CN104725512A - 增加肌肉生长的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是抗激活素受体IIB(ActRIIB)抗体的领域。具体而言，其涉及所述抗体用于治疗肌肉病症，如因疾病或废用引起的肌肉萎缩的用途。

Description

增加肌肉生长的组合物和方法
本申请是申请日为2010年4月23日、发明名称为“增加肌肉生长的组合物和方法”的中国专利申请201080018660.2(国际申请号PCT/EP2010/055458)的分案申请。
技术领域
本发明是抗激活素受体IIB(ActRIIB)抗体的领域。具体而言，其涉及所述抗体治疗肌肉病症，如疾病或废用引起的肌肉萎缩的用途。
背景技术
激活素是二聚体生长和分化因子，其属于结构相关的信号蛋白质的转化生长因子β(TGF-β)超家族。激活素通过受体丝氨酸激酶的异二聚体复合体进行信号传递，所述受体丝氨酸激酶包括至少两种类型I(I和IB)和两种类型II(II和IIB、aka ACVR2A和ACVR2B)受体。这些受体都是跨膜蛋白质，其由具有富含半胱氨酸区的配体结合胞外域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的细胞质结构域组成。类型I受体对信号转导至关重要，类型II受体为结合配体和表达类型I受体所需。类型I和II受体在配体结合后形成稳定的复合体，导致类型II受体将类型I受体磷酸化。
激活素受体II B(ActRIIB)是肌肉抑制素(myostatin)的受体。肌肉抑制素与该受体之间的相互作用通过Smad依赖型途径调节骨骼肌分化的抑制。因此，通过抑制或防止肌肉抑制素结合ActRIIB，可以诱导骨骼肌的形成。
多个研究小组已经关注到了这个问题。Bogdanovich等(Nature，2002，420：418-421)描述了抗肌肉抑制素抗体能够阻断肌肉抑制素，导致进行性假肥大性肌营养不良的小鼠模型中肌肉质量增加。Bradley等(Cell Mol.LifeSci.2008，65：2119-2124)已经概述了调节肌肉抑制素/ActRIIB相互作用的不同的可用方法，包括前述抗肌肉抑制素抗体、通过施用肌肉抑制素前肽抑制成熟肌肉抑制素的释放、施用促滤泡素抑制素以阻断肌肉抑制素受体、施用HDAC抑制剂以诱导促滤泡素抑制素产生、施用防止肌肉抑制素结合受体的改变的肌肉抑制素肽和施用肌肉抑制素的可溶性诱饵受体。
尽管具有这些可能的治疗，却不能获得用于治疗患者的产品。实际上，最近一个公司取消了其抗肌肉抑制素抗体项目。
因此需要增加患者中肌肉质量和强度的方法。
发明内容
已经发现，针对ActRIIB受体的抗体可防止肌肉抑制素结合受体，因此防止Smad-依赖型途径对肌肉分化的抑制。这导致患者中肌肉质量和强度的增加。
因此，一方面，本发明提供抗ActRIIB抗体，或包含所述抗体的抗原结合部分的功能蛋白质。在一个实施方案中，所述ActRIIB是人ActRIIB。在SEQ ID NO：181(AAC64515.1，GI：3769443)中描述了人ActRIIB的多肽序列。在一个实施方案中，抗体或功能蛋白质来自哺乳动物，其具有如人或骆驼(camelid)起源。因此，抗体可以是嵌合的、人的或人源化的抗体。在特定实施方案中，抗ActRIIB抗体特征在于具有抗原结合区，其对靶蛋白质ActRIIB特异并结合ActRIIB或ActRIIB的片段。优选地，所述抗体适合用于治疗。
在一个实施方案中，本发明的抗体是没有或具有低拮抗活性的ActRIIB拮抗剂。在另一实施方案中，抗体或功能片段结合靶蛋白质ActRIIB并降低肌肉抑制素与ActRIIB的结合至基础水平。在该实施方案的一个方面，抗体或功能片段减少结合ActRIIB的肌肉抑制素的量。在该实施方案的另一方面，抗体或功能片段完全阻止肌肉抑制素结合ActRIIB。在其他实施方案中，抗体或功能片段抑制Smad激活。在其他实施方案中，抗体或功能片段抑制激活素受体类型IIB通过Smad-依赖性途径介导的肌肉抑制素诱导的骨骼肌分化抑制。
可通过一种或多种测定法来确定结合，所述测定法用于测量抗体的拮抗作用或激动作用的活性。优选地，测定法测量抗体对ActRIIB的至少一种作用，其包括：通过ELISA抑制肌肉抑制素结合ActRIIB、抑制肌肉抑制素诱导的信号转导(例如通过Smad依赖型受体基因测定)、抑制肌肉抑制素诱导的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素诱导的骨骼肌细胞分化抑制(例如通过肌酸激酶测定)。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合ActRIIB的肌肉抑制素结合区(即配体结合域)的抗体。该配体结合结构域由SEQ ID NO：181的19-134位氨基酸组成，并在本文中指定为SEQ ID NO：182。
在一个实施方案中，抗体以100nM或更低、10nM或更低、1nM或更低的KD结合ActRIIB。优选地，本发明的抗体以100pM或更低(即100pM、50pM、10pM、1pM或更低)的亲和力结合ActRIIB。在一个实施方案中，本发明的抗体以10到20pM的亲和力结合ActRIIB。
在一个实施方案中，本发明的抗体不与ActRIIB相关蛋白质交叉反应，并且更特别地不与人ActRIIA(NP_001607.1，GI：4501897)交叉反应。
在一个实施方案中，本发明的抗体优先结合ActRIIB，而非ActRIIA。在一个实施方案中，本发明的抗体以比它们结合ActRIIA高5倍，更优选10倍，更优选50倍，更优选100倍的亲和力结合ActRIIB。
在一个实施方案中，本发明的抗体以100pM或更高(即250pM、500pM、1nM、5nM或更高)的亲和力结合ActRIIA。
在一个实施方案中，本发明的抗体是IgG2同种型抗体。
在另一实施方案中，本发明的抗体是IgG1同种型抗体。在其他实施方案中，本发明的抗体是IgG1同种型抗体，并通过Fc区突变而具有改变的效应功能。在一个实施方案中，所述改变的效应功能是降低的ADCC和CDC活性。在一个实施方案中，所述改变的效应功能是沉默的ADCC和CDC活性。
在另一相关实施方案中，本发明的抗体是完全人或人源化IgG1抗体，其没有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性或CDC活性，并且结合由SEQ IDNO：181的19-134位氨基酸组成的ActRIIB区。
在另一相关实施方案中，本发明的抗体是完全人或人源化IgG1抗体，其具有降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性或CDC活性，并且结合由SEQ ID NO：181的19-134位氨基酸组成的ActRIIB区。
本发明涉及分离的抗体，特别是人或人源化抗体，其抑制肌肉抑制素结合ActRIIB，并在体外和体内激活骨骼肌分化。在某些实施方案中，本发明的抗体来自特定的重链和轻链序列和/或包含特定的结构特征，如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备此类抗体的方法、包含此类抗体的免疫缀合物和多价或多特异性分子和含有本发明抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用所述抗体抑制，即拮抗ActRIIB功能的方法，以抑制Smad激活并由此诱导骨骼肌分化，例如导致对病理学病症的治疗。
病理学病症可以是肌骨骼疾病或病症，如肌肉萎缩。肌肉萎缩有许多原因，包括利用糖皮质激素，如氢化可的松、地塞米松、倍他米松、泼尼松、甲基氢化泼尼松或泼尼松龙治疗引起。肌肉萎缩也可以是神经外伤导致去神经的结果或变性、代谢或炎性神经病(例如，吉-巴综合征、周围神经病或暴露于环境毒素或药物)的结果。
此外，肌肉萎缩可以由以下引起：肌病，如肌强直；先天性肌病，包括线状体肌病、多/小核肌病和肌管(中央核性)肌病；线粒体性肌病；家族性周期性麻痹；炎症性肌病；代谢性肌病，如糖原或脂质积累病引起的；皮肌炎；多发性肌炎；包含体肌炎；骨化性肌炎；横纹肌溶解和肌红蛋白尿。
肌病可以由肌营养不良综合征，如迪谢纳肌营养不良、贝克肌营养不良、强直性肌营养不良、面-肩-肱型肌营养不良、埃-德肌营养不良、眼咽型肌营养不良、肩肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、福山型肌营养不良、先天性肌营养不良或遗传性远端肌病引起。肌骨骼肌病也可以是骨质疏松症、骨折、身材矮小症或侏儒症。
此外，肌肉萎缩可以由以下引起：成人运动神经元病、婴儿脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧索硬化、幼年期脊髓性肌萎缩、具有多病灶传导阻断的自身免疫性运动神经病、因中风或脊髓损伤引起的麻痹、因创伤、延长的卧床休息、自愿的不活动、非自愿的不活动引起的骨骼固定化、代谢性应激或营养不足、癌症、AIDS、禁食、甲状腺病症、糖尿病、良性先天性肌紧张低下症、中央核疾病、烧伤、慢性阻塞性肺疾病、肝病(实例，如纤维化、肝硬化)、脓毒症、肾衰竭、充血性心力衰竭、衰老、宇宙飞行或零重力环境中时间消耗。
可治疗的年龄相关性状况的实例包括，少肌症、皮肤萎缩、肌萎缩、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松症、骨关节炎、无免疫活性、高血压、痴呆、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏病、白内障、年龄相关性黄斑变性、前列腺癌、中风、减少的预期寿命、脆弱、记忆丧失、皱纹、损伤的肾功能和年龄相关性听力损失；代谢性疾病，包括II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖症。
可用本发明抗体治疗的其他状况包括急性和/或慢性肾脏疾病或衰竭、肝纤维化或肝硬变、癌症如乳腺癌、帕金森病；与神经死亡相关的状况，如ALS、脑萎缩或痴呆和贫血。
其他状况包括恶病质、与风湿性关节炎相关的恶病质和与癌症相关的恶病质。
迄今为止，已经开发了很少可靠或有效的治疗法来治疗这些病症。
基于激活素结合受体中的ActRIIB(Werner和Alzheimer，CytokineGrowth Factors Rev 2006，17(3)：157-171)促进肝、肾和肺纤维化的作用和肌肉抑制素、激活素或ActRIIB在癌症中的作用(Tsuchida等，Endo J，2008，55(1)：11-21)的报道证据，本发明的抗体可用于治疗肝、肾、肺纤维化和癌症，例如但不限于横纹肌肉瘤、骨丢失诱导癌、肝细胞癌、胃肠癌。
预防可以是完全的，例如年龄相关性状况或代谢性病症的完全缺失。预防也可以是部分的，以便受试者与不接受本发明抗体的受试者相比，发生年龄相关性状况或代谢性病症的可能性不太可能发生。
为了更容易地理解本发明，首先定义某些术语。在详述中阐明额外的定义。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致从人体选择性损伤、破坏或消除入侵的病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌性细胞，或在自身免疫或病理学炎症的情况下，正常人细胞或组织。
“信号转导途径”或“信号转导活性”指一般由蛋白质-蛋白质相互作用，如生长因子结合受体起始的生物化学因果关系，导致信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分。一般而言，传递包括在引起信号转导的一系列反应中，一个或多个蛋白质上一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。次末端过程通常包括核事件，导致基因表达的改变。
术语ActRIIB或Act IIB受体指SEQ ID NO：181(AAC64515.1，GI：3769443)中定义的人ActRIIB。研究级的多克隆和单克隆抗ActRIIB抗体为本领域所知，如R&DMN，USA制备的那些。先前未曾描述过治疗性抗ActRIIB抗体。当然，可针对来自其他物种的ActRIIB产生抗体，并且其可用于治疗那些物种中的病理学状况。
本文参考的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。天然发生的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，它们散布着称为构架区(FR)的更保守的区域。每一VH和VL由以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一个组分(Clq)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)指全长抗体或抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如ActRIIB的部分)的能力。已经显示，可由全长抗体的片段执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”包括的结合片段的实例包括Fab片段，其为VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段、F(ab)2片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等，1989Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可以使用重组方法，通过合成的接头将它们连接起来，所述合成的接头使得它们制备成单条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参阅例如Bird等，1988 Science 242：423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合区”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的有效性。
如本文所用，术语“分离的抗体”指抗体，其基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异性结合ActRIIB的分离的抗体基本不含特异性结合除ActRIIB外的抗原的抗体)。然而，特异性结合ActRIIB的分离抗体与其他抗原，如来自其他物种的ActRIIB分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学品。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单个分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区均来自人来源序列。此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区也来自该人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有来自例如Knappik等(2000.J Mol Biol 296，57-86)中描述的人构架序列分析的共有构架序列的抗体。
本发明的人抗体可包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物物种，如小鼠的种系的CDR序列已经移植到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体，在所述可变区中构架和CDR区均来自人序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，其包括从转基因非人动物，例如转基因小鼠中获得的B细胞，所述转基因非人动物具有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其中制备的杂交瘤中分离的抗体、从经转化以表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体、从重组的组合人抗体文库分离的抗体和通过任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体，所述任何其他手段涉及将全部或部分人免疫球蛋白基因、序列剪接成其他DNA序列。此类重组人抗体具有可变区，其中构架和CDR区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中，此类重组人抗体可进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管来自并与人种系VH和VL序列相关，但是可能在体内人抗体种系所有组成成分中不天然存在的序列。
如本文所用，“同种型”指重链恒定区基因提供的抗体类型(例如，IgM、IgE、IgG，如IgG1或IgG2)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
如本文所用，“特异性结合ActRIIB多肽”的抗体旨在指以100nM或更低、10nM或更低、1nM或更低的KD结合人ActRIIB多肽的抗体。“与除ActRIIB以外的抗原交叉反应”的抗体旨在指以10x 10-9M或更低、5x10-9M或更低、或2x 10-9M或更低的KD结合抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体旨在指以1.5x 10-8M或更高的KD、或5-10x 10-8M或1x 10-7M或更高的KD结合抗原的抗体。在某些实施方案中，不与抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测定中显示基本上检测不到针对这些蛋白质的结合。可使用生物传感器系统，如系统，或溶液平衡滴定测定KD。
如本文所用，术语“拮抗剂抗体”旨在指在肌肉抑制素存在下抑制ActRIIB诱导的信号转导活性的抗体。检测这种抑制的测定的实例包括抑制肌肉抑制素诱导的信号转导(例如通过Smad依赖型报告基因测定)、抑制肌肉抑制素诱导的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素诱导的骨骼肌细胞分化抑制(例如通过肌酸激酶测定)。
在一些实施方案中，如在Smad依赖型报告基因测定中测量的，抗体以10nM或更低、1nM或更低，或100pM或更低的IC50抑制肌肉抑制素诱导的信号转导。
如本文所用，“没有激动活性”的抗体旨在指在基于细胞的测定中缺少肌肉抑制素下不显著增加ActRIIB介导的信号转导活性的抗体，如抑制肌肉抑制素诱导的信号转导(例如通过Smad依赖型报告基因测定)、抑制肌肉抑制素诱导的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素诱导的骨骼肌细胞分化抑制(例如通过肌酸激酶测定)。在下文实施例中更详细地描述了此类测定。
如本文所用，术语“Kassoc”或“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的结合常数，而如本文所用术语“Kdis”或“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。如本文所用，术语“KD”旨在指解离常数，其获得自Kd与Ka(即Kd/Ka)的比值，并表示为摩尔浓度(M)。可使用本领域成熟的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法是通过使用表面等离振子共振，如的生物传感器系统，或溶液平衡滴定(SET)(参阅Friguet B等(1985)J.Immunol Methods；77(2)：305-319，和Hanel C等(2005)AnalBiochem；339(1)：182-184)。
如本文所用，术语“亲和力”指在单一抗原位点上抗体与抗原之间的相互作用的强度。在每一抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在多个位点上相互作用；相互作用越强，亲和力越大。
如本文所用，术语“亲合力”指抗体-抗原复合体的总稳定性或强度的信息性量度。其由三个主要的因素控制：抗体表位亲和力；抗原和抗体的效价；和相互作用部分的结构排列。最终，这些因子定义了抗体的特异性，即，特定抗体结合精确的抗原表位的可能性。
如本文所用，术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒性”活性指人B细胞消耗活性。可通过本领域已知的人B细胞消耗测定测量ADCC活性。
为了得到更高亲合力的探针，可构建二聚缀合物(偶联FACS标记的两个分子抗体蛋白质)，因此使得通过FACS更容易检测低亲和力相互作用(如与种系抗体的相互作用)。此外，增加抗原亲合力的另一手段包括产生抗ActRIIB抗体的本文描述的任何构建体的二聚体、三聚体或多聚体。可通过单个模块之间的共价结合，例如通过模仿天然的C到N末端结合或通过模仿抗体二聚体(其通过恒定区结合在一起)产生此类多聚体。改造成Fc/Fc界面的键可以是共价键或非共价键。此外，二聚化或多聚化配偶体而非Fc可用于ActRIIB杂合体中，以产生此类更高级的结构。例如，可以使用多聚化结构域，如WO2004/039841中描述的三聚化结构域或WO98/18943中描述的五聚化结构域。
如本文所用，术语对抗体的“选择性”指抗体结合某些靶多肽，但不结合紧密相关的多肽。
如本文所用，术语对抗体的“高亲和力”指抗体对靶抗原具有1nM或更低的KD。如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。
术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
如本文所用，术语“优化的”表示已经改变了核苷酸序列以使用在生产细胞或生物，一般是真核细胞，例如毕赤酵母(Pichia)的细胞、木霉(Trichoderma)的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞优选的密码子编码氨基酸序列。改造优化的核苷酸序列，以保留完整的或尽可能多的由初始核苷酸序列编码的氨基酸序列，初始核苷酸序列也称为“亲本”序列。已经改造了本文的优化序列，以具有CHO哺乳动物细胞中优选的密码子，然而本文也考虑这些序列在其他真核细胞中的优化表达。优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
在下文部分中进一步详细描述了本发明的多个方面。
评估抗体对多种物种的ActRIIB的结合能力的标准测定为本领域所知，包括例如EILSA、western印迹和RIA。在实施例中详细描述了合适的测定。也可通过本领域已知的标准测定，如通过Biacore分析或溶液平衡滴定评估抗体的结合亲和力。基于表面等离振子共振的技术，如Biacore可测定结合动力学，其允许计算结合亲和力。在实施例中进一步详细描述了评估抗体对ActRIIB的功能性质的影响(例如受体结合、预防或诱导人B细胞增殖或IgG产生)的测定。
因此，如根据本领域已知的和本文描述的方法学测定的，抗体“抑制”一种或多种这些ActRIIB功能性质(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物活性等)将被理解为涉及相对于在缺少所述抗体(例如，或当存在无关的特异性的对照抗体时)见到的特定活性，抗体的特定活性统计学上的显著降低。抑制ActRIIB活性的抗体实现测定的参数至少10％，至少50％、80％或90％这种统计学上的显著降低，并且在某些实施方案中，本发明的抗体可抑制高于95％、98％或99％的ActRIIB功能活性。
术语“交叉阻断”、“交叉阻断的”和“交叉阻断”在本文互换使用，以表示抗体或其他结合剂在标准竞争结合测定中干扰其他抗体或结合剂与ActRIIB，特别是配体结合域的结合的能力。
可使用标准的竞争结合测定来测定抗体或其他结合剂能够干扰另一抗体或结合分子与ActRIIB结合的能力或程度，并因此测定是否可以说成是本发明的交叉阻断。一种合适的测定包括使用Biacore技术(例如，通过使用BIAcore仪器(Biacore，Uppsala，Sweden))，其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉阻断的另一测定使用基于ELISA的方法。其他测定使用FACS分析，其中检测多种抗体结合ActRIIB表达细胞的竞争(如实施例中描述)。
根据本发明，在描述的BIAcore交叉阻断测定中交叉阻断抗体或本发明的其他结合剂结合ActRIIB，使得抗体或结合剂的组合(混合物)的记录结合在组合的两个抗体或结合剂的最大理论结合的80％到0.1％(例如80％到4％)，尤其是在最大理论结合的75％到0.1％(例如75％到4％)，并且最特别是在最大理论结合(如上文定义)的70％到0.1％(例如70％到4％)，最特别是65％到0.1％(例如65％到4％)之间。
当与阳性对照孔(即，同一抗ActRIIB抗体和ActRIIB，但没有“测试”交叉阻断抗体)相比时，如果测试抗体能够引起抗ActRIIB抗体结合ActRIIB降低60％到100％，尤其是70％到100％，并更尤其是80％到100％，那么抗体在ELISA测定中定义为交叉阻断本发明的抗体ActRIIB抗体。本文引用的交叉阻断抗体的实例是MOR08159和MOR08213。因此，本发明提供交叉阻断MOR08159或MOR08213结合ActRIIB的抗体。
重组抗体
本发明的抗体包括如实施例中描述的分离的和结构上表征的人重组抗体。在SEQ ID NOs：99-112中显示了本发明的分离抗体的VH氨基酸序列。分别在SEQ ID NOs：85-98中显示了本发明的分离的抗体的VL氨基酸序列。在SEQ ID NOs：146-150和156-160中显示了本发明抗体的优选全长重链氨基酸序列的实例。分别在SEQ ID NOs：141-145和151-155中显示了本发明抗体的优选全长轻链氨基酸序列的实例。本发明的其他抗体包括这样的氨基酸，已经通过氨基酸缺失、插入或替换进行了突变，但在CDR区仍与上文描述的序列中描述中CDR区具有至少60、70、80、90、95、97或99百分比同一性。在一些实施方案中，其包括突变体氨基酸序列，其中当与上文描述的序列中描述的CDR区相比时，已经在CDR区通过氨基酸缺失、插入或替换突变了不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
此外，在SEQ ID NOs：127-140中显示了可变重链亲本核苷酸序列。在SEQ ID NOs：113-126中显示了可变轻链亲本核苷酸序列。在SEQ IDNOs：161-165和171-175中显示了经优化用于在哺乳动物细胞中表达的全长轻链核苷酸序列。在SEQ ID NOs：166-170和176-180中显示了经优化用于在哺乳动物细胞中表达的全长重链核苷酸序列。本发明的其他抗体包括已经突变，但仍然与上文描述的序列具有至少60或更高(即，80、90、95、97、99或更多)百分比同一性的氨基酸或核酸。在一些实施方案中，其包括突变体氨基酸序列，其中当与上文描述的序列中描述的可变区比较时，已经在可变区中通过氨基酸缺失、插入或替换突变了不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
因为每一这些抗体结合同一表位，并且是来自同一亲本抗体的后代，VH、VL、全长轻链和全长重链序列(核苷酸序列和氨基酸序列)可“混和并匹配”以产生本发明的其他抗ActRIIB结合分子。可使用上文和实施例中描述的结合测定(例如，ELISA)检测此类“混和并匹配的”抗体的ActRIIB结合。当这些链混和并匹配时，应该用结构类似的VH序列替换来自特定VH/VL配对的VH序列。同样，应该用结构类似的全长重链序列替换来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列。同样，应该用结构类似的VL序列替换来自特定VH/VL配对的VL序列。同样，应该用结构类似的全长轻链序列替换来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列。因此，一方面，本发明提供分离的重组抗ActRIIB抗体或其抗原结合区，其具有：包含选自SEQ ID NOs：99-112的氨基酸序列的重链可变区；和包含选自SEQ ID NOs：85-98的氨基酸序列的轻链可变区。
另一方面，本发明提供：
(i)分离的重组抗ActRIIB抗体，其具有：包含选自SEQ IDNOs：99-112的氨基酸序列的全长重链；和包含选自SEQ ID NOs：85-98的氨基酸序列的全长轻链，或
(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
另一方面，本发明提供：
(i)具有全长重链和全长轻链的分离的重组抗ActRIIB抗体，所述全长重链由已经优化用于在哺乳动物细胞中表达的选自SEQ IDNOs：127-140的核苷酸序列编码，所述全长轻链由已经优化用于在哺乳动物细胞中表达的选自SEQ ID NOs：113-126的核苷酸序列编码，或
(ii)包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
在SEQ ID NOs：1-14中显示了抗体的VH CDR1s的氨基酸序列。在SEQ ID NOs：15-28中显示了抗体的VH CDR2s的氨基酸序列。在SEQ IDNOs：29-42中显示了抗体的VH CDR3s的氨基酸序列。在SEQ ID NOs：43-56中显示了抗体的VL CDR1s的氨基酸序列。在SEQ ID NOs：57-70中显示了抗体的VL CDR2s的氨基酸序列。在SEQ ID NOs：71-84中显示了抗体的VL CDR3s的氨基酸序列。使用Kabat系统(Kabat，E.A.，等，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)描述了CDR区。确定CDR区的备选方法使用Chothia设计的方法(Chothia等1989，Nature，342：877-883)。Chothia定义是基于结构环区的位置。然而，因为Chothia使用的编号系统的改变(参阅例如，http：//www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/abs/GeneralInfo.html和http：//www.bioinf.org.uk/abs/)，目前不太经常使用该系统。存在定义CDR的其他系统，并在这两个网站上提及了这些系统。
如何每一这些抗体可结合ActRIIB并且抗体特异性主要由CDR1、2和3区提供，可“混和并匹配”VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列(即，可混和并匹配来自不同抗体的CDR，含有VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3的每一抗体产生本发明的其他抗ActRIIB结合分子)。可使用上文和实施例中描述的结合测定(例如，EILSA)来检测此类“混和并匹配的”抗体的ActRIIB结合。当混和并匹配VH CDR序列时，应该用结构上相似的CDR序列替换来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。同样，当混和并匹配VL CDR序列时，应该用结构上相似的CDR序列替换来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。对本领域技术人员显而易见的是，可通过来自本文为本发明单克隆抗体显示的CDR序列的结构相似序列替换一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新的VH和VL序列。
分离的重组抗ActRIIB抗体，或其抗原结合区具有：包含选自SEQ IDNOs：1-14的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NOs：15-28的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NOs：29-42的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含选自SEQ ID NOs：43-56的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NOs：57-70的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NOs：71-84的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：15的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：29的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：57的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：71的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：2的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：58的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：72的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：3的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：17的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：31的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：45的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：59的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：73的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：4的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：18的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：32的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：60的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：74的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：5的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：19的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：33的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：61的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：75的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：6的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：20的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：34的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：62的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：76的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：7的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：21的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：35的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：49的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：63的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：77的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：8的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：22的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：36的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：50的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：64的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：78的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：9的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：37的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：51的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：65的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：79的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：10的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：38的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：52的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：66的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：80的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：11的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：25的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：39的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：53的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：67的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：81的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：12的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：26的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：40的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：54的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：68的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：82的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：27的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：41的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：55的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：69的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：83的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：14的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：28的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：42的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：56的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：70的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO：84的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供这样的抗体，其包含(a)SEQ ID NO：85的可变重链序列和SEQ ID NO：99的可变轻链序列；(b)SEQ ID NO：86的可变重链序列和SEQ ID NO：100的可变轻链序列；(c)SEQ ID NO：87的可变重链序列和SEQ ID NO：101的可变轻链序列；(d)SEQ ID NO：88的可变重链序列和SEQ ID NO：102的可变轻链序列；(e)SEQ ID NO：89的可变重链序列和SEQ ID NO：103的可变轻链序列；(f)SEQ ID NO：90的可变重链序列和SEQ ID NO：104的可变轻链序列；(g)SEQ ID NO：91的可变重链序列和SEQ ID NO：105的可变轻链序列；(h)SEQ ID NO：92的可变重链序列和SEQ ID NO：106的可变轻链序列；(i)SEQ ID NO：93的可变重链序列和SEQ ID NO：107的可变轻链序列；(j)SEQ ID NO：94的可变重链序列和SEQ ID NO：108的可变轻链序列；(k)SEQ ID NO：95的可变重链序列和SEQ ID NO：109的可变轻链序列；(l)SEQ ID NO：96的可变重链序列和SEQ ID NO：110的可变轻链序列；(m)SEQ ID NO：97的可变重链序列和SEQ ID NO：111的可变轻链序列；或(n)SEQ ID NO：98的可变重链序列和SEQ ID NO：112的可变轻链序列。
在一个实施方案中，本发明提供这样的抗体，其包含：(a)SEQ ID NO：146的重链序列和SEQ ID NO：141的轻链序列；(b)SEQ ID NO：147的重链序列和SEQ ID NO：142的轻链序列；(c)SEQ ID NO：148的重链序列和SEQ ID NO：143的轻链序列；(d)SEQ ID NO：149的重链序列和SEQ IDNO：144的轻链序列；(e)SEQ ID NO：150的重链序列和SEQ ID NO：145的轻链序列；(f)SEQ ID NO：156的重链序列和SEQ ID NO：151的轻链序列；(g)SEQ ID NO：157的重链序列和SEQ ID NO：152的轻链序列；(h)SEQ ID NO：158的重链序列和SEQ ID NO：153的轻链序列；(i)SEQ IDNO：159的重链序列和SEQ ID NO：154的轻链序列；或(j)SEQ ID NO：160的重链序列和SEQ ID NO：155的轻链序列。
如本文所用，人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链，其“产自”或“来自”特定种系序列，如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统的话。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或利用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。例如可通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体在序列上最相近(即，最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列来鉴定“产自”或“来自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体。“产自”或“来自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系序列相比例如因天然发生的体细胞突变或刻意引入定点突变引起的氨基酸差异。然而，所选人抗体在氨基酸序列上通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的同一性，并含有氨基酸残基，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)比较时，其将人抗体鉴定为人的。在某些情况下，人抗体与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少80％、90％，或至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常，来自特定人种系序列的人抗体与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
在一个实施方案中，本发明的抗体是由pBW522或pBW524编码的抗体(于2009年8月18日，在DSMZ，Inhoffenstr.7B，D-38124 Braunschweig，Germany保藏，保藏号分别为DSM22873和DSM22874)。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明的抗体具有全长重链和轻链氨基酸序列；全长重链和轻链核苷酸序列，可变区重链和轻链核苷酸序列，或可变区重链和轻链氨基酸序列，其与本文描述的抗体的氨基酸和核苷酸序列同源，并且其中所述抗体保留本发明抗ActRIIB抗体的期望功能性质。
例如，本发明提供包含重链可变区和轻链可变区的分离的重组抗ActRIIB抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白质)，其中：所述重链可变区包含与选自SEQ ID NOs：99-112的氨基酸序列具有至少80％，或至少90％(优选至少95、97或99％)同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NOs：85-98的氨基酸序列具有至少80％，或至少90％(优选至少95、97或99％)同一性的氨基酸序列；并且所述抗体展示至少以下功能性质之一：(i)其抑制体外或体内的肌肉抑制素结合和/或(ii)降低通过Smad-依赖性途径对肌肉分化的抑制。
在其他实例中，本发明提供包含全长重链和全长轻链的分离的重组抗ActRIIB抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白质)，其中：所述全长重链包含与选自SEQ ID NOs：146-150和156-160的氨基酸序列具有至少80％，或至少90％(优选至少95、97或99％)同一性的氨基酸序列；所述全长轻链包含与选自SEQ ID NOs：141-145和151-155的氨基酸序列具有至少80％，或至少90％(优选至少95、97或99％)同一性的氨基酸序列；并且所述抗体展示至少以下功能性质之一：(i)其抑制体外或体内的肌肉抑制素结合和/或(ii)降低通过Smad-依赖性途径对肌肉分化的抑制。优选地，该抗体结合ActRIIB的配体结合结构域。
在另一实例中，本发明提供包含全长重链和全长轻链的分离的重组抗ActRIIB抗体(或包含其抗原结合部分的功能蛋白质)，其中：所述全长重链由这样的核苷酸序列编码，其与选自SEQ ID NOs：166-170和176-180的核苷酸序列具有至少80％，或至少90％(优选至少95、97或99％)同一性；所述全长轻链由这样的核苷酸序列编码，其与选自SEQ ID NOs：161-165和171-175的核苷酸序列具有至少80％，或至少90％(优选至少95、97或99％)同一性；并且所述抗体展示至少以下功能性质之一：(i)其抑制体外或体内的肌肉抑制素结合和/或(ii)降低通过Smad-依赖性途径对肌肉分化的抑制。优选地，该抗体结合ActRIIB的配体结合结构域。
在多个实施方案中，抗体可显示一种或多种、两种或多种、或三种上文讨论的功能性质。抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。优选地，所述抗体是全人IgG1抗体。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上文阐明的序列具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以相同，只是在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置上具有氨基酸替换。可通过分别诱变(例如定点或PCR介导诱变)SEQ ID NOs：127-140和113-126的核酸分子来获得这样的抗体，所述抗体具有分别与SEQ ID NOs 99-112和SEQ ID NOs：85-98的VH和VL区具有高(即，80％或更高)同一性的VH和VL区，然后使用本文所述的功能测定法测试所编码的经改变抗体的保留的功能(即，上文阐明的功能)。
在其他实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可以与上文阐明的序列具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可通过分别诱变(例如定点或PCR介导诱变)SEQ ID NOs：166-170和176-180和SEQ ID NOs：161-165和171-175的核酸分子来获得这样的抗体，所述抗体具有分别与SEQ ID NOs：146-150和156-160任一全长重链和SEQ ID NOs：141-145和151-155任一全长轻链具有高(即，80％或更高)同一性的全长重链和全长轻链，然后使用本文所述的功能测定法测试所编码的经改变的抗体保留的功能(即，上文阐明的功能)。
在其他实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可与上文阐明的序列具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在其他实施方案中，重链和/或轻链核苷酸序列的可变区可与上文阐明的序列具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
如本文所用，两条序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数量的函数(即，％同一性＝相同位置的数量/位置总数x 100)，其中考虑空位数量和每一空位长度，需要引入所述空位用于两条序列的最佳比对。如下文所述，可使用数学算法完成两条序列之间序列的比较和百分比同一性的确定。
可使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)的算法，使用PAM120加权残基表，空位长度罚分12和空位罚分4确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。此外，可使用已经整合到GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中一个或多个这些CDR序列具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明抗ActRIIB抗体的期望功能性质。因此，本发明提供分离的重组抗ActRIIB抗体，或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，其由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成，其中：所述重链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NOs：1-14，及其保守修饰；所述重链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NOs：15-28，及其保守修饰；所述重链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NOs：29-42，及其保守修饰；所述轻链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NOs：43-56，及其保守修饰；所述轻链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NOs：57-70，及其保守修饰；所述轻链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NOs：71-84，及其保守修饰。优选地，抗体展示至少以下功能性质之一：(i)其抑制体外或体内的肌肉抑制素结合和/或(ii)降低通过Smad-依赖性途径对肌肉分化的抑制。
在多个实施方案中，抗体可显示一种或两种上文列出的功能性质。抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方案中，优化用于在哺乳动物细胞中表达的本发明的抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中一个或多个这些序列具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明抗ActRIIB抗体的期望功能性质。因此，本发明提供优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗ActRIIB抗体，其由全长重链和全长轻链组成，其中：所述全长重链具有选自SEQ ID NOs：146-150和156-160的氨基酸序列，及其保守修饰；并且所述全长轻链具有选自SEQ ID NOs：141-145和151-155的氨基酸序列，及其保守修饰；并且所述抗体展示以下功能性质至少之一：(i)其抑制体外或体内的肌肉抑制素结合和/或(ii)降低通过Smad-依赖性途径对肌肉分化的抑制。
在多个实施方案中，抗体可显示一种或两种上文列出的功能性质。该抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如本文所用，术语“保守序列修饰”旨在指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变来向本发明的抗体中引入修饰。
保守的氨基酸替换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的替换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可被来自同一侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且使用本文描述的功能测定法测试经改变的抗体保留的功能。
与本发明抗ActRIIB抗体结合同一表位的抗体
在另一实施方案中，本发明提供与本文描述的本发明多个特异性抗ActRIIB抗体结合同一表位的抗体。在实施例中描述的能够阻断肌肉抑制素结合ActRIIB的所有抗体以高亲和力结合ActRIIB中的同一表位，所述表位包含在SEQ ID NO：181的19-134位氨基酸之间。
因此可基于它们在标准的ActRIIB结合测定中与本发明其他抗体交叉竞争(例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)的能力鉴定额外的抗体。测试抗体抑制本发明抗体与人ActRIIB结合的能力显示所述测试抗体可与该抗体竞争结合人ActRIIB；根据非限制性理论，该抗体和与其竞争的抗体结合人ActRIIB上相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的表位。在某一实施方案中，与本发明抗体结合人ActRIIB上相同表位的抗体是人重组抗体。可如实施例所述制备并分离这种人重组抗体。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：85中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：99中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：86中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：100中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：87中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：101中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：88中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：102中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：89中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：103中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：90中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：104中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：91中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：105中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：92中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：106中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：93中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：107中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：94中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：108中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：95中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：109中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：96中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：110中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：97中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：111中描述的可变轻链序列。
因此，本发明提供结合抗体识别的表位的抗体，前一抗体具有SEQ IDNO：98中描述的可变重链序列，和SEQ ID NO：112中描述的可变轻链序列。
在更详细的表位作图实验之后，已经更清楚地定义了本发明优选抗体的结合区。
因此，本发明提供结合表位的抗体，所述表位包含SEQ ID NO：181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO：188)。
本发明还提供结合表位的抗体，所述表位包含SEQ ID NO：181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO：186)。
本发明还提供结合表位的抗体，所述表位包含SEQ ID NO：181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO：190)。
本发明还提供结合表位的抗体，所述表位包含SEQ ID NO：181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO：189)。
本发明还提供结合表位的抗体，所述表位包含SEQ ID NO：181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO：187)。
本发明还提供抗体，其结合由这些序列组成的表位和包含这些表位区的组合的表位。
因此，本发明还提供结合表位的抗体，所述表位包含或由SEQ ID NO：181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO：181的氨基酸52-56(EQDKR)组成。
改造和修饰的抗体
还可使用具有一个或多个本文所示VH和/或VL序列的抗体作为起始材料制备本发明的抗体，以改造修饰的抗体，所述修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。可通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)，例如一个或多个CDR区和/或一个或多个构架区内的一个或多个残基来改造抗体。此外或备选地，可通过在恒定区内修饰残基来改造抗体，例如来改变所述抗体的效应功能。
可以进行的一种类型的可变区改造是CDR移植。抗体主要通过定位在六个重链和轻链互补决定区(CDRs)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，CDRs内的氨基酸序列在各抗体之间比CDRs外的序列更多样化。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以通过构建表达载体来表达模拟特定天然发生抗体的性质的重组抗体是可能的，所述表达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然发生抗体的CDR序列(参阅例如，Riechmann，L.等，1998 Nature 332：323-327；Jones，P.等，1986 Nature 321：522-525；Queen，C.等，1989 Proc.Natl.Acad.，U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，和Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗ActRIIB抗体，或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，其包含重链可变区，所述重链可变区分别包含具有选自SEQ ID NOs：1-14的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NOs：15-28的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ IDNOs：29-42的氨基酸序列的CDR3序列；和轻链可变区，所述轻链可变区分别包含具有选自SEQ ID NOs：43-56的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NOs：57-70的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ IDNOs：71-84的氨基酸序列的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但仍然可含有来自这些抗体的不同构架序列。
可从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的出版的参考文献中获得此类构架序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库(可在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)，以及Kabat，E.A.，等，[上文]；Tomlinson，I.M.，等，1992J.fol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等，1994 Eur.JImmunol.24：827-836。
用于本发明抗体的构架序列的实例是与本发明所选抗体使用的构架序列，例如本发明单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列在结构上相似的那些构架序列。VH CDR1、2和3序列，以及VL CDR1、2和3序列可移植到与见于构架序列来源的种系免疫球蛋白基因中的序列具有相同序列的构架区上，或者所述CDR序列可移植到与种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现有利的是在某些情况下在构架区内突变残基以维持或增强抗体的抗原结合能力(参阅例如，Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是在VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内突变氨基酸残基，由此改善目的抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和力)，称为“亲和力成熟”。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并在如本文所述以及实施例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合或其他目的功能性质的影响。可引入保守修饰(如上文讨论)。所述突变可以是氨基酸替换、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过1、2、3、4或5个残基。
因此，在另一实施方案中，本发明提供分离的抗ActRIIB单克隆抗体，或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，其由重链可变区组成，所述重链可变区具有：由选自SEQ ID NOs：1-14的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：1-14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有选自SEQ ID NOs：15-28的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：15-28相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NOs：29-42的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：29-42相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ ID NOs：43-56的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：43-56相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NOs：52-70的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：52-70相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；和具有选自SEQID NOs：71-84的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：71-84相比具有1、2、3、4或5个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
抗原结合结构域移植到备选构架或支架中
可使用多种抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要所得多肽包括至少一个特异性结合ActRIIB的结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的5个主要个体基因型或其片段(如本文其他地方讨论的那些)，并包括其他动物物种，优选具有人源化方面的动物物种的免疫球蛋白。单重链抗体，如在骆驼中鉴定的那些单重链抗体在该方面尤其重要。本领域技术人员不断发现并开发新的构架、支架和片段。
一方面，本发明涉及使用其上可移植本发明CDRs的非免疫球蛋白支架产生基于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知或将来的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包含对SEQ ID NO：181的靶蛋白质特异的结合区(优选地，SEQ ID NO：182中显示的其配体结合结构域)。此类化合物在本文中称为“包含靶标特异结合区的多肽”。在下文部分中进一步描述了非免疫球蛋白构架的实例(骆驼抗体和非抗体支架)。
骆驼(camelid)抗体
从骆驼和单峰骆驼家族(双峰驼(Camelus bactrianus)和Calelusdromaderius)的成员，包括新世界成员如骆马物种(Lama paccos、Lamaglama和Lama vicugna)中获得的抗体蛋白质已经在大小、结构复杂性和对人受试者的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来自该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并因此在结构上不同于来自其他动物的抗体的两条重链和两条轻链的典型四链四级结构(参阅WO94/04678)。
可通过遗传改造获得鉴定为VHH的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域，以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，得到低分子量的抗体来源蛋白质，称为“骆驼纳米抗体”(参阅US5,759,808；Stijlemans，B.等，2004 JBiol Chem 279：1256-1261；Dumoulin，M.等，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger，M.等2003 Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo，V.等2002 Int J Cancer 89：456-62；和Lauwereys，M.等1998 EMBO J 17：3512-3520)。例如从Ablynx，Ghent，Belgium通过商业途径获得骆驼抗体和抗体片段的改造库。如同非人来源的其他抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列，来获得与人序列更像的序列，即纳米抗体可以进行“人源化”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
骆驼纳米抗体的分子量是人IgG分子的大概十分之一，并且所述蛋白质的物理直径仅几纳米。小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体能够结合更大抗体蛋白质在功能上看不见的抗原位点，即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的检测试剂，并可能用作治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体由于结合靶蛋白质的沟或窄缝中特异位点而因此可抑制靶蛋白，并因而可具有这样的能力，其比典型抗体更像典型的低分子量药物的功能。
低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且抗原性弱。另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织，甚至穿过血脑屏障，可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步利于药物运输穿过血脑屏障(参阅US2004/0161738)。这些特征与对人的低抗原性结合表明巨大的治疗潜能。另外，这些分子可在原核细胞，如大肠杆菌(E.coli)中完全表达，并用噬菌体表达为融合蛋白，且是有功能的。
因此，本发明的特征是对ActRIIB具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案中，所述骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生，即，使用本文为其他抗体描述的技术，用ActRIIB或其肽片段免疫骆驼来产生。或者，改造，即如本文实施例中所述使用ActRIIB作为靶标的淘选方法，通过例如从展示适当诱变的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库中选择产生抗ActRIIB骆驼纳米抗体。可通过遗传改造进一步定制改造的纳米抗体，以在受体受试者中具有从45分钟到两周的半衰期。在特定实施方案中，如WO94/04678所述，通过将本发明人抗体的重链或轻链的CDRs序列移植到纳米抗体或单结构域抗体构架序列中来获得骆驼抗体或纳米抗体。
非抗体支架
已知的非免疫球蛋白构架或支架包括，但不限于Adnectins(纤连蛋白)(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)、锚蛋白(MolecularPartners AG，Zurich，Switzerland)、结构域抗体(Domantis，Ltd(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，Belgium))、脂笼蛋白(Anticalin)(Pieris Proteolab AG，Freising，Germany)、小模块免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia，Inc.(Mountain View，CA))、A蛋白(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，Germany)、蛋白质表位模拟物(Polyphor Ltd，Allschwil，Switzerland)。
(i)纤连蛋白支架
纤连蛋白支架优选基于纤连蛋白类型III结构域(例如，纤连蛋白类型III的第十个模块(10 Fn3结构域))。纤连蛋白类型III结构域具有在两个β折叠之间分布的7个或8个β链，所述两个β折叠自身彼此包装形成蛋白质的核心，并进一步含有将β链彼此连接且暴露在溶剂中的环(与CDRs类似)。在β折叠夹层每一边缘具有至少三个这样的环，其中所述边缘是与β链方向垂直的蛋白质边界(US 6,818,418)。
这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，尽管总体折叠与最小功能抗体片段十分相近，最小功能抗体片段是在骆驼和骆马IgG中包含完整抗原识别单位的重链可变区。因为该结构，非免疫球蛋白抗体模拟与自然界中相似的抗原结合性质以及与抗体的那些亲和力相似的亲和力。这些支架可用于体外环随机化和改组策略，其与体内抗体的亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中使用标准克隆技术用本发明的CDRs替换所述分子的环区。
(ii)锚蛋白-分子配偶体
该技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支架，所述可变区可用于结合不同靶标。所述锚蛋白重复模块是由两个反向平行的α螺旋和β转角组成的33个氨基酸的多肽。通过使用核糖体展示对可变区的结合进行最大优化。
(iii)Maxybodies/Avimers-Avidia
Avimers来自含有如LRP-1蛋白质的天然A结构域。这些结构域天然地用于蛋白质-蛋白质相互作用，并且在人中超过250种蛋白质在结构上基于A结构域。Avimers由通过氨基酸接头连接的许多不同的“A结构域”单体(2-10)组成。可使用例如US2004/0175756；US2005/0053973；US2005/0048512；和US2006/0008844中描述的方法产生可以结合靶抗原的Avimers。
(vi)A蛋白-Affibody
亲和配体是由基于A蛋白的一个IgG结合结构域的支架的三螺旋束组成的小的简单蛋白质。A蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个随机化以产生具有大量配体变体的文库(参阅例如，US 5,831,012)。分子模拟抗体，它们与150kDa的抗体分子量相比具有6kDa的分子量。尽管其具有小的尺寸，但分子的结合位点与抗体的结合位点类似。
(v)Anticalins-Pieris
是Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们衍生自脂笼蛋白，其为一大类小且坚固的蛋白质，一般参与生理运输或储藏化学敏感的或不溶解的化合物。若干天然脂笼蛋白在人组织或体液中产生。
蛋白质结构表明为免疫球蛋白，在刚性构架上面具有高变环。然而，与抗体或它们的重组片段相比，脂笼蛋白由具有160到180个氨基酸残基的单条多肽链组成，仅比单个免疫球蛋白结构域稍大。
构成结合口袋的四环组显示明显的结构可塑性并耐受多种侧链。因此结合位点在专有方法中可重塑，以识别具有高亲和力和特异性的不同形状的规定靶分子。
脂笼蛋白家族的一个蛋白质——Pieris Brassicae的后胆色素结合蛋白(BBP)已经用于通过诱变处理四环组来开发anticalins。描述“anticalins”的专利申请的一个实例是WO1999/16873。
(vi)Affilin-Scil蛋白质
AffilinTM分子是设计用来针对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的AffilinTM分子，每一所述文库基于来自不同人的支架蛋白。
AffilinTM分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。Scil蛋白质使用两个AffilinTM支架，其中一个是γ晶体蛋白——人结构晶状体蛋白质，另一个是“泛素”超家族蛋白质。两个人支架均非常小，显示高的温度稳定性，并对pH改变和变性剂几乎是有抵抗力的。该高稳定性主要是因为蛋白质的扩展的β折叠结构。γ晶体蛋白来源的蛋白质的实例描述于WO2001/004144中，并且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004/106368中。
(vii)蛋白质表位模拟物(PEM)
PEM是模拟蛋白质β发夹二级结构的中等大小、环形的肽样分子(MW 1-2kDa)，所述主要二级结构参与蛋白质-蛋白质相互作用。
构架或Fc改造
本发明的改造抗体包括其中VH和/或VL内构架残基已经进行了修饰，例如以改善抗体性质的那些抗体。通常进行这些构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更特别地，已经经历体细胞突变的抗体可含有不同于抗体来源种系序列的构架残基。可通过比较抗体构架序列与抗体来源的种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型，例如通过定点诱变或PCR介导的诱变可以将体细胞突变“回复突变”到种系序列中。此类“回复突变的”抗体也旨在包括在本发明内。
另一类型的构架修饰涉及突变构架区，或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，来去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，并进一步详细描述于US2003/0153043中。
除了在构架或CDR区内进行修饰外或作为备选，可改造本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常用来改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞毒性。另外，可化学修饰(例如，一个或多个化学部分可附着到抗体上)或修饰本发明的抗体以改变其糖基化，再次用于改变抗体的一种或多种功能性质。在下文中进一步详细描述了这些实施方案中的每一个实施方案。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使得改变，例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数量。在US5,677,425中进一步描述了该方法。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数量，例如用来便于轻链和重链装配，或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物学半衰期。更特别地，向Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得抗体相对于天然的Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。在US6,165,745中进一步描述了该方法。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半衰期。多种方法是可能的。例如，可引入一个或多个以下突变：T252L、T254S、T256F，如US6,277,375中所述。或者，为了增加生物学半衰期，可在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的挽救受体结合表位，如US5,869,046和US6,121,022所述。
在其他实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区域，以改变抗体的效应功能。例如，可用不同氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得所述抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可以是例如，Fc受体或补体的C1组分。在Winter等的US5,624,821和US5,648,260中进一步详细描述了该方法。具体而言，可突变残基234和235。具体而言，这些突变可以是丙氨酸。因此，在一个实施方案种，本发明的抗体在Fc区一个或两个氨基酸234和235上具有突变。在另一实施方案中，一个或两个氨基酸234和235可替换成丙氨酸。两个氨基酸234和235替换成丙氨酸导致降低的ADCC活性。
在另一实施方案中，可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的C1q结合/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在US6,194,551中进一步详细描述了该方法。
在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，由此改变抗体固定补体的能力。在WO94/29351中进一步详细描述了该方法。
在再一实施方案中，修饰Fc区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。在WO00/42072中进一步描述了该方法。此外，已经在人IgG1上对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点进行作图，并且已经描述了具有提高的结合的变体(参阅Shields，R.L.等，2001J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在再一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可制备无糖基化抗体(即，所述抗体缺少糖基化)。可改变糖基化，例如用来增加抗体对抗原的亲和力。可通过例如改变抗体序列中一个或多个糖基化位点来完成此类糖类修饰。例如，可进行一个或多个氨基酸替换，其导致一个或多个可变区构架糖基化位点的去除，由此去除该位点上的糖基化。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。在Co等的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细了描述该方法。
此外或备选地，可以制备具有改变类型糖基化的抗体，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经显示此类改变的糖基化模式提高抗体的ADCC能力。例如通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来完成此类糖类修饰。已经在本领域中描述了具有改变的糖基化机器的细胞，并且其可用作宿主细胞，在其中表达本发明重组抗体，由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖化。因此，在一个实施方案中，在显示低岩藻糖化模式的细胞系，例如具有编码岩藻糖转移酶的FUT8基因缺失表达的哺乳动物细胞系中通过重组表达产生本发明的抗体。WO03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附着到Asn(297)-连接的糖类上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也参阅Shields，R.L.等，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。WO99/54342描述了经改造以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在改造的细胞系中表达的抗体显示增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性提高(也参阅Umana等，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。或者，可在改造用于哺乳动物样糖基化模式并能够产生缺少岩藻糖作为糖基化模式的抗体的酵母或丝状真菌中产生本发明的抗体(参阅例如，EP1297172B1)。
本发明涵盖的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可将抗体聚乙二醇化，以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了聚乙二醇化抗体，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，如PEG的活性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团变得附着到抗体或其片段的条件下进行反应。可利用活性PEG分子(或类似活性水溶性聚合物)通过酰化反应或烷化反应进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在包括任何的PEG形式，其已经用于衍生其他蛋白质，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域所知，并可应用到本发明的抗体中(参阅例如，EP0154316和EP0401384)。
本发明涵盖的抗体的另一种修饰是本发明抗体的至少抗原结合区与血清蛋白质(如人血清白蛋白或其片段)的缀合物或蛋白质融合，以提高所得分子的半衰期(参阅例如，EP0322094)。
另一种可能是本发明抗体的至少抗原结合区与能够结合血清蛋白质(如人血清白蛋白)的融合，以提高所得分子的半衰期(参阅例如，EP0486525)。
改造改变的抗体的方法
如上讨论，本文显示的具有VH和VL序列或全长重链和轻链序列的抗ActRIIB抗体可用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列、或附着到其上的恒定区产生新的抗ActRIIB抗体。因此，在本发明的另一方面，本发明抗ActRIIB抗体的结构特征用于产生结构上相关的抗ActRIIB抗体，其保留了本发明抗体的至少一种功能性质，如结合人ActRIIB，以及抑制ActRIIB的一种或多种功能性质(例如，抑制Smad激活)。
例如，本发明抗体的一个或多个CDR区或其突变可与已知的构架区和/或其他CDRs重组组合以产生本发明额外的重组改造的抗ActRIIB抗体，如上讨论。其他类型的修饰包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是本文提供的一个或多个VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为了产生改造的抗体，不必实际制备(即，表达为蛋白质)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是，序列中包含的信息用作起始材料，来产生来自初始序列的“第二代”序列，然后制备所述“第二代”序列并将其表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供用于制备抗ActRIIB抗体；改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体序列；并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法，所述抗ActRIIB抗体由以下组成：具有选自SEQ ID NOs：1-14的CDR1序列、选自SEQ ID NOs：15-28的CDR2序列，和/或选自SEQ IDNOs：29-42的CDR3序列的重链可变区抗体序列；和具有选自SEQ IDNOs：43-56的CDR1序列、选自SEQ ID NOs：57-70的CDR2序列，和/或选自SEQ ID NOs：71-84的CDR3序列的轻链可变区抗体序列。
因此，在另一实施方案中，本发明提供用于制备经过优化以在哺乳动物细胞中表达的抗ActRIIB抗体；改变全长重链抗体序列和/或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体序列；并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法，所述抗ActRIIB抗体由以下组成：具有选自SEQ ID NOs：146-150和156-160的序列的全长重链抗体序列；和具有选自SEQ ID NOs：141-145和151-155的序列的全长轻链抗体序列。
也可通过筛选抗体文库制备改变的抗体序列，所述抗体文库具有如US2005/0255552中描述的选自SEQ ID NO：29-42和SEQ ID NO：71-84的固定的CDR3序列或最小基本结合决定簇以及CDR1和CDR2序列上的多样性。可根据适合于从抗体文库中筛选抗体的任何筛选技术，如噬菌体展示技术进行筛选。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。所述改变的抗体序列编码的抗体是保留此处所述抗ActRIIB抗体的一种、一些或所有功能性质的抗体，所述功能性质包括，但不限于特异性结合人ActRIIB并抑制Smad激活。
改变的抗体可显示一种或多种，两种或多种，或三种或多种上文讨论的功能性质。
可使用本领域中可得的和/或本文描述的标准测定法，如在实施例中阐明的那些测定法(例如，ELISA)评估经改变的抗体的功能性质。
在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中，可沿全部或部分抗ActRIIB抗体编码序列随机或选择性引入突变，并且可如本文描述的筛选所得的经修饰抗ActRIIB抗体的结合活性和/或其他功能性质。已经在本领域中描述了突变方法。例如，WO02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合产生并筛选抗体突变的方法。或者，WO03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体理化性质的方法。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。在SEQ ID NOs：161-165和171-175中显示了优化用于在哺乳动物细胞中表达的全长轻链核苷酸序列的实例。在SEQ ID NOs：166-170和176-18中显示了优化用于在哺乳动物细胞中表达的全长重链核苷酸序列的实例。
核酸可存在于整个细胞中或细胞裂解物中，或可以是部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl banding、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术从其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质纯化分离时，核酸是“分离的”或“使得基本纯的”。参阅，F.Ausubel，等，编辑1987 Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或可以不含有内含子序列。在实施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体，如噬菌体展示载体中，或重组质粒载体中。本发明也提供称为pBW522和pBW524的载体(在2009年8月18日在DSMZ，Inhoffenstr.7B，D-38124 Braunschweig，Germany保藏，保藏号分别为DSM22873和DSM22874)。
可使用标准分子生物学技术获得本发明的核酸。对于杂交瘤(例如，从携带下文进一步描述的人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可从文库成员的多个噬菌体克隆中回收编码抗体的核酸。
本发明范围内也包括的是包含一个或多个缺失、添加或替换的变体核酸序列。在一个实施方案中，本发明包含一个或多个SEQ ID NOs：113-140或161-180，其包含保守的核苷酸替换。由于遗传密码的简并性，氨基酸可由多于一个密码子编码。因此，可以修改核苷酸序列，而翻译的氨基酸序列保持不变。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如以将可变区基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，VL-或VH-编码DNA片段有效连接另一DNA分子，或有效连接编码另一蛋白质的片段，如抗体恒定区或柔韧接头。如该上下文中所用，术语“有效连接”旨在表示两个DNA片段以功能方式连接，例如使得两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内，或蛋白质在想要的启动子控制下表达。
通过有效连接VH-编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领域所知(参阅例如，Kabat，E.A.，等[上文])并且可通过标准PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一些实施方案中，在IgG1同种型中选择重链恒定区。对于Fab片段重链基因，VH-编码DNA可有效连接编码仅重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过有效连接VL-编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列为本领域所知(参阅例如，Kabat，E.A.，等[上文])并且可通过标准PCR扩增获得包括这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，VH-和VL-编码DNA片段有效连接编码柔韧接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，以便VH和VL序列可表达为邻接的单链蛋白质，并且VH和VL区通过柔韧接头连接(参阅例如，Bird等，1988 Science 242：423-426；Huston等，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等，1990 Nature 348：552-554)。
本发明的核酸可用于基因递送。即，编码本发明多肽(抗体或功能蛋白质)的核酸可直接递送到患者中用于在患者中翻译。
通常“包装”核酸用于向患者施用。基因递送媒介物可以是非病毒，如脂质体或复制缺陷型病毒，如Berkner，K.L.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)描述的腺病毒或Muzyczka，N.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美国专利号5,252,479描述的腺伴随病毒(AAV)载体。或者，可使用逆转录病毒，如慢病毒。例如，可改造编码本发明多肽的核酸分子，用于在复制缺陷型的逆转录病毒载体中表达。然后可分离该表达构建体，并将其引入转导了含有编码多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体的包装细胞中，以便所述包装细胞目前产生含有目的基因的感染性病毒颗粒。可向受试者施用这些生产细胞，用于在体内改造细胞并在体内表达多肽(参阅第20章，Gene Therapy and otherMolecular Genetic-based Therapeutic Approaches，(和其中引用的参考文献)in Human Molecular Genetics(1996)，T Strachan and A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd)。
另一方法是施用“裸DNA”，其中治疗基因直接注射到血流或肌肉组织中。
本发明单克隆抗体的产生
可通过多种技术，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975 Nature 256：495)的标准体细胞杂交技术来产生单克隆抗体(mAbs)。可使用产生单克隆抗体的许多技术，例如，B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生是良好建立的程序。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
可在如上文描述制备的鼠类单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合或人源化抗体。可使用标准分子生物学技术从目的鼠类杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并进行改造以含有非鼠类(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠类可变区连接到人恒定区(参阅例如，US4,816,567)。为了产生人源化抗体，可使用本领域已知的方法将鼠类CDR区插入人构架中(参阅例如，美国专利号5225539；5530101；5585089；5693762和6180370)。
在某一实施方案中，本发明抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对ActRIIB的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并在本文统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex，Inc.)含有编码未重排人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及失活内源μ和κ链基因座的靶向突变(参阅例如，Lonberg，等，1994 Nature368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示降低表达的小鼠IgM或κ，并且响应免疫时，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等，1994[上文]；综述见于Lonberg，N.，1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.，1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠的制备和用途以及该小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor，L.等，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等，1993International Immunology 5：647-656；Tuaillon等，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等，1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等，1994 International Immunology 579-591；和Fishwild，D.等，1996 Nature Biotechnology 14：845-851，所有参考文献的内容以其整体明确引入作为参考。进一步参阅美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,429；和5,545,807；以及WO92/103918，WO93/12227，WO94/25585，WO97/113852，WO98/24884；WO99/45962；和WO01/14424。
在另一实施方案中，可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。在WO02/43478中详细描述了本文称为“KM小鼠”的这种小鼠。
进一步，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统可在本领域中获得，并可用于产生本发明的抗ActRIIB抗体。例如，可使用称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统。在例如美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述了此类小鼠。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统可在本领域中获得，并可用于产生本发明的抗ActRIIB抗体。例如，可使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；在Tomizuka等，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述了这种小鼠。另外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经描述于本领域中(Kuroiwa等，2002Nature Biotechnology 20：889-894)，并可用于产生本发明的抗ActRIIB抗体。
也可使用噬菌体展示方法制备本发明的人重组抗体，用于筛选人免疫球蛋白基因文库。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法。参阅例如：美国专利号5,223,409；5,403,484；5,571,698；5,427,908；5,580,717；5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可使用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，在所述SCID小鼠中已经重建了人免疫细胞，使得在免疫后产生人抗体应答。例如在美国专利号5,476,996和5,698,767中描述了此类小鼠。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生杂交瘤(其产生本发明的人单克隆抗体)，可从经免疫小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并将其融合到适当的无限增殖细胞系中，如小鼠骨髓瘤细胞系。可筛选所得杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。例如，可利用50％的PEG将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单一细胞悬浮液融合到六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)中。以约2x 145将细胞平铺到平底微量滴定板中，然后在含有20％胎儿克隆血清、18％″653″条件培养基、5％三甲氧唑辛(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择培养基中温育2周。大约2周后，可在用HT替换HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA筛选各细胞的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常可在10-14天后观察培养基。可重新平铺分泌杂交瘤的抗体，再次筛选，并且如果对人IgG仍然是阳性的，那么通过有限稀释来亚克隆单克隆抗体至少两次。然后可在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生小量的抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体，可在两升旋转烧瓶中培养所选的杂交瘤用于单克隆抗体纯化。可过滤上清液并在用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia)进行亲和层析之前浓缩。可通过凝胶电泳和高效液相层析检查洗脱的IgG，以保证纯度。可将缓冲液交换成PBS，并使用1.43消光系数通过OD280测定浓度。可等分单克隆抗体并储存在-80℃。
产生单克隆抗体的转染瘤的产生
可使用例如本领域(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且所述DNA可插入到表达载体中，以便基因有效连接转录和翻译控制序列。在该上下文中，术语“有效连接”旨在表示抗体基因连接到载体中，以便载体中的转录和翻译控制序列行使它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列与所用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可插入到分别的载体中，或更通常地，两个基因可插入到同一个表达载体中。通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补性限制性位点，或如果不存在限制性位点，则连接平末端)将抗体基因插入到表达载体中。本文描述的抗体的轻链和重链可变区可用于通过将它们插入到表达载体中来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，所述表达载体已经编码想要的同种型的重链恒定区和轻链恒定区，以便VH区段有效连接载体内的CH区段，并且VL区段有效连接载体内的CL区段。此外或备选地，重组表达载体可编码利于抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。抗体链基因可克隆到载体中，以便信号肽框内连接抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽，或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。例如在Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA 1990)中描述了此类调节序列。本领域技术人员应理解的是，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可依赖于这样的因素，如待转化的宿主细胞的选择、想要的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。或者，可使用非病毒调节序列，如泛素启动子或P-珠蛋白启动子。再进一步，调节元件包括来自不同来源的序列，如SRa启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病毒类型1的长末端重复(Takebe，Y.等，1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调节序列，本发明的重组表达载体可携带额外的序列，如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始区)和选择标记基因。所述选择标记基因利于选择已经引入了载体的宿主细胞(参阅例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予已经引入载体的宿主细胞对药物，如G418、潮霉素或氨甲喋呤的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲喋呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。多种形式的术语“转染”旨在包括通常用于向原核或真核宿主细胞引入外源DNA的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。因为真核细胞，尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配并分泌适当折叠并在免疫学上有活性的抗体，所以讨论了抗体在真核细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞中的表达。已经报道了抗体基因的原核表达对产生高产率的活性抗体无效(Boss，M.A.和Wood，C.R.，1985Immunology Today6：12-13)。
用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220描述的dhfr-CHO细胞，其与DH FR选择标记一起使用，例如在R.J.Kaufman和P.A.Sharp，1982 Mol.Biol.159：601-621中描述的选择标记)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是CHO K1PD细胞。具体而言，为了与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一表达系统是WO87/04462、WO89/01036和EP 338,841中显示的GS基因表达系统。
在一个实施方案中，用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括缺少FUT8基因表达的哺乳动物细胞系，例如在US6,946,292B2中描述的。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，可通过培养宿主细胞足以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到培养基中的时间来产生抗体，其中宿主细胞可以在所述培养基中生长。可使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
免疫缀合物
另一方面，本发明描述了抗ActRIIB抗体，或其片段，其缀合到治疗部分，如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素上。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒素剂包括对细胞有害(例如杀死)细胞的任何试剂。
可使用本领域可得的接头技术将细胞毒素缀合到本发明的抗体上。已经用于将细胞毒素缀合到抗体上的接头类型的实例包括，但不限于，腙、硫醚、酯类、二硫化物和含肽接头。可选择这样的接头，其例如对溶酶体区室内的低pH裂解敏感或对蛋白酶，如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D)的切割敏感。
对于细胞毒素类型、将治疗剂缀合到抗体上的接头和方法的进一步讨论，也可以参阅Saito，G.等，2003 Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等，2003 Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.2003Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.，2002 Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.，2002 Curr.Opin.Investig.Drugs3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.，2001 Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本发明的抗体也可缀合到放射性同位素上，以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射性免疫缀合物。可缀合到抗体上用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括，但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。在本领域中建立了制备放射性免疫缀合物的方法。可通过商业途径获得放射性免疫缀合物的实例，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并且相似的方法可用于使用本发明的抗体制备放射性免疫缀合物。
本发明的抗体缀合物可用于修饰给定的生物反应，并且药物部分不解释为限制于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有想要的生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如，酶促活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物反应修饰因子，例如淋巴因子、白细胞介素-1(″IL-1″)、白细胞介素-2(″IL-2″)、白细胞介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其他生长因子。
用于将这种治疗部分缀合到抗体上的技术是众所周知的，参阅例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等，″ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Inmunol.Rev.，62：119-58(1982)。
双特异性分子
另一方面，本发明描述了包含本发明抗ActRIIB抗体或其片段的双特异性或多特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合区可衍生或连接另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如，另一抗体或受体的配体)，来产生结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本发明的抗体可实际上衍生或连接超过一种其他功能分子，以产生结合多于两种不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；本文所用的术语“双特异性分子”也旨在包括此类多特异性分子。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可在功能上连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他)一种或多种其他结合分子，如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以便产生双特异性分子。
因此，本发明包括双特异性分子，其包含对ActRIIB的至少第一种结合特异性，和对第二个靶表位的第二种结合特异性。例如，第二个靶表位可以是ActRIIB的不同于第一个靶表位的另一表位。
此外，对于其中双特异性分子是多特异性的发明，除了第一个和第二个靶表位之外，所述分子可以还包括第三种结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体，或其抗体片段，包括例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链Fv。所述抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Ladner等US4,946,778(其内容明确引入作为参考)中描述的Fv或单链构建体。
可用于本发明双特异性分子中的其他抗体是鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体。
可使用本领域已知的方法，通过缀合成分结合特异性来制备本发明的双特异性分子。例如，可单独产生双特异性分子的每一结合特异性，然后相互缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参阅例如，Karpovsky等，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括在Paulus，1985 Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等，1985 Science229：81-83和Glennie等，1987 J.Immunol.139：2367-2375中描述的那些。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可通过两条重链的C末端铰链区的巯基成键而缀合。在特定实施方案中，在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，例如1个。
或者，两种结合特异性可在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达并装配。其中双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab′)2或配体x Fab融合蛋白质时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是单链分子，其包含一个单链抗体和结合决定簇，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。例如在美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；和5,482,858中描述了用于制备双特异性分子的方法。
例如，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)、或Western印迹测定来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些测定法中的每一种一般通过使用对目的复合体特异的标记试剂(例如抗体)检测特别重要的蛋白质-抗体复合物的存在。
多价抗体
另一方面，本发明提供了包含结合ActRIIB的本发明抗体的至少两个相同或不同抗原结合部分的多价抗体。在一个实施方案中，多价抗体提供抗体的至少两个、三个或四个抗原结合部分。抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接在一起。或者，已经为双特异性分子描述了连接方法。例如通过用结合本发明抗体的恒定区，例如Fc或铰链区的抗体交联本发明的抗体获得四价化合物。
药物组合物
另一方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的本发明的一种单克隆抗体或其抗原结合部分或其组合。此类组合物可包括本发明的一种抗体或(例如两种或多种不同)抗体的组合，或免疫缀合物或双特异分子。例如，本发明的药物组合物可包含结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的抗体的组合。
也可以组合治疗，即与其他试剂组合施用本发明的药物组合物。例如，组合治疗可包括与至少一种其他肌肉力量/强度增强剂，例如IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不激活它的肌肉抑制素诱饵蛋白、β2激动剂、Ghrelin激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或促滤泡素抑制素组合的本发明抗ActRIIB抗体。在下文本发明抗体用途部分中更详细描述了可用于组合治疗的治疗剂的实例。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。载体应适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，可以材料包被活性化合物，即抗体、免疫缀合物或双特异分子，以保护所述化合物免于酸和可能失活所述化合物的其他自然条件的作用。
本发明的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留亲本化合物的想要的生物活性但不传递任何不想要的毒理学作用的盐(参阅例如，Berge，S.M.，等，1977 J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸的那些盐，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及来自无毒有机酸，如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括来自碱土金属的那些盐，如钠、钾、镁、钙等，以及来自无毒有机胺，如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚等；和金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本发明药物组合物中的合适的水和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其合适的混合物，植物油，如橄榄油，和注射用的有机酯，例如油酸乙酯。例如，可使用包衣材料如卵磷脂通过在分散情况下维持所需颗粒大小并使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过上文的灭菌程序并通过包含多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的存在。还可希望将等渗剂，如糖、氯化钠等包括到组合物中。此外，可通过引入延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)产生可注射药物形式的长期吸收。
药学上可接受的载体包括用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌水溶液或分散剂和无菌粉末。用于药物活性物质的此类介质和试剂的用途为本领域所知。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容之外，其在本发明的药物组合物中的用途是可以考虑的。补充的活性化合物也可掺入到组合物中。
治疗组合物在生产和储存条件下通常必须是无菌且稳定的。所述组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适合于高药浓度的其他有序结构。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可使用包被材料如卵磷脂通过在分散情况下维持所需颗粒大小并使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，可以在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中引入延迟吸收的物质(例如单硬脂酸盐或明胶)产生可注射组合物的长期吸收。
可通过将活性化合物以需要的量与上文列举的一种试剂或试剂组合掺入到适当溶剂中，需要时随后进行灭菌微量过滤来制备无菌可注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入到含有基本分散剂和上文列举的那些其他所需试剂的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥法(冻干)，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性剂的粉末及任何额外想要的物质。
可以与载体物质组合来产生单一剂量形式的活性剂的量将根据接受治疗的受试者和具体施用方式而变化。可以与载体物质组合来产生单一剂量形式的活性剂的量一般会是产生治疗效果的组合物的量。一般地，以百分比而言，所述量将从活性剂的约百分之0.01至约百分之九十九，从约百分之0.1至约百分之70，或从活性剂的百分之1至约百分之30与药学上可接受载体组合。
调整剂量方案来提供最想要的应答(例如，治疗应答)。例如，可施用单次推注，可随时间施用若干分份剂量或根据治疗情形的紧急性指示按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其利于容易施用和剂量的均一性。本文所用的剂量单位形式指适合作为待治疗的受试者的单一剂量的物理分离单位；每一单位含有预定量的活性化合物，其经计算以产生与需要的药学载体相关的想要的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格决定于或直接依赖于活性化合物的独特特征和待达到的特定治疗效果、以及配药领域中的内在限制，如用于个体中敏感性治疗的活性化合物。
对于抗体的施用，剂量范围从约0.0001至100mg/kg，并更一般为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg或3-7mg/kg的范围内。示例性治疗方案为每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。或者，可以约每年一次或仅一次施用抗体。可经静脉内或皮下进行此类施用。本发明的抗ActRIIB抗体的剂量方案包括经静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，并且按以下剂量方案之一给予抗体：每四周给六次剂量，然后按每三个月；每三周；3mg/kg体重一次随后按每三周1mg/kg体重。
剂量应该是引起肌肉质量和/或强度上调的量。优选地，所述效果产生于骨骼肌上。优选地，剂量引起肌肉肥大，内部器官(如心脏、肺、肝、肾)的大小至多成比例增加。可通过测定质量或体积来比较这种成比例增加。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在这种情况下施用的每一抗体的剂量处于所指示的范围内。一般在多个时期施用抗体。单次剂量间的间隔可以是例如每周一次、每月一次、每三个月一次、每六个月一次或每年一次。如通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平指示，间隔还可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，而在一些方法中为约25-300μg/ml。例如，本发明的ActRIIB抗体可与抗肌肉抑制素抗体共同施用。
或者，抗体可以作为缓释制剂来施用，在这种情况下需要更不频繁地施用。剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变化。一般地，人抗体显示最长的半衰期，然后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时候需要在相对短间隔内相对高的剂量，直至疾病的发展减慢或终止，或直至所述患者显示疾病症状部分或彻底改善。此后，可对患者施用预防性方案。
可改变本发明药物组合物中活性剂的实际剂量水平，以获得活性成份的量，其对特定患者、组合物和施用方式有效实现想要的治疗应答，而对所述患者无毒。所选剂量水平依赖于多种药物代谢动力学因素，包括所用本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、年龄、性别、体重、状况、一般健康和所治疗患者的先前医疗史以及医学领域所熟知的因素。
本发明抗ActRIIB抗体的“治疗有效剂量”可导致疾病症状的严重性下降，无疾病症状周期的频率和持续时间的增加，或防止由于疾病折磨，即肌肉质量和/或强度增加而导致的损伤或失能。
可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径来施用本发明的组合物。技术人员将理解的是，施用途径和/或方式将根据想要的结果而有所不同。本发明抗体的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如经注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”表示除肠内和局部施用以外的施用方式，一般通过注射，包括但不局限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，静脉内施用抗体。在另一实施方案中，皮下施用抗体。
或者，可通过非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用本发明抗体。
可利用载体制备活性化合物，所述载体将保护化合物避免快速释放，如控释制剂，包括埋植剂、透皮贴剂和微囊递送系统。可使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法为专利保护或一般为本领域技术人员所知。参阅例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可用本领域已知的医疗设备来施用治疗组合物。例如，在一个实施方案中，可用无针头皮下注射设备，例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中显示的设备来施用本发明的治疗组合物。用于本发明的众所周知的埋植剂和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其显示了用于以受控速率分配药物的可植入微量输液泵；美国专利号4,486,194，其显示了用于经皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其显示了用于以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其显示了用于持续药物递送的变速流可植入输液器；美国专利号4,439,196，其显示了具有多腔隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其显示了渗透药物递送系统。许多其他的此类埋植剂、递送系统和模块为本领域技术人员所知并包括由MicroCHIPSTM(Bedford，MA)制造的那些。
在某些实施方案中，可配制本发明的人单克隆抗体，以确保在体内正确分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如需要)，例如可将其配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参阅例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。所述脂质体可包含一个或多个部分，其被选择性运输至特定的细胞或器官中，因此增强靶向药物递送(参阅例如V.V.Ranade，1989 J.Clin Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参阅例如美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等，1995 Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性剂A蛋白受体(Briscoe等，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等，1994J.Biol.Chem.269：9090)；还可参阅K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994 Imrnunomethods 4：273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体具有体外和体内诊断和治疗用途。例如，可将这些分子例如在体外或离体施用给培养的细胞，或例如在体内施用给受试者的细胞，来治疗、预防或诊断多种病症。因此可在疾病治疗、预防中使用所述抗体并用于延迟疾病症状的开始。如本文所用，术语“受试者”旨在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、奶牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物。
本发明提供了用于治疗患有病理性病症(如肌肉萎缩疾病或病症)的患者的方法，其包括施用治疗有效量的抗ActRIIB抗体。
本发明还提供了抗ActRIIB抗体，用于治疗。
本发明还提供了抗ActRIIB抗体在制备用于治疗病理性病症的药物中的用途。
本方法特别适合于治疗、预防、改善或诊断病理性病症。
如本文所用，“病理性病症”包括，但不局限于，肌骨骼疾病或病症，如肌肉萎缩。肌肉萎缩有许多原因，包括利用糖皮质激素，如氢化可的松、地塞米松、倍他米松、泼尼松、甲泼尼龙或泼尼松龙治疗引起。肌肉萎缩也可以是神经外伤导致去神经的结果或变性、代谢或炎症性神经病(例如，吉-巴综合征、周围神经病或暴露于环境毒素或药物)的结果。
此外，肌肉萎缩可以由以下引起：肌病，如肌强直；先天性肌病，包括线状体肌病、多/小核肌病和肌管(中央核性)肌病；线粒体性肌病；家族性周期性麻痹；炎症性肌病；代谢性肌病，如糖原或脂质沉积病引起；皮肌炎；多肌炎；包含体肌炎；骨化性肌炎；横纹肌溶解和肌红蛋白尿。
肌病可以由肌营养不良综合征症，如迪谢纳肌营养不良、贝克肌营养不良、肌强直、面-肩-肱型肌营养不良、埃-德肌营养不良、眼咽型肌营养不良、肩肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、福山型肌营养不良、先天性肌营养不良或遗传性远端肌病引起。肌骨骼肌病也可以是骨质疏松症、骨折、身材矮小症或侏儒症。
此外，肌肉萎缩可以由以下引起：成人运动神经元病、婴儿脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧索硬化、幼年期脊髓性肌萎缩、具有多病灶传导阻断的自身免疫性运动神经病、因中风或脊髓损伤引起的麻痹、因创伤、延长的卧床休息、自愿的不活动、非自愿的不活动引起的骨骼固定化、代谢性应激或营养不足、癌症、AIDS、禁食、甲状腺病症、糖尿病、良性先天性肌紧张低下症、中央核疾病、烧伤、慢性阻塞性肺疾病、肝病(实例，如纤维化、肝硬化)、脓毒症、肾衰竭、充血性心力衰竭、衰老、宇宙飞行或零重力环境中时间消耗。
可治疗的年龄相关性状况的实例包括，少肌症、皮肤萎缩、肌萎缩、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松症、骨关节炎、无免疫活性、高血压、痴呆、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默氏病、白内障、年龄相关性黄斑变性、前列腺癌、中风、减少的预期寿命、脆弱、记忆丧失、皱纹、损伤的肾功能和年龄相关性听力损失；代谢性疾病，包括II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖症。当然，患者还可能同时患有一种或多种这些状况，例如少肌症和肺气肿，或少肌症和损伤的肾功能。
本文描述的认为是“病理性疾病”的其他状况包括急性和/或慢性肾脏疾病或衰竭、肝纤维化或肝硬变、癌症如乳腺癌、帕金森病；与神经死亡相关的状况，如ALS、脑萎缩或痴呆和贫血。
其他状况包括恶病质、与风湿性关节炎相关的恶病质和与癌症相关的恶病质。
迄今为止，已经开发了很少可靠或有效的治疗法来治疗这些病症。
基于激活素结合受体中的ActRIIB(Werner和Alzheimer，CytokineGrowth Factors Rev 2006，17(3)：157-171)促进肝、肾和肺纤维化的作用和肌肉抑制素、激活素或ActRIIB在癌症中的作用(Tsuchida等，Endo J，2008，55(1)：11-21)的报道证据，本文所述的“病理性病症”包括肝、肾、肺纤维化和癌症，例如但不限于横纹肌肉瘤、骨丢失诱导癌、肝细胞癌、胃肠癌。
预防可以是完全的，例如年龄相关性状况或代谢性病症的完全缺失。预防也可以是部分的，以便受试者与不接受本发明抗体的受试者相比，发生年龄相关性状况或代谢性病症的可能性不太可能发生。
本文所指的年龄相关疾病可从50岁或更老(即60岁、70岁、80岁或更老)开始。
在一个实施方案中，可在预期的强制性休息/不活动之前用抗ActRIIB抗体预先治疗患者。此类周期可当患者入院，例如进行臀部或腿部手术时发生。不活动可通过例如灌制破碎的四肢或关节，或通过施用麻痹剂而局部化。
在一个实施方案中，待治疗的患者具有四肢(即腿或手臂)或关节(即膝盖或髋)的骨折。因此，在一个实施方案中，待治疗的患者具有肱骨、桡骨、尺骨、腕骨、掌骨、锁骨、肩胛骨、股骨、髋骨、髌骨、胫骨、腓骨、距骨、跟骨、跗骨、跖骨、坐骨或回肠中的一种或多种的骨折。在另一实施方案中，待治疗的患者已遭受或将遭受以下一种或多种关节的手术：膝、髋、踝、肩、肘。此类手术包括髋置换术或膝置换术。
由于固定导致的萎缩可能会迅速发生，但通常都缓慢发生。因此，在一个实施方案中，患者、关节或四肢已被固定或将被固定2周或更长时间(即3周、4周、6周、8周或更长时间)。在一个实施方案中，患者、关节或四肢已被固定或将被固定1-8周、2-6周或3-5周。
在其他实施方案中，所述患者可能是未应答之前的骨合成代谢治疗的患者。例如，所述患者可能未对用IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不激活它的肌肉抑制素诱饵蛋白质、β2激动剂、Ghrelin激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或促滤泡素抑制素的治疗产生应答。测定患者对治疗的应答的简单方法是对患者用多少时间爬上已知高度的台阶计时并比较治疗前和治疗后的结果。
本发明的抗体可作为唯一的活性剂或例如作为佐剂与其他药物，例如IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不激活它的肌肉抑制素诱饵蛋白质、β2激动剂、Ghrelin激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或促滤泡素抑制素缀合或组合施用。例如，本发明的抗体可与如WO2007/146689中公开的IGF-1模拟物组合使用。
根据上文，本发明在其他方面中提供：
如上文定义的方法，其包括例如同时或顺序地共同施用治疗有效量的ActRIIB拮抗剂，例如本发明的抗体和至少一种第二种药品，所述第二种药品为IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不激活它的肌肉抑制素诱饵蛋白质、β2激动剂、Ghrelin激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或促滤泡素抑制素。
本发明还提供治疗组合，例如药盒，其包含治疗有效量的a)ActRIIB拮抗剂，例如本发明的抗体和b)至少一种选自例如上文所述的IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的变体、抗肌肉抑制素抗体、肌肉抑制素前肽、结合ActRIIB但不激活它的肌肉抑制素诱饵蛋白质、β2激动剂、Ghrelin激动剂、SARM、GH激动剂/模拟物或促滤泡素抑制素的第二种物质。所述药盒还可包括用于其施用的说明书。
本发明的抗体与另一种活性剂结合施用时，共同施用的组合化合物的剂量当然将根据所用共同药物的类型、所用的特定药物、待治疗的状况等不同。
在另一实施方案中，本发明的抗体仅对选自患有肌肉萎缩患者的患者群进行施用。在另一实施方案中，本发明的抗体对患有骨骼肌萎缩的患者群进行施用。在另一实施方案中，本发明的抗体仅对选自对抗ActRIIB治疗应答的患者的患者群进行施用。鉴定对抗ActRIIB治疗应答的可能性增加的患者的生物标记可以是任何以下标记，但不局限于此：相比于对照患者高水平的血清肌肉抑制素、GDF-11或激活素。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于检测ActRIIB水平或含有ActRIIB的细胞的水平。例如，这可通过使样品(如体外样品)和具有抗ActRIIB抗体的对照样品在允许抗体和ActRIIB间形成复合体的条件下接触来实现。检测抗体和ActRIIB间形成的任何复合体并在样品和所述对照之间进行比较。例如，可使用本发明的组合物来进行本领域中熟知的标准检测方法，如ELISA和流式细胞术测定。
因此，一方面，本发明进一步提供用于检测样品中ActRIIB(例如人ActRIIB)的存在或测定ActRIIB量的方法，所述方法包括使样品和对照样品与本发明的抗体或其抗原结合区(其特异地结合ActRIIB)在允许所述抗体或其部分与ActRIIB间形成复合体的条件下接触。随后检测复合体的形成，其中所述样品相对于对照样品间的复合体形成中的差异指示了样品中ActRIIB的存在。
在本发明的范围内还有由本发明的组合物(例如抗体、人抗体和双特异性分子)和使用说明书组成的试剂盒。所述试剂盒进一步含有至少一种额外试剂、或一种或多种额外的本发明的抗体(例如抗体，其具有结合到与第一种抗体不同的靶抗原上的表位的互补活性)。试剂盒通常包括用于说明试剂盒内含物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上提供的或与试剂盒一起的或伴随试剂盒的任何书面或录音材料。所述试剂盒还可以包含这样的工具，其用于诊断患者是否属于如上文定义的对抗ActRIIB抗体治疗应答的组。此类试剂盒可包含冻干形式的本发明抗体、稀释剂和使用说明书。
已充分描述了本发明，通过以下实施例和权利要求来进一步说明本发明，其为说明性的并且不旨在进一步限制。
一般用语
术语“包含”表示“包括”以及“由......组成”，例如组合物“包含”X可单独由X组成或可包括其他额外的例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”指例如x±10％。
附图说明
图1显示了在亲代和ActRIIB转染的HEK293T/17细胞系中经FACS滴定的MOR07079的EC50测定。
图2显示了在报告基因测定中通过2、10和50μg/ml的多个抗ActRIIBFabs的肌肉抑制素诱导的萤光素酶表达的抑制。
图3显示了在肌肉抑制素诱导的萤光素酶报告基因测定中Fabs的IC50测定。
图4显示了结合原代人骨骼肌细胞的抗体。
图5显示了在骨骼肌分化测定的肌肉抑制素诱导的抑制中IgG的IC50测定。
图6显示了小鼠研究：首次用于实验的动物中的体内功效研究-用10mg/kg的MOR08159或MOR08213处理6周增加体重和肌肉重量。显示了(A)体重，(B)胫骨肌，(C)具有跖肌的腓肠肌，(D)四头肌和(E)胸肌的变化。
图7显示了小鼠研究：首次用于实验的动物中的剂量响应体内功效研究-用25、5、1mg/kg的MOR08213处理6周，剂量依赖性地增加体重和肌肉重量。显示了(A)体重，(B)胫骨肌，(C)具有跖肌的腓肠肌，(D)四头肌和(E)胸肌的变化。
图8显示了FACS结果，表明与单独同种型对照(黑色)或存在MOR08213的同种型对照(虚线)相比，存在MOR08213时的MOR08159(粗体虚线)和单独MOR08159(粗体黑色)间的交叉阻断。
图9显示了使用多种表位测定技术，MOR08159结合的ActRIIB残基(SEQ ID NO：181)的概述。
用于实施本发明的方式
功能测定
报告基因测定(RGA)
培养HEK293T/17细胞系
在含10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(50IE/ml)和链霉素(50μg/ml)的DMEM中维持亲本HEK293T/17细胞。细胞在37℃和5％CO2的培养箱中生长并每3-4天进行传代培养。使用AccutaseTM分离细胞并随后转移至含新鲜培养基的新烧瓶中。
如上文中对亲本HEK293T/17细胞描述，培养稳定转染有CAGA-12luc的HEK293T/17细胞，但细胞培养基中除了FBS、青霉素和链霉素之外还添加有4mM L-谷氨酰胺和3μg/ml杀稻瘟菌素。
肌肉抑制素诱导的萤光素酶报告基因测定
为了测定抗ActRIIB抗体抑制肌肉抑制素诱导的信号转导的能力，进行使用稳定报告细胞系HEK293T/17 CAGA-12 luc的报告基因测定。CAGA-12萤光素酶报告基因构建体在最小启动子和对磷酸化Smad-2和Smad-3特异的多个CAGA盒下游携带萤光素酶基因。加入纯化的肌肉抑制素(但还可以是GDF-11、激活素或TGFβ)诱导Smad磷酸化并因此结合至CAGA-12报告基因，导致萤光素酶基因表达。
HEK293T/17 CAGA-12 luc细胞达到90％汇合后，如描述的分离细胞并在培养基中稀释至浓度为2.5x105细胞/ml。随后，按每孔100μl细胞接种至平底的96孔板上并在37℃和5％CO2中培养过夜。
第二天，将作为阳性对照的抗体(Fab或IgG)和重组人ActRIIB/Fc在PBS中稀释至所需浓度。将20μl的抗体溶液加入至前一天接种的孔中并将细胞培养1小时，以允许抗体结合。最后，向孔中加入50ng/ml肌肉抑制素并将细胞进一步培养过夜。
第二天早晨，向每一孔中加入120μl Bright-Glo萤光素酶试剂(Promega)。温育2分钟后，在光度计上读取发光。用各个抗体完全滴定后计算半最大抑制浓度(IC50值)。
特异性ELISAs
在ELISA装置中评估抗ActRIIB Fab抗体对人ActRIIB的特异性和对人ActRIIA和小鼠ActRIIB的交叉反应性。此外，测定了与相关受体(抗靶标：人TGF-βRII/Fc(R&D systems)、小鼠TGF-βRI(ALK-5)/Fc(R&Dsystems)、人激活素RIB(ALK-4)/Fc(R&D systems))的结合。为此，将在PBS中稀释的5μg/ml(若未说明)重组蛋白质加入黑色96孔平底MaxiSorpTM平板并在4℃温育过夜用于包被。
第二天早晨，用TBST洗涤平板并用MTBST进行封闭。洗涤平板几次后，加入5μg/ml抗ActRIIB Fab并温育2.5小时。随后通过与碱性磷酸酶缀合的特异的山羊抗人IgG Fab温育，随后加入AttoPhos萦光底物来检测结合抗原的Fabs。在TECAN Spectrafluor平板读数器上读取535nm处的萤光发射及在430nm处的激发。
ActRIIB/Fc-肌肉抑制素结合相互作用ELISA
为了评估抑制性Fabs是否通过封闭人ActRIIB的肌肉抑制素结合位点起作用，进行了hActRIIB/Fc-肌肉抑制素相互作用ELISA。为此，在PBS中将重组肌肉抑制素稀释至5μg/ml并包被至黑色96孔平底Maxisorp平板上。第二天早晨，用MTBST封闭孔。与此同时，在TBST中将50μg/ml抗ActRIIB Fabs与10μg/ml ActRIIB/Fc室温预温育1.5小时并最终加入到包被并封闭的孔中(室温下1.5小时)。用TBST缓冲液洗涤后，使用未标记的小鼠抗人Ig Fc特异抗体和POD标记的山羊抗小鼠IgG检测抗体进行检测结合的ActRIIB/Fc。用TBST缓冲液将孔洗涤几次后，加入Quanta BluTM Fluorogenic Peroxidase底物。在GENiosProTM读数器中读取萦光(激发光320nm，发射光430nm)。
结合细胞
细胞
在含10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(50IE/ml)、链霉素(50μg/ml)和嘌呤霉素(2μg/ml)的DMEM中维持稳定的人ActRIIA-和人ActRIIB转染的HEK293T/17细胞，通过转染有使用FuGENE6(Roche)线性化的pEGFP(Clontech)-ActRIIB(ECD)或-ActRIIA(ECD)和pPGK-puro(AddGene)的HEK293T/17细胞(ATCC)来产生所述稳定的人ActRIIA-和人ActRIIB转染的HEK293T/17细胞。细胞在37℃和5％CO2的培养箱中生长并每3-4天进行传代培养。使用AccutaseTM分离细胞并随后转移至含新鲜培养基的新烧瓶中。
在约70-90％的融合时收获人骨骼肌细胞(huSkMC)(Cambrex)。对于那些细胞，抽吸培养基(其为由添加有20％FCS(Amimed)的骨骼肌基础培养基(skBM；Lonza)组成的生长培养基(GM))，用HEPES-BSS洗涤细胞，并与胰蛋白酶/EDTA温育。细胞解离后，用胰蛋白酶中和溶液中和胰蛋白酶。细胞在220x g离心5分钟，并在骨骼肌生长培养基(SkeletalMuscle Growth Media)中将沉淀重悬浮。随后将细胞用于实验或以～3500细胞/cm2的细胞密度接种用于传代培养。细胞在37℃和5％CO2的培养箱中生长并每5-6天进行传代培养。
hActRIIB-和hActRIIA-表达细胞上的FACS滴定
通过FACS，经过与细胞hActRIIA和hActRIIB的结合来测定抗ActRIIB抗体的半最大有效浓度(EC50)。
为此，将连续稀释的抗ActRIIB Fab或IgG与每孔中1x104个hActRIIA转染的、hActRIIB转染的或亲本HEK293T/17细胞在4℃温育1小时。几次洗涤步骤后，用藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG(H+L)二级抗体来检测细胞结合的Fabs或IgGs。在4℃温育1小时后，再次洗涤细胞并在FACS缓冲液中重悬浮，并且在FACSArrayTM仪器中测定细胞的萦光强度。
结合原代人骨骼肌细胞
抗ActRIIB Fab或IgG以及同种型对照Fab或IgG(10μg)与每管中FACS缓冲液(PBS、2％FCS、1mM EDTA)中的105huSkMC在4℃温育1小时。洗涤步骤后，用已在FACS缓冲液中按1∶200稀释的藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG(H+L)二级抗体来检测细胞结合的Fabs或IgGs。在振荡器中4℃温育1小时后，再次洗涤细胞并在FACS缓冲液中重悬浮，并且在FACSCaliberTM仪器上测定细胞的萦光强度。
亲和力测定
使用表面等离振子共振(Biacore)测定所选抗人ActRIIB Fabs的亲和 力
对于直接抗原固定，使用标准EDC-NHS胺偶联化学。用10mM乙酸盐缓冲液，pH 4.5中的约6000RU的人或小鼠ActRIIB/Fc，或约1500RU的人ActRIIA/Fc(根据抗原活性而定)包被CM5芯片(Biacore，Sweden)。对于参照流动池，使用各自量的HAS。用5μl的10mM甘氨酸/HCl缓冲液pH1.5进行再生。
或者，不直接固定抗原，但在CM5芯片上捕获抗原，用抗人Fc抗体(Fc capture kit，GE Healthcare/Biacore)修饰所述CM5芯片。在参照流动池上，将捕获抗体固定，但不捕获抗原。使用5μL 3M MgCl2注射2次来完成再生。
使用连续稀释行的Fab样品在Dulbecco’s PBS中以20μl/分钟的流速进行动力学测定。Fab浓度从15.6变化至500nM。对于每一浓度的注射时间为1分钟。解离时间设置为至少2分钟(或者更长，根据所测定的亲和力而定)。使用电泳缓冲液的空白注射进行双参照。使用BIA评估软件3.2(Biacore，Sweden)对所有传感图进行总体拟合。
CK测定
接种24小时后通过将细胞从GM转移到由骨骼肌基础培养基(skBM)组成的无血清分化培养基中来起始分化。细胞在存在或不存在给定浓度的肌肉抑制素(R&D systems)或其他TGF-b蛋白质和测试抗体的情况下分化3天。用PBS洗涤细胞，随后用Reporter裂解缓冲液(Promega)裂解并在-80℃储存直至测定。用CK(IFCC)试剂(Thermo Electron)测定CK活性。根据生产商说明书制备CK试剂。将细胞裂解物调整至室温，加入CK试剂并立即在340nm处读取吸光值20分钟，读数间隔为1分钟。使用来自兔肌肉的CK(Roche Diagnostics)新制作CK标准曲线。使用BCA试剂盒测定蛋白质含量。
动物模型
根据体重将九周龄的雌性CB17/ICR-Prkdcscid/Crl小鼠(n＝每组10只，Charles River，Germany)随机化，并随后在第0、3、7、14、21、28和35天(第3天开始每周一次)用10mg/kg剂量的抗人ActRIIB抗体(MOR8159，MOR8213)或IgG对照抗体(研究1；比较研究)，或用25、5或1mg/kg剂量的MOR8213(研究2；剂量应答研究)进行腹膜内处理。每周两次测定体重。施用后六周(42天)，用CO2将小鼠处死。收集胫骨肌、带有跖肌的腓肠肌、四头肌和胸肌并称重。
处理方案
对照抗体：抗鸡溶菌酶hIgG，
浓度：2mg/mL(研究1)，5mg/mL(研究2)，应用体积：5mL/kg
载体：50mM柠檬酸盐、140mM NaCl或PBS
抗人ActRIIB抗体：抗ActRIIB-MOR8159和MOR8213、hIgG，
浓度：2mg/mL(研究1)、5mg/mL(研究2)、1mg/mL(研究2)、0.2mg/mL(研究2)
应用体积：5mL/kg
载体：50mM柠檬酸盐、140mM NaCl
处理组：
研究1：MOR08159和MOR08213比较
1IgG对照，腹膜内注射(抗鸡溶菌酶-IgG)，10mg/kg
2抗ActRIIB-MOR8159，腹膜内注射，10mg/kg
3抗ActRIIB-MOR8213，腹膜内注射，10mg/kg
研究2：MOR08213的剂量反应
1IgG对照，腹膜内注射(抗鸡溶菌酶IgG)，25mg/kg
2抗ActRIIB-MOR8213，腹膜内注射，25mg/kg
3抗ActRIIB-MOR8213，腹膜内注射，5mg/kg
4抗ActRIIB-MOR8213，腹膜内注射，1mg/kg
维持条件
按每组四只到五只动物在25℃下以12∶12小时光-暗周期饲养动物。用含18.2％蛋白质和3.0％脂肪具有15.8MJ/kg能量的标准实验室饮食对其进行饲喂(NAFAG 3890，Kliba)。随意提供食物和水。根据Canton ofBasel-City，Switzerland中有效的规定进行动物实验。
方法
统计学分析
结果以均值+/-SEM表示。使用Dunnett′s多重比较检验，然后单向方差分析法进行统计学分析。检验了处理(抗ActRIIB抗体MOR8159和MOR8213)与对照(对照抗体)的差异，并当概率值为＜0.05时认为差异显著：＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，NS：相对于IgG对照无显著性。用GraphPadPrism 5.0版本(GraphPad Software，Inc)进行统计学分析。通过减去第0天的体重来计算体重，并且第0天的体重(初始体重)对肌肉重量进行归一化。
淘选，抗体鉴定和表征
使用市售噬菌体展示文库MorphoSys HuCAL文库作为抗体变体蛋白质来源，通过选择具有高亲和力的克隆来产生针对人ActRIIB蛋白质的治疗性抗体
HuCAL文库是Fab文库(Knappik等，2000)，其中通过适合的方法使所有六个CDRs多样化，并且其使用CysDisplayTM技术用于将Fab连接至噬菌体表面(WO01/05950)。
使用HuCAL噬菌粒文库(Rothe等，2008)来选择特异性的Fab抗体片段。
通过从文库中淘选ActRIIB特异性抗体进行选择
对于识别人ActRIIB的抗体的选择，应用几种淘选策略。
简述之，将HuCAL抗体噬菌体分为包含不同VH主导基因的几个库。
将这些库分别进行不同的细胞淘选，由此瞬时人ActRIIB转染细胞上的选择周期与重组人ActRIIB/Fc蛋白质上的选择周期交替进行。
i.全细胞淘选
为了淘选，将PBS中稀释的噬菌体颗粒与等体积的PBS/BSA混合并封闭。平行地，也在预封闭的管中，将每个噬菌体库中的1x107个各个hActRIIB表达细胞在PBS/3％FCS/0.04％NaN3中重悬浮并在振荡器中4℃封闭1小时。将封闭后的细胞离心甩下，在预封闭的噬菌体颗粒中重悬浮并温育3小时。同时，制备每个噬菌体库中1x107hActRIIB击倒细胞。
在PBS/BSA中洗涤噬菌体-细胞复合体，并随后在PBS中洗涤。用甘氨酸缓冲液，pH 2.2进行酸性洗脱将噬菌体颗粒从hActRIIB表达细胞上洗脱下来。离心后，通过加入未缓冲的Tris中和洗脱液。
经感染和随后的离心后，在2xYT培养基中重悬浮细菌沉淀，接种于LB/CAM/Glc琼脂平板上并在37℃温育过夜。第二天早晨，从平板上刮下菌落并复苏和扩增噬菌体。
ii.固相淘选
对于固相淘选，在4℃过夜将重组人ActRIIB/Fc包被至MaxiSorpTM平板上。用PBS洗涤后用5％MPBST封闭包被的孔。
选择之前，HuCAL噬菌体在封闭缓冲液中进行预吸附。向包被的抗原加入封闭的噬菌体并在室温下温育2小时。用PBST和PBS将非特异的噬菌体洗涤下来。通过加入20mM DTT将结合的噬菌体洗脱下来。洗脱液用于感染大肠杆菌TG-1培养物。感染后，将细菌接种至LB/CAM/Glc琼脂平板上并在37℃温育过夜。第二天早晨，从平板上刮下菌落并复苏和扩增噬菌体。
最成功的淘选方法证明是不同的细胞/蛋白质淘选，其中在ActRIIB转染的HEK293T/17细胞上进行第一轮淘选，然后在重组人ActRIIB/Fc上选择循环，并再次在转染细胞上进行选择。
分析所选Fabs用于结合亲本或rhActRIIB转染的HEK293细胞。
MOR07079 Fab以20nM的EC50优先结合ActRIIB转染的细胞(图1)。在肌肉抑制素结合抑制ELISA中，MOR07079 Fab显示抑制活性并阻断rhActRIIB/Fc与肌肉抑制素结合。在为MOR07079使用HEK293-CAGA12的报告基因测定中通过肌肉抑制素抑制反映ELISA中强的肌肉抑制素结合抑制。使用特异性ELISA，显示MOR07079特异性结合人和小鼠ActRIIB并且不与不相关的TGFβRII、ALK4和ALK5受体结合。与ActRIIA相比，MOR7079还显示优先结合ActRIIB。
产生免疫球蛋白
i.Fabs向IgG形式的转化
为了表达全长免疫球蛋白(Ig)，将重链(VH)和轻链(VL)的可变域片段从X9_FH Fab表达载体亚克隆至用于人IgG2的2_h_Ig载体系列中。所选克隆还转化为沉默IgG1LALA形式，其中在234和235位的亮氨酸突变为丙氨酸，以去除FcRγ结合并减弱效应功能。
使用适合的限制酶(Knappik等，2000)将VH和VL结构域片段亚克隆至2_h_IgG2、2_h_IgG1LALA、2_h_Igκ和2_h_Igλ2中。
转染到HKB11细胞之前，所有DNA制剂均进行序列分析。
ii.人IgG的瞬时表达和纯化
用IgG重链和轻链表达载体DNA转染真核HKB11细胞。转染后3天或7天收获细胞培养物上清液并进行标准的A蛋白亲和层析。如果不另行说明，将缓冲液交换为1x Dulbecco′s PBS(pH 7.2)并将样品无菌过滤(0.2μm)。
CDR-L3和CDR-H2成熟文库
为了提高所选抗体片段的亲和力和生物学活性，使用三核苷酸定点诱变通过盒式诱变同时将CDR-L3和CDR-H2区域优化(Virnekas等1994，Nucleic Acids Res.22：5600-5607)，由此所述构架区保持不变(Nagy等，2002，Nature Medicine，8：801-807)。克隆成熟文库之前，经XbaI/EcoRI限制性位点将所有亲本Fab片段从表达载体X9转移至CysDisplayTM成熟载体25中。该载体提供了通过N末端融合半胱氨酸残基以及通过C末端半胱氨酸融合到Fd抗体链的噬菌体蛋白质pIII，并因此允许在噬菌体表面上通过二硫键展示各Fab片段。
为了产生CDR-H2文库，将每一亲本Fab的CDR-H2区切下并用高度多样化的CDR-H2成熟盒替换。
平行地，用多样化的CDR-L3成熟盒替换亲本克隆的CDR-L3区。
成熟文库的大小从4x105变化至1x108个克隆。所有情况下载体背景低于1％。通过单个克隆测序的质量控制揭示每一文库的高质量。
对于每一CDR-L3和CDR-H2成熟文库，制备抗体展示噬菌体并通过点滴定法测定噬菌体滴度。
亲和力成熟的淘选策略
用来自以下成熟文库的抗体展示噬菌体进行单独的淘选和筛选：
引导1：MOR07079(L-CDR3成熟)
引导1：MOR07079(H-CDR2成熟)
在生物素化的hActRIIB/Fc和在huSkMC上进行使用各自抗体的成熟淘选。
从新产生的成熟文库中复苏出的每个子码中2x1010或1x1011个噬菌体用于第一轮选择。
进行几种不同的淘选，由此重组生物素化的hActRIIB/Fc的选择循环与huSkMC上的选择循环交替进行。
对于第一轮和第三轮溶液淘选，将生物素化的重组hActRIIB/Fc捕获至链霉抗生素包被的Dynabeads上。应用以下方案：对于每一噬菌体库，用PBS洗涤链霉抗生物素蛋白珠并在封闭缓冲液中重悬浮。PBS中稀释的噬菌体颗粒与含0.1％Tween20的封闭缓冲液混合并置于旋转轮上。用于去除链霉抗生物素蛋白或珠结合的噬菌体的噬菌体颗粒的预清除进行两次：每个噬菌体库，将封闭的链霉抗生物素蛋白珠加入到封闭的噬菌体颗粒中并在旋转轮上温育。经磁力设备将珠分离后，将噬菌体上清液转移至新鲜的、预封闭的反应管中并重复预吸附。
封闭步骤之后，将生物素化的hActRIIB/Fc抗原加入至预清除并封闭的噬菌体颗粒中并在旋转轮上温育。使用封闭的链霉抗生物素蛋白珠捕获噬菌体-抗原复合体，将其加入至噬菌体淘选库中并进一步温育。收集结合到链霉抗生物素蛋白珠上的噬菌体颗粒。随后用PBST和PBS洗涤珠子。通过加入20mM DTT从链霉抗生物素蛋白珠上将噬菌体颗粒洗脱下来。收集洗脱液并用于转染已生长至OD600nm为0.6-0.8的大肠杆菌TG-1培养物。
在感染及随后的离心之后，在2xYT培养基中重悬浮细菌沉淀，将其接种至LB/CAM/Glc琼脂板上并在37℃温育过夜。第二天早晨，从平板上刮下菌落，并主要如所述复苏并扩增噬菌体(Krebs等，2001)，只是辅助噬菌体感染的细胞在22℃下在含0.25mM IPTG的培养基中过夜生长。除了降低所用的抗原量和提高洗涤条件的严格性之外，根据第一轮的方案来进行生物素化的hActRIIB/Fc上的第三轮溶液淘选。
对于第二轮淘选(在表达内源hActRIIB的huSkMC上)，将PBS中稀释的噬菌体颗粒与等体积的PBS/BSA混合并封闭。平行地，对于每一子码，在4℃用PBS/FCS/0.02％NaN3封闭9x105huSkMC。将封闭的细胞离心甩下，与预封闭的噬菌体颗粒一起重悬浮并进一步温育。
用PBS/BSA洗涤噬菌体细胞复合体，随后在PBS中洗涤。细胞在4℃以410x g离心2分钟。通过与甘氨酸缓冲液，pH 2.2进行10分钟的温育步骤来进行噬菌体颗粒从表达huSkMC的hActRIIB上的酸洗脱。离心后，通过加入未缓冲的Tris来中和洗脱液。含有噬菌体的上清液用于转染已生长至OD600nm为0.6-0.8的大肠杆菌TG-1培养物。
在感染及随后的离心之后，在2xYT培养基中重悬浮细菌沉淀，将其接种至LB/CAM/Glc琼脂板上并在37℃温育过夜。第二天早晨，从平板上刮下菌落并主要如所述复苏并扩增噬菌体(Krebs等，2001)，只是辅助噬菌体感染的细胞在22℃下在含0.25mM IPTG的培养基中过夜生长。
产生非常有效结合子的最成功的淘选方法证明为不同的淘选，其中第一轮和第三轮在生物素化的ActRIIB/Fc上进行，并且第二轮在huSkMC上进行。
测序后，选择Fabs进行表达和纯化，并将最有希望的进一步表征。
大多数抗ActRIIB抗体显示出以高达低双数字纳摩尔范围内的EC50值与hActRIIB转染的HEK293T/17细胞结合。若干Fabs在肌肉抑制素结合抑制ELISA中能够从ActRIIB/Fc置换肌肉抑制素，但是其中只有MOR08067在报告基因测定中显示出肌肉抑制素诱导活性的完全抑制(图2)。
对人和小鼠ActRIIB/Fc最有希望的Fab的综合亲和力列于下表中(表1)。
表1：抗ActRIIB Fab-FH对ActRIIB抗原的亲和力数据
Fab克隆MOR08067显示出对肌肉抑制素诱导的RGA的良好抑制性以及与rhActRIIB转染的HEK293细胞的结合。通过Biacore的亲和力测定揭示对人和小鼠ActRIIB/Fc低于100pM的KD值。选择MOR08067和其他候选物通过交叉克隆方法用于进一步优化，而含有潜在的N连接的糖基化位点的MOR08067也用于进行去糖基化方法。
来自第一次亲和力成熟的抗体优化
a)MOR08067的去糖基化
根据序列分析，该抗体在重链的CDR-H2中含有潜在的N连接的糖基化位点。去除该位点，以产生MOR08156和MOR08159。这些MOR08067衍生物的表征描述在下文中。
b)优化Fabs的交叉克隆
对于CDR-H2s和/或CDR-L3s中潜在N连接糖基化位点的进一步的功能改进和去除，将来自第一次亲和力成熟所得的单一亲和力成熟Fabs的独立优化的CDR-H2和CDR-L3区组合，但保持每一家族分开。MOR07079的后代进入杂交克隆。在对HEK293T/17/ActRIIB的FACS亲和力评级中检测了大概200个细菌裂解物并且表达及纯化了最有希望的Fab克隆MOR08144和MOR08213。
c)优化抗体的表征
以下部分中，详细描述了MOR08067的去糖基化后代(MOR08156，MOR08159)和来自MOR08067的两个杂交克隆(MOR08144和MOR08213)。
在报告基因测定中测定了优化的Fabs抑制肌肉抑制素信号转导的能力，所有结合子能够在最高浓度下诱导＞95％的抑制(图3)。
在使用Biacore的亲和力测定实验中，MOR08159和MOR08213鉴定为人和小鼠ActRIIB的高度有效结合子(表2)。显然，成熟且优化的Fabs的提高的亲和力反映了在肌肉抑制素诱导的报告基因测定中提高的效能。
表2：抗ActRIIB Fabs对ActRIIB抗原的亲和力数据
亲和力成熟的Fabs的IgG2转化(第一轮成熟)
选择来自第一轮亲和力成熟的最有希望的Fabs用于IgG2转化。
通过瞬时转染HKB11细胞进行IgG2表达并从细胞培养物上清液中纯化全长免疫球蛋白。
转化成IgG后，所有候选物在报告基因测定中保留其剂量依赖性抑制肌肉抑制素诱导的活性的能力(表3)。
IgG IC50[nM] 抑制％
MOR08067 2.57 86.5
MOR08144 0.5 94.9
MOR08156 0.19 97.4
MOR08159 0.32 99
MOR08213 0.32 98.6
表3：肌肉抑制素诱导的萤光素酶报告基因测定中抗ActRIIB IgGs的IC50测定
通过FACS测定MOR08159和MOR08213的结合人原代肌肉肌原细胞的能力，并报导与那些细胞的特异性结合，与那些细胞上ActRIIB的低表达一致。
MOR08159和MOR08213显示完全逆转原代骨骼肌肌原细胞分化的肌肉抑制素诱导的抑制的能力(图5)。由于其中和内源产生的ActRIIB配体的能力，那些抗体还在缺失外源肌肉抑制素的情况下提高分化高于基础水平。
第二次亲和力成熟
选择候选物进行第二次亲和力成熟以进一步改善功效。
i.CDR-L3和CDR-H2成熟文库的构建
为了提高所选抗体片段(例如MOR08067)的亲和力和生物学活性，使用三核苷酸定向诱变通过盒式诱变优化CDR-L1和CDR-H2区(Virnekas等[上文])，由此构架区保持不变(Nagy等[上文])。在克隆成熟文库之前，经XbaI/EcoRI限制性位点将所有亲本Fab片段从表达载体X9转移至CysDisplayTM成熟载体25中。
所有成熟文库的大小通常产生最少1x107个独立克隆。在所有情况中载体背景低于1％。通过单一克隆的测序进行质量控制显示了每一文库的高质量。
对于每一CDR-L1和CDR-H2成熟文库，制备抗体展示噬菌体并通过点滴定来测定噬菌体滴度。
ii.改良抗体的淘选策略、亲和力分级和筛选
第二轮亲和力成熟的差异淘选包括亲本HEK293T/17细胞和以低水平内源表达人ActRIIB的huSkMC。此外，在所有淘选策略中包括重组生物素化的hActRIIB/Fc抗原。
对于抗ActRIIB Fabs的分级，在基于MSD的方法中，在重组生物素化的hActRIIB/Fc抗原和hActRIIB转染的HEK293T/17细胞的膜囊制剂上对大约2700个细菌裂解物(每一淘选子码有～88个克隆)进行了亲和力分级。对具有高亲和力分级因子的命中进行了测序。
此外，在FACS亲和力分级中评估了不显示为命中的随机选择的克隆。为此，使用亲本HEK293T/17和/或hActRIIB转染的HEK293T/17细胞筛选细菌裂解物。用藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG(H+L)二级抗体检测细胞结合的Fabs。平行进行裂解物中Fab表达的定量。
所有淘选策略产生了抗ActRIIB特异性抗体。序列分析后鉴定到MOR08067后代。所有结合子在CDR-H2中成熟。
IgG2转化和IgG2的表征(第二次成熟)
同样，选择来自第二次亲和力成熟的最有希望的Fab进行IgG2转化。通过瞬时转染HKB11细胞来进行IgG2表达并且从细胞培养上清液中纯化全长免疫球蛋白。
所检测的所有IgG均能够完全逆转对原代骨骼肌肌原细胞分化的肌肉抑制素诱导的抑制(表4)。
表4：肌肉抑制素诱导的骨骼肌分化抑制测定中抗ActRIIB IgGs的IC50测定
我们评估了抗ActRIIB Ab中和肌肉抑制素以及其他TGFβ家族配体结合原代人骨骼肌肌原细胞上的ActRIIB的能力。在肌原细胞分化测定中，我们评估了多种配体在存在或不存在MOR08159或MOR08213的情况下抑制分化的潜力。
表5：在存在或不存在MOR08159/MOR08213(10μg/ml)的情况下多种配体诱导的骨骼肌分化抑制测定的IC50和Emax测定
肌肉抑制素和GDF-11能够以相似的效率抑制人肌原细胞并抑制至相似程度。在单一浓度的MOR08159或MOR08213存在的情况下，肌肉抑制素和GDF-11剂量反应以并行方式迁移。激活素A也能够抑制分化，然而在MOR08159或MOR08213存在的情况下，我们观察到伴随Emax和效能变化的非并行迁移。在MOR08159或MOR08213存在的情况下BMP-2应答不受影响，提示它不经过ActRIIB结合来发生。
在体内鼠类研究中抗ActRIIB抗体的表征
在按10mg/kg腹膜内注射施用MOR08159或MOR08213(每周一次，进行六周)的SCID小鼠中评估抗ActRIIB抗体诱导肌肉肥大的能力(图6)。
在研究结束时两种抗体都能够诱导所有检测的肌肉产生显著的肥大。最早在处理1周后就检测到了抗ActRIIB抗体处理小鼠中总体重的显著增加。
5mg/kg和25mg/kg剂量的MOR08213能够诱导所有检测肌肉的剂量依赖性显著肥大，而在1mg/kg剂量时观察不到显著变化(图7)。
交叉阻断研究
稳定的人ActRIIB转染的HEK293T/17细胞维持在含10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(50IE/ml)、链霉素(50μg/ml)和嘌呤霉素(2μg/ml)的DMEM中。细胞在37℃和5％CO2的培养箱中生长并每3-4天进行传代培养。使用AccutaseTM分离细胞并随后转移至含有新鲜培养基的新烧瓶中。
使用表达hActRIIB的细胞通过FACS来评估抗ActRIIB抗体结合人ActRIIB的相同表位的能力。
为此，将抗ActRIIB IgG与每孔中1x105个hActRIIB转染的细胞在4℃温育1小时。洗涤后，不同的生物素化的抗ActRIIB IgG或对照生物素化IgG以等摩尔浓度与第一种抗ActRIIB IgG在4℃温育1小时。洗涤后，用链霉抗生物素蛋白-APC(Biolegend)检测结合细胞的生物素化的IgG。在4℃温育1小时后，再次洗涤细胞，在FACS缓冲液中重悬浮并在FACSArrayTM仪器中测定细胞的萦光强度。
通过FACS检测MOR08159和MOR08213的共同结合人ActRIIB转染的细胞的能力，并且报导了MOR08159单独(黑色粗体)或在MOR08213存在的情况下(粗体虚线)与同种型对照(黑色)或在MOR08213存在的情况下同种型对照(虚线)相比的特异性结合(图8)。
在MOR08213存在的情况下，MOR08159的结合显著降低，提示这两个抗体结合到相同位点上或可能具有某种程度重叠的位点上，或是MOR08213结合到不同但邻近的位点上，因此可能在空间上阻碍了MOR08159的结合。
表位作图
使用几种互补方法来测定抗体MOR08159结合的表位。在本实例中，残基编号参考全长ActRIIB氨基酸序列(SEQ ID NO：181)。
斑点印迹
进行MOR08159表位的斑点印迹分析。将天然和变性的(还原且热变性的)ActRIIB点到硝酸纤维素膜上，用MOR08159探测，并用标记的抗人抗体检测。仅检测到天然的ActRIIB而非还原且热变性的ActRIIB。该结果说明所述表位为构象表位。
突变研究
通过易错PCR来产生ActRIIB胞外域(aa 21-120)的文库并在大肠杆菌的周质中表达变体。通过菌落滤器筛选和western染色来检测那些变体中约30’000个(理论文库大小中的一小部分)与MOR08159的结合。通过ELISA进一步验证与MOR08159仅显示微弱结合或不结合的变体。将ActRIIB变体的表达水平(用抗Flag抗体检测)和MOR08159结合与野生型ActRIIB比较。如果表位是野生型的至少75％且与MOR08159的结合小于25％，则将该突变评定为参与MOR08159结合。仅考虑无明显结构扭曲的具有单个点突变(例如S-S桥键半胱氨酸的突变)的变体。
在K75至D81位置的一段序列中发现阻止MOR08159结合的大多数突变，说明该区域对于抗体结合是重要的。发现在W78、D80和D81位置上的突变显著降低了MOR08159结合。
环肽阵列
在肽微阵列上展示出的抗原来源的环肽集合与目的抗体温育。通过RepliTope分析来进行肽-抗体结合的测定，其中所述肽微阵列与一级抗体温育，随后与针对一级抗体的Fc部分的萦光标记的二级抗体温育。几次洗涤步骤后，用微阵列离心机将肽微阵列干燥并在具有合适的波长设定的高分辨率微阵列扫描系统中进行扫描。
所述微阵列由三个子阵列组成，每一个展示来自于ActRIIB的环肽(Cys残基交换为Ser)，扫描所述子阵列(肽扫描形式15/12)。作为对照实验，进行与不相关抗体(ACE18543，同位素对照)，随后与萦光标记的二级抗体(Cy-5标记的抗人IgG)的温育，来测定假阳性信号。此外，进行了与目的抗体，随后与萦光标记的二级抗体的温育。
显示抗体MOR08159(ACE19819)识别一个表位，其发现于三个所检测的肽中(nos.18-20)。
认为MOR08159结合的这些肽共同的序列为76GCWLDDFNC84(SEQ ID NO：186)。
使用该方法还鉴定到了具有更微弱结合特征的第二个区域。该第二区域具有序列49CEGEQDKRLHCYASW63(SEQ ID NO：187)。
X射线晶体学
表达人ActRIIB aa20-120和aa24-117。此外，表达并纯化MOR08159Fab和Fv区(在大肠杆菌中进行所有表达)。使用这些蛋白质，制备、纯化并结晶了四个蛋白质复合体(MOR08159Fab-ActRIIB 20-120、MOR08159Fab-ActRIIB 24-117、MOR08159Fv-ActRIIB 20-120、MOR08159Fv-ActRIIB 24-117)。
自由MOR08159 Fab的x射线结构解析到分辨率。Fv与ActRIIB-LBD复合体的x射线结构解析到分辨率。使用标准距离截断值来测定接触残基，证明了序列76GCWLDDFNC84是重要的区域，其具有来自78WLDDFN83序列(SEQ ID NO：188)的主要结合贡献。此外，还发现了与肽区域49CEGEQDKRLHCYASW63的相互作用。
在图9中总结了多种表位作图实验的结果。
通过SET验证亲和力
在PBS0.5％(w/v)BSA/0.02％(w/v)Tween 20中制备抗原(ActRIIB或ActRIIA的胞外域)的连续稀释液，并将抗体(MOR08159)加入到每一抗原浓度中以达到恒定的抗体浓度。一式两份将100μl/孔的每一稀释混合物分布到96孔聚丙烯MTP(Greiner)中。测定缓冲液作为阴性对照而不含抗原的样品作为阳性对照(Bmax)。将板密封并温育过夜。用在PBS中稀释的25μl 0.1μg/ml小鼠ActRIIB-Fc包被96-孔High Bind MTP(Meso ScaleDiscovery)。还密封该板并在4℃温育过夜。温育后，用PBS/0.05％(w/v)Tween 20洗涤抗原包被的High Bind MTP。随后，用PBS/5％(w/v)BSA封闭板。重复洗涤步骤并将来自聚丙烯MTP的50μl/孔抗体-抗原制剂转移至抗原包被的High Bind MTP中。所述High BindMTP在室温温育25分钟。经三次额外的洗涤步骤后，向每一孔中加入在测定缓冲液中稀释的25μl 1μg/ml的Sulfo-Tag标记的山羊抗人检测抗体(Meso Scale Discovery)，并在室温温育1小时。洗涤板后，向每一孔中转移50μlRead Buffer(Meso Scale Discovery)。产生并用Sector Imager 6000读数器(Meso Scale Discovery)检测电化学发光(ECL)信号。
将ECL值对相应的抗原浓度作图。通过用Piehler J等描述的拟合模型(J Immunol Methods；1997，201(2)：189-206)拟合曲线来测定KD。
从独立实验中获取的单个KD值来测定所报导的KD值和标准差。
从这些实验中，测定了人ActRIIB的解离平衡常数KD的均值为1.73(±0.31)pM，而ActRIIA的解离平衡常数KD的均值为434(±25)pM。
应理解的是，已经仅通过实施例描述了本发明，并且可进行修改，同时保持在本发明的范围和精神内。

Claims (8)

1.人单克隆治疗性抗ActRIIB抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，所述抗体或功能性蛋白质结合SEQ ID NO:181的氨基酸19-134之间的ActRIIB，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:99-112的至少一条具有至少95％序列同一性的VH多肽序列和与SEQ ID NO:85-98的至少一条具有至少95％序列同一性的VL多肽序列。
2.权利要求1的抗ActRIIB抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，所述抗体或功能蛋白质结合包含或由以下组成的表位：
(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN–SEQ ID NO:188)；
(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC–SEQ IDNO:186)；
(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY–SEQ IDNO:190)；
(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR–SEQ ID NO:189)；
(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW–SEQID NO:187)；或
(f)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)。
3.权利要求1或2的抗ActRIIB抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，其中所述抗体是IgG1同种型抗体。
4.根据任一前述权利要求的抗ActRIIB抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，其通过Fc区的突变具有改变的效应功能。
5.药物组合物，其包含权利要求1-4任何一项的抗ActRIIB抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
6.权利要求5的药物组合物，其还包含药学上可接受的稀释剂或载体。
7.权利要求5或6的药物组合物，其还包含一种或多种额外的活性剂。
8.权利要求1-4任何一项的抗ActRIIB抗体或包含其抗原结合部分的功能蛋白质，或权利要求5-7任何一项的药物组合物，其用作药物。
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