: 550) rnl_17-27 NERATLLREF 5 gly c AACGAACGTGCTACCC WQLVGGYGV TGCTGCGTGAATTCTG NQR GCAGCTGGITGGTGGIT ACGGTGTTAACCAGCG T (SEC ID NO: 551) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8- QREWYPCYG 5 gly C CAGCGTGAATGGTACC Con6-1 GHLWCYDLH CGTGCTACGGTGGTCA KA CCTGTGGTGCTACGAC CTGCACAAAGCT (SEC ID NO: 552) mTN8- ISAWYSCYAG 5 gly C ATCTCCGCTTGGTACT Con6-2 HF CCTGCTACGCTGGTCA WCWDLKQK CTTCTGGTGCTGGGAC CTGAAACAGAAA (SEC ID NO: 553) mTN8- WTGWYQCY 5 gly c TGGACCGGTTGGTACC Con6-3 GGH AGTGCTACGGTGGTCA LWCYDLRRK CCTGTGGTGCTACGAC CTGCGTCGTAAA (SEC ID NO: 554) mTN8- KTFWYPCYD 5 gly c AAAACCTTCTGGTACC Con6-4 GHF CGTGCTACGACGGTCA WCYNLKSS CTTCTGGTGCTACAAC CTGAAATCCTCC (SEC ID NO: 545) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8- ESRWYPCYE 5 gly C GAATCCCGTTGGTACC Con6-5 GHLWCFDLT CGTGCTACGAAGGTCA ET CCTGTGGTGCTTCGAC CTGACCGAAACC(SEC ID NO: 546) mL24-1 NVFFQWVQK 5 gly C AATGTTTTTTTTCAATG HGRVVYQWL GGTTCAAAAACATGGT DINV CGTGTTGTTTATCAAT GGCTTGATATTAATGTT (SEC ID NO: 557) mL24-2 FDFLQWLQN 5 gly C TTTGATTTTCTTCAATG HRSEVEHWL GCTTCAAAATCATCGT VMDV TCTGAAGTT'GAACATT GGCTTGTTATGGATGT T (SEC ID NO: 558) mL20-1 HQRDMSMLW 5 gly C CATCAACGTGATATGT ELLDVLDGLR CTATGCTTTGGGAACT QYS TCTTGATGTTCTTGATG GTCTTCGTCAATATTCT (SEC ID NO: 559) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_20-2 TQRDMSMLD 5 gly C ACTCAACGTGATATGT GLLEVLDQLR CTATGCTTGATGGTCT QQR TCTTGAAGTTCTTGATC AACTTCGTCAACAACG T (SEC ID NO: 560) ml_20-3 TSRDMSLLW 5 gly C ACCTCCCGTGACATGT ELLEELDRLG CCCTGCTGTGGGAACT HQR GCTGGAAGAACTGGAC CGTCTGGGTCACCAGC GT (SEC ID NO: 561) ml_20-4 MQHDMSMLY 5 gly C ATGCAACATGATATGT GLVELLESLG CTATGCTTTATGGTCTT HQI GTTGAACTTCTTGAAT CTCTTGGTCATCAAATT (SEC ID NO: 562) ml_20-5 WNRDMRMLE 5 gly C TGGAATCGTGATATGC SLFEVLDGLR GTATGCTTGAATCTCTI QQV TTTGAAGTTCTTGATG GTCTTCGTCAACAAGT T (SEC ID NO: 563) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_20-6 GYRDMSMLE 5 gly C GGTTATCGTGATATGT GLLAVLDRLG CTATGCTTGAAGGTCT PQL TCTTGCTGTTCTTGATC GTCTTGGTCCACAACT T (SEC ID NO: 564) ml_20 TQRDMSMLE 5 gly C ACTCAACGTGATATGT Con1 GLLEVLDRLG CTATGCTTGAAGGTCT QQR TCTTGAAGTTCTTGATC GTCTTGGTCAACAACG T (SEC ID NO:565) ml_20 WYRDMSMLE 5 gly c TGGTACCGTGACATGT Con2 GLLEVLDRLG CCATGCTGGAAGGTCT QQR GCTGGAAGTTCTGGAC CGTCTGGGTCAGCAGC GT (SEC ID NO: 566) mL21-1 TQNSRQMLL 5 gly c ACTCAAAATTCTCGTC SDFMMLVGS AAATGCTTCTTTCTGAT MIQG TTTATGATGCTTGTTG G1TCTATGATTCAAGG T (SEC ID NO: 567) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_21 -2 MQTSRHILLS 5 gly C ATG CAAACTTCTCGTC EFMMLVGSIM ATATTCTTCTITCTGAA HG TTTATGATGCTTGTTG GTTCTATTATGCATGG T (SEC ID NO: 568) mL21-3 HDNSRQMLL 5 gly C CACGACAACTCCCGTC SDLLHLVGTM AGATGCTGCTGTCCGA IQG CCTGCTGCACCTGGTT GGTACCATGATCCAGG GT (SEC ID NO: 569) ml_21-4 MENSRQNLL 5 gly c ATGGAAAACTCCCGTC RELIMLVGNM AGAACCTGCTGCGTGA SHQ ACTGATCATGCTGGTT GGTAACATGTCCCACC AG(SEC ID NO: 570) mL21-5 QDTSRHMLL 5 gly c CAGGACACCTCCCGTC REFMMLVGE ACATGCTGCTGCGTGA MIQG ATTCATGATGCTGGTT GGTGAAATGATCCAGG GT (SEC ID NO: 571 ) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) ml_21 DQNSRQMLL 5 gly C GACCAGAACTCCCGTC Con1 SDLMILVGSM AGATGCTGCTGTCCGA IQG CCF GATGATCCTGGTT GGTTCCATGATCCAGG GT (SEC ID NO: 572) mTN8-19- VALHGQCTR 5 gly C GTTGCTCTTCATGGTC 1 WPWMCPPQ AATGTACTCGTTGGCC REG ATGGATGTGTCCACCA CAACGTGAAGGT (SEC ID NO: 573) mTN8-19- YPEQGLCTR 5 gly c TATCCAGAACAAGGTC 2 WPWMCPPQT TTTGTACTCGTTGGCC LA ATGGATGTGTCCACCA CAAACTCTTGCT (SEC ID NO: 574) mTN8-19- GLNQGHCTR 5 gly GGTCTGAACCAGGGTC 3 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC DSN GTGGATGTGCCCGCC GCAGGACTCCAAC (SEC ID NO: 575) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8-19- MITQGQCTR 5 gly C ATGATTACTCAAGGTC 4 WPWMCPPQ AATGTACTCGTTGGCC PSG ATGGATGTGTCCACCA CAACCATCTGGT (SEC ID NO: 576) mTN8-19- AGAQEHCTR 5 gly C GCTGGTGCTCAGGAAC 5 WPWMCAPN ACTGCACCCGTTGGCC DWI GTGGATGTGCGCTCCG AACGACTGGATC (SEC ID NO: 577) mTN8-19- GVNQGQCTR 5 gly c GGTGTTAACCAGGGTC 6 WRWMCPPN AGTGCACCCGTTGGCG GWE TTGGATGTGCCCGCCG AACGGTTGGGAA (SEC ID NO: 578) mTN8-19- LADHGQCIR 5 gly c CTGGCTGACCACGGTC 7 WPWMCPPE AGTGCATCCGTTGGCC GWE GTGGATGTGCCCGCC GGAAGGTTGGGAA (SEC ID NO: 579) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8-19- I LEQAQCTRW 5 gly C ATCCTGGAACAGGCTC 8 PW AGTGCACCCGTTGGCC MCPPQRGG GTGGATGTGCCCGCC GCAGCGTGGTGGT (SEC ID NO: 580) mTN8-19- TQTHAQCTR 5 gly C ACTCAAACTCATGCTC 9 WPWMCPPQ AATGTACTCGTTGGCC WEG ATGGATGTGTCCACCA CAATGGGAAGGT (SEC ID NO: 581) mTN8-19- VVTQGHCTL 5 gly c GTTGTTACTCAAGGTC 10 WPWMCPPQ ATTGTACTCTTTGGCC RWR ATGGATGTGTCCACCA CAACGTTGGCGT (SEC ID NO: 582) mTN8-19- I YPHDQCTR 5 gly c ATTTATCCACATGATCA 11 WPWMCPPQ ATGTACTCGTTGGCCA PYP TGGATGTGTCCACCAC AACCATATCCA (SEC ID NO: 583) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mlN8-19- SYWQGQCTR 5 gly C TCTTATTGGCAAGGTC 12 WPWMCPPQ AATGTACTCGTTGGCC WRG ATGGATGTGTCCACCA CAATGGCGTGGT (SEC ID NO: 584) mTN8-19- MWQQGHCT 5 gly C ATGTGGCAACAAGGTC 13 RWPWMCPP ATTGTACTCGTTGGCC QGWG ATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGGT (SEC ID NO: 585) mTN8-19- EFTQWHCTR 5 gly C GAATTCACCCAGTGGC 14 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC RSQ GTGGATGTGCCCGCC GCAGCGTTCCCAG(SE C ID NO: 586) mTN8-19- LDDQWQCTR 5 gly C CTGGACGACCAGTGGC 15 WPWMCPPQ AGTGCACCCGTTGGCC GFS GTGGATGTGCCCGCC GCAGGGTTTCTCC (SEC ID NO: 587) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8-19- YQTQGLCTR 5 gly C TATCAAACTCAAGGTC 16 WPWMCPPQ TTTGTACTCGTTGGCC SQR ATG GATGTGTCCACCA CAATCTCAACGT (SEC ID NO: 588) mTN8-19- ESNQGQCTR 5 gly C GAATCTAATCAAGGTC 17 WPWMCPPQ AATGTACTCGTTGGCC GGW ATG GATGTGTCCACCA CAAGGTGGTTGG (SEC ID NO: 589) mTN8-19- WTDRGPCTR 5 gly c TGGACCGACCGTGGTC 18 WPWMCPPQ CGTGCACCCGTTGGCC ANG GTGGATGTGCCCGCC GCAGGCTAACGGT (SEC ID NO: 590) mTN8-19- VGTQGQCTR 5 gly c GTTGGTACCCAGGGTC 19 WPWMCPPYE AGTGCACCCGTTGGCC TG GTGGATGTGCCCGCC GTACGAAACCGGT (SEC ID NO: 591 ) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) MIN8-19- PYEQGKCTR 5 gly C CCGTACGAACAGGGTA 20 WPWMCPPYE AATGCACCCGTTGGCC VE GTGGATGTGCCCGCC GTACGAAGTTGAA (SEC ID NO: 592) mTN8-19- SEYQGLCTR 5 gly C TCCGAATACCAGGGTC 21 WPWMCPPQ TGTGCACCCGTTGGCC GWK GTGGATGTGCCCGCC GCAGGGTTGGAAA (SEC ID NO: 593) mTN8-19- TFSQGHCTR 5 gly c ACCTTCTCCCAGGGTC 22 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTT'GGC GWG CGTGGATGTGCCCGCC GCAGGGTTGGGGT (SEC ID NO: 594) mTN8-19- PGAHDHCTR 5 gly c CCGGGTGCTCACGACC 23 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC SRY GTGGATGTGCCCGCC GCAGTCCCGTTAC (SEC ID NO: 595) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8-19- VAEEWHCRR 5 gly C GTTGCTGAAGAATGGC 24 WPWMCPPQ ACTGCCGTCGTTGGCC DWR GTGGATGTGCCCGCC GCAGGACTGGCGT (SEC ID NO: 596) mTN8-19- VGTQGHCTR 5 gly C GTTGGTACCCAGGGTC 25 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC PAG GTGGATGTGCCCGCC GCAGCCGGCTGGT (SEC ID NO: 597) mTN8-19- EEDQAHCRS 5 gly c GAAGAAGACCAGGCTC 26 WPWMCPPQ ACTGCCGTTCCTGGCC GWV GTGGATGTGCCCGCC GCAGGGTTGGGTT (SEC ID NO: 598) mTN8-19- ADTQGHCTR 5 gly c GCTGACACCCAGGGTC 27 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC HWF GTGGATGTGCCCGCC GCAGCACTGGTTC (SEC ID NO: 599) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8-19- SGPQGHCTR 5 gly C TCCGGTCCGCAGGGTC 28 WPWMCAPQ ACTGCACCCGTTGGCC GWF GTGGATGTGCGCTCCG CAGGGTTGGTTC (SEC ID NO: 600) mTN8-19- TLVQGHCTR 5 gly C ACCCTGGTTCAGGGTC 29 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC RWV GTGGATGTGCCCGCC GCAGCGTTGGGTT (SEC ID NO: 601) mTN8-19- G AHGKCTR 5 gly C GGTATGGCTCACGGTA 30 WAW CPPQ AATGCACCCGTTGGGC SWK TTGGATGTGCCCGCCG CAGTCCTGGAAA (SEC ID NO: 602) mTN8-19- ELYHGQCTR 5 gly C GAACTGTACCACGGTC 31 WPWMCPPQ AGTGCACCCGTTGGCC SWA GTGGATGTGCCCGCC GCAGTCCTGGGCT (SEC ID NO: 603) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8-19- VADHGHCTR 5 gly C GTTGCTGACCACGGTC 32 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC GWG GTGGATGTGCCCGCC GCAGGGTTGGGGT (SEC ID NO: 604 MIN8-19- PESQGHCTR 5 gly C CCGGAATCCCAGGGTC 33 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC GWG GTGGATGTGCCCGCC GCAGGGTTGGGGT (SEC ID NO: 605) mTN8-19- IPAHGHCTR 5 gly c ATCCCGGCTCACGGTC 34 WPWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCC RWR GTGGATGTGCCCGCC GCAGCGTTGGCGT (SEC ID NO: 606) ?G???8-19- FTVHGHCTR 5 gly c TTCACCGTTCACGGTC 35 WPWMCPPY ACTGCACCCGTTGGCC GWV GTGGATGTGCCCGCC GTACGGTTGGGTT (SEC ID NO: 607) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) mTN8-19- PDFPGHCTR 5 gly C CCAGATTTTCCAGGTC 36 WRWMCPPQ ATTGTACTCGTTGGCG GWE TTGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGAA (SEC ID NO: 608) mTN8-19- QLWQGPCTQ 5 gly C CAGCTGTGGCAGGGTC 37 WPWMCPPK CGTGCACCCAGTGGCC GRY GTGGATGTGCCCGCC GAAAGGTCGTTAC (SEC ID NO: 609) mTN8-19- HANDGHCTR 5 gly C CACGCTAACGACGGTC 38 WQWMCPPQ ACTGCACCCGTTGGCA WGG GTGGATGTGCCCGCC GCAGTGGGGTGGT (SEC ID NO: 610) mTN8-19- ETDHGLCTR 5 gly C GAAACCGACCACGGTC 39 WPWMCPPY TGTGCACCCGTTGGCC GAR GTGGATGTGCCCGCC GTACGGTGCTCGT (SEC ID NO: 611) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) 2X mTN8- FC-5G-AQ- 1K TCTGAATATCAAGGTC 19- 21 ST- SEYQGLCTR TTTGTACTCGTTGGCC GGdel2x WPWMCPPQ ATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGAAAGGTT LE GWKGSGSAT CCGGTTCCGCTACCGG GGSGGGASS CGGCTCTGGCGGTGG GSGSATGSE CGCTTCTTCCGGTTCC YQGLCTRWP GGTTCTGCTACTGGTT WMCPPQGW CTG AGTATCAAGGCCT CTGTACTCGCTGGCCA K (SEC ID TGG ATGTGTCCACCAC NO: 621) AAGGTTGGAAA (SEC ID NO: 622) 2X mTN8- FC-5G-AQ- 1K C ACTTTTTCTCAAGGTCA 19-22 TFSQGHCTR TTGTACTCGTTGGCCA WPWMCPPQ TGG ATGTGTCCACCAC AAGGTT'GGGGTCTCG GWGLEGSGS AGGGTTCCGGTTCCGC ATGGSGSTA TACCGGCGGCTCTGGC SSGSGSATG TCCACTGCTTCFICCGG TFSQGHCTR TTCCGGTTCTGCTACT WPWMCPPQ GGTACTITTICTCAAGG CCATTGTACTCGCTGG GWG-LE CCATGGATGTGTCCAC (SEC ID NO: CACAAGGCTGGGGCCT 623) GGAA (SEC ID NO: 624) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) 2X mTN8- FC-5G-AQ- 1K C GTTGCTGATCATGGTC 19-32 VADHGHCTR ATTGTACTCGTTGGCC WPWMCPPQ ATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGGTCTCG GWGLEGSGS AGGGTTCCGGTTCCGC ATGGSGSTA AACCGGCGGCTCTGG SSGSGSATG CTCCACTGCTTCTTCC VADHGHCTR GGTTCCGGTTCTGCTA WPWMCPPQ CTGGTGTTGCTGACCA CGGTCACTGCACCCGT GWG-LE TGGCCGTGGATGTGCC (SEC ID NO: CGCCGCAGGGTTGGG 625) GTCTGGAA (SEC ID NO: 626) 2X mTN8- FC-5G-AQ- 1 K c GTTGCTGATCATGGTC 19- 32 ST- VADHGHCTR ATTGTACTCGTTGGCC GGdel2x WPWMCPPQ ATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGGTGGTT LE GWGGSGSAT CCGGTTCCGCTACCGG GGSGGGASS CGGCTCTGGCGGTGG GSGSATGVA TGCTTCTTCCGGTTCC DHGHCTRWP GGTTCTGCTACTGGTG WVCPPQGW TTGCTGACCACGGTCA CTGCACCCGTTGGCCG G (SEC ID TGGGTGTGTCCACCAC NO: 627) AAGGTTGGGGT (SEC ID NO: 628) Nombre de Péptido Secuencia de nucleótido Enlace terminal pepticuerpo (SEC ID No) 2X mTN8- FC-5G-AQ- 1K CCAGAATCTCAAGGTC C 19-33 PESQGHCTR ATTGTACTCGTTGGCC WPWMCPPQ ATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGGTCTCG GWGLEGSGS AGGGITCCGGTTCCGC ATGGSGSTA TACCGGCGGCTCTGGC SSGSGSATG TCCACTGCTTCTTCCG PESQGHCTR GTTCCGGTTCTGCTAC TGGTCCGGAATCCCAG WPWMCPPQ GGTCACTGCACCCGTT GWGLE (SEC GGCCGTGGATGTGCC ID NO: 629) CGCCGCAGGGTTGGG GTCTGGAA (SEC ID NO: 630) 2X mTN8-19- FC-50-AQ- CCAGAATCTCAAGGTC 1K C 33ST- PESQGHCTR ATTGTACTCGTTGGCC ATGGATGTGTCCACCA GGde12xLE WPWMCPPQ CAAGGTTGGGGTGGTT GWGGSGSAT CCGGTTCCGCTACCGG GGSGGGASS CGGCTCTGGCGGTGG TGCTTCTTCCGGTICCG GSGSATGPE GTTCTGCTACTGGTCC SQGHCTRWP GGAATCCCAGGGTCAC WMCPPQGW TGCACCCGTTGGCCGT GGATGTGTCCACCACA G (SEC ID AGGTTGGGGT NO: 631) (SEC ID NO: 632) Ejemplo 7 Análisis in vitro de los péptidos de afinidad madura Los siguientes pepticuerpos ejemplares fueron analizados de acuerdo a los protocolos establecidos anteriormente para obtener los siguientes valores KD y Cl50. La tabla VII muestra el intervalo de valores KD para los pepticuerpos de afinidad madura seleccionados en comparación a con los pepticuerpos madre, según lo determinado por los análisis basados en la solución KinExA™ o análisis BIAcore®. Estos valores muestran la afinidad de unión aumentada de los pepticuerpos de afinidad madura a la miostatina en comparación a los pepticuerpos madre. La tabla VIII muestra los valores Cl50 para un número de pepticuerpos de afinidad madura. Un intervalo de valores se proporciona en esta tabla. Tabla VII Pepticuerpos KD TN8-19 (madre) > 1 nM 2xmTN8-19 (madre) > 1 nM 1x mTN8-19-7 10 pM 2x mTN8-19-7 12 pM 1x mTN8-19-21 6 pM 2x mTN8-19-21 6 pM 1x mTN8-19-32 9 pM 1x mTN8-19-33 21 pM Pepticuerpos KD 2x mTN8-19-33 3 pM 1x mTN8-19-22 4 pM 1x mTN8-19-con1 20 pM Tabla VIII Pepticuerpo de Cl50 afinidad Madura (nM) mTN8-19 Con1 1.0-4.4 mTN8-19-2 7.508- 34.39 mTN8-19-4 16.74 mTN8-19-5 7.743- 3.495 mTN8-19-6 17.26 mTN8-19-7 1.778 mTN8-19-9 22.96- 18.77 mTN8-19-10 5.252- 7.4 mTN8-19-11 28.66 mTN8-19-12 980.4 mTN8-19-13 20.04 mTN8-19-14 4.065- 6.556 Pepticuerpo de CI50 afinidad Madura (nM) mTN8-19-16 4.654 mTN8-19-21 2.767- 3.602 mTN8-19-22 1.927- 3.258 mTN8-19-23 6.584 mTN8-19-24 1.673- 2.927 mTN8-19-27 4.837- 4.925 mTN8-19-28 4.387 mTN8-19-29 6.358 mTN8-19-32 1.842- 3.348 mTN8-19-33 2.146- 2.745 mTN8-19-34 5.028- 5.069 mTN8Con6-3 86.81 mTN8Con6-5 2385 mTN8-19-7(-LE) 1.75- 2.677 Pepticuerpo de C o afinidad Madura (nM) mTN8-19-21(-LE) 2.49 mTN8-19-33(-LE) 1.808 2xmTN8-19-7 0.8572- 2.649 2xrnTN8-19-9 1.316- 1.228 2xmTN8-19-14 1.18- 1.322 2xmTN8-19-16 0.9903- 1.451 2xmTN8-19-21 0.828- 1.434 2xmTN8-19-22 0.9937- 1.22 2xmTN8-19-27 1.601- 3.931 2xmTN8-19-7(-LE) 1.077- 1.219 2xmTN8-19-21(-LE) 0.8827- 1.254 2xmTN8-19-33(-LE) 1.12- 1.033 Pepticuerpo de C o afinidad Madura (nM) ml_2-7 90.24 mL2-9 105.5 mL15-7 32.75 mL15-9 354.2 mL20-2 122.6 mL20-3 157.9 mL20-4 160 Ejemplo 8 Actividad anabólica in vivo de los pepticuerpos ejemplares El modelo ratón de CD1 nu/nu (Charles River Laboratories, Massachusettes) fue utilizado para determinar la eficacia in vivo de los pepticuerpos de la presente invención que incluyó la región humana Fe (huFc). Este modelo respondió a los inhibidores de la presente invención con una respuesta anabólica rápida que estuvo asociada a la masa muscular seca aumentada y a un incremento de las proteínas miofibrilares pero no se asoció a la acumulación en el contenido corporal de agua. En un ejemplo, la eficacia de 1x pepticuerpo mTN8-19-21 in vivo fue demostrada por el siguiente experimento. Un grupo de 10 ratones CD1 nu/nu de 8 semanas de edad fue tratado dos veces semanalmente o una vez semanalmente con dosificaciones de 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg (inyección subcutánea). El grupo de control de 10 ratones CD1 nu/nu de 8 semanas de edad recibió una inyección (subcutánea) dos veces semanalmente de huFc (vehículo) a 10 mg/kg. Los animales fueron pesados al siguiente día y la masa corporal magra fue determinada por RMN el día 0 y el día 13. Los animales entonces se sacrificaron el día 14 y fue determinado el tamaño del músculo gastrocnemio. Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3. La Figura 2 muestra el aumento del peso corporal total de los ratones durante los 14 días para varias dosificaciones de pepticuerpo en comparación al control. Como se puede observar a partir de la Figura 2, todas las dosificaciones han mostrado un aumento en el peso corporal comparado al control, todas las dosificaciones muestran aumentos estadísticos significativos con respecto al control el día 14. La Figura 3 muestra el cambio en la masa corporal magra el día 0 y el día 13 según lo determinado por la representación gráfica de la resonancia magnética nuclear (RMN) (EchoMRI 2003, Echo Medical Systems, Houston, Tx), así como el cambio en el peso del músculo gastrocnemio disecado de los animales el día 14. En otro ejemplo, el pepticuerpo 1x mTN8-19-32 fue administrado a los ratones CD1 nu/nu cada dos semanas en una inyección de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, y 30 mg/kg en comparación al control huFc (vehículo). Los animales tratados con el pepticuerpo muestran un incremento en el peso corporal total (no mostrado) así como en la masa corporal magra el día 13 comparado al día 0 según lo determinado por la medición de RMN. El incremento de la masa corporal magra se muestra en la Figura 4. En otro ejemplo, un pepticuerpo de afinidad madura 1x fue comparado a un pepticuerpo de afinidad madurad 2x para la eficacia anabólica in vivo. Los ratones CD1 nu/nu machos (10 animales por grupo) fueron tratados con las inyecciones dos veces a la semana de 1 mg/kg y 3 mg/kg 1x mTN8-19-7 y 2x mTN8-19-7 durante 35 días, mientras que el grupo de control (10 animales) recibió inyecciones dos veces a la semana de huFc (3 mg/kg). Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con el 2x pepticuerpo dio lugar a un mayor incremento del peso corporal y del peso magro del animal muerto en la autopsia en comparación al con pepticuerpo 1x o control.

Ejemplo 9 Incremento de la fuerza muscular Ratones C57B1/6 machos de 4 meses de edad, misma edad a lo normal, fueron tratados durante 30 días con 2 inyecciones por semana, inyecciones subcutáneas por semana de 5 mg/kg del grupo de control de vehículo 2x mTN8-19-33, 2x mTN8-19-7, y huFc (10 animales/grupo). Los animales de dejaron recuperarse sin ninguna inyección adicional. La fuerza de sujeción fue medida el día 18 del período de recuperación. La fuerza de sujeción fue medida usando un medidor Colombia Instruments, modelo 1027 dsm (Columbus, Ohio). El tratamiento de pepticuerpo dio lugar a un incremento significativo de la fuerza de sujeción, los animales tratados previamente con 2x mTN8-19-33 mostraron 14% de incremento de la fuerza de sujeción comparada a los ratones tratados con el control, mientras que los animales tratados con 2x mTN8-19-7 mostraron un incremento del 15% de la fuerza de sujeción comparada con a ratones tratados con el control.

Ejemplo 10 Fa r m ac oc i n éticos Los experimentos farmacocinéticos in vivo fueron realizados usando pepticuerpos representativos sin las secuencias LE. Las dosificaciones de 10 mg/kg y 5mg/kg fueron administradas a los ratones CD1 nu/nu y se determinaron los siguientes parámetros: Cmax (ug/ml), área bajo la curva (AUC) (ug-hr/ml), y período de vida (horaa). Se encontró que las versiones 2x de los pepticuerpos de afinidad madura tienen un período de vida significativamente más largo que las versiones 1x. Por ejemplo 1x mTN8-19-22 de afinidad madura tiene un período de vida en los animales de aproximadamente 50.2 horas, mientras que 2x mTN8-19-22 tiene un período vida de aproximadamente 85.2 horas. 1x mTN8-7 de afinidad madura tiene un período de vida de aproximadamente 65 horas, mientras que 2x mTN8-19-7 tiene un período de vida de aproximadamente 106 horas.

Ejemplo 11 Tratamiento de ratones mdx Los pepticuerpos de la presente invención han mostrado aumentar la masa muscular magra en un animal y son útiles para el tratamiento de una variedad de trastornos que implican la perdida muscular. La distrofia muscular es uno de tales trastornos. El modelo ratón para la distrofia muscular de Duchenne es el ratón mdx de Duchenne (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Ratones mdx maduros (10 meses de edad) fueron inyectados con el pepticuerpo 1x mTN8-19-33 (n = 8/grupo) o con la proteína vehículo huFc (N = 6/grupo) durante un período de tiempo de tres meses. El horario de dosificación fue cada tercer día, 10 mg/kg, por inyección subcutánea. El tratamiento de pepticuerpo tuvo un efecto positivo en el incremento y mantenimiento de la masa corporal en los ratones mdx maduros. Los incrementos significativos del peso corporal fueron observados en el grupo tratado con el pepticuerpo comparado al grupo treated con el control hu-Fc, según lo mostrado en la Figura 6A. Además, el análisis R N reveló que la relación masa corporal magra a masa grasa también fue incrementada significativamente en los ratones mdx maduros como un resultado del tratamiento de pepticuerpo comparado con el grupo de control, y que el porcentaje de peso corporal disminuyó en los ratones tratados con pepticuerpo comparado con el grupo de control, según lo mostrado en la Figura 6B.

Ejemplo 12 Tratamiento del modelo ratón con artritis CIA El modelo ratón con artritis inducida por colágeno se utiliza ampliamente como modelo de la artritis reumatoide. Ratones DBA/1J de 8 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, aine), fueron inmunizados el día 1 y el día 21 del experimento con 100 ug de colágeno II bovino (Chrondex, Redmond, WA) en la base de la cola para inducir la artritis. Las condiciones artríticas de los ratones fueron registradas por enrojecimiento y/o hinchazón de la articulación y pata, y los animales fueron seleccionados en esta base. Tres grupos de animales fueron establecidos: animales normales que no recibieron el colágeno (normal, 12 animales), animales que recibieron el colágeno más un vehículo Fe murino (Cl A/veh ículo, 6 animales), y animales que recibieron el colágeno más el pepticuerpo 2x mTN8-19-21 unido a Fe murino (2x mTN8-19-21 /muFc, también designado como 2x-21) (CIA/pepticuerpo, 8 animales). El Fe murino usado en estos experimentos y en los ejemplos más adelante es un Fe de un IgG murino. Los animales de CIA/vehículo y los animales de CIA/pepticuerpo, además de recibir el colágeno el día 1 y el día 21, fueron inyectados subcutáneamente (s.c.) con 5 mg/kg pepticuerpo de miostatina 2x mTN8- 9-21 /muFc o Fe murino vehículo solamente dos veces a la semana iniciando el día 8 y continuando hasta el día 50. Los animales fueron pesados cada cuatro días. Los resultados se muestran en la Figura 7. La Figura 7 muestra un incremento del peso corporal para los animales CIA/pepticuerpo (2x21) en comparación a los animales CIA/vehículo que perdieron peso, indicando que los antagonistas de miostatina que incluyen los pepticuerpos descritos en la presente, pueden contrarrestar la caquexia reumatoide exhibida en los animales de control. Ejemplo 13 Tratamiento de los ratones orquiectom izados El siguiente ejemplo describe el tratamiento de ratones C57B1/6 orquiectomizados con un pepticuerpo ejemplar. Dos grupos de ratones C57B1/6 de edad y peso comparables a seis meses de edad orquiectomizados quirúrgicamente (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fueron tratados con Fe murino, o con el pepticuerpo 2x mTN8-19-21 /muFc (11 animales por grupo). Los dos grupos de ratones fueron inyectados IP con 3 mg/kg pepticuerpo o Fe murino 2x por semana. El tratamiento comenzó 3 semanas después de la cirugía y continuó durante 10 semanas. La representación gráfica de la resonancia magnética nuclear (RMN) fue realizada en cada animal vivo para determinar la masa magra al principio del estudio, a 7 semanas y a 10 semanas. Como puede ser observado en la tabla más adelante, los ratones orquiectomizados tratados con Fe murino comienzan a perder la masa magra en la semana 10. La comparación del grupo orquiectomizado que recibió el pepticuerpo contra el vehículo Fe, indicó que el pepticuerpo mejoró el incremento del peso corporal magro en los animales orquiectomizados en comparación a los animales tratados con Fe murino. Este resultado se muestra en la siguiente tabla.

Además, el tratamiento de ratones orquiectomizados con el pepticuerpo anti-miostatina no dio lugar a un incremento de los niveles de testosterona. Estos resultados muestran que los antagonistas de miostatina tal como los pepticuerpos descritos en la presente, se pueden utilizar para tratar los estados derivados del andrógeno. Ejemplo 14 Reducción de los niveles de TNF-a Los ratones hembra BALB/c, de 8-10 semanas, (Charles River Laboratories, Wilmington , MA) fueron tratados previamente con un control de PBS o 10 mg/kg de pepticuerpo 2x TN8-19- 21/muFc un día antes del desafío de LPS. Hubo 5 animales en cada grupo. El día 1, el LPS (lipopolisacárido de E. coli 055, B5 (sigma) se administró de manera intravenosa a 0.5 mg/kg (10 ug/ratón). Las muestras de suero fueron recolectadas 30 minutos después de la administración de LPS. Los niveles de mTNF-a (factor a de necrosis tumoral) fueron medidos. Los resultados mostraron que los animales tratados previamente con el pepticuerpo habían reducido los niveles de mTNF-a en su sangre. Los animales tratados con PBS tuvieron un promedio de aproximadamente 380 pg/ml de mTNF-a en su sangre. Los animales tratados con el pepticuerpo tuvieron un promedio de solo aproximadamente 120 pg/ml de mTNF-d en su sangre. Esto demostró que los antagonistas de miostatina pueden reducir por lo menos un citocina responsable de la inflamación, contribuyendo así a la efectividad del antagonista al tratar la artritis reumatoide y otros trastornos inmunes. Ejemplo 15 Modelo de diabetes inducida por STZ El propósito de los siguientes experimentos fue determinar los efectos de los antagonistas de miostatina en el modelo animal de diabetes inducida por estreptozotocina (STZ). Además, los experimentos fueron diseñados para determinar si un antagonista de miostatina retrasaría o prevendría el progreso o desarrollo de la nefropatía diabética. El pepticuerpo usado fue 2x mTN8-19-21 unido a un Fe murino (2x mTN8-19-21 /muFc o 2x-21). El vehículo del control fue solamente Fe murino. Diabetes inducida por estreptozotocina Un modelo animal diabético fue creado por la inyección de dosis múltiple bajas de estreptozotocina. Ratones C57B1/6 de ocho semanas de edad fueron adquiridos de Charles River Laboratories. Todos los animales fueron colocados en jaulas individuales durante una semana. Los pesos corporales de los animales fueron medidos y después fueron divididos aleatoriamente en 2 grupos (n = 20/grupo). 20 ratones fueron inyectados con estreptozotocina (STZ, Sigma Co.) de dosis baja a 40 mg/kg (disueltos en 0.1 mi de solución de amortiguador de citrato) durante 5 días consecutivos. Otro grupo de 20 ratones fue inyectado con el vehículo (0.1 mi solución de amortiguador de citrato) durante 5 días consecutivos. Los niveles de glucosa en sangre fueron medidos usando el método de oxidasa de glucosa (Glucometer Elite, Bayer Corp., Elkhart, IN). La inducción de la diabetes fue definida por la medición de los niveles de glucosa en sangre. Los niveles de glucosa en sangre por encima de 11 mmol/l o 200 mg/dl eran fueron considerados como hiperglucemia. Después los ratones normales diabéticos y de misma edad fueron mantenidos durante otros 4 meses. El peso corporal, la ingesta de alimento y los niveles de glucosa en sangre fueron medidos mensualmente. Cuatro meses después de la inyección de STZ, 16 de los 20 ratones desarrollaron la diabetes, y éstos fueron utilizados en estudios posteriores. Los ratones diabéticos fueron divididos en dos grupos de tratamiento de acuerdo a su peso corporal. Los ratones normales de misma edad también fueron divididos en dos grupos de tratamiento. Diseño Experimental Comenzando el día 0, ambos grupos diabéticos fueron inyectados de manera subcutánea con el vehículo (mu-Fc) o 2x mTN8-19-21 a 5 mg/kg, 3 veces por semana durante 6 semanas. El peso corporal y la ingesta de alimento fueron medidos 3 veces por semana. Los ratones no-diabéticos, que no habían sido inyectados con STZ fueron tratados con el vehículo (muFc) y a la misma dosis y al mismo horario durante 6 semanas. Los niveles de glucosa en sangre fueron medidos usando el método de oxidase de glucosa el día 0, día 15, día 30, y al final del estudio. El diseño del estudio se presenta en la siguiente tabla.

Grupo Grupo animal Animal N Tratamiento Dosis horario de duración No No. (mg/kg) dosificación del estudio 1 diabetes de 1-8 8 2xmTN8-19- 5 3x/ 6 STZ 21/muFc semana semanas 2 diabetes de 9-18 8 Vehículo 5 3x/ 6 STZ (muFc) semana semanas 3 Normal 19-24 8 2xmTN8-19- 5 3x/ 6 21/muFc semana semanas 4 Normal 25-32 8 Vehículo 5 3x/ 6 (muFc) semana semanas Para determinar los cambios de las masas magras y grasas en los ratones diabéticos y normales de misma edad tratados con 2x mTN8-19-21 /muFc, el cuerpo de la composición fue medido usando RMN Bruker Minispec (Echo Medical Systems, Houston, TX) al principio (día 0), 2 semanas (día 15), 4 semanas (día 30) y al final del estudio (día 45). Al final del estudio (día 45), los ratones fueron colocados en jaulas metabólicas individuales durante 24 horas para la recolección de orina. El volumen de orina de 24 h fue medido de manera gravimétrica, y la concentración urinaria de albúmina fue determinada con un análisis inmuno-absorbente vicnculado a la enzima usando un kit de análisis de microalbumina-urea murina (Alpha Diagnostics, San Antonio, TX). La función renal fue evaluada calculando el índice de eliminación de creatinina. Los niveles de plasma y creatinina urinaria fueron medidos por un método enzimático (CRE, Mizuho medy, Saga, Japón) usando el auto-analizador Hitachi 717 Clinical Chemestry (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Los niveles del nitrógeno de urea en sangre fueron medidos usando el auto-analizador. Todos los animales fueron sacrificados al finalizar el estudio (día 46). Los ratones fueron sacrificados en una cámara de C02 y las muestras de sangre cardiaca fueron recolectadas y fue realizada la disección del tejido corporal entero. Se tomaron muestras de suero y se almacenaron a -80°C para el análisis de bioquímica. Fueron medidos los niveles de suero de glucosa en sangre, nitrógeno urinario en sangre (BUN), niveles de creatinina. Inmediatamente después del sacrificio, el músculo gastrocnemio, y la masa magra del animal muerto fueron extraídos y pesados. La porción central media del riñon del lado derecho fue fijada con solución del isopentano N2, y se incrusto en parafina. Los trozos fueron teñidos con H&E y PSA (ácido periódico Schiff) para el análisis de las estructuras glomerulares. Los resultados fueron expresados como el promedio ± error estándar del promedio (SEM). La prueba T no par fue realizada para determinar las diferencias estadísticas entre los grupos. La importancia estadística fue considerada cuando el valor p fue de menos de 0.05. Resultados: El peso corporal y la glucosa en sangre cambian en los ratones con diabetes inducida por STZ La inyección STZ a dosis múltiples bajas en base al peso corporal y la glucosa en sangre de los ratones C57B1/6, dio lugar a ratones tratados con STZ que tuvieron niveles significativamente más altos de glucosa en sangre que el grupo de ratones normales de misma edad, el promedio de 20 animales que inician a niveles normales de un promedio de aproximadamente 120 mg/dl azúcar en sangre promedio para 20 animales, aumentó a un promedio de aproximadamente 250-280 mg/dl en la semana 2 después de la inyección de STZ, y hasta entre 350 mg/dl de 8 a 18 semanas después de la inyección. Las diferencias estadísticamente significativas fueron encontradas en los cambios de peso corporal entre el grupo tratado con ST2 y de control a través del período de 4 meses antes de comenzar el tratamiento del pepticuerpo anti-miostatina. El grupo de control ganó constantemente peso corporal, teniendo así un promedio de una ganancia de peso de hasta 40% durante 20 semanas (promedio de 25 g aumentados hasta 34 ó 35 gramos después de 20 semanas), mientras que el grupo STZ ganó poco peso durante el período de 20 semanas, aumentando solo aproximadamente 12 a 14% durante 20 semanas (25 g a aproximadamente 28 ó 29 g después de 20 semanas). El tratamiento de seis semanas con 2x mTN8-19-21 /muFc y vehículo en el tratamiento de ratones diabéticos y normales de misma edad durante 6 semanas dio lugar a un incremento significativamente mayor de peso corporal en ratones diabéticos por STZ tratados con 2x-21 en comparación al grupo diabético tratado con el vehículo. El peso corporal total aumentó hasta aproximadamente 1.5 gramos adicionales para los ratones tratados con STZ que recibieron 2x-21 en comparación a los ratones que recibieron el vehículo. Se presenta el peso corporal delta como los cambios netos del peso corporal después del tratamiento de 6 semanas con 2x mTN8-19-21/muFc o vehículo en comparación con su valor de la línea base respectivo del día 0. Esto se muestra en la Figura 8. El tratamiento de 6 semanas con 2x-21 atenuó significativamente la pérdida de peso corporal en animales diabéticos. Cambios de composición corporal en ratones diabéticos por STZ y normales de misma edad tratados con 2x-21 La masa corporal magra se presente como los cambios netos en la masa corporal magra después del tratamiento de 6 semanas con 2x-21 o vehículo en comparación con sus valores de la línea base del día 0. Estos valores se presentan en la siguiente tabla. El tratamiento con 2x-21 (p<0.05) aumenta significativamente el incremento neto de masa corporal magra en los ratones diabéticos por STZ y normales de misma edad (6.16 ± 0.81 g y 8.56 ± 0.75 g) con respecto a los ratones de control tratados con el vehículo (0.94 ± 1.94 g y 1.60 ± 1.28 g). El % de cambio de la masa grasa representa el cambio neto después del tratamiento de 6 semanas con 2x-21 o vehículo en comparación con sus valores del día 0 de la línea base en cada grupo (ver la segunda tabla más adelante). El % de incremento de masa grasa en ratones diabéticos por STZ no es significativamente diferente del grupo tratado con 2x-21 (-15.60 ± 7.01) y con el vehículo (-21.59 ± 6.84). El tratamiento de 2x-21 disminuyó el incremento neto de masa grasa en los ratones normales de misma edad (-1.53 ± 3.42 contra 7.13 ± 3.38), pero no alcanzó cantidades estadísticamente significativas. Tabla. Efecto de 2X-21 en la masa corporal magra en ratones diabéticos inducidos por STZ y en ratones normales de misma edad (medición de RMN) Masa corporal magra Tratamiento Línea base % de cambio Animal Inyección (g) DO D15 D30 D45 SC 5 mg/kg, 3/semanas ratones Mu-Fc 20.33 ±0.33 (2.85 ± 1.79) (2.50 ± 1.42) (0.94 + 1.93) diabéticos por STZ 2x-21 20.16 + 0.26 (3.7511.34) (6.50 + 0.89)* (6.16 + 0.81)* Ratones Mu-Fc 22.38 + 0.57 (1.82 + 1.18) (3.87 + 1.21) (1.60+ 1.28) C57BU6 normales 2x-21 21.82 ±0.42 (3.15 + 0.74) (7.60 ± 1.05)* (8.56 ± 0.75)* Tabla. Efecto de 2X-21 en la masa corporal grasa en ratones diabéticos inducidos por STZ y en ratones normales de misma edad (medición de RMN) Masa corporal grasa Tratamiento Línea base % de cambio Animal Inyección SC (g) DO D15 D30 D45 5 mg/kg, 3/semanas Ratones Mu-Fc 3.13 ±0.36 (-12.73 ±7.66) (-16.61 ±6.16) (-21.59 ±6.84) diabéticos por STZ 2x-21 2.95 ±0.22 (-15.43 ±4.14) (-14.66 ±6.83) (-15.60 + 7.01) Tratamiento Línea base % de cambio Animal Inyección SC (g) DO D15 D30 D45 5 mg/kg, 3/semanas Ratones Mu-Fc 8.43 + 0.54 (-4.76± 1.10) (1.91 +2.74) (7.13 ±3.38) C57BL/6 normales 2x-21 8.90 ±0.56 (-7.08 + 0.52) (-6.14 + 2.75) (-1.53 ±3.42) Cambios de glucosa en sangre en ratones diabéticos por STZ y normales de misma edad tratados con 2x-21 La siguiente tabla muestra el efecto de 2x mTN8-19-21 /muFc en los cambios de glucosa en sangre en ratones diabético por STZ y normales de misma edad. Los niveles de glucosa en sangre no son significativamente diferentes de los de los grupos tratados con 2x-21 y con el vehículo en ratones diabéticos po rde STZ o normales de misma edad.

Tabla. Efecto de 2X-21 sobre el nivel de glucosa en sangre en ratones diabéticos inducidos por STZ y ratones normales de misma edad Glucosa en sangre Tratamiento Línea base % de cambio Animal Inyección SC (mg/dl) D15 D30 5 mg/kg, DO 3/semanas Ratones Mu-Fc 430.50 ± (5.53 ±7.81) (9.44 ±7.51) diabéticos 19.15 por STZ 2x-21 425.63 ± (6.68 ± 2.26) (-3.70 ± 10.35) 20.99 ratones Mu-Fc 123.50 ± (9.56 ± 1.49) (7.46 ± 5.80) C57BU6 3.26 normales 2x-21 122.88 ± (3.84 ± 2.83) (6.20 ±2.52) 3.75 Peso de riñon/peso corporal: La hiperglucemia en ratones diabéticos por STZ parece estar asociada a la hipertrofia del riñon. La relación de peso corporal a peso de riñon de los ratones diabéticos por STZ fue más alta que aquella en los ratones normales de misma edad (0.98 ± 0.04 contra 0.67 ± 0.02). El tratamiento con 2x-21 durante 6 semanas redujo significativamente la relación de peso de riñón/peso corporal de 0.98 ± 0.04 al valor de 0.84 ± 0.04 (p<0.05) en los ratones diabéticos tratados con el vehículo. índice de eliminación de creatinina Hubo una tendencia de que los ratones diabéticos aumenten el índice de eliminación de creatinina en comparación con los ratones normales no diabéticos de control (Figura 9). El índice promedio de eliminación de creatinina de ratones diabéticos fue dos veces más alto que el de los ratones normales de misma edad. El tratamiento con 2x-21 disminuyó el índice de eliminación de creatinina en los ratones diabéticos en comparación con los ratones diabéticos tratados con vehículo según lo mostrado en la Figura 9, indicando así la función del riñon. Volumen de orina de 24 horas y excreción de albúmina urinaria: La excreción albúmina urinaria y el volumen de orina de 24 horas son biomarcadores muy importantes en la determinación de la lesión renal durante la primera etapa de la nefropatía diabética. Los resultados demostraron que la excreción de albúmina urinaria (Figura 10A) y los volúmenes de orina de 24 horas fueron incrementados en ratones diabéticos por STZ con respecto a ratones normales de misma edad. El tratamiento con 2x-21 disminuyó los niveles de albúmina urinaria en ratones diabéticos y también redujo los volúmenes de orina de 24 horas (Figura 10B). Esto demostró una normalización de la función del ri ñón . La administración de la pepticuerpo de miostatina 2x mTNF8-19-21 /muFc atenuó la pérdida de peso corporal y preservó significativamente la masa muscular esquelética y la masa corporal magra en ratones diabéticos inducidos pro STZ. Además de un incremento del músculo esquelético y de la masa magra, 2x mTN8-19-21/rnuFc atenuó la hipertrofia de riñon, aumentó el índice de eliminación de creatinina y redujo el volumen de orina de 24 horas y la excreción de albúmina urinaria en ratones diabéticos inducidos por STZ. Esto muestra la función mejorada del riñon en la primera etapa de desarrollo de la nefropatía diabética. Ejemplo 16 Efectos del antagonista de míostatina en un modelo murino de caquexia inducida por quimioterapia con 5-fluorouracilo El compuesto de 5-fluorouracilo (5-Fu) se utiliza comúnmente como agente terapéutico en pacientes con cáncer colorrectal, de mama, estómago o pancreático. Un efecto secundario de la terapia con 5-Fu es la pérdida peso corporal y atrofia muscular. Se investigó El beneficio terapéutico potencial de la terapia con el antagonista anti-miostatina en el tratamiento de la caquexia inducida por 5-Fu. El pepticuerpo usado fue 2x mTN8-19-21 /muFc (también designado como 2x-21) o 2x mTN8-19-21 unido a un Fe murino. El vehículo de control fue solo Fe murino. En este estudio, los ratones macho C57B1/6 normales fueron dividido en 4 grupos (n = 24) y se sometieron a una administración intraperitoneal (IP) de 5-Fu (45 a 50 mg/kg) o de solución amortiguadora de fosfato del vehículo (PBS) durante 5 días consecutivos (día 0 a día 4). Dos grupos fueron penetrados con 2x21, a 10 mg/kg dos veces a la semana, comenzando en a las 2 semanas (día-13) o 1 semana (día-6) antes de que el tratamiento con 5-Fu comenzara (el día 0), y continuaron después del tratamiento con 5-Fu al final del estudio el día 24. El peso corporal, la masa corporal magra, y la ingesta de alimento fueron monitoreados dos veces por semana o con más frecuencia antes y después la terapia con 5-Fu. El suero fue recolectado 0, 2, 24, 96, 168, 336 horas después de la última dosificación del estudio terminal. El día 0 y antes de la terapia con 5-FU, los cambios promedios del peso corporal de los grupos tratados previamente con 2x21 durante 1 ó 2 semanas, fueron de 12.6% y 13.9%, respectivamente, en comparación con 6.4% para el grupo de control con 5-Fu (ambos p < 0.0001). Esto fue paralelo al incremento del 14.7% y 16.2% de la masa corporal magra en los grupos tratados previamente durante 1 ó 2 semanas con el pepticuerpo en comparación con el incremento del 7.4% en solamente el grupo con 5-Fu (p = 0.001 y p < 0.0001). En el día 6 después de la dosificación de 5-Fu, los cambios del peso corporal de los grupos tratados previamente con 2x21 durante 1 ó 2 semanas fueron de -1.9% y -1.4% en comparación con -8.6% solo del grupo con 5-Fu (ambos valores fueron p < 0.0001); la masa corporal magra cambió a -1.3% y a -0.9% en comparación con -8.8% solo del grupo con 5-FU (ambos valores de p < 0.0001). El día 8 durante la recuperación, los cambios del peso corporal de los grupos tratados previamente con 2x21 durante 1 ó 2 semanas aumentaron significativamente a 6.8% y 8.5%, respectivamente, en comparación a un incremente del 0.6% en el grupo con 5-Fu (p = 0.0006 y p < 0.0001). Simi larmente, la masa corporal magra cambió a 4.9% y a 6.0% en los grupos tratados previamente con 2x21 durante 1 ó 2 semanas en comparación a -3.3% para solo el grupo con 5-Fu (p = 0.001 y p 0.0001 respectivamente). Los resultados se presentan brevemente en la figura 11.

Del día 8 al día 24, casi todos los ratones desarrollaron una neutropenia severa y algunos ratones murieron debido a los efectos secundarios severos. Los índices de supervivencia para los grupos tratados previamente con 2x21 durante 1 ó 2 semanas antes de la administración de 5-Fu fueron de 46%, en comparación con el índice de supervivencia de 13% solamente para el grupo con 5-Fu (p = 0.001 y p = 0.009, respectivamente). Los resultados de la supervivencia se presentan brevemente en la Figura 12.

El análisis estadístico usando los métodos de medición repetida ANOVA, indicó que los grupos tratados previamente con el pepticuerpo 2x21 durante 1 ó 2 semanas antes del tratamiento con 5-Fu, tuvieron un peso corporal y una masa corporal magra significativamente más altos a través del transcurso del estudio, el día 13 al día 8, en comparación al grupo tratado con 5-Fu solamente (los valores p para ambos fueron de menos de 0.0001).

Los resultados de este estudio mostraron que el tratamiento previo con el pepticuerpo anti-miostatina, 2x21, a 10 mg/kg dos veces semanalmente, durante 1 ó 2 semanas fue efectivo en el mejoramiento significativo de la pérdida de peso corporal y la atrofia muscular inducidas por 5-Fu en los ratones C57B1/6. Además, el tratamiento previo con el pepticuerpo aumentó el índice de supervivencia y la duración de la respuesta a la quimioterapia con 5-Fu. Por lo tanto, los antagonistas de miostatina tal como los agentes de unión de miostatina de la presente invención pueden utilizarse antes y durante el tratamiento con quimioterapéuticos u otros agentes químicos para prevenir o mejorar la caquexia química. El alcance de la presente invención no se debe limitar a las modalidades específicas descritas en la presente, que tienen el propósito solamente de ser ilustrativas de los aspectos individuales de la invención, y los métodos y componentes funcionalmente equivalentes son la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de los dibujos anexos. Tales modificaciones tienen el propósito de estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar los efectos del hipogonadismo en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable al sujeto.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el hipogonadismo resulta de terapia de privación de andrógeno.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el hipogonadismo resulta de la disminución relacionada a la edad del funcionamiento gonadal.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia CbibgWbaWMCPP (SEC ID NO: 353), en donde se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F -(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L )c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, en donde el agente de unión tiene la estructura: -(L1)c-P1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y se seleccionan independientemente de las SEC ID NO: 305 a la 351 y de la SEC ID NO: 357 a la 454; en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno de a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

8. Un método para tratar la caquexia debido a la artritis reumatoide en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

10. El método de la reivindicación 8, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia Cbib?WbaWMCPP (SEC ID NO: 353), en donde b-\ se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

11. El método de la reivindicación 8, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1)a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1 )c-P1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P , P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y en donde L , L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

12. El método de la reivindicación 8, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1)a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L )c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P -(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4) P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y se seleccionan independientemente de la SEC ID NO: 305 a 351 y de la SEC ID NO: 357 a 454; en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

13. Un método para tratar los efectos del síndrome de Prader-Willy en un sujeto que padece tal condición, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

15. El método de la reivindicación 13, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia Cbib?WbaWMCPP (SEC ID NO: 353), en donde b-? se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

16. El método de la reivindicación 13, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F -(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L )c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L )c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, en donde L , L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno de a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

17. El método de la reivindicación 13, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P -(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P -(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y se seleccionan independientemente de la SEC ID NO: 305 a 351 y de la SEC ID NO: 357 a 454; en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

18. Un método para tratar la caquexia debida a lesiones por quemadura en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-1 , proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

20. El método de la reivindicación 18, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia Cbib?WbsWMCPP (SEC ID NO: 353), en donde bi se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

21. El método de la reivindicación 18, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F -(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno de a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

22. El método de la reivindicación 18, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P -(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L )f-P4; en donde P , P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y se seleccionan independientemente de la SEC ID NO: 305 a 351 y de la SEC ID NO: 357 a 454; en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

23. Un método para tratar la caquexia debida a la diabetes en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

24. El método de la reivindicación 23, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

25. El método de la reivindicación 23, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia (SEC ID NO: 353), en donde se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

26. El método de la rei indicación 23, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P -(L )d-P2-(L3)e-P3; y -(L )c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno de a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

27. El método de la reivindicación 23, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P -(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L )c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P , P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y se seleccionan independientemente de la SEC ID NO: 305 a 351 y de la SEC ID NO: 357 a 454; en donde L , L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

28. Un método para tratar la nefropatía diabética en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

29. El método de la reivindicación 28, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

30. El método de la reivindicación 28, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia Cbib?Wb.WMCPP (SEC ID NO: 353), en donde bi se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

31. El método de la reivindicación 28, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1)a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L )c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno de a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

32. El método de la reivindicación 28, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F -(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P , P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y se seleccionan independientemente de la SEC ID NO: 305 a 351 y de la SEC ID NO: 357 a 454; en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

33. Un método para tratar la caquexia debida al tratamiento con un agente quimioterapéutico en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

34. El método de la reivindicación 33, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

35. El método de la reivindicación 33, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia Cbib?Wb¾WMCPP (SEC ID NO: 353), en donde b-¡ se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

36. El método de la reivindicación 33, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X )a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L )c-P -(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno de a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

37. El método de la reivindicación 33, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X )a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P -(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L )f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatína, y se seleccionan independientemente de la SEC ID NO: 305 a 351 y de la SEC ID NO: 357 a 454; en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

38. Un método para tratar el TNF-a excesivo en un sujeto que padece una condición inflamatoria, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de miostatina en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

39. El método de la reivindicación 38, en donde el antagonista de miostatina se selecciona del grupo que consiste de folistatina, prodominio de miostatina, prodominio de GDF-11, proteínas de fusión de prodominio, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen la miostatina, anticuerpos antagónicos o fragmentos de anticuerpo que unen el receptor IIB de tipo activina, receptor IIB soluble de tipo activina, proteínas de fusión del receptor IIB soluble de tipo activina, análogos de miostatina solubles, oligonucleótidos, moléculas pequeñas, peptidomiméticos, y agentes de unión de miostatina.

40. El método de la reivindicación 38, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente comprende por lo menos un péptido capaz de unir la miostatina, en donde el péptido comprende la secuencia CbibgWbaWMCPP (SEC ID NO: 353), en donde b^ se selecciona de los aminoácidos T, I, o R; b2 se selecciona de R, S, Q; b3 se selecciona de P, R y Q, y en donde el péptido es de entre 10 y 50 aminoácidos de longitud, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

41. El método de la reivindicación 38, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1)a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1; -(L )c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L )f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno de a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

42. El método de la reivindicación 38, en donde el antagonista de miostatina es un agente de unión de miostatina, y en donde el agente tiene la estructura: (X1 )a-F1-(X2)b, multímeros del mismo; en donde F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de -(L1)c-P1-(L2)d-P2; -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L )f-P4; en donde P1, P2, P3, y P4 son péptidos capaces de unir la miostatina, y se seleccionan independientemente de la SEC ID NO: 305 a 351 y de la SEC ID NO: 357 a 454; en donde L1, L2, L3, y L4 son cada uno enlaces; y a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición que por lo menos uno a y b sea 1, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.