KR20120104490A - 근육 성장을 증가시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-액티빈 수용체 IIB (ActRIIB) 항체 분야에 관한 것이다. 특히, 근육 장애, 예컨대 질환 또는 불사용으로 인한 근육 소모를 치료하기 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

근육 성장을 증가시키기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING MUSCLE GROWTH}
본 발명은 항-액티빈 수용체 IIB (ActRIIB) 항체 분야에 관한 것이다. 특히, 근육 장애, 예컨대 질환 또는 불사용으로 인한 근육 소모를 치료하기 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
액티빈은 구조적으로 관련이 있는 신호전달 단백질인 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 슈퍼패밀리에 속하는 2량체성 성장 및 분화 인지이다. 액티빈은 적어도 2종의 유형 I (I 및 IB) 및 2종의 유형 II (II 및 IIB, 일명 ACVR2A 및 ACVR2B) 수용체를 포함하는 수용체 세린 키나제의 이종이량체 복합체를 통해 신호를 전달한다. 이들 수용체는 모두 시스테인-풍부 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 세린/트레오닌 특이성이 예상되는 세포질 도메인으로 구성된 막횡단 단백질이다. 유형 I 수용체는 신호전달에 본질적인 반면, 유형 II 수용체는 리간드에 결합하고 유형 I 수용체를 발현하는데 요구된다. 유형 I 및 II 수용체는 리간드 결합 이후에 안정한 복합체를 형성하여 유형 II 수용체에 의한 유형 I 수용체의 인산화를 야기한다.
액티빈 수용체 II B (ActRIIB)는 미오스타틴에 대한 수용체이다. 미오스타틴 및 이러한 수용체 사이의 상호작용은 Smad-의존성 경로를 통해 근골격 분화의 억제를 조절한다. 이에 따라, 미오스타틴의 ActRIIB에의 결합을 억제 또는 방지함으로써 골격근 형성을 유도할 수 있다.
다양한 그룹이 이를 조사하고 있다. 문헌 [Bogdanovich et al., Nature, 2002, 420:418-421]에는 항-미오스타틴 항체가 미오스타틴을 차단하여 마우스의 뒤시엔느(Duchenne) 근이영양증 모델에서 근육 질량을 증가시킬 수 있음이 기재되어 있다. 문헌 [Bradley et al., Cell Mol. Life Sci. 2008, 65:2119-2124]은 상기 항-미오스타틴 항체를 비롯하여 미오스타틴/ActRIIB 상호작용을 조정하고, 미오스타틴 프로펩티드를 투여하고, 폴리스타틴을 투여하여 미오스타틴 수용체를 차단하고, HDAC 억제제를 투여하여 폴리스타틴 생산을 유도하고, 미오스타틴이 수용체에 결합하는 것을 방지하는 변경된 미오스타틴 펩티드를 투여하고, 미오스타틴에 대해 가용성 디코이 수용체를 투여함으로써 성숙한 미오스타틴이 방출되는 것을 억제하기 위한 다양한 이용가능한 접근법을 검토하고 있다.
이러한 잠재적인 요법에도 불구하고, 환자를 치료하기 위해 이용가능한 제품은 전혀 존재하지 않는다. 실제로, 최근 한 회사는 그의 항-미오스타틴 항체 프로젝트를 취소하였다.
따라서, 환자의 근육 질량 및 힘을 증가시키는 방법에 대한 필요가 존재한다.
발명의 개시내용
ActRIIB 수용체에 대한 항체가 미오스타틴이 수용체에 결합하는 것을 방지하여, Smad-의존성 경로에 의한 근육 분화의 억제를 방지할 수 있음을 발견하였다. 이는 환자에서 근육 질량 및 힘을 증가시켰다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 항-ActRIIB 항체, 또는 상기 항체의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, ActRIIB는 인간 ActRIIB이다. 인간 ActRIIB의 폴리펩티드 서열은 서열 181 (AAC64515.1, GI:3769443)에 기재한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 기능적 단백질은 인간 또는 낙타류와 같은 기원을 갖는 포유동물 유래의 것이다. 따라서, 항체는 키메라, 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항-ActRIIB 항체는 표적 단백질 ActRIIB에 대해 특이적이고 ActRIIB 또는 ActRIIB의 단편에 결합하는 항원 결합 영역을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 항체는 요법에 사용하는데 적합하다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 효능작용 활성이 없거나 낮은 ActRIIB 길항제이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 기능적 단편은 표적 단백질 ActRIIB에 결합하고, 미오스타틴이 ActRIIB에 결합하는 것을 기저 수준으로 감소시킨다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 항체 또는 기능적 단편은 ActRIIB에 결합하는 미오스타틴의 양을 감소시킨다. 이러한 실시양태의 추가 측면에서, 항체 또는 기능적 단편은 미오스타틴이 ActRIIB에 결합하는 것을 완벽하게 방지한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 기능적 단편은 Smad 활성화를 억제한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 기능적 단편은 Smad-의존성 경로를 통한 골격 분화의 액티빈 수용체 유형 IIB 매개된 미오스타틴-유도된 억제를 억제한다.
결합은 항체에 의한 길항작용 또는 효능작용인 활성을 측정하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 검정을 이용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 검정은 ELISA에 의한 미오스타틴의 ActRIIB에 대한 결합의 억제, 미오스타틴 유도된 신호전달의 억제 (예를 들어 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의함), 미오스타틴 유도된 Smad 인산화의 억제 (P-Smad ELISA) 및 골격근 세포 분화의 미오스타틴 유도된 억제의 억제 (예를 들어 크레아틴 키나제 검정에 의함)를 포함하여, ActRIIB에 대한 항체의 적어도 하나의 효과를 측정한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 ActRIIB의 미오스타틴 결합 영역 (즉 리간드 결합 도메인)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 리간드 결합 도메인은 서열 181의 아미노산 19-134로 이루어지고, 이는 본원에서 서열 182로 지정하였다.
한 실시양태에서, 항체는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 ActRIIB에 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 100 pM 이하 (즉 100 pM, 50 pM, 10 pM, 1 pM 이하)의 친화도로 ActRIIB에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 10 내지 20 pM의 친화도로 ActRIIB에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 ActRIIB 관련 단백질과 교차 반응하지 않으며, 보다 특히 인간 ActRIIA (NP_001607.1, GI:4501897)와 교차 반응하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 ActRIIA 보다 ActRIIB에 우세하게 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 그것이 ActRIIA에 결합하는 것보다 5배, 보다 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 50배, 보다 더 바람직하게는 100배 더 큰 친화도로 ActRIIB에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 100 pM 이상 (즉 250 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM 이상)의 친화도로 ActRIIA에 결합한다.
한 실시양태에서 본 발명의 항체는 IgG2 이소형이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1 이소형이다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG1 이소형이며, Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 갖는다. 한 실시양태에서, 상기 변경된 이펙터 기능은 감소된 ADCC 및 CDC 활성이다. 한 실시양태에서, 상기 변경된 이펙터 기능은 침묵된 ADCC 및 CDC 활성이다.
또 다른 관련 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성 또는 CDC 활성이 없는 완전 인간 또는 인간화 IgG1 항체이며, 서열 181의 아미노산 19-134로 이루어진 ActRIIB 영역에 결합한다.
또 다른 관련 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성 또는 CDC 활성이 감소된 완전 인간 또는 인간화 IgG1 항체이며, 서열 181의 아미노산 19-134로 이루어진 ActRIIB 영역에 결합한다.
본 발명은 ActRIIB에 대한 미오스타틴의 결합을 억제하고, 시험관내 및 생체내에서 골격근 분화를 활성화시키는 단리된 항체, 특히 인간 또는 인간화 항체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래하고/거나 특정 구조적 특징, 예컨대 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역을 포함한다. 본 발명은 단리된 항체, 상기 항체의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 다가 또는 다중특이적 분자, 및 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, ActRIIB의 기능을 억제, 즉 길항작용하여 Smad 활성화를 억제하고, 이로써 골격근 분화를 유도하여, 예를 들어 병적 장애를 치료하기 위한, 항체의 이용 방법에 관한 것이다.
병적 장애는 근골격 질환 또는 장애, 예컨대 근육 위축일 수 있다. 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔, 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니솔론에 의한 치료의 결과를 비롯한, 수많은 근육 위축의 원인이 존재한다. 근육 위축은 또한 신경 외상으로 인한 탈신경의 결과, 또는 퇴행성, 대사성 또는 염증성 신경병증 (예를 들어, 길랑-바레 증후군, 말초 신경병증, 또는 환경 독소 또는 약물에 대한 노출)의 결과일 수 있다.
또한, 근육 위축은 근병증, 예컨대 근긴장증; 선천성 근병증 (네말린 근병증, 멀티/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증 포함); 미토콘드리아 근병증; 가족성 주기성 마비; 염증성 근병증; 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환으로 인한 것; 피부근염; 다발성근염; 봉입체 근염; 골화성 근염; 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨증의 결과일 수 있다.
근병증은 근이영양증 증후군, 예컨대 뒤시엔느(Duchenne), 베커(Becker), 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss), 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마(Fukuyama), 선천성 근이영양증, 또는 유전성 원위 근병증에 의해 유발될 수 있다. 근골격 질환은 또한 골다공증, 골절, 단신, 또는 왜소증일 수 있다.
또한, 근육 위축은 성인 운동 뉴런 질환, 영아 척수성 근육 위축, 근위축성 측삭 경화증, 소아 척수성 근육 위축, 다초점 전도 차단에 의한 자가면역 운동 신경병증, 졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비, 외상으로 인한 골격 고정화, 장기간 침상 안정, 수의 비활동, 불수의 비활동, 대사성 스트레스 또는 영양 부족, 암, AIDS, 단식, 갑상선 장애, 당뇨병, 양성 선천성 저긴장증, 중심핵병, 화상 손상, 만성 폐쇄성 폐 질환, 간 질환 (예컨대 섬유증, 경변증), 패혈증, 신부전, 울혈성 심부전, 노화, 우주 여행 또는 무중력 환경에서의 시간 소비의 결과일 수 있다.
치료가능한 연령-관련 상태의 예에는 근육감소증, 피부 위축, 근육 소모, 뇌 위축, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역 부전증, 고혈압, 치매, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 전립선암, 졸중, 감소된 기대 수명, 허약, 기억 상실, 주름, 신장 기능 장애 및 연령-관련 청력 상실; 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증 및 비만을 비롯한 대사 장애가 포함된다.
본 발명의 항체로 치료할 수 있는 다른 상태로는 급성 및/또는 만성 신장 질환 또는 부전, 간 섬유증 또는 경변증, 암, 예컨대 유방암, 파킨슨병; 뉴런 사멸과 관련된 상태, 예컨대 ALS, 뇌 위축, 또는 치매 및 빈혈이 포함된다.
추가의 상태에는 악액질, 류마티스 관절염 관련 악액질, 및 암 관련 악액질이 포함된다.
현재까지, 이러한 장애를 치료하기 위해 극소수의 믿을 만한 또는 효과적인 요법이 개발되어 있다.
간, 신장 및 폐 섬유증에 기여하는 다른 수용체들 중에서 ActRIIB에 대한 액티빈 결합의 역할에 대해 보고된 문헌 (문헌 [Werner and Alzheimer, Cytokine Growth Factors Rev 2006, 17(3):157-171]) 및 암에서의 미오스타틴, 액티빈, 또는 ActRIIB의 역할에 대해 보고된 문헌 (문헌 [Tsuchida et al., Endo J., 2008, 55(1):11-21])들에 기초하면, 본 발명의 항체는 간, 신장, 폐 섬유증, 및 횡문근육종, 골 손실 유도 암, 간세포 암종, 위장암으로 예시되지만 이들로 한정되는 것은 아닌 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
예방은 완전한, 예를 들어, 연령-관련 상태 또는 대사 장애의 완전 부재일 수 있다. 예방은 또한 부분적일 수 있어서, 대상체에서의 연령-관련 상태 또는 대사 장애의 발생 가능성이 본 발명의 항체를 수여받지 못한 대상체에서 발생하는 것보다 아마도 더 적을 것이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 기재되어 있다.
용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 감소를 초래하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
"신호 전달 경로" 또는 "신호전달 활성"은 단백질-단백질 상호 작용, 예컨대 수용체에 대한 성장 인자의 결합에 의해 일반적으로 개시되어, 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 전송시켜 주는 생화학적 인과 관계를 지칭한다. 일반적으로, 전송은 신호 전달을 유발시키는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기를 특이적으로 인산화시키는 것을 포함한다. 끝에서 두번째 과정에는 전형적으로, 유전자 발현을 변화시켜 주는 핵 사건이 포함된다.
용어 ActRIIB 또는 Act IIB 수용체는 서열 181에서 규정한 바와 같은 인간 ActRIIB (AAC64515.1, GI:3769443)를 지칭한다. 연구용 폴리클로날 및 모노클로날 항-ActRIIB 항체가 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 미국 미네소타주 소재의 R&D 시스템즈®에 의해 제조된 것들이 있다. 치료용 항-ActRIIB 항체는 종전에는 설명된 바 없었다. 물론, 항체를 다른 종으로부터의 ActRIIB에 대해 발생시켜 그러한 종의 병적 상태를 치료하는데 사용할 수 있다.
본원에서 지칭되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉 "항원 결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된, 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, VL이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 일컬어지는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있는데, 이들 영역 사이사이에는 프레임워크 영역 (FR)으로 일컬어지는 보다 보존된 영역이 존재한다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예를 들어 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단히 "항원 부분")은 본원에서 사용된 바와 같이 항원 (예를 들어, ActRIIB의 부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체, 또는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편); F(ab)2 단편 (힌지 영역에서 디술피드 가교로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
추가로, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 이들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 합성 펩티드 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 이들을 연결시킬 수 있고, 이에 따라 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)라 공지됨, 예를 들어 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 그러한 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 영역" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득하고, 상기 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 바와 같은 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 ActRIIB 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 ActRIIB 분자에 대한 교차 반응성을 지닐 수 있다. 추가로, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물인 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역를 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 그러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전, 또는 예를 들어 문헌 [Knappik, et al., 2000. J Mol Biol 296, 57-86]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는, 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래한 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하도록 의도된 것은 아니다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조말 동물 (예를 들어 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서는, 상기와 같은 재조합 인간 항체를 시험관내 돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용할 수 있으며, 그에 따라 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래하여 이들에 관련되지만, 천연적으로는 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용되는 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG2)를 지칭한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "ActRIIB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는" 항체는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 인간 ActRIIB 폴리펩티드에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. "ActRIIB 이외의 항원과 교차-반응하는" 항체는 10 x 10-9 M 이하, 5 x 10-9 M 이하, 또는 2 x 10-9 M 이하의 KD로 상기 항원에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. "특정 항원과 교차-반응하지 않는" 항체는 1.5 x 10-8 M 이상의 KD, 또는 5-10 x 10-8 M, 또는 1 x 10-7 M 이상의 KD로 상기 항원에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, 항원과 교차-반응하지 않는 항체는 표준 결합 분석에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출불가능한 결합을 나타낸다. KD는 비아코어® 시스템과 같은 바이오센서 시스템 또는 용액 평형 적정(Solution Equilibrium Titration)을 사용하여 측정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "길항제 항체"는 미오스타틴의 존재하에 ActRIIB 유도된 신호전달 활성을 억제하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 이를 검출하기 위한 검정의 예는 미오스타틴 유도된 신호전달의 억제 (예를 들어 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의함), 미오스타틴 유도된 Smad 인산화의 억제 (P-Smad ELISA) 및 미오스타틴 유도된 골격근 세포 분화 억제의 억제 (예를 들어 크레아틴 키나제 검정에 의함)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의한 측정시 10 nM 이하, 1 nM 이하 또는 100 pM 이하의 IC50으로 미오스타틴 유도된 신호전달을 억제한다.
본원에 사용된 바와 같은 "효능작용 활성이 없는" 항체는 세포 기반 검정, 예컨대 미오스타틴 유도된 신호전달의 억제 (예를 들어 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의함), 미오스타틴 유도된 Smad 인산화의 억제 (P-Smad ELISA) 및 미오스타틴 유도된 골격근 세포 분화의 억제의 억제 (예를 들어 크레아틴 키나제 검정에 의함)에서 미오스타틴의 부재하에 ActRIIB 매개된 신호전달 활성을 현저하게 증가시키지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 이같은 검정은 이하의 실시예에서 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것으로 의도되고, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, Ka에 대한 Kd의 비율 (즉, Kd/Ka)로부터 구하며 몰 농도 (M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 측정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 비아코어®의 바이오센서 시스템 또는 용액 평형 적정 (SET)을 이용하는 것에 의한다 (문헌 [Friguet B et al., (1985) J. Immunol Methods; 77(2): 305-319], 및 [Hanel C et al., (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-184] 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 항원과 상호작용하고, 상호작용이 많을수록 친화도가 더 강하다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도에 관한 유용한 척도를 지칭한다. 이는 항체 에피토프 친화도, 항원과 항체 둘 다의 원자가, 및 상호작용 부분의 구조적 정렬의 3가지 주요 인자에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 규정한다.
본원에 사용된 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포성 세포독성" 활성은 인간 B 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 당업자에게 공지되어 있는 인간 B 세포 고갈 검정으로 측정할 수 있다.
보다 높은 결합력의 프로브를 얻기 위해서, 이량체 접합체 (FACS 마커에 커플링된 항체 단백질의 2개 분자)를 구축하여 FACS에 의해 (예컨대 배선 항체와의) 저친화도 상호작용이 보다 쉽게 검출되도록 할 수 있다. 또한, 항원 결합의 결합력을 증가시키는 다른 수단은 항-ActRIIB 항체의 본원에 기재된 임의의 구축물의 이량체, 삼량체 또는 다량체를 생성하는 것을 포함한다. 그러한 다량체는 예를 들어, 천연 C→N-말단 결합을 모방함으로써 또는 그의 불변 영역을 통해 함께 유지되는 항체 이량체를 모방함으로써 개별 모듈들 사이의 공유 결합을 통해 생성할 수 있다. Fc/Fc 계면 내로 설계된 결합은 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 또한, Fc 이외의 이량체화 또는 다량체화 파트너가 그러한 보다 고차의 구조를 생성하기 위해 ActRIIB 하이브리드에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 다량체화 도메인, 예컨대 WO2004/039841에 기재되어 있는 삼량체화 도메인 또는 WO98/18943에 기재된 오량체화 도메인을 사용하는 것이 가능하다.
본원에 사용된 용어 항체에 대한 "선택성"은 특정 표적 폴리펩티드에 결합하지만 밀접하게 관련된 폴리펩티드에는 결합하지 않는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 항체에 대한 "고 친화도"는 표적 항원에 대해 1 nM 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다.
용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia)의 세포 또는 트리코데르마(Trichoderma)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열이라고도 공지됨)을 완전하게 또는 가능한 만큼 많이 보유하도록 조작된다. 최적화된 서열은 본원에서 CHO 포유동물 세포에 바람직한 코돈을 갖도록 조작되지만, 다른 진핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현이 또한 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 역시 최적화된 것으로 지칭된다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재한다.
예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 비롯한 다양한 종의 ActRIIB를 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정이 당업계에 공지되어 있다. 적합한 검정을 실시예에서 상세하게 기재한다. 항체의 결합 친화도는 또한 당업계에 공지되어 있는 표준 검정에 의해, 예컨대 비아코어 분석 또는 용액 평형 적정에 의해 측정할 수 있다. 비아코어와 같은 표준 플라즈몬 공명을 기반으로 하는 기술로는 결합 역학을 측정할 수 있어, 결합 친화도의 계산이 가능하다. ActRIIB의 기능적 특성 (예를 들어, 수용체 결합, 인간 B 세포 증식 또는 IgG 생산의 방지 또는 유도)에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 검정이 실시예에 보다 상세히 기재되어 있다.
따라서, 당업계에 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법에 따라 측정된 바와 같은 하나 이상의 이들 ActRIIB의 기능적 특성 (예를 들어, 생화학, 면역화학, 세포성, 생리학적 또는 다른 생물학적 활성 등)을 "억제하는" 항체는 항체의 부재하에서 (또는, 예를 들어 비관련 특이성의 대조군 항체가 존재할 때) 관찰되는 것에 비해 특정 활성이 통계적으로 유의하게 감소되는 것과 관련되는 것으로 이해될 것이다. ActRIIB 활성을 억제하는 항체는 측정된 파라미터의 적어도 10％, 적어도 50％, 80％ 또는 90％ 만큼의 통계적으로 유의한 감소를 일으키고, 특정 실시양태에서 본 발명의 항체는 ActRIIB 기능적 활성을 95％, 98％ 또는 99％를 초과하여 억제할 수 있다.
용어 "교차-차단", "교차-차단된" 및 "교차-차단하는"은 본원에서 서로 구별없이 사용되며, 표준 경쟁 결합 검정에서 항체 또는 다른 결합제가 ActRIIB, 특히 리간드 결합 도메인에 대한 다른 항체 또는 결합제의 결합을 방해하는 능력을 의미한다.
항체 또는 다른 결합제가 ActRIIB에 대한 또 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 이로써 본 발명에 따라 교차-차단한다고 할 수 있는지 여부는 표준 경쟁 결합 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 한 가지 적합한 검정은 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술 (예를 들어 비아코어 기기 (비아코어, 스웨덴 웁살라 소재)를 사용함)의 이용을 포함한다. 교차-차단을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA에 기초한 접근법을 이용한다. 추가의 검정은 FACS 분석을 이용하며, 이는 ActRIIB 발현 세포에의 결합에 대한 다양한 항체의 경쟁을 시험한다 (실시예에서 기재한 바와 같음).
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 교차-차단 항체 또는 다른 결합제는 기재된 비아코어 교차-차단 검정에서 항체 또는 결합제의 조합물 (혼합물)의 기록된 결합이 조합된 2개의 항체 또는 결합제의 최대 이론적 결합 (상기에서 규정함)의 80％ 내지 0.1％ (예를 들어 80％ 내지 4％), 구체적으로 최대 이론적 결합의 75％ 내지 0.1％ (예를 들어 75％ 내지 4％), 보다 구체적으로 70％ 내지 0.1％ (예를 들어 70％ 내지 4％), 보다 구체적으로 최대 이론적 결합의 65％ 내지 0.1％ (예를 들어 65％ 내지 4％)가 되도록 ActRIIB에 결합한다.
시험 항체가 양성 대조군 웰 (즉 동일한 항-ActRIIB 항체 및 ActRIIB, 그러나 "시험" 교차 차단 항체는 아님)과 비교하여 ActRIIB에 대한 항-ActRIIB 항체의 결합을 60％ 내지 100％, 구체적으로 70％ 내지 100％, 및 보다 구체적으로 80％ 내지 100％ 만큼 감소시킬 수 있다면, 항체는 ELISA 검정에서 본 발명의 항-ActRIIB 항체를 교차 차단하는 것으로 정의된다. 본원에서 언급하는 교차 차단 항체의 예는 MOR08159 및 MOR08213이다. 따라서, 본 발명은 ActRIIB에의 결합에 대해 MOR08159 또는 MOR08213을 교차 차단하는 항체를 제공한다.
재조합 항체
본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같은 단리되고 구조적으로 특성화된 인간 재조합 항체를 포함한다. 단리된 본 발명의 항체의 VH 아미노산 서열을 서열 99-112에 나타낸다. 단리된 본 발명의 항체의 VL 아미노산 서열을 서열 85-98에 각각 나타낸다. 본 발명의 항체의 바람직한 전장 중쇄 아미노산 서열의 예는 서열 서열 146-150 및 156-160에 나타낸다. 본 발명의 항체의 바람직한 전장 경쇄 아미노산 서열의 예는 서열 141-145 및 151-155에 각각 나타낸다. 본 발명의 그 밖의 항체는 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되었지만, CDR 영역에서 상기에서 기재한 서열로 열거한 CDR 영역과 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 97 또는 99 동일성 백분율을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 상기에서 기재한 서열로 열거한 CDR 영역과 비교하여 CDR 영역에서 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 가변 중쇄 모 뉴클레오티드 서열을 서열 127-140에 나타낸다. 가변 경쇄 모 뉴클레오티드 서열은 서열 113-126에 나타낸다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 서열 161-165 및 171-175에 나타낸다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열은 서열 166-170 및 176-180에 나타낸다. 본 발명의 그 밖의 항체는 돌연변이되었지만 상기에서 기재한 서열과 적어도 60 (즉 80, 90, 95, 97, 99 이상) 퍼센트 이상의 동일성을 갖는 아미노산 또는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 상기에서 기재한 서열로 열거한 가변 영역과 비교하여 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
각각의 이들 항체가 동일한 에피토프에 결합하고 몇몇 모 항체로부터 유래되었기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 항-ActRIIB 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 ActRIIB 결합을 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어 ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 99-112로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 85-98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 단리된 재조합 항-ActRIIB 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(i) 서열 99-112로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄; 및 서열 85-98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 재조합 항-ActRIIB 항체, 또는
(ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질
을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(i) 서열 127-140으로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 전장 중쇄, 및 서열 113-126으로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 전장 경쇄를 갖는 단리된 재조합 항-ActRIIB 항체, 또는
(ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질
을 제공한다.
항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 1-14에 나타낸다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 15-28에 나타낸다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 29-42에 나타낸다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 43-56에 나타낸다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 57-70에 나타낸다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 71-84에 나타낸다. CDR 영역은 카바트 시스템 (문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication number 91-3242])을 이용하여 기재된다. CDR 영역을 결정하는 대안적 방법은 코티아에 의해 고안된 방법을 이용한다 (문헌 [Chothia et al., 1989, Nature, 342:877-883]). 코티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기초로 한다. 그러나, 코티아에 의해 사용되는 넘버링 시스템에서의 변화로 인해 (예를 들어 http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/GeneralInfo.html 및 http://www.bioinf.org.uk/abs/ 참조), 이 시스템은 현재 덜 흔하게 사용된다. CDR을 규정하기 위한 다른 시스템이 존재하며, 상기 두 사이트에 또한 언급되어 있다.
각각의 이들 항체가 ActRIIB에 결합할 수 있고, 항원 결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공되면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있으며 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있음), VH CDR1, 2 및 3, 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유하는 각각의 항체는 본 발명의 다른 항-ActRIIB 결합 분자를 생성한다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 ActRIIB 결합을 상기 및 실시예에 기재된 결합 검정 (예를 들어 ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 당업자에게는, 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 나타낸 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음이 매우 명확할 것이다.
단리된 재조합 항-ActRIIB 항체, 또는 그의 항원 결합 영역은 서열 1-14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 15-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 29-42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 43-56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 57-70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 71-84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 갖는다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 15의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 29의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 43의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 57의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 71의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 16의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 30의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 44의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 58의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 72의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 31의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 45의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 59의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 73의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 4의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 18의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 32의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 46의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 60의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 74의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 5의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 33의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 47의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 61의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 75의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 6의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 20의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 34의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 48의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 62의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 76의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 7의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 21의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 35의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 49의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 63의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 77의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 8의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 36의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 50의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 78의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 9의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 23의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 37의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 51의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 79의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 10의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 24의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 38의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 52의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 66의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 80의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 11의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 25의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 39의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 53의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 67의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 81의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 12의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 26의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 40의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 54의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 68의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 82의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 13의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 27의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 41의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 55의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 69의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 83의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체는 서열 14의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 28의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 42의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 56의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 70의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 84의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 85의 가변 중쇄 서열 및 서열 99의 가변 경쇄 서열; (b) 서열 86의 가변 중쇄 서열 및 서열 100의 가변 경쇄 서열; (c) 서열 87의 가변 중쇄 서열 및 서열 101의 가변 경쇄 서열; (d) 서열 88의 가변 중쇄 서열 및 서열 102의 가변 경쇄 서열; (e) 서열 89의 가변 중쇄 서열 및 서열 103의 가변 경쇄 서열; (f) 서열 90의 가변 중쇄 서열 및 서열 104의 가변 경쇄 서열; (g) 서열 91의 가변 중쇄 서열 및 서열 105의 가변 경쇄 서열; (h) 서열 92의 가변 중쇄 서열 및 서열 106의 가변 경쇄 서열; (i) 서열 93의 가변 중쇄 서열 및 서열 107의 가변 경쇄 서열; (j) 서열 94의 가변 중쇄 서열 및 서열 108의 가변 경쇄 서열; (k) 서열 95의 가변 중쇄 서열 및 서열 109의 가변 경쇄 서열; (l) 서열 96의 가변 중쇄 서열 및 서열 110의 가변 경쇄 서열; (m) 서열 97의 가변 중쇄 서열 및 서열 111의 가변 경쇄 서열; 또는 (n) 서열 98의 가변 중쇄 서열 및 서열 112의 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 146의 중쇄 서열 및 서열 141의 경쇄 서열; (b) 서열 147의 중쇄 서열 및 서열 142의 경쇄 서열; (c) 서열 148의 중쇄 서열 및 서열 143의 경쇄 서열; (d) 서열 149의 중쇄 서열 및 서열 144의 경쇄 서열; (e) 서열 150의 중쇄 서열 및 서열 145의 경쇄 서열; (f) 서열 156의 중쇄 서열 및 서열 151의 경쇄 서열; (g) 서열 157의 중쇄 서열 및 서열 152의 경쇄 서열; (h) 서열 158의 중쇄 서열 및 서열 153의 경쇄 서열; (i) 서열 159의 중쇄 서열 및 서열 154의 경쇄 서열; 또는 (j) 서열 160의 중쇄 서열 및 서열 155의 경쇄 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 (즉, 동일성 ％가 가장 큰 것)인 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선별함으로써 확인할 수 있다. 특정 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 배선 서열에 비해, 예를 들어 자연 발생하는 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 가질 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로, 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 90％이고, 기타 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교시 인간 항체를 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유하고 있다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 적어도 80％, 90％, 또는 적어도 95％, 또는 심지어 적어도 96％, 97％, 98％, 또는 99％일 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 pBW522 또는 pBW524 (2009년 8월 18일자로 독일 D-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7B 소재의 DSMZ에 각각 기탁 번호 DSM22873 및 DSM22874 하에 기탁됨)으로 코딩된 것이다.
상동성 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 항체의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 상동성인 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열; 전장 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 가변 영역 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 또는 가변 영역 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항체는 본 발명의 항-ActRIIB 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 재조합 항-ActRIIB 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질)를 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 99-112로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80％, 또는 적어도 90％ (바람직하게는 적어도 95, 97 또는 99％) 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열 85-98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80％, 또는 적어도 90％ (바람직하게는 적어도 95, 97 또는 99％) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다: (i) 시험관내 또는 생체내에서 미오스타틴 결합을 억제하고/거나 (ii) Smad-의존성 경로를 통해 근육 분화의 억제를 감소시킴.
추가의 예에서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단리된 재조합 항-ActRIIB 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질)를 제공하며, 여기서 전장 중쇄는 서열 146-150 및 156-160으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80％, 또는 적어도 90％ (바람직하게는 적어도 95, 97 또는 99％) 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 전장 경쇄는 서열 141-145 및 151-155로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80％, 또는 적어도 90％ (바람직하게는 적어도 95, 97 또는 99％) 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 항체는 하기 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다: (i) 시험관내 또는 생체내에서 미오스타틴 결합을 억제하고/거나 (ii) Smad-의존성 경로를 통해 근육 분화의 억제를 감소시킴. 바람직하게는 이같은 항체는 ActRIIB의 리간드 결합 도메인에 결합한다.
또 다른 예에서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단리된 재조합 항-ActRIIB 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질)를 제공하며, 여기서 전장 중쇄는 서열 166-170 및 176-180으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80％, 또는 적어도 90％ (바람직하게는 적어도 95, 97 또는 99％) 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 전장 경쇄는 서열 161-165 및 171-175로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80％, 또는 적어도 90％ (바람직하게는 적어도 95, 97 또는 99％) 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며, 항체는 하기 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다: (i) 시험관내 또는 생체내에서 미오스타틴 결합을 억제하고/거나 (ii) Smad-의존성 경로를 통해 근육 분화의 억제를 감소시킴. 바람직하게는 이같은 항체는 ActRIIB의 리간드 결합 도메인에 결합한다.
다양한 실시양태에서, 항체는 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 상기 논의된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 완전 인간 IgG1 항체이다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기에서 언급한 서열과 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 각각 서열 99-112 및 서열 85-98의 VH 및 VL 영역에 대해 높은 (즉, 80％ 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 각각 핵산 분자 서열 127-140 및 113-126을 돌연변이유발 (예를 들어 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)시킨 후, 코딩된 변경된 항체를 본원에서 기재하는 기능적 검정을 이용하여 보유 기능 (즉, 상기에서 언급한 기능)을 시험하여 수득할 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 상기에서 언급한 서열과 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 각각 서열 146-150 및 156-160 중 임의의 전장 중쇄 및 서열 141-145 및 151-155 중 임의의 전장 경쇄와 높은 (즉, 80％ 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 각각 핵산 분자 서열 166-170 및 176-180 및 서열 161-165 및 171-175을 돌연변이유발 (예를 들어 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)시킨 후, 코딩된 변경된 항체를 본원에서 기재하는 기능적 검정을 이용하여 보유 기능 (즉, 상기에서 언급한 기능)을 시험하여 수득할 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 상기에서 언급한 서열과 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.
다른 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 상기에서 언급한 서열과 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 동일성 백분율은, 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하면서 그 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수에 대한 함수이다 (즉, ％ 동일성 = 동일 위치의 수/위치의 전체 수x100). 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율의 결정은 하기하는 바와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 이용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입되어 있는 E. 메이어(E. Meyers) 및 W. 밀러(W. Miller)의 알고리즘 (문헌 [Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988])을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 블로썸(Blossom) 62 행렬 또는 PAM250 행렬, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)에 혼입되어 있는 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch) (문헌 [J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970]) 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반을 둔 특정 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 항-ActRIIB 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 재조합 항-ActRIIB 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 1-14 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 15-28 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 29-42 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 43-56 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 57-70 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 71-84 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 항체는 하기 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다: (i) 시험관내 또는 생체내에서 미오스타틴 결합을 억제하고/거나 (ii) Smad-의존성 경로를 통해 근육 분화의 억제를 감소시킴.
다양한 실시양태에서, 항체는 상기에서 열거한 기능적 특성 중 하나 또는 둘 모두를 나타낼 수 있다. 이같은 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 갖고, 여기서 이들 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형을 기초로 하는 특정 아미노산 서열을 갖고, 상기 항체는 본 발명의 항-ActRIIB 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어진 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 단리된 모노클로날 항-ActRIIB 항체를 제공하며, 여기서 전장 중쇄는 서열 146-150 및 156-160 및 그의 보존적 변형으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 전장 경쇄는 서열 141-145 및 151-155 및 그의 보존적 변형으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 항체는 하기 기능적 특성 중 적어도 하나를 나타낸다: (i) 시험관내 또는 생체내에서 미오스타틴 결합을 억제하고/거나 (ii) Smad-의존성 경로를 통해 근육 분화의 억제를 감소시킴.
다양한 실시양태에서, 항체는 상기에서 열거한 기능적 특성 중 하나 또는 둘 모두를 나타낼 수 있다. 이같은 항체는, 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서 사용할 때, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 그러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의하여 본 발명의 항체에 도입될 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변형된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 보유 기능에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 항-ActRIIB 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 기재하는 본 발명의 다양한 특정 항-ActRIIB 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. ActRIIB에 대한 미오스타틴의 결합을 차단할 수 있는 실시예에서 기재하는 모든 항체는 ActRIIB 내의 동일한 에피토프에 높은 친화도로 결합하고, 상기 에피토프는 서열 181의 아미노산 19-134로 구성된다.
따라서, 추가의 항체는 표준 ActRIIB 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체와 교차-경쟁하는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 인간 ActRIIB에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은, 시험 항체가 인간 ActRIIB에 대한 결합에 대해 상기 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고; 그러한 항체는 비-제한적인 이론에 따르면 그가 경쟁하는 항체와 인간 ActRIIB 상의 동일한 또는 관련 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 인간 ActRIIB 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 재조합 항체이다. 이러한 인간 재조합 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 제조하고 단리할 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 85에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 99에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 86에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 100에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 87에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 101에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 88에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 102에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 89에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 103에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 90에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 104에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 91에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 105에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 92에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 106에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 93에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 107에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 94에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 108에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 95에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 109에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 96에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 110에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 97에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 111에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 서열 98에 기재된 가변 중쇄 서열 및 서열 112에 기재된 가변 경쇄 서열을 갖는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
보다 상세한 에피토프 맵핑 실험에 따르면, 본 발명의 바람직한 항체의 결합 영역이 보다 분명하게 규정된다.
따라서, 본 발명은 서열 181의 아미노산 78-83 (
Figure pct00001
)을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 181의 아미노산 76-84 (
Figure pct00002
)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 181의 아미노산 75-85 (
Figure pct00003
)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 181의 아미노산 52-56 (
Figure pct00004
)을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 181의 아미노산 49-63 (
Figure pct00005
)을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 이러한 서열로 이루어진 에피토프 또는 이러한 에피토프 영역의 조합을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 서열 181의 아미노산 78-83 (WLDDFN) 및 서열 181의 아미노산 52-56 (EQDKR)을 포함하거나 이들로 이루어지는 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
조작되고 변형된 항체
추가로, 본 발명의 항체는, 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 제시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 별법적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시키는 것에 의해 조작되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 가지 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 밖의 서열보다 개개의 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 다양한 특성을 갖는 다양한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정 천연발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 천연발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 1-14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 15-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 29-42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 43-56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 57-70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 71-84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항-ActRIIB 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체와 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 간행된 문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., [상기 문헌]]; [Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열을 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역으로 그라프팅시킬 수도 있고, 또는 CDR 서열을 배선 서열과 비교해서 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역으로 그라프팅시킬 수도 있다. 예를 들어, 특정의 경우에는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증강시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어 미국 특허 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써, 관심 항체의 한 가지 이상 결합 특성 (예를 들어 친화성)을 개선시키는 것이다 ("친화성 성숙"로서 공지됨). 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)을 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 본원에 기재된 바와 같고 실시예에서 제공되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가할 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 추가로, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-14, 또는 서열 1-14와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 15-28, 또는 서열 15-28과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 29-42, 또는 서열 29-42와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역; 서열 43-56, 또는 서열 43-56과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 52-70, 또는 서열 52-70과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 71-84, 또는 서열 71-84와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 항-ActRIIB 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질을 제공한다.
대안적 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항원 결합 도메인의 그라프팅
생성된 폴리펩티드가 ActRIIB에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 영역을 포함하는 한, 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 이같은 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5가지 주요 이디오타입, 또는 그의 단편 (예컨대 본원의 다른 곳에 기술된 것들)을 포함하고, 다른 동물 종 (바람직하게는 인간화 측면을 갖는 것)의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 단일 중쇄 항체, 예컨대 낙타류에서 확인된 것들에 특별한 관심이 있다. 신규한 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 당업자에 의해 계속 발견되고 개발된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그라프팅될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기반 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 서열 181 (바람직하게는, 서열 182에 나타낸 바와 같은 그의 리간드 결합 도메인)의 표적 단백질에 대해 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 미래의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드를 사용할 수 있다. 그러한 화합물은 본원에서 "표적-특이적 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"로서 공지되어 있다. 비-이뮤노글로불린 프레임워크의 예는 다음 섹션 (낙타류 항체 및 비-항체 스캐폴드)에서 추가로 설명한다.
낙타류 항체
신세계 구성원, 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉 낙타 패밀리 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로마데리우스(Camelus dromaderius))의 구성원으로부터 얻은 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합도 및 항원성에 관하여 특징규명하였다. 자연계에서 발견되는 바와 같이 이러한 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 없어서, 다른 동물로부터의 항체의 경우에서의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 상이하다 (WO94/04678 참조).
VHH로서 확인되는 소형 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 소형 단백질이 생성되어 "낙타류 나노바디"로 공지되어 있는 저분자량 항체-유래 단백질이 생성되도록 하는 유전자 조작에 의해 수득할 수 있다 (US5,759,808; 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004J Biol Chem 279: 1256-1261]; [Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788]; [Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448]; [Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89: 456-62]; 및 [Lauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17: 3512-3520] 참조). 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 시판되고 있으며, 예를 들어 아블린크스 (Ablynx) (벨기에 겐트 소재)가 시판한다. 비-인간 기원의 다른 항체와 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열을 재조합 방식으로 변경시켜 인간 서열과 보다 근접하게 유사한 서열을 수득할 수 있으며, 즉, 나노바디를 "인간화"할 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연적으로 낮은 항원성을 추가로 저하시킬 수 있다.
낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터에 불과한 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기가 갖는 결과 중 하나는 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고, 즉, 낙타류 나노바디는 고전적인 면역학적 기술을 이용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기가 갖는 또 다른 결과는, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로 억제할 수 있기 때문에 고전적인 항체의 기능보다 고전적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 작용할 수 있다는 것이다.
이러한 저분자량 및 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고 극한 pH 및 단백질분해적 소화에 대해서도 안정적이고 낮은 항원성을 갖는 낙타류 나노바디가 추가로 생성된다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 쉽게 이동하고 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈뇌 장벽을 횡단하여 약물 수송을 용이하게 할 수 있다 (US2004/0161738 참조). 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이러한 특징은 높은 치료 잠재력을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 ActRIIB에 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 천연적으로 생산되는데, 즉, 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 이용하여 ActRIIB 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후의 낙타류에 의해 생산된다. 별법적으로, 항-ActRIIB 낙타류 나노바디는 조작되며, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 ActRIIB를 사용하는 패닝 절차를 이용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선별하는 것에 의해 생산된다. 조작된 나노바디는 수용자 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 맞춤 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 WO94/04678에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열에 그라프팅하여 수득하였다.
비-항체 스캐폴드
공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드에는 애드넥틴 (Adnectin) (피브로넥틴) (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월담 소재), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히 소재), 도메인 항체 (도만티스, 엘티디(Domantis, Ltd), 매사추세츠주 캠브리지 소재) 및 아블린크스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 즈비나아르데 소재), 리포칼린 (안티칼린) (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징 소재), 소형 모듈 면역-의약품 (small modular immuno-pharmaceuticals) (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱톤주 시애틀 소재), 맥시바디(maxybody) (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴 소재) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스킬 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레 소재), 단백질 에피토프 모방체 (폴리포르 엘티디(Polyphor Ltd), 스위스 알슈빌 소재)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
(i) 피브로넥틴 스캐폴드
피브로넥틴 스캐폴드는 바람직하게는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))에 기반한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7개 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥들을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 적어도 3개의 그러한 루프가 존재하고, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418).
이러한 피브로넥틴-기재의 스캐폴드는 이뮤노글로불린은 아니지만, 전반적인 폴드(fold)는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 항체의 것과 성질 및 친화도에서 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이러한 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링(shuffling) 전략에서 사용될 수 있다. 이러한 피브로넥틴-기재의 분자는 표준 클로닝 기술을 이용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로 사용될 수 있다.
(ii) 안키린 - 분자 파트너
이 기술은 다양한 표적들에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 지니기 위해 안키린 유래 반복 모듈이 있는 단백질을 스캐폴드로 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행한 α-나선 및 β-턴으로 이루어진 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보좀 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
(iii) 맥시바디/아비머 - 아비디아
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1에서 유래된다. 이러한 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기초로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 수많은 상이한 "A-도메인" 단량체들 (2개 내지 10개)로 이루어진다. 예를 들어 US2004/0175756; US2005/0053973; US2005/0048512; 및 US2006/0008844에 기재되어 있는 방법을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머를 제작할 수 있다.
(vi) 단백질 A - 아피바디
아피바디® 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기초로 하는 3개의 나선 다발로 구성된 소형의 단순한 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디® 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피바디® 분자는 항체를 모방하고, 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 그의 분자량은 6 kDa이다. 아피바디® 분자는 작은 크기에도 불구하고 이것의 결합 부위가 항체의 결합 부위와 유사하다.
(v) 안티칼린 - 피에리스
안티칼린®은 피에리스 프로테오랩 아게라는 회사가 개발한 제품이다. 이것은 화학적으로 감수성이 있거나 불용성인 화합물의 생리적인 수송 또는 저장에 일반적으로 포함되는 광범위한 군의 작고 강한 단백질인 리포칼린으로부터 유래된다. 여러가지 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다.
단백질 구조는 초가변 루프가 단단한 프레임워크의 최상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 이것의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160개 내지 180개 아미노산 잔기의 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어져서 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간만 더 크다.
결합 포켓을 이루는, 4개 루프의 세트는 두드러진 구조적 유연성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 독점적인 방법에서는 상이한 형태의 규정된 표적 분자들을 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 결합 부위를 재성형시킬 수 있다.
리포칼린 패밀리의 단백질 중 하나인, 피에리스 브라시카애(Pieris brassicae)의 빌린(bilin)-결합 단백질 (BBP)이, 4개 루프 세트의 돌연변이유발에 의해 안티칼린을 개발하는데 사용되어 왔다. "안티칼린"이 기술된 특허 출원의 한 예는 WO1999/16873이다.
(vi) 아필린 - Scil 단백질
아필린™ 분자는 단백질 및 소분자를 향한 특이적 친화도를 위해 설계된 작은 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 새로운 아필린™ 분자는 그 각각이 상이한 인간 유래 스캐폴드 단백질에 기초하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다.
아필린™ 분자는 이뮤노글로불린 단백질에 대해 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. Scil 단백질은 하나는 인간의 구조적 눈 렌즈 단백질인 감마 결정질이고 다른 하나는 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질인 2개의 아필린™ 스캐폴드를 사용한다. 인간 스캐폴드는 둘 모두 매우 작고, 고온 안정성을 나타내며, pH 변화 및 변성제에 거의 내성을 갖는다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO2001/004144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004/106368에 기재되어 있다.
(vii) 단백질 에피토프 모방체 (PEM)
PEM은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로는, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 이러한 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 구조로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해, 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이" 항체 역시 본 발명에 포함된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로 불리며, US2003/0153043에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형과는 별법적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원 의존성 세포성 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학 모이어티를 항체에 부착시킬 수 있음), 그의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 지수의 넘버링이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 US5,677,425에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜서 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 1개 이상의 아미노산 돌연변이는, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코쿠스의 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 US 6,165,745에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, US6,277,375에 기재되어 있는 바와 같이, 다음 돌연변이 중 하나 이상을 도입할 수 있다: T252L, T254S, T256F. 별법적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, US5,869,046 및 US6,121,022에 기재되어 있는 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 유래된 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 항체의 CH1 또는 CL 영역 내를 변경시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 이펙터 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원 결합 능력은 보유하게 할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 US5,624,821 및 US5,648,260 (둘 모두 Winter et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다. 특히, 잔기 234 및 235를 돌연변이시킬 수 있다. 특히, 이러한 돌연변이는 알라닌으로 이루어질 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 항체는 아미노산 234 및 235 중 하나 또는 둘 모두에서 Fc 영역 내에 돌연변이를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 234 및 235 중 하나 또는 둘 모두는 알라닌으로 치환될 수 있다. 아미노산 234 및 235 둘 모두의 알라닌으로의 치환은 ADCC 활성을 감소시킨다.
또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜서 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 저하되거나 파괴된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 US6,194,551에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 WO94/29351에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력이 증가되고/되거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형된다. 이러한 접근법은 WO00/42072에 추가로 상세하게 기재되어 있다. 추가로, 인간 IgG1에서 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재된 바 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화 항체를 제조할 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 하나 이상의 아미노산 치환을 만들 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
추가로 또는 별법적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시켜서 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 항체는 저푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서의 재조합 발현에 의해 생산된다. WO03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고 있으며, 이로 인해 상기 숙주 세포 내에서 발현된 항체에서 저푸코실화가 일어난다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). WO99/54342에는 당단백질을 변형시키는 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주가 기재되어 있는데, 이와 같이 조작된 세포주 내에서 발현된 항체는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성이 증가시킨다 (또한, 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 별법적으로, 본 발명의 항체는 포유동물-유사 글리코실화 패턴으로 조작되고, 글리코실화 패턴으로서 항체 결핍 푸코스를 생성할 수 있는 효모 또는 사상 진균에서 생산될 수 있다 (예를 들어, EP1297172B1 참조).
본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형으로서는 PEG화가 있다. 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해, 항체를 PEG화할 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응으로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 기타 단백질, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 온 모든 형태의 PEG를 포괄한다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다 (예를 들어 EP0154316 및 EP0401384 참조).
본 발명에서 고려되는 항체의 또 다른 변형은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편에 대한 적어도 본 발명의 항체의 항원 결합 영역의 접합 또는 단백질 융합이다 (예를 들어 EP0322094 참조).
또 다른 가능성은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 단백질에 대한 적어도 본 발명의 항체의 항원 결합 영역의 융합이다(예를 들어 EP0486525 참조).
변경된 항체의 조작 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 나타낸 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항-ActRIIB 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시켜서 새로운 항-ActRIIB 항체를 제작할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항-ActRIIB 항체의 구조적 특징은 인간 ActRIIB에 대한 결합, 뿐만 아니라 ActRIIB의 하나 이상의 기능적 특성의 억제와 같은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성 (예를 들어, Smad 활성화의 억제)을 보유하는 구조적으로 관련된 항-ActRIIB 항체를 생성하기 위해 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로 조작된 항-ActRIIB 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 상기 섹션에 기재된 것들을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공되는 1종 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 1종 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 1종 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 그의 1종 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 후에 이러한 "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-14로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 15-28로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 29-42로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 43-56으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 57-70으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열 및/또는 서열 71-84로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 항-ActRIIB 항체를 제조하고; 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 146-150 및 156-160의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 중쇄 항체 서열; 및 141-145 및 151-155의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어진 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 항-ActRIIB 항체를 제조하고; 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
변경된 항체 서열은 또한 서열 29-42 및 서열 71-84로 이루어진 군 중에서 선택된 고정된 CDR3 서열 또는 US2005/0255552에 기재된 바와 같은 최소 필수 결합 결정인자, 및 CDR1 및 CDR2 서열 상의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터의 항체를 스크리닝하기에 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는 본원에서 기재하는 항-ActRIIB 항체의 하나, 일부 또는 모든 기능적 특성을 보유하는 것이며, 상기 기능적 특성에는 인간 ActRIIB에의 특이적 결합 및 Smad 활성화의 억제가 포함되지만 이로 제한되지 않는다.
변경된 항체는 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 상기 논의된 기능적 특성을 나타낼 수 있다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 조작 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 항-ActRIIB 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-ActRIIB 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, WO02/092780에는 포화 돌연변이 유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 이들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 제작 및 스크리닝하는 방법이 기재되어 있다. 또 다른 한편, WO03/074679에는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위한 연산처리 스크리닝 방법을 사용하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 161-165 및 171-175에 나타낸다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 166-170 및 176-180에 나타낸다.
핵산은 온전한 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수도 있고, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수도 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계 공지의 기타 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수한" 상태이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터, 예컨대 파지 디스플레이 벡터 또는 재조합 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다. 본 발명은 또한 pBW522 및 pBW524이라 불리는 벡터를 제공한다 (2009년 8월 18일자로 독일 D-38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7B 소재의 DSMZ에 각각 기탁 번호 DSM22873 및 DSM22874 하에 기탁됨).
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 이하에서 추가로 기재하는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 수득할 수 있다. 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우에는 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하는 경우), 항체를 코딩하는 핵산을 라이브러리의 구성원인 각종 파지 클론으로부터 회수할 수 있다.
또한 본 발명의 범주에는 하나 이상의 결실, 부가 또는 치환을 포함하는 변이체 핵산 서열이 포함된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 서열 113-140 또는 161-180을 포함하며, 이들은 보존적 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 유전자 코드의 퇴화로 인해, 아미노산은 하나를 초과하는 코돈에 의해 코딩될 수 있다. 따라서, 번역되는 아미노산 서열은 동일하게 유지되도록 하면서, 뉴클레오티드 서열을 보정하는 것이 가능하다.
일단 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득하게 되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전당 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서는, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을 또 다른 DNA 분자와 작동가능하게 연결시키거나, 또는 또 다른 단백질, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편과 작동가능하게 연결시킨다. 이와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로, 예를 들어 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인 프레임으로 유지되도록, 또는 상기 단백질이 목적하는 프로모터의 제어하에 발현되도록 연결된 것을 의미한다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어 문헌 [Kabat, E. A., et al., [상기 문헌]] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소형 중에서 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VL-코딩 DNA를 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., [상기 문헌]] 참조), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해서는, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시켜, VH 및 VL 서열이 연속되는 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 하는데, VL 영역과 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; [McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554] 참조).
본 발명의 핵산은 유전자 전달에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드 (항체 또는 기능적 단백질)를 코딩하는 핵산은 환자 내에서의 번역을 위해 환자에게 직접 전달될 수 있다.
핵산은 전형적으로 환자에의 투여를 위해 "패키지"된다. 유전자 전달 비히클은 비바이러스성, 예컨대 리포좀, 또는 복제 결여 바이러스, 예컨대 문헌 [Berkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)]에 기재되어 있는 바와 같은 아데노바이러스 또는 문헌 [Muzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992)] 및 미국 특허 번호 5,252,479에 기재되어 있는 바와 같은 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다. 달리, 레트로 바이러스, 예컨대 렌티바이러스가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 복제 결여 레트로바이러스 벡터 내에서의 발현을 위해 조작될 수 있다. 이어서, 이러한 발현 구축물을 단리하고, 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 플라스미드 벡터에 의해 형질도입된 패키징 세포로 도입하여, 이제 패키징 세포가 관심 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산하도록 할 수 있다. 이들 생산자 세포를, 생체내 세포의 조작 및 생체내 폴리펩티드의 발현을 위해서 대상체에 투여할 수 있다 (문헌 [Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (및 여기서 언급된 참조문헌) in Human Molecular Genetics (1996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd] 참조).
또 다른 접근법은 "네이키드 DNA"를 투여하는 것으로, 이때 치료 유전자는 혈류 또는 근육 조직으로 곧바로 주사된다.
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술로 생성할 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하는 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환을 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성하는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 뮤린 하이브리도마로부터 얻고 이것을 조작하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 제작하기 위해서는, 뮤린 가변 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, US4,816,567 참조). 인간화 항체를 제작하기 위해, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5225539; 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. ActRIIB에 대해 지시된 이같은 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조믹 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모조믹 마우스는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스라고 각각 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서는 이들을 통칭하여 "인간 Ig 마우스"라고 지칭한다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 재배열되지 않는 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌(miniloci)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 대한 반응시에 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나서 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (문헌 [Lonberg, N. et al., 1994 [상기 문헌]]; 문헌 [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에서 검토됨; [Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93], 및 [Harding, F. 및 Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 운반되는 게놈 변형은 문헌 [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724]; [Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 상기 모든 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 구체적으로 참고로 포함된다. 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,770,429; 및 5,545,807; 뿐만 아니라 WO92/103918, WO93/12227, WO94/25585, WO97/113852, WO98/24884; WO99/45962; 및 WO01/14424를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모좀 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"라 불리고, WO02/43478에 상세히 기재되어 있다.
추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-ActRIIB 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (아브제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))라고 지칭되는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모조믹 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-ActRIIB 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"라고 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀 둘 다를 보유하는 마우스를 사용할 수 있고, 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더우기, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하고 있는 암소가 당업계에 보고되었고 (문헌 [Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894]), 이를 사용하여 본 발명의 항-ActRIIB 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 인간 재조합 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되어 있거나 하기 실시예에서 기재된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; 5,427,908; 5,580,717; 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이같은 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767에 기재되어 있다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화시킨 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예컨대 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원 특이적 항체 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단세포 현탁액을, 50％ PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 내에 대략 2 x 145로 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 나트륨 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마(Sigma); HAT는 융합 24시간 후에 첨가)을 함유하는 선택 배지 내에서 2주 인큐베이이션한다. 대략 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개개의 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 대체로 10-14일 후에 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 특성화를 위한 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 ℓ의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상청액을 여과하고, 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia))로 친화성 크로마토그래피할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고 -80℃에서 보관할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 널리 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용가능한 것을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로 유전자 둘 모두가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터로 삽입하여 VH 절편이 벡터 내 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되게 하고 VL 절편이 벡터 내 CL 절편에 작동가능하게 연결되게 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가로 또는 별법적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 인 프레임으로 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계가 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존적일 수 있음을 인식할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포 내 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, 상이한 공급원들로부터의 서열로 구성된 조절 요소, 예컨대 SRa 프로모터 시스템은 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 제1 형의 긴 말단 반복체의 서열을 함유한다 (문헌 [Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선택 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별하기 위함)가 포함된다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는데 일반적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하다. 항체를 진핵 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 논의되는데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비시키는 데에 원핵 세포 보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 활성 항체의 고수율 생산을 위해 비효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13]).
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포)가 포함된다 (예를 들어 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DH FR 선택 마커와 함께 사용되는 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO K1PD 세포이다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하는 경우의 또 다른 발현 시스템은 WO87/04462, WO89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 포유동물 숙주 세포는, 예를 들어 US6,946,292B2에 기재된 바와 같은 FUT8 유전자 발현이 결핍된 포유동물 세포주를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포에서의 항체 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로의 항체 분비를 허용하기에 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 약물 (예를 들어 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 항-ActRIIB항체, 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 이같은 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제가 포함된다.
세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 이용하여 본 발명의 항체에 접합시킬 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용되는 링커 유형의 예로는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예컨대 종양 조직에서 우세하게 발현되는 프로테아제, 예컨대 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.
세포독소의 유형, 링커, 및 치료제를 항체에 접합시키는 방법에 관한 추가의 논의에 대해서는, 또한 문헌 [Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215]; [Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Payne, G. 2003 Cancer Cell 3:207-212]; [Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750-763]; [Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091]; [Senter, P.D. and Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]를 참조한다.
본 발명의 항체는 방사성면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성약제를 생성하기 위하여 방사성 동위원소에 접합될 수도 있다. 진단 또는 치료 목적으로 이용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예에는 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177이 포함되지만 이들에 제한되지 않는다. 방사성면역접합체의 제조 방법은 당업계에 확립되어 있다. 제발린(Zevalin)™ (DEC 파마슈티칼스(DEC Pharmaceuticals)) 및 벡사르(Bexxar)™ (코릭사 파마슈티칼스(Corixa Pharmaceuticals))을 비롯한 방사성면역접합체의 예가 상업적으로 입수가능하고, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체는 소정의 생물학적 반응을 변화시키는데 이용될 수 있고, 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제에 한정하여 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이같은 단백질에는, 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포킨, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자가 포함될 수 있다.
이같은 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982)]를 참조한다.
이중특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-ActRIIB 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 영역은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고, 이러한 다중특이적 분자 역시 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적 분자"에 포함된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체를 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의함)시켜 이중특이적 분자를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 ActRIIB에 대해 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대해 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한, ActRIIB의 또 다른 에피토프일 수 있다.
추가로, 본 발명에서 이중특이적 분자가 다중특이적인 경우, 상기 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 대한 것 이외의 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 하나의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv를 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 그의 임의의 최소 단편, 예컨대 US4,946,778 (Ladner et al.) (이는 그 내용이 참고로 분명하게 포함됨)에 기재되어 있는 바와 같은 Fv 또는 단일쇄 구축물일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체를 별도로 생성시킨 후에 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위해 각종 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. number 78,118-132]; [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83], 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 다 피어스 케미컬 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드 소재)가 시판함)이다.
결합 특이체가 항체인 경우, 이들을 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합시켜 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
별법적으로, 2개의 결합 특이체 모두가 동일한 벡터에서 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정인자를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정인자를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자의 제조 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; 및 5,482,858에 기재되어 있다.
그의 특이적 표적에 대한 이중특이적 분자의 결합은, 예를 들어 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어 항체)을 이용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다.
다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 ActRIIB에 결합하는 본 발명의 항체의 적어도 2개의 동일하거나 상이한 항원 결합 부분을 포함하는 다가 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 항체의 적어도 2, 3 또는 4개의 항원 결합 부분을 제공한다. 항원 결합 부분들은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 별법적으로, 연결 방법이 이중특이적 분자에 대해 기술되었다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜서 4가 화합물을 수득할 수 있다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부분(들) 중 하나 또는 이들의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 하나 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 상보성 활성을 갖는 항체의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 본 발명의 항-ActRIIB 항체와 함께, 적어도 하나의 다른 근육 질량/힘 증가제, 예를 들어 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴을 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용할 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 항체의 용도에 대한 아래 섹션에서 보다 상세히 설명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하여야 한다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 자연적인 조건의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고, 임의의 원치않는 독성 효과는 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염에는 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 인산 등으로부터 유래된 염 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산으로부터 유래된 염 등이 포함된다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 및 또한 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기한 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 유도될 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이들을 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에 멸균이고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 다수의 경우에서, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 유도될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 작용제들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것 중의 요구되는 기타 작용제를 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성제 및 임의의 추가의 목적하는 작용제의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성제의 양은 치료받는 대상체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성제의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 100％를 기준으로, 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성제의 약 0.01％ 내지 약 99％, 약 0.1％ 내지 약 70％, 또는 약 1％ 내지 약 30％의 범위일 것이다.
투여 요법은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은, 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체에서의 감수성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존적이다.
항체의 투여에 대해, 투여량은 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100 ㎎/kg, 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 ㎎/kg 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수도 있고, 또는 1-10 mg/kg 또는 3-7 mg/kg의 범위 이내일 수도 있다. 예시적인 치료법은 1주 1회 투여, 매 2주마다 1회 투여, 매 3주마다 1회 투여, 매 4주마다 1회 투여, 매 1개월마다 1회 투여, 매 3개월마다 1회 투여, 또는 매 3개월 내지 매 6개월마다 1회 투여를 포함한다. 별법적으로, 항체를 일년에 약 한번 또는 단 한번만 투여할 수 있다. 이러한 투여는 정맥내 또는 피하로 수행될 수 있다. 본 발명의 항-ActRIIB 항체에 대한 투여 요법에는 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중으로 정맥내 투여하는 것이 포함되고, 여기서 항체는 다음 투여 스케쥴 중 하나를 사용하여 제공한다: 6회 투여량에 대해 매 4주마다, 이어서 매 3개월마다; 매 3주마다; 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 1 mg/kg 체중으로 매 3주마다.
투여량은 근육 질량 및/또는 힘을 상향조절하는 양이어야 한다. 바람직하게는, 효과는 골격근에 대한 것이다. 바람직하게는, 투여량은 내부 장기 (예를 들어 심장, 폐, 간, 신장)의 크기에 비례하여 이를 초과하지 않게 증가시켜 근육을 비대시킨다. 이같은 비례적 증가는 질량 또는 부피를 측정하여 비교할 수 있다.
일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2가지 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 여러회 투여된다. 단일 투여량들 사이의 간격은, 예를 들어 매주, 매월, 매 3개월, 매 6개월 또는 매년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈중 농도를 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서의 투여량은 약 1-1000 ㎍/mL, 일부 방법에서는 약 25-300 ㎍/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 예를 들어, 본 발명의 ActRIIB 항체는 항-마이오스타틴 항체와 공동투여될 수 있다.
별법적으로, 빈도를 덜하게 하여 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방을 위한 것인지 치료를 위한 것인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방을 위해 적용하는 경우에는 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 처치를 받는다. 치료를 위해 적용하는 경우에는 질환의 진행이 저하되거나 종결될 때까지, 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 나타낼 때까지 비교적 높은 투여량을 비교적 짧은 간격으로 투여하는 것이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법제를 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성제의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성제의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 처치 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 처치를 받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 따라 달라될 것이다.
본 발명의 항-ActRIIB 항체의 "치료 유효 투여량"은 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상이 없는 기간의 빈도와 지속 기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 무능력을 방지, 즉 근육 질량 및/또는 힘을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 투여 경로로 투여될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대한 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "비경구 투여"는 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 투여를 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서 항체는 정맥내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서 항체는 피하로 투여된다.
별법적으로, 본 발명의 항체는 비경구가 아닌 경로에 의해, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소로 투여할 수 있다.
활성 화합물은 예를 들어 제어 방출 제제, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 미세캡슐화 전달 시스템과 같이 급속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc, New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 기기를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 기재된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하는 치료 장치를 제시하는 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하는 약물 주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동식 이식가능 주입 기기를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,224; 다중 챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,475,196. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있고, 마이크로칩스(MicroCHIPS)™ (메사추세츠주 베드포드 소재)에서 제조된 것이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적합한 분포를 보장하기 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (목적하는 경우) BBB를 확실히 횡단하도록 하기 위해서는, 이들을 예를 들어 리포좀 내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 증진시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티에는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 (문헌 [P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134]); p120 (문헌 [Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090])이 포함되며, 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273]을 참조한다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 예를 들어 시험관내 또는 생체외에서 배양 중인 세포에 투여될 수도 있고, 또는 대상체에게 예를 들어 생체내 투여하여 각종 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수도 있다. 따라서 항체는 질환의 치료, 예방 및 질환 증상의 개시를 지연시키는 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다.
본 발명은 치료 유효량의 항-ActRIIB 항체를 투여하는 것을 포함하는, 병적 장애 (예컨대 근육 소모 질환 또는 장애)로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 항-ActRIIB 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 병적 장애를 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 항-ActRIIB 항체의 용도를 제공한다.
상기 방법들은 특히 병적 장애를 치료하거나, 방지하거나, 개선시키거나, 또는 진단하는데 특히 적합하다.
본원에서 사용되는 "병적 장애"는 근골격 질환 또는 장애, 예컨대 근육 위축을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다. 글루코코르티코이드, 예컨대 코르티솔, 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 또는 프레드니솔론에 의한 치료의 결과를 포함하는, 근육 위축의 많은 원인이 존재한다. 근육 위축은 또한 신경 외상으로 인한 탈신경의 결과, 또는 퇴행성, 대사성 또는 염증성 신경병증 (예를 들어, 길랑-바레 증후군, 말초 신경병증, 또는 환경 독소 또는 약물에 대한 노출)의 결과일 수 있다.
또한, 근육 위축은 근병증, 예컨대 근긴장증; 선천성 근병증 (네말린 근병증, 멀티/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증 포함); 미토콘드리아 근병증; 가족성 주기성 마비; 염증성 근병증; 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환으로 인한 것; 피부근염; 다발성근염; 봉입체 근염; 골화성 근염; 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨증의 결과일 수 있다.
근병증은 근이영양증 증후군, 예컨대 뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스, 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마, 선천성 근이영양증, 또는 유전성 원위 근병증에 의해 유발될 수 있다. 근골격 질환은 또한 골다공증, 골절, 단신, 또는 왜소증일 수 있다.
또한, 근육 위축은 성인 운동 뉴런 질환, 영아 척수성 근육 위축, 근위축성 측삭 경화증, 소아 척수성 근육 위축, 다초점 전도 차단에 의한 자가면역 운동 신경병증, 졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비, 외상으로 인한 골격 고정화, 장기간 침상 안정, 수의 비활동, 불수의 비활동, 대사성 스트레스 또는 영양 부족, 암, AIDS, 단식, 갑상선 장애, 당뇨병, 양성 선천성 저긴장증, 중심핵병, 화상 손상, 만성 폐쇄성 폐 질환, 간 질환 (예컨대 섬유증, 경변증), 패혈증, 신부전, 울혈성 심부전, 노화, 우주 여행 또는 무중력 환경에서의 시간 소비의 결과일 수 있다.
치료가능한 연령-관련 상태의 예에는 근육감소증, 피부 위축, 근육 소모, 뇌 위축, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 폐기종, 골다공증, 골관절염, 면역 부전증, 고혈압, 치매, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 백내장, 연령-관련 황반 변성, 전립선암, 졸중, 감소된 기대 수명, 허약, 기억 상실, 주름, 신장 기능 장애 및 연령-관련 청력 상실; 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈당증 및 비만을 비롯한 대사 장애가 포함된다. 물론, 환자는 이들 상태 중 하나 이상, 예를 들어 근육감소증 및 폐기종, 또는 근육감소증 및 신장 기능 장애를 동시에 앓을 수 있다.
본원에서 말하는 "병적 장애"로 간주되는 그 밖의 상태로는 급성 및/또는 만성 신장 질환 또는 부전, 간 섬유증 또는 경변증, 암, 예컨대 유방암, 파킨슨병; 뉴런 사멸과 관련된 상태, 예컨대 ALS, 뇌 위축, 또는 치매 및 빈혈이 포함된다.
추가의 상태에는 악액질, 류마티스 관절염 관련 악액질, 및 암 관련 악액질이 포함된다.
현재까지, 이러한 장애를 치료하기 위해 극소수의 믿을 만한 또는 효과적인 요법이 개발되어 있다.
간, 신장 및 폐 섬유증에 기여하는 다른 수용체들 중에서 ActRIIB에 대한 액티빈 결합의 역할에 대해 보고된 문헌 (문헌 [Werner and Alzheimer, Cytokine Growth Factors Rev 2006, 17(3):157-171]) 및 암에서의 미오스타틴, 액티빈, 또는 ActRIIB의 역할에 대해 보고된 문헌 (문헌 [Tsuchida et al., Endo J, 2008])들에 기초하면, 본원에서 말하는 "병적 장애"에는 간, 신장, 폐 섬유증, 및 횡문근육종, 골 손실 유도 암, 간세포 암종, 위장암으로 예시되지만 이들로 한정되는 것은 아닌 암이 포함된다.
예방은 완전한, 예를 들어 연령-관련 상태 또는 대사 장애의 완전 부재일 수 있다. 예방은 또한 부분적일 수 있어서, 대상체에서의 연령-관련 상태 또는 대사 장애의 발생 가능성이 본 발명의 항체를 수여받지 못한 대상체에서 발생하는 것보다 아마도 더 적을 것이다.
본원에서 말하는 연령-관련 상태는 50세 이상 (즉 60, 70, 80세 이상)에서 시작될 수 있다.
한 실시양태에서, 환자는 예상되는 강요된 휴식/비활성 기간 이전에 항-ActRIIB 항체로 사전 치료될 수 있다. 이러한 기간은 환자가 예를 들어 엉덩이 또는 다리 수술을 위해 병원에 입원할 경우 발생할 수 있다. 비활성은 국소적일 수 있으며, 예컨대 부러진 사지 또는 관절의 캐스팅, 또는 마비제의 투여에 의한다.
한 실시양태에서, 치료하고자 하는 환자는 사지 (즉, 다리 또는 팔) 또는 관절 (즉 무릎 또는 엉덩이) 골절을 갖는다. 따라서, 한 실시양태에서, 치료하고자 하는 환자는 상완골, 요골, 척골, 수근골, 중수골, 쇄골, 견갑골, 대퇴골, 관골, 슬개골, 경골, 비골, 거골, 종골, 족근골, 중족골, 좌골 또는 장골 중 하나 이상에 골절을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 치료하고자 하는 환자는 다음과 같은 관절: 무릎, 엉덩이, 발목, 어깨, 팔꿈치 중 하나 이상에서 수술을 받거나 받을 것이다. 이러한 수술은 고관절 치환술 및 슬관절 치환술을 포함한다.
고정으로 인한 위축은 빨리 발생할 수 있지만, 정상적으로는 천천히 발생한다. 따라서, 한 실시양태에서, 환자, 관절 또는 사지는 2 주 이상 (즉 3 주, 4 주, 6 주, 8 주 이상) 동안 고정되거나 또는 고정될 것이다. 한 실시양태에서, 환자, 관절 또는 사지는 1-8 주, 2-6 주 또는 3-5 주 동안 고정되거나 또는 고정될 것이다.
추가 실시양태에서, 환자는 종전의 골 동화 치료에 반응하지 않은 자일 수 있다. 예를 들어, 환자는 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴에 의한 치료에 반응하지 않을 수 있다. 치료에 대한 환자의 반응을 측정하는 간단한 방법은 환자가 공지된 높이의 계단을 얼마의 시간에 걸쳐서 오르는지를 측정하고, 이를 치료 전후의 결과와 비교하는 것일 수 있다.
본 발명의 항체는 단독 활성제로서 또는, 예를 들어 아주반트로서 다른 약물, 예를 들어 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴과 함께, 또는 이들과 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 WO2007/146689에 개시된 바와 같은 IGF-1 모방체와 조합되어 사용될 수 있다.
상기 내용에 따라, 본 발명은 하기 추가의 측면을 제공한다:
상기에서 규정한 바와 같은 방법은 치료 유효량의 ActRIIB 길항제, 예를 들어 본 발명의 항체, 및 적어도 하나의 제2 약물 물질을 예를 들어 부수적으로 또는 차례로 공동 투여하는 것을 포함하며, 상기 제2 약물 물질은 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴이다.
본 발명은 추가로 치료 유효량의 a) ActRIIB 길항제, 예를 들어 본 발명의 항체, 및 b) 예를 들어 상기에서 나타낸 바와 같은 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴으로부터 선택된 적어도 하나의 제2 물질을 포함하는 치료 조합물, 예를 들어 키트를 제공한다. 키트는 추가로 그의 투여에 관한 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체를 또 다른 활성제와 함께 투여하는 경우, 공동 투여되는 조합 화합물의 투여량은 당연히 사용되는 공동 약물의 유형, 사용되는 특정 약물, 치료하고자 하는 상태 등에 따라 달라질 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 근육 위축을 앓는 환자 중에서 선택된 환자 집단에게만 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 골격근 위축을 앓는 환자 집단에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-ActRIIB 치료에 반응하는 환자 그룹 중에서 선택된 환자 집단에게만 투여된다. 항-ActRIIB 치료에 반응할 가능성이 높은 환자를 확인시켜주는 바이오마커는 다음 중 임의의 것일 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다: 대조군 환자에 비해 높은 수준의 혈청 미오스타틴, GDF-11 또는 액티빈.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 ActRIIB 수준, 또는 ActRIIB를 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 샘플 (예컨대 시험관내 샘플) 및 대조군 샘플을 항-ActRIIB 항체와 항체 및 ActRIIB 사이에 복합체를 형성하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 항체 및 ActRIIB 사이에 형성된 임의의 복합체를 검출하고, 샘플과 대조군을 비교한다. 예를 들어, 당업계에 널리 공지되어 있는 표준 검출 방법, 예컨대 ELISA 및 유동 세포측정 검정을 본 발명의 조성물을 이용하여 수행할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 추가로 샘플 및 대조군 샘플을 ActRIIB에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 영역과, 항체 또는 그의 일부와 ActRIIB 사이에 복합체를 형성하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내의 ActRIIB (예를 들어, 인간 ActRIIB)의 존재를 검출하는 방법 또는 ActRIIB의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서, 복합체의 형성을 검출하고, 이때 대조군 샘플과 비교하여 샘플 사이의 복합체 형성의 차이는 샘플 내 ActRIIB의 존재를 나타낸다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체, 인간 항체 및 이중특이적 분자) 및 사용 지침서로 이루어진 키트가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 키트는 추가로, 적어도 하나의 부가적 시약, 또는 본 발명의 하나 이상의 부가적 항체 (예를 들어, 제1 항체와 별개로 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 보충 활성을 갖는 항체)를 함유할 수 있다. 전형적으로, 키트는 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트상에 또는 키트와 함께 제공되는 임의의 기입물 또는 기록물 또는 기타 방식으로 키트에 수반되는 물질을 포함한다. 키트는 환자가 상기에서 규정한 바와 같은 항-ActRIIB 항체 치료에 반응할 군에 속하는지 여부를 진단하는 도구를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 키트는 동결건조된 형태의 본 발명의 항체, 희석제 및 사용 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명이 상세히 기재되긴 하였지만, 하기하는 실시예 및 특허청구범위에 의해 추가로 예시되며, 이는 예시적인 것이지 추가의 제한을 의미하는 것이 아니다.
일반론
용어 "포함하는"은 "비롯한" 뿐만 아니라 "이루어진"을 포함하고, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 전적으로 X로 이루어질 수 있거나, 또는 추가의 어떤 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다.
수치 값 x에 관련된 용어 "약"은 예를 들어 x±10％를 의미한다.
도 1은 모 세포주 및 ActRIIB 형질감염된 HEK293T/17 세포주에 대한 FACS 적정에 의한 MOR07079의 EC50 측정을 나타낸다.
도 2는 리포터 유전자 검정에서 다수의 항-ActRIIB Fab에 의한 2, 10 및 50 ㎍/ml에서의 미오스타틴-유도된 루시페라제 발현의 억제를 나타낸다.
도 3은 미오스타틴-유도된 루시페라제 리포터 유전자 검정에서의 Fab의 IC50 측정을 나타낸다.
도 4는 원발성 인간 골격근 세포에 대한 항체 결합을 나타낸다.
도 5는 골격근 분화 검정의 미오스타틴-유도된 억제에 있어서 IgG의 IC50 측정을 나타낸다.
도 6은 마우스 연구를 보여준다: 천연 동물에서의 생체내 효능 연구 - MOR08159 또는 MOR08213 10 mg/kg에 의한 6 주 처리는 체중 및 근육 중량을 증가시켰다. (A) 체중, (B) 경골근, (C) 비복근+족척근, (D) 사두근 및 (E) 흉근에서의 변화를 나타낸다.
도 7은 마우스 연구를 보여준다: 천연 동물에서의 용량 반응 생체내 효능 연구 - MOR08213 25, 5, 1 mg/kg에 의한 6 주 처리는 용량 의존적으로 체중 및 근육 중량을 증가시킨다. (A) 체중, (B) 경골근, (C) 비복근+족척근, (D) 사두근 및 (E) 흉근에서의 변화를 나타낸다.
도 8은 이소형 대조군 단독 (실선) 또는 MOR08213의 존재하에서의 이소형 대조군 (점선)과 비교하여, MOR08213의 존재하에서의 MOR08159 (굵은 점선) 및 MOR08159 단독 (굵은 실선) 사이의 교차 차단을 보여주는 FACS 결과를 나타낸다.
도 9는 다양한 에피토프 결정 기술을 이용하여, MOR08159이 결합하는 ActRIIB 잔기 (서열 181)를 개관하여 나타낸다.
발명의 수행 방식
기능적 검정
리포터 유전자 검정 (RGA)
HEK293T/17 세포주의 배양
모 HEK293T/17 세포를 10％ FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (50 IE/ml), 및 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml)을 함유하는 DMEM 중에 유지시켰다. 세포를 37℃ 및 5％ CO2의 인큐베이터 내에서 성장시키고, 매 3-4 일마다 계대배양하였다. 아쿠타제(Accutase)™를 이용하여 세포를 탈착시킨 다음, 새로운 배지를 함유하는 새로운 플라스크로 옮겼다.
CAGA-12 luc으로 안정적으로 형질감염시킨 HEK293T/17 세포를 상기에서 모 HEK293T/17 세포에 대해 기재한 바와 같이 배양하되, 세포 성장 배지에는 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신에 더하여 4 mM L-글루타민 및 3 ㎍/ml 블라스티시딘을 보충하였다.
미오스타틴-유도된 루시페라제 리포터 유전자 검정
항-ActRIIB 항체가 미오스타틴-유도된 신호전달을 억제하는 능력을 측정하기 위해, 안정한 리포터 세포주 HEK293T/17 CAGA-12 luc을 이용한 리포터 유전자 검정을 수행하였다. CAGA-12 루시페라제 리포터 구축물은 인산화된 Smad-2 및 Smad-3에 특이적인 최소 프로모터 및 다중 CAGA 박스의 하류에 루시페라제 유전자를 보유한다. 정제된 미오스타틴의 (뿐만 아니라 GDF-11, 액티빈 또는 TGFß의) 부가는 Smad를 인산화시켜 CAGA-12 리포터에의 결합을 유도하고, 루시페라제 유전자가 발현되게 한다.
HEK293T/17 CAGA-12 luc 세포의 90％ 포화성장 시에, 기재한 바와 같이 세포를 탈착시키고, 배양 배지 중에서 2.5x105 세포/ml의 농도로 희석시켰다. 이어서, 웰 당 100 ㎕의 세포를 편평 바닥 96 웰 플레이트에 시딩하고, 37℃ 및 5％ CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음날, 항체 (Fab 또는 IgG) 및 재조합 인간 ActRIIB/Fc (양성 대조군으로서 제공됨)를 PBS 중에서 목적하는 농도로 희석시켰다. 항체 용액 20 ㎕를 전날 시딩한 플레이트에 첨가하고, 세포를 1 시간 동안 배양하여 항체가 결합되게 하였다. 마지막으로, 50 ng/ml 미오스타틴을 웰에 첨가하고, 세포를 추가로 밤새 배양하였다.
다음날 오전, 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시페라제 시약 (프로메가(Promega)) 120 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 2 분 인큐베이션한 후, 발광측정기로 발광을 판독하였다. 각 항체를 완전히 적정한 후, 최대 억제 농도의 1/2 (IC50 값)을 계산하였다.
특이성 ELISA
항-ActRIIB Fab 항체의 인간 ActRIIB에 대한 특이성 및 인간 ActRIIA 및 마우스 ActRIIB에 대한 교차 반응성을 ELISA 세팅에서 평가하였다. 부가적으로, 관련 수용체 (반대 표적: 인간 TGF-βRII/Fc (R&D 시스템즈(R&D systems)), 마우스 TGF-βRI (ALK-5)/Fc (R&D 시스템즈), 인간 액티빈 RIB (ALK-4)/Fc (R&D 시스템즈))에 대한 결합을 측정하였다. 이를 위해, (달리 언급하지 않는 한) PBS 중에 희석시킨 재조합 단백질 5 ㎍/ml를 흑색 96 웰 편평 바닥 맥시소르프(MaxiSorp)™ 플레이트에 첨가하고, 코팅을 위해 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음날 오전, 플레이트를 TBST로 세척하고 MTBST로 차단시켰다. 플레이트를 수회 세척한 후, 5 ㎍/ml 항-ActRIIB Fab를 첨가하고, 2.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 알칼리성 포스파타제가 접합된 염소-항-인간 IgG Fab-특이적 항체와 함께 인큐베이션한 후, 아토포스(AttoPhos) 형광 기질을 첨가하여 항원 결합된 Fab를 검출하였다. TECAN 스펙트라플로오르(Spectrafluor) 플레이트 판독기 내에서 535 nm에서의 형광 방출을 430 nm에서의 여기와 함께 판독하였다.
ActRIIB/Fc-미오스타틴 결합 상호작용 ELISA
억제성 Fab가 인간 ActRIIB의 미오스타틴 결합 부위를 차단하는 것을 통해 작용하는지 여부를 평가하기 위해, hActRIIB/Fc-미오스타틴 상호작용 ELISA를 수행하였다. 이를 위해, 재조합 미오스타틴을 PBS 중에서 5 ㎍/ml로 희석하고, 흑색 96 웰 편평 바닥 맥시소르프 플레이트에 코팅시켰다. 다음날 오전, 웰을 MTBST로 차단시켰다. 한편 50 ㎍/ml 항-ActRIIB Fab를 TBST 중의 10 ㎍/ml ActRIIB/Fc와 함께 1.5 시간 동안 실온에서 사전 인큐베이션하고, 마지막으로 코팅되고 차단된 웰에 첨가하였다 (1.5 시간, 실온). TBST 완충제로 세척한 후, 미표지된 마우스 항-인간 Ig Fc-특이적 항체 및 POD-표지된 양 항-마우스 IgG 검출 항체를 이용하여 결합된 ActRIIB/Fc의 검출을 수행하였다. 웰을 TBST 완충제로 수회 세척한 후, 콴타 블루(Quanta Blu)™ 형광 퍼옥시다제 기질을 첨가하였다. GENiosPro™ 판독기에서 형광을 판독하였다 (여기 320 nm, 방출 430 nm).
세포에 대한 결합
세포
FuGENE6 (로쉐(Roche))를 이용하여 선형 pEGFP (클론테크(Clontech))-ActRIIB(ECD) 또는 -ActRIIA(ECD) 및 pPGK-퓨로 (애드진(AddGene))으로 형질감염시킨 HEK293T/17 세포 (ATCC)를 이용하여 생성한 안정한 인간 ActRIIA-, 및 인간 ActRIIB-형질감염된 HEK293T/17 세포를 10％ FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (50 IE/ml), 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml) 및 퓨로마이신 (2 ㎍/ml)을 함유하는 DMEM 중에 유지시켰다. 세포를 37℃ 및 5％ CO2의 인큐베이터 내에서 성장시키고, 매 3-4 일마다 계대배양하였다. 아쿠타제™를 이용하여 세포를 탈착시킨 다음, 새로운 배지를 함유하는 새로운 플라스크로 옮겼다.
인간 골격근 세포 (huSkMC) (캄브렉스(Cambrex))를 약 70 - 90％의 포화성장 시에 수거하였다. 이들 세포를 위한 배양 배지, 20％ FCS (아미메드(Amimed))가 보충된 골격근 기초 배지 (skBM; 론자(Lonza))로 이루어진 성장 배지 (GM)를 흡출해내고, 세포를 HEPES-BSS로 세척하고, 트립신/EDTA와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 탈착시킨 후, 트립신을 트립신 중화 용액으로 중화시켰다. 세포를 220 x g에서 5 분 동안 원심분리하고, 펠렛을 골격근 성장 배지에 재현탁시켰다. 이어서 세포를 실험을 위해 사용하거나, 또는 약 3500 세포/cm2의 세포 밀도로의 계대배양을 위해 시딩하였다. 세포를 37℃ 및 5％ CO2의 인큐베이터 내에서 성장시키고, 매 5-6 일마다 계대배양하였다.
hActRIIB- 및 hActRIIA-발현 세포에 대한 FACS 적정
항-ActRIIB 항체의 최대 효과 농도의 1/2 (EC50)을 FACS에 의한 세포성 hActRIIA 및 hActRIIB에 대한 결합을 통해 결정하였다.
이를 위해, 항-ActRIIB Fab 또는 IgG의 연속 희석물을 웰 당 1x104의 hActRIIA-형질감염된, hActRIIB-형질감염된 또는 모 HEK293T/17 세포와 함께 1 시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 수회의 세척 단계 이후, 세포 결합된 Fab 또는 IgG를 피코에리트린-접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체로 검출하였다. 4℃에서의 1 시간 인큐베이션 이후에, 세포를 다시 세척하고, FACS 완충제에 재현탁시키고, FACS어레이(FACSArray)™ 기기 내에서 세포의 형광 강도를 측정하였다.
원발성 인간 골격근 세포에 대한 결합
항-ActRIIB Fab 또는 IgG 뿐만 아니라 이소형 대조군 Fab 또는 IgG (10 ㎍)를 튜브 당 FACS 완충제 (PBS, 2％ FCS, 1 mM EDTA) 중의 105 huSkMC와 함께 1 시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세척 단계 이후, 세포 결합된 Fab 또는 IgG를 FACS 완충제 중에서 1:200으로 희석시킨 피코에리트린-접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체로 검출하였다. 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 다시 세척하고, FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACS칼리버(FACSCaliber)™ 기기 내에서 세포의 형광 강도를 측정하였다.
친화도 결정
표면 플라즈몬 공명 (비아코어)을 이용한 선택된 항-인간 ActRIIB Fab의 친화도 결정
직접 항원 고정을 위해, 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학을 이용하였다. CM5 칩 (비아코어, 스웨덴 소재)을 10 mM 아세테이트 완충제 (pH 4.5) 중의 대략 6000 RU 인간- 또는 마우스-ActRIIB/Fc, 또는 대략 1500 RU 인간-ActRIIA/Fc (항원의 활성에 따름)로 코팅하였다. 참고 유동 세포용으로, 각각의 양의 HSA를 사용하였다. 5 ㎕ 10 mM 글리신/HCl 완충제 (pH 1.5)를 이용하여 재생을 행하였다.
별법적으로, 항원을 직접 고정시키지 않고, 항-인간-Fc 항체로 변형시킨 CM5 칩에 포획시켰다 (Fc 포획 키트, GE 헬스케어(GE Healthcare)/비아코어). 참고 유동 세포에 대해서는, 포획 항체를 고정시켰지만 어떤 항원도 포획되지 않았다. 5 ㎕ 3 M MgCl2를 2회 주입하여 재생을 달성하였다.
역학 측정은 Fab 샘플의 연속 희석 열을 이용하여 둘베코의 PBS 중에서 20 ㎕/분의 유속으로 행하였다. Fab 농도는 15.6 내지 500 nM 범위였다. 각 농도의 주입 시간은 1 분이었다. 해리 시간은 적어도 2 분 (또는 결정된 친화도에 따라 그 이상)으로 설정하였다. 이중 참조를 위해 구동 완충제의 블랭크(blank) 주사를 사용하였다. BIA 평가 소프트웨어 3.2 (비아코어, 스웨덴 소재)를 사용하여 모든 센소그램을 광범위하게 대입하였다.
CK 검정
세포를 GM에서 골격근 기초 배지 (skBM)로 이루어진 혈청 무함유 분화 배지로 바꾸는 것에 의해 시딩한 지 24 시간 후에 분화가 개시되었다. 세포를 미오스타틴 (R&D 시스템즈) 또는 다른 TGF-b 단백질의 부재 및 존재하에서 3일 동안 분화시키고, 주어진 농도에서 항체를 시험하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 리포터 용해 완충제 (프로메가)로 용해시키고, 측정시 까지 -80℃에서 보관하였다. CK (IFCC) 시약 (써모 엘렉트론(Thermo Electron))을 이용하여 CK 활성을 측정하였다. CK 시약은 제조업체의 지침에 따라 제조하였다. 세포 용해물을 실온으로 조정하고, CK 시약을 첨가하고, 흡광도를 즉시, 340 nm에서 20 분 동안 1 분의 판독 간격으로 판독하였다. CK를 이용하여 토끼 근육 (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics))으로부터 CK 표준 곡선을 새로이 제작하였다. 단백질 함량은 BCA 키트를 이용하여 측정하였다.
동물 모델
9 주령의 암컷 CB17/ICR-Prkdcscid/Crl 마우스 (그룹 당 n=10, 챨스리버(Charles River), 독일 소재)를 체중별로 무작위화한 다음, 항-인간 ActRIIB 항체 (MOR8159, MOR8213) 또는 IgG 대조군 항체를 10 mg/kg (연구 1; 비교 연구)의 용량으로, 또는 MOR8213을 25, 5, 또는 1 mg/kg (연구 2; 용량 반응 연구)의 용량으로 제0일, 제3일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일 및 제35일 (제3일부터는 매주 1회)에 복강내 처리하였다. 주 2회 체중을 측정하였다. 투여한 지 6 주 (42 일) 후에, 마우스를 CO2로 안락사시켰다. 경골근, 비복근+족척근, 사두근 및 흉근을 수집하고 칭량하였다.
처리 프로토콜
대조군 항체: 항-닭 리소자임-hIgG,
농도: 2 mg/mL (연구 1), 5 mg/mL (연구 2), 적용 부피: 5 mL/kg
비히클: 50 mM 시트레이트, 140 mM NaCl 또는 PBS
항-인간 ActRIIB 항체: 항-ActRIIB-MOR8159 및 MOR8213, hIgG,
농도: 2 mg/mL (연구 1), 5 mg/mL (연구 2), 1 mg/mL (연구 2), 0.2 mg/mL (연구 2), 적용 부피: 5 mL/kg
비히클: 50 mM 시트레이트, 140 mM NaCl
처리 그룹:
연구 1; MOR08159 및 MOR08213의 비교
1 IgG 대조군, i.p. (항-닭 리소자임 -IgG), 10 mg/kg
2 항-ActRIIB-MOR8159, i.p., 10 mg/kg
3 항-ActRIIB-MOR8213, i.p, 10 mg/kg
연구 2; MOR08213의 용량 반응
1 IgG 대조군, i.p. (항-닭 리소자임 IgG), 25 mg/kg
2 항-ActRIIB-MOR8213, i.p., 25 mg/kg
3 항-ActRIIB-MOR8213, i.p., 5 mg/kg
4 항-ActRIIB-MOR8213, i.p., 1 mg/kg
유지 조건
동물을 4 내지 5마리의 동물 그룹으로 25℃에서 12:12 시간 주야 사이클로 수용하였다. 이들에게 15.8 MJ/kg의 에너지를 갖는 18.2％ 단백질 및 3.0％ 지방을 함유하는 표준 실험실 식이 (NAFAG 3890, 클리바(Kliba)를 먹였다. 음식 및 물을 자유롭게 접근하도록 제공하였다. 동물 실험은 스위스 캔톤 바젤-시티에서 유효한 규제에 따라 수행하였다.
방법
통계적 분석
결과를 평균+/-SEM으로 나타낸다. 던넷(Dunnett)의 일원분산분석에 따른 다중 비교 시험을 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 처리 (항-ActRIIB 항체 MOR8159 및 MOR8213)를 대조군 (대조군 항체)와의 차이에 대해 시험하고, 확률값이 0.05 미만인 경우에 차이가 현저한 것으로 간주하였다 (*: P < 0.05, **: P < 0.01, NS: IgG 대조군에 비해 현저하지 않음). 통계적 분석은 그래프패드 프리즘 버전 5.0 (그래프패드 소프트웨어, 인크(GraphPad Software, Inc))을 이용하여 수행하였다. 체중은 제0일의 체중을 제하고 계산하였고, 근육 중량은 제0일의 체중 (최초 체중)으로 정상화하였다.
패닝, 항체 확인 및 특성화
항체 변이체 단백질의 공급원으로서 시판되는 파지 디스플레이 라이브러리, MorphoSys HuCAL 골드® 라이브러리를 사용하여 높은 결합 친화도를 갖는 클론을 선별함으로써 인간 ActRIIB 단백질에 대한 치료용 항체를 생성하였다.
HuCAL 골드® 라이브러리는 모든 6개의 CDR이 적절한 방법에 의해 다양화되고, Fab를 파지 표면에 연결하기 위해 시스디스플레이(CysDisplay)™ 기술 (WO01/05950)을 이용한 Fab 라이브러리이다 (문헌 [Knappik et al., 2000]).
HuCAL 골드® 파지미드 라이브러리 (문헌 [Rothe et al., 2008])를 사용하여 특이적 Fab 항체 단편을 선별하였다.
라이브러리로부터 ActRIIB-특이적 항체의 패닝에 의한 선별
인간 ActRIIB를 인식하는 항체의 선별을 위해, 몇몇 패닝 전략을 적용하였다.
요약하면, HuCAL 골드® 항체-파지를 상이한 VH 마스터 유전자를 포함하는 몇몇 풀로 나누었다.
이러한 풀에 대해 개별적으로 차별적 세포 패닝을 수행하여, 일시적으로 인간 ActRIIB 형질감염된 세포에 대한 선별 라운드를 재조합 인간 ActRIIB/Fc 단백질에 대한 선별 라운드와 번갈아 행하였다.
i. 전체 세포 패닝
패닝을 위해, PBS 중에 희석시킨 파지 입자를 동 부피의 PBS/BSA와 혼합하고 차단시켰다. 병행해서, 또한 사전 차단시킨 튜브 내에서, 파지 풀 당 1x107의 각각의 hActRIIB 발현 세포를 PBS/3％ FCS/0.04％ NaN3 중에 재현탁시키고, 진탕기 상에서 4℃에서 1 시간 동안 차단시켰다. 차단된 세포를 스핀 다운시키고, 사전 차단시킨 파지 입자 중에 재현탁시키고, 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 한편, 파지 풀 당 1x107의 hActRIIB 녹 다운 세포를 제조하였다.
파지-세포 복합체를 PBS/BSA 중에서 세척한 후, PBS 중에서 세척하였다. 글리신 완충제 (pH 2.2)를 이용한 산성 용출에 의해 hActRIIB 발현 세포로부터 파지 입자를 용출시켰다. 원심분리한 후, 비완충된 트리스를 첨가하여 용출액을 중화시켰다.
감염시키고 후속하여 원심분리한 후, 박테리아 펠렛을 2xYT 배지 중에 재현탁시키고, LB/CAM/Glc 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 오전, 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 파지를 수거 및 증폭시켰다.
ii. 고체 상 패닝
고체 상 패닝을 위해, 재조합 인간 ActRIIB/Fc로 맥시소르프™ 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅시켰다. PBS로 세척한 후, 코팅된 웰을 5％ MPBST로 차단시켰다.
선별하기 전에, HuCAL 골드® 파지를 차단 완충제로 사전 흡착시켰다. 차단된 파지를 코팅된 항원에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 비특이적인 파지를 PBST 및 PBS로 씻어내었다. 결합된 파지는 20 mM DTT를 첨가하여 용출시켰다. 용출액은 이. 콜라이 TG-1 배양물을 감염시키는데 사용하였다. 감염시킨 후, 박테리아를 LB/CAM/Glc 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 오전, 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 파지를 수거 및 증폭시켰다.
가장 성공적인 패닝 접근법은 ActRIIB 형질감염된 HEK293T/17 세포에 대해 첫번째 패닝 라운드를 수행한 후, 재조합 인간 ActRIIB/Fc에 대해 선별 라운드를 수행하고, 다시 형질감염된 세포에 대해 수행하는 차별적 세포/단백질 패닝인 것으로 밝혀졌다.
선별된 Fab에 대해 모 또는 rhActRIIB 형질감염된 HEK293 세포에 대한 결합을 분석하였다.
MOR07079 Fab는 ActRIIB 형질감염된 세포에 20 nM의 EC50으로 우세하게 결합하였다 (도 1). 미오스타틴 결합 억제 ELISA에서, MOR07079 Fab는 억제 활성을 나타내었고, 미오스타틴에 대한 rhActRIIB/Fc의 결합을 차단하였다. ELISA에서의 강력한 미오스타틴 결합 억제는 MOR07079에 대해 HEK293-CAGA12를 이용한 리포터 유전자 검정에서의 미오스타틴 억제를 반영하였다. 특이성 ELISA를 이용할 경우, MOR07079는 인간 및 뮤린 ActRIIB에 특이적으로 결합하지만 관련이 없는 TGFβRII, ALK4 및 ALK5 수용체에는 그렇지 않은 것으로 나타났다. MOR7079는 또한 ActRIIA에 비해 ActRIIB에 우세하게 결합하는 것으로 나타났다.
HuCAL® 이뮤노글로불린의 생산
i. Fab의 IgG 포맷으로의 전환
전장 이뮤노글로불린 (Ig)을 발현시키기 위해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 pMORPH®X9_FH Fab 발현 벡터로부터 인간 IgG2에 대한 pMORPH®2_h_Ig 벡터 시리즈로 서브클로닝하였다. 또한, 선별된 클론을 침묵 IgG1LALA 포맷으로 전환시켰고, 여기서 상기 IgG1LALA 포맷은 위치 234 및 235에서의 류신이 알라닌으로 돌연변이되어 FcRγ 결합능이 없어지고 이펙터 기능이 감쇄된 것이다.
적절한 제한 효소 (문헌 [Knappik et al., 2000])를 사용하여 VH 및 VL 도메인 단편을 pMORPH®2_h_IgG2, pMORPH®2_h_IgG1LALA, pMORPH®2_h_Igκ, 및 pMORPH®2_h_Igλ2로 서브클로닝시켰다.
모든 DNA 제조물에 대해 서열 분석을 행한 후 HKB11 세포를 형질감염시켰다.
ii. 인간 IgG의 일시적 발현 및 정제
진핵 HKB11 세포를 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양 상청액을 형질감염 후 3 또는 7일 째에 수거하고, 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 행하였다. 달리 언급하지 않는 한, 1 x 둘베코 PBS (pH 7.2)로 완충제 교환하였고, 샘플을 멸균 여과시켰다 (0.2 μm).
CDR-L3 및 CDR-H2 성숙 라이브러리
선별된 항체 단편의 친화성 및 생물학적 활성을 증가시키기 위해, CDR-L3 및 CDR-H2 영역을 트리뉴클레오티드 지정 돌연변이유발 (문헌 [Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:5600-5607])을 이용한 카세트 돌연변이유발에 의해 동시에 최적화하여, 프레임워크 영역을 일정하게 유지시켰다 (문헌 [Nagy et al., 2002, Nature Medicine, 8:801-807]). 성숙 라이브러리의 클로닝 이전에, XbaI/EcoRI 제한 부위를 통해 모든 모 Fab 단편을 발현 벡터 pMORPH®X9로부터 시스디스플레이™ 성숙 벡터 pMORPH®25로 전달하였다. 상기 벡터는 시스테인 잔기에 N-말단에서 융합되고 C-말단 시스테인은 Fd 항체 쇄에 융합되어, 파지 표면 상에 각각의 Fab 단편의 디술피드-연결된 디스플레이를 허용하는 파지 단백질 pIII을 제공한다.
CDR-H2 라이브러리의 생성을 위해, 각각의 모 Fab의 CDR-H2 영역을 잘라내어 고도로 다양화된 CDR-H2 성숙 카세트로 대체하였다.
병행해서, 모 클론의 CDR-L3 영역은 다양화된 CDR-L3 성숙 카세트로 대체하였다.
성숙 라이브러리의 크기는 4x105 내지 1x108 클론 범위였다. 벡터 백그라운드는 모든 경우에서 1％ 미만이었다. 단일 클론의 서열분석에 의한 품질 관리 결과 각 라이브러리의 품질이 높은 것으로 밝혀졌다.
각각의 CDR-L3 및 CDR-H2 성숙 라이브러리의 경우, 항체-디스플레이 파지를 제조하고, 스폿 적정에 의해 파지 역가를 측정하였다.
친화성 성숙을 위한 패닝 전략
다음의 성숙 라이브러리로부터의 항체-디스플레이 파지에 대해 별개의 패닝 및 스크리닝을 행하였다:
선례 1: MOR07079 (L-CDR3 성숙)
선례 1: MOR07079 (H-CDR2 성숙)
비오티닐화된 hActRIIB/Fc 및 huSkMC에 대해 각각의 항체를 이용한 성숙 패닝을 수행하였다.
새롭게 생성한 성숙 라이브러리로부터 수거한 서브코드당 2x1010 또는 1x1011개의 파지를 제1 선별 라운드에 사용하였다.
몇몇 차별적인 패닝을 수행하여, 재조합 비오티닐화된 hActRIIB/Fc에 대한 선별 라운드를 huSkMC에 대한 선별 라운드와 번갈아 행하였다.
제1 및 제3 용액 패닝 라운드를 위해, 비오티닐화된 재조합 hActRIIB/Fc를 스트렙타비딘 코팅된 다이나비드(Dynabead) 상에 포획시켰다. 다음과 같은 프로토콜을 적용하였다: 각각의 파지 풀에 대해, 스트렙타비딘 비드를 PBS로 세척하고, 차단 완충제 중에 재현탁시켰다. PBS 중에 희석된 파지 입자를 0.1％ 트윈20을 함유하는 차단 완충제와 혼합하고, 회전 휠 상에 유지시켰다. 스트렙타비딘- 또는 비드-결합 파지의 제거를 위해 파지 입자의 사전세정을 2회 수행하였다: 파지 풀 당 차단된 스트렙타비딘 비드를 차단된 파지 입자에 첨가하고, 회전 휠 상에서 인큐베이션하였다. 자기 장치를 통해 비드를 분리시킨 후, 파지 상청액을 새로운, 사전 차단시킨 반응 튜브로 옮기고, 사전 흡착을 반복하였다.
차단 절차 이후에, 비오티닐화된 hActRIIB/Fc 항원을 사전 세정하고 차단시킨 파지 입자에 첨가하고, 회전 휠 상에서 인큐베이션하였다. 차단된 스트렙타비딘 비드를 이용하여 파지-항원 복합체를 포획하고, 파지 패닝 풀에 첨가하고, 추가로 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 비드에 결합된 파지 입자를 수집하였다. 이어서, 비드를 PBST 및 PBS로 세척하였다. 20 mM DTT를 첨가하여 스트렙타비딘 비드로부터 파지 입자를 용출시켰다. 용출액을 수집하고, 0.6-0.8의 OD600nm으로 성장시킨 이. 콜라이 TG-1 배양물을 감염시키는데 사용하였다.
감염시키고 후속하여 원심분리한 후, 박테리아 펠렛을 2xYT 배지에 재현탁시키고, LB/CAM/Glc 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 오전, 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 헬퍼 파지로 감염된 세포를 0.25 mM IPTG를 함유하는 배지 중에서 22℃에서 밤새 성장시키는 것을 제외하고, 상기에서 대부분 기재한 바와 같이 파지를 수거하여 증폭시켰다 (문헌 [Krebs et al., 2001]). 비오티닐화된 hActRIIB/Fc에 대한 제3 용액 패닝 라운드를, 사용되는 항원의 양은 감소시키고, 세척 조건의 엄격성은 증가시키는 것을 제외하고, 제1 라운드의 프로토콜에 따라 수행하였다.
(내인성 hActRIIB를 발현하는 huSkMC에 대한) 제2 패닝 라운드의 경우, PBS 중에 희석시킨 파지 입자를 동 부피의 PBS/BSA와 혼합하고 차단시켰다. 병행해서, 각각의 서브코드에 대해 9x105개의 huSkMC를 PBS/FCS/0.02％ NaN3으로 4℃에서 차단시켰다. 차단된 세포를 스핀 다운시키고, 사전 차단시킨 파지 입자와 함께 재현탁시키고, 추가로 인큐베이션하였다.
파지-세포 복합체를 PBS/BSA로 세척한 후, PBS 중에서 세척하였다. 세포를 410 x g로 2 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 글리신 완충제 (pH 2.2)를 이용한 10 분 인큐베이션 단계에 의해 hActRIIB 발현 huSkMC로부터 파지 입자를 산성 용출시켰다. 원심분리한 후, 비완충된 트리스를 첨가하여 용출액을 중화시켰다. 파지 함유 상청액을 0.6-0.8의 OD600nm으로 성장시킨 이. 콜라이 TG-1 배양물을 감염시키는데 사용하였다.
감염시키고 후속하여 원심분리한 후, 박테리아 펠렛을 2xYT 배지에 재현탁시키고, LB/CAM/Glc 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 오전, 플레이트로부터 콜로니를 긁어내고, 헬퍼 파지로 감염된 세포를 0.25 mM IPTG를 함유하는 배지 중에서 22℃에서 밤새 성장시키는 것을 제외하고, 상기에서 대부분 기재한 바와 같이 파지를 수거하여 증폭시켰다 (문헌 [Krebs et al., 2001]).
매우 강력한 결합체를 야기하는 가장 성공적인 패닝 접근법은 비오티닐화된 ActRIIB/Fc에 대해 제1 및 제3 라운드를 수행하고 huSkMC에 대해 제2 라운드를 수행하는 차별적 패닝인 것으로 밝혀졌다.
서열분석 이후, 발현 및 정제를 위한 Fab를 선별하고, 가장 유망한 것을 추가로 특성화하였다.
대부분의 항-ActRIIB 항체는 hActRIIB-형질감염된 HEK293T/17 세포에 한 자릿수, 최대 낮은 두 자릿수의 나노몰 범위의 EC50 값으로 결합하는 것으로 나타났다. 몇몇 Fab는 미오스타틴 결합 억제 ELISA에서 ActRIIB/Fc로부터 미오스타틴을 대체할 수 있었지만, 이들 중에서 오직 MOR08067 만이 리포터 유전자 검정에서 미오스타틴-유도된 활성의 완전한 억제를 나타내었다 (도 2).
인간 및 마우스 ActRIIB/Fc에 대한 가장 유망한 Fab의 친화도를 요약한 것을 하기 표에 열거한다 (표 1).
Figure pct00006
Fab 클론 MOR08067은 미오스타틴 유도된 RGA에서 양호한 억제를 나타내었을 뿐만 아니라, rhActRIIB 형질감염된 HEK293 세포에의 결합을 나타내었다. 비아코어에 의한 친화도 측정 결과 인간 및 마우스 ActRIIB/Fc에 대한 KD 값이 100 pM 미만인 것으로 나타났다. MOR08067 및 다른 후보물질을 선별하여 교차 클로닝 접근법을 이용한 추가의 최적화를 행하는 한편, 또한 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하는 MOR08067에 대해 탈글리코실화 접근법을 행하였다.
제1 친화성 성숙으로부터 유래된 항체의 최적화
a) MOR08067의 탈글리코실화
서열 분석에 따르면, 이 항체는 중쇄의 CDR-H2 내에 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하였다. 이 부위를 제거하여 MOR08156 및 MOR08159를 수득하였다. 이들 MOR08067-유도체의 특성화를 이하에 기술한다.
b) 최적화된 Fab의 교차 클로닝
CDR-H2 및/또는 CDR-L3 내의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위의 추가적인 기능 개선 및 제거를 위해, 제1 친화성 성숙으로 단일 친화성 성숙시킨 Fab로부터의 독립적으로 최적화시킨 CDR-H2 및 CDR-L3 영역을 각 패밀리가 분리된 상태로 있게 하면서 조합하였다. MOR07079 자손을 교차 클로닝에 진입시켰다. 대략 200 박테리아 용해물을 HEK293T/17/ActRIIB에 대한 FACS 친화도 순위결정에서 시험하였고, 가장 유망한 Fab 클론인 MOR08144 및 MOR08213을 발현시키고 정제하였다.
c) 최적화된 항체의 특성화
하기 섹션에서, MOR08067의 탈글리코실화된 자손 (MOR08156, MOR08159) 및 MOR08067 유래의 2 종의 교차 클론 (MOR08144 및 MOR08213)을 보다 상세하게 기재한다.
최적화된 Fab가 리포터 유전자 검정에서 미오스타틴 신호전달을 억제하는 능력을 측정하였고, 모든 결합체는 가장 높은 농도에서 95％ 초과의 억제를 유도할 수 있었다 (도 3).
비아코어를 이용한 친화도 결정 실험에서, MOR08159 및 MOR08213이 인간 및 마우스 ActRIIB 둘 모두에 대한 가장 강력한 결합체인 것으로 확인되었다 (표 2). 성숙되고 최적화된 Fab의 증가된 친화도는 미오스타틴-유도된 리포터 유전자 검정에서 증가된 효능을 반영한다는 것이 분명해졌다.
Figure pct00007
친화성 성숙된 Fab의 IgG2 전환 (1st 성숙)
제1 친화성 성숙으로부터 유래된 가장 유망한 Fab를 IgG2 전환을 위해 선별하였다.
IgG2 발현은 HKB11 세포의 일시적 형질감염에 의해 수행되었고, 세포 배양 상청액으로부터 전장 이뮤노글로불린을 정제하였다.
IgG로의 전환시, 모든 후보물질들은 리포터 유전자 검정에서 용량 의존적으로 미오스타틴-유도된 활성을 억제하는 능력을 유지하였다 (표 3).
Figure pct00008
MOR08159 및 MOR08213에 대해 FACS을 이용하여 인간 원발성 근육 근육모세포에 결합하는 이들의 능력을 시험하였고, 상기 세포에 대한 특이적 결합을 상기 세포에서의 ActRIIB의 낮은 발현과 연결지어 보고하였다 (도 4).
MOR08159 및 MOR08213은 원발성 골격 근육모세포 분화의 미오스타틴-유도된 억제를 완전하게 역전시키는 능력을 나타내었다 (도 5). 이들 항체는 또한, 내생적으로 생산된 ActRIIB 리간드를 중화시키는 그들의 능력으로 인해, 외인성 미오스타틴의 부재하에서 분화를 기저 수준을 초과하여 증가시켰다.
제2 친화성 성숙
추가로 효능을 개선시키기 위한 제2 친화성 성숙용 후보물질의 선별.
i. CDR-L3 및 CDR-H2 성숙 라이브러리의 구축
선별된 항체 단편 (예를 들어 MOR08067)의 친화성 및 생물학적 활성을 둘 모두 증가시키기 위해, CDR-L1 및 CDR-H2 영역을 트리뉴클레오티드 지정 돌연변이유발 (문헌 [Virnekas et al., [상기 문헌]])을 이용한 카세트 돌연변이유발에 의해 최적화하여, 프레임워크 영역을 일정하게 유지시켰다 (문헌 [Nagy et al., [상기 문헌]]). 성숙 라이브러리의 클로닝 이전에, XbaI/EcoRI 제한 부위를 통해 모든 모 Fab 단편을 발현 벡터 pMORPH®X9로부터 시스디스플레이™ 성숙 벡터 pMORPH®25로 전달하였다.
모든 성숙 라이브러리의 크기는 항상 최소 1x107개의 독립적인 클론을 생성하였다. 벡터 백그라운드는 모든 경우에서 1％ 미만이었다. 단일 클론의 서열분석에 의한 품질 관리 결과 각 라이브러리의 품질이 높은 것으로 밝혀졌다.
각각의 CDR-L1 및 CDR-H2 성숙 라이브러리의 경우, 항체-디스플레이 파지를 제조하고, 스폿 적정에 의해 파지 역가를 측정하였다.
ii. 패닝 전략, 친화도 순위결정 및 개선된 항체의 스크리닝
제2 친화성 성숙 라운드를 위한 차별적 패닝은 모 HEK293T/17 세포 및 인간 ActRIIB를 내생적으로 낮은 수준으로 발현하는 huSkMC를 포함하였다. 부가적으로, 재조합 비오티닐화된 hActRIIB/Fc 항원을 모든 패닝 전략에 포함시켰다.
항-ActRIIB Fab의 순위결정을 위해, 대략 2700개의 박테리아 용해물 (각 패닝 서브코드에 대해 약 88 클론)에 대해 MSD에 기초한 방법에서 재조합 비오티닐화된 hActRIIB/Fc 항원 및 hActRIIB-형질감염된 HEK293T/17 세포의 막 소포 제조물에 대한 친화도를 순위결정하였다. 히트를 높은 친화도 순위결정 인자와 함께 차례로 배열하였다.
또한, 히트로 표시되지 않는 무작위로 선별된 클론을 FACS 친화도 순위결정에서 평가하였다. 이를 위해, 모 HEK293T/17 및/또는 hActRIIB-형질감염된 HEK293T/17 세포를 이용하여 박테리아 용해물을 스크리닝하였다. 세포에 결합된 Fab를 피코에리트린-접합된 염소 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체로 검출하였다. 용해물 중 Fab 발현의 정량화를 병행해서 수행하였다.
모든 패닝 전략은 항-ActRIIB 특이적 항체를 생성하였다. MOR08067 자손은 서열 분석 이후에 확인할 수 있었다. 모든 결합체는 CDR-H2에서 성숙되었다.
IgG2 전환 및 IgG2의 특성화 (2nd 성숙)
다시, 제2 친화성 성숙으로부터 유래된 가장 유망한 Fab를 IgG2 전환을 위해 선별하였다. IgG2 발현은 HKB11 세포의 일시적 형질감염에 의해 수행되었고, 세포 배양 상청액으로부터 전장 이뮤노글로불린을 정제하였다.
시험된 모든 IgG는 원발성 골격 근육모세포 분화의 미오스타틴-유도된 억제를 완전하게 역전시킬 수 있었다 (표 4).
Figure pct00009
본 발명자들은 항-ActRIIB Ab가 미오스타틴 뿐만 아니라 원발성 인간 골격 근육모세포 상의 ActRIIB에 대한 다른 TGFβ 패밀리 리간드의 결합을 중화시키는 능력을 평가하였다. 근육모세포 분화 검정에서, 본 발명자들은 MOR08159 또는 MOR08213의 부재 또는 존재하에서 분화를 억제하는 다양한 리간드 잠재력을 평가하였다.
Figure pct00010
미오스타틴 및 GDF-11은 유사한 효율 및 유사한 범위로 인간 근육모세포 분화를 억제할 수 있다. 단일 농도의 MOR08159 또는 MOR08213의 존재하에서, 미오스타틴 및 GDF-11 용량 반응은 평행하게 이동되었다. 액티빈 A도 또한 분화를 억제할 수 있었지만, MOR08159 또는 MOR08213의 존재하에서, 본 발명자들은 Emax 및 효능에 있어서의 변화를 수반한 어떤 평행 이동도 관찰하지 못했다. BMP-2 반응은 MOR08159 또는 MOR08213의 존재에 의해 어떤 영향도 받지 않았는데, 이는 그러한 반응이 ActRIIB 결합을 통해 일어나지 않음을 시사한다.
생체내 뮤린 연구에서 항-ActRIIB 항체의 특성화.
항-ActRIIB 항체가 근육 비대를 유도하는 능력을, MOR08159 또는 MOR08213을 10 mg/kg i.p.로 6 주 동안 매주 투여한 SCID 마우스에서 평가하였다 (도 6).
연구 말미에, 항체는 둘 모두 시험한 모든 근육에서 매우 큰 비대를 유도할 수 있었다. 항-ActRIIB 항체를 처리한 마우스의 전체적인 체중에 있어서의 현저한 증가는 처리 1 주 후인 초기에 검출되었다.
MOR08213은 5 및 25 mg/kg에서 시험한 모든 근육에서 용량 의존적인 매우 큰 비대를 유도할 수 있었지만, 1 mg/kg 용량에서는 어떤 현저한 변화도 관찰되지 않았다 (도 7).
교차 차단 연구
안정한 인간 ActRIIB-형질감염된 HEK293T/17 세포를 10％ FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (50 IE/ml), 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml) 및 퓨로마이신 (2 ㎍/ml)을 함유하는 DMEM 중에 유지시켰다. 세포를 37℃ 및 5％ CO2의 인큐베이터 내에서 성장시키고, 매 3-4 일마다 계대배양하였다. 아쿠타제™를 이용하여 세포를 탈착시킨 다음, 새로운 배지를 함유하는 새로운 플라스크로 옮겼다.
항-ActRIIB 항체가 인간 ActRIIB의 동일한 에피토프에 결합하는 능력은 hActRIIB 발현 세포를 이용한 FACS에 의해 평가하였다.
이를 위해, 항-ActRIIB IgG를 웰 당 1x105개의 hActRIIB 형질감염된 세포와 함께 1 시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세척한 후, 상이한 비오티닐화된 항-ActRIIB IgG 또는 대조군 비오티닐화된 IgG를 동몰 농도로 제1 항-ActRIIB IgG로 1 시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세척한 후, 세포 결합된 비오티닐화된 IgG를 스트렙타비딘-APC (바이오레전드(Biolegend))로 검출하였다. 4℃에서 1 시간 인큐베이션한 후, 다시 세포를 세척하고, FACS 완충제 중에 재현탁시키고, FACS어레이™ 기기에서 세포의 형광 강도를 측정하였다.
FACS를 이용하여 MOR08159 및 MOR08213에 대해 인간 ActRIIB 형질감염된 세포에 대해 공동 결합하는 그들의 능력을 시험하였고, MOR08159 단독 (굵은 실선) 또는 MOR08213의 존재하에서의 (굵은 점선) 특이적 결합을 이소형 대조군 (실선) 또는 MOR08213의 존재하에서의 이소형 대조군 (점선)과 비교하여 보고하였다 (도 8).
MOR08213의 존재하에서 MOR08159의 결합은 현저하게 감소되었는데, 이는 이들 2종의 항체 각각이 동일한 부위에 결합하거나 또는 어느 정도 중첩될 수 있는 부위에 결합함을 시사하거나, 또는 MOR08213의 다르지만 매우 가까운 부위에의 결합이 MOR08159의 결합을 입체적으로 방해할 수 있음을 시사한다.
에피토프 맵핑
몇몇 상보적인 방법을 이용하여 항체 MOR08159가 결합하는 에피토프를 결정하였다. 본 실시예에서, 잔기 넘버링은 전장 ActRIIB 아미노산 서열 (서열 181)과 관련되어 있다.
도트 블롯
MOR08159 에피토프의 도트 블롯 분석을 수행하였다. 천연 및 변성된 (환원되고 열 변성된) ActRIIB를 니트로셀룰로스 막에 스폿팅하고, MOR08159로 프로브화하고, 표지된 항-인간 항체로 검출하였다. 천연 ActRIIB 만이 검출되었고, 환원 및 열 변성된 ActRIIB는 검출되지 않았다. 이 결과는 에피토프가 입체형태적 에피토프임을 나타낸다.
돌연변이 연구
ActRIIB의 세포외 도메인 (aa 21 - 120)의 라이브러리를 에러 유발(error-prone) PCR에 의해 생성하고, 변이체를 이. 콜라이의 주변세포질에서 발현시켰다. 이들 변이체 중 약 30,000개 (이론상 라이브러리 크기의 작은 일부)의 MOR08159에 대한 결합을 콜로니 필터 스크리닝 및 웨스턴 염색에 의해 시험하였다. MOR08159에 대해 단지 약한 결합만을 나타내거나 전혀 결합하지 않는 변이체를 ELISA에 의해 추가로 확인하였다. ActRIIB 변이체의 발현 수준 (항-Flag 항체로 검출함) 및 MOR08159 결합을 야생형 ActRIIB와 비교하였다. 발현이 야생형의 적어도 75％이고 MOR08159에 대한 결합이 25％ 미만인 경우, 돌연변이가 MOR08159 결합에 수반되는 것으로 평가하였다. (예를 들어 S-S 가교 시스테인의 돌연변이와 같은) 분명한 구조 왜곡이 없는 단일 점 돌연변이를 갖는 변이체 만이 고려되었다.
MOR08159 결합을 막는 대부분의 돌연변이가 위치 K75 내지 D81의 스트레치에서 발견되었는데, 이는 이 영역이 항체 결합에 중요함을 나타낸다. 위치 W78, D80 및 D81에서의 돌연변이는 MOR08159 결합을 현저하게 감소시키는 것으로 관찰되었다.
시클릭 펩티드 어레이
펩티드 마이크로어레이 상에 디스플레이된 항원 유래의 시클릭 펩티드 수집물을 관심 항체와 함께 인큐베이션하였다. 펩티드-항체 결합의 측정은 레플리토프(RepliTope)-분석에 의해 수행하였고, 본 분석에서는 펩티드 마이크로어레이를 1차 항체와 인큐베이션한 후, 1차 항체의 Fc 부분에 대해 지시된 형광 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 수회의 세척 단계 이후에, 마이크로어레이 원심분리기를 이용하여 펩티드 마이크로어레이를 건조시키고, 적절한 파장으로 설정한 고 해상도 마이크로어레이 스캐닝 시스템에서 스캐닝하였다.
마이크로어레이는 각각이 ActRIIB 유래의 시클릭 펩티드 (Cys 잔기가 Ser로 교환된 것)를 디스플레이하는 3 개의 서브어레이로 구성되었고, 이것을 스캐닝하였다 (펩티드 스캔 포맷 15/12). 대조 실험으로서, 관련이 없는 항체 (ACE18543, 동위원소 대조군)와 1회 인큐베이션한 후 형광 표지된 2차 항체 (Cy-5 표지된 항-인간 IgG)와 인큐베이션하여, 가양성 신호를 결정하였다. 부가적으로, 표적 항체와 인큐베이션한 후 형광 표지된 2차 항체와 인큐베이션하였다.
항체 MOR08159 (ACE19819)는 하나의 에피토프를 인식하는 것으로 나타났고, 이는 시험된 펩티드 중 3개에서 발견되었다 (번호 18-20).
Figure pct00011
MOR08159가 결합하는 것으로 보이는 이들 펩티드에서 공통되는 서열은 76GCWLDDFNC84 (서열 186)였다.
보다 약한 결합 특성을 갖는 제2 영역이 또한 본 방법에 의해 확인되었다. 이러한 제2 영역은 서열 49CEGEQDKRLHCYASW63 (서열 187)을 가졌다.
X선 결정학
인간 ActRIIB aa20-120 및 aa24-117을 발현시켰다. 또한, MOR08159 Fab 및 Fv 영역을 발현시키고 정제하였다 (모든 발현은 이. 콜라이에서 수행함). 이들 단백질을 이용하여, 4 종의 단백질 복합체를 제조하고, 정제하고, 결정화하였다 (MOR08159Fab-ActRIIB 20-120, MOR08159Fab-ActRIIB 24-117, MOR08159Fv-ActRIIB 20-120, MOR08159Fv-ActRIIB 24-117).
유리 MOR08159 Fab의 X선 구조가 1.78Å 해상도에서 분석되었다. ActRIIB-LBD와의 Fv 복합체의 X선 구조는 3.35Å 해상도에서 분석되었다. 접촉 잔기를 결정하기 위한 표준 3.9Å 거리 컷오프를 이용하여, 서열 76GCWLDDFNC84가 78WLDDFN83 서열 (서열 188)로부터의 우세한 결합 기여를 갖는 중요한 영역임을 확인하였다. 또한, 펩티드 영역 49CEGEQDKRLHCYASW63과의 상호작용이 또한 관찰되었다.
다양한 에피토프 맵핑 실험의 결과를 도 9에 요약한다.
SET에 의한 친화도 확인
항원 (ActRIIB 또는 ActRIIA의 세포외 도메인)의 연속 희석물을 PBS0.5％(w/v)BSA/0.02％(w/v)트윈 20 중에서 제조하고, 항체 (MOR08159)를 각 항원 농도에 첨가하여 일정한 항체 농도에 이르게 하였다. 각 희석물 혼합액 100 ㎕/웰을 96 웰 폴리프로필렌 MTP (그라이네르(Greiner))에 2중으로 분배하였다. 검정 완충제를 음성 대조군으로서 제공하였고, 어떤 항원도 함유하지 않는 샘플을 양성 대조군 (Bmax)으로서 제공하였다. 플레이트를 밀봉하고, 밤새 인큐베이션하였다. 96 웰 하이 바인드 MTP (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery))를 PBS 중에 희석시킨 0.1 ㎍/ml 마우스 ActRIIB-Fc 25 ㎕로 코팅하였다. 또한, 이 플레이트를 밀봉하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 이후에 항원 코팅된 하이 바인드 MTP를 PBS/0.05％(w/v)트윈 20으로 세척하였다. 후속하여, 플레이트를 PBS/5％(w/v)BSA로 차단시켰다. 세척 단계를 반복하고, 폴리프로필렌 MTP로부터의 항체-항원 제조물 50 ㎕/웰을 항원 코팅된 하이 바인드 MTP로 옮겼다. 하이 바인드 MTP를 실온에서 25 분 동안 인큐베이션하였다. 3번의 추가의 세척 단계 이후에, 검정 완충제 중에 희석시킨 1 ㎍/ml 술포-태그-표지된 염소 항-인간-검출 항체 (메조 스케일 디스커버리) 25 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 판독 완충제 (메조 스케일 디스커버리) 50 ㎕를 각 웰로 옮겼다. 전자화학발광 (ECL) 신호가 생성되었고, 섹터 영상장치 6000 판독기 (메조 스케일 디스커버리)로 검출하였다.
ECL 값을 상응하는 항원 농도에 대해 플롯팅하였다. 상기 플롯을 문헌 [Piehler J, et al., J Immunol Methods; 1997, 201(2): 189-206]에 기재되어 있는 적합 모델과 피팅시켜 KD를 결정하였다.
보고된 KD 값 및 표준 편차를 독립적인 실험으로부터 수득한 개개의 KD 값으로부터 결정하였다.
이들 실험으로부터, 인간 ActRIIB에 대해 해리 평형 상수 KD의 평균 값이 1.73 (±0.31) pM인 것으로 결정되었고, ActRIIA에 대해서는 해리 평형 상수 KD의 평균 값이 434 (±25) pM인 것으로 결정되었다.
본 발명은 단지 예를 들어 기재된 것이며, 본 발명의 범주 및 취지 내에서 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
DSMZ DSM22873 20090818 DSMZ DSM22874 20090818
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING MUSCLE GROWTH <130> 53508 <150> US 61/173004 <151> 2009-04-27 <150> US 61/306137 <151> 2010-02-19 <160> 190 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 3 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 5 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Tyr Ile Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 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caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag gaaatgacca agaaccaggt gtccctgacc 1080 tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacggccag 1140 cccgagaaca actacaagac cacccccccc atgctggaca gcgacggcag cttcttcctg 1200 tacagcaagc tgacagtgga caagagccgg tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc 1260 gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct gtcccccggc 1320 aaa 1323 <210> 181 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160 Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro 165 170 175 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val 420 425 430 His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Ala Cys Trp Asp His Asp 450 455 460 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480 Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu 485 490 495 Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 500 505 510 <210> 182 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 110 Thr Ala Pro Thr 115 <210> 183 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Ser Trp Leu Asp Asp Phe Asn Ser 1 5 10 15 <210> 184 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Val Lys Lys Gly Ser Trp Leu Asp Asp Phe Asn Ser Tyr Asp Arg 1 5 10 15 <210> 185 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Gly Ser Trp Leu Asp Asp Phe Asn Ser Tyr Asp Arg Gln Glu Ser 1 5 10 15 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys 1 5 <210> 187 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp 1 5 10 15 <210> 188 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Trp Leu Asp Asp Phe Asn 1 5 <210> 189 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Glu Gln Asp Lys Arg 1 5 <210> 190 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr 1 5 10

Claims (48)

  1. 항-ActRIIB 치료용 항체 또는 기능적 단백질.
  2. ActRIIB의 리간드 결합 도메인에 결합하는 항-ActRIIB 항체 또는 기능적 단백질.
  3. 서열 181의 아미노산 19-134 사이의 ActRIIB에 결합하는 항-ActRIIB 항체 또는 기능적 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 1 nM 이하, 바람직하게는 100 pM 이하의 KD로 ActRIIB에 결합하는 항-ActRIIB 항체 또는 기능적 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미오스타틴이 ActRIIB에 결합하는 것을 억제하는 항-ActRIIB 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의해 측정되는 바와 같이, 미오스타틴 유도된 신호전달을 억제하는 항-ActRIIB 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ActRIIA에 결합하는 것보다 10 배 이상의 친화도로 ActRIIB에 결합하는 항-ActRIIB 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1-84에 기재된 CDR 중 적어도 하나와 95％ 이상의 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 29-42에 기재된 적어도 하나의 CDR3과 95％ 이상의 동일성을 갖는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 99-112 중 적어도 하나와 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 85-98 중 적어도 하나와 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 99-112 중 적어도 하나와 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 VH 폴리펩티드 서열 및 서열 85-98 중 적어도 하나와 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 VL 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1-14로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 15-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 29-42로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 43-56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 57-70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 71-84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 15의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 29의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 43의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 57의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 71의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (b) 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 16의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 30의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 44의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 58의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 72의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (c) 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 31의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 45의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 59의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 73의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (d) 서열 4의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 18의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 32의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 46의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 60의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 74의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (e) 서열 5의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 33의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 47의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 61의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 75의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (f) 서열 6의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 20의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 34의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 48의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 62의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 76의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (g) 서열 7의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 21의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 35의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 49의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 63의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 77의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (h) 서열 8의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 36의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 50의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 78의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (i) 서열 9의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 23의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 37의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 51의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 79의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (j) 서열 10의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 24의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 38의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 52의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 66의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 80의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (k) 서열 11의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 25의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 39의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 53의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 67의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 81의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (l) 서열 12의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 26의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 40의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 54의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 68의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 82의 경쇄 가변 영역 CDR3,
    (m) 서열 13의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 27의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 41의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 55의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 69의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 83의 경쇄 가변 영역 CDR3, 또는
    (n) 서열 14의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 28의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 42의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 56의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 70의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 84의 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 146-150 및 156-160으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 141-145 및 151-155로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열과 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 기능적 단백질.
  17. (a) 서열 85의 가변 중쇄 서열 및 서열 99의 가변 경쇄 서열;
    (b) 서열 86의 가변 중쇄 서열 및 서열 100의 가변 경쇄 서열;
    (c) 서열 87의 가변 중쇄 서열 및 서열 101의 가변 경쇄 서열;
    (d) 서열 88의 가변 중쇄 서열 및 서열 102의 가변 경쇄 서열;
    (e) 서열 89의 가변 중쇄 서열 및 서열 103의 가변 경쇄 서열;
    (f) 서열 90의 가변 중쇄 서열 및 서열 104의 가변 경쇄 서열;
    (g) 서열 91의 가변 중쇄 서열 및 서열 105의 가변 경쇄 서열;
    (h) 서열 92의 가변 중쇄 서열 및 서열 106의 가변 경쇄 서열;
    (i) 서열 93의 가변 중쇄 서열 및 서열 107의 가변 경쇄 서열;
    (j) 서열 94의 가변 중쇄 서열 및 서열 108의 가변 경쇄 서열;
    (k) 서열 95의 가변 중쇄 서열 및 서열 109의 가변 경쇄 서열;
    (l) 서열 96의 가변 중쇄 서열 및 서열 110의 가변 경쇄 서열;
    (m) 서열 97의 가변 중쇄 서열 및 서열 111의 가변 경쇄 서열; 또는
    (n) 서열 98의 가변 중쇄 서열 및 서열 112의 가변 경쇄 서열
    을 포함하는 항체.
  18. (a) 서열 146의 중쇄 서열 및 서열 141의 경쇄 서열;
    (b) 서열 147의 중쇄 서열 및 서열 142의 경쇄 서열;
    (c) 서열 148의 중쇄 서열 및 서열 143의 경쇄 서열;
    (d) 서열 149의 중쇄 서열 및 서열 144의 경쇄 서열;
    (e) 서열 150의 중쇄 서열 및 서열 145의 경쇄 서열;
    (f) 서열 156의 중쇄 서열 및 서열 151의 경쇄 서열;
    (g) 서열 157의 중쇄 서열 및 서열 152의 경쇄 서열;
    (h) 서열 158의 중쇄 서열 및 서열 153의 경쇄 서열;
    (i) 서열 159의 중쇄 서열 및 서열 154의 경쇄 서열; 또는
    (j) 서열 160의 중쇄 서열 및 서열 155의 경쇄 서열
    을 포함하는 항체.
  19. ActRIIB에 대한 결합을 교차 차단하거나, ActRIIB에 대한 결합이 제18항의 적어도 하나의 항체에 의해 교차 차단되는 항체 또는 기능적 단백질.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ActRIIB에 대한 결합을 교차 차단하거나, ActRIIB에 대한 결합이 제18항의 적어도 하나의 항체에 의해 교차 차단되는 항체 또는 기능적 단백질.
  21. 제17항 또는 제18항의 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 기능적 단백질.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제17항 또는 제18항의 항체에 의해 인식되는 에피토프에 결합하는 항체 또는 기능적 단백질.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하거나 다음으로 이루어진 에피토프에 결합하는 항체:
    (a) 서열 181의 아미노산 78-83
    Figure pct00012
    ;
    (b) 서열 181의 아미노산 76-84
    Figure pct00013
    ;
    (c) 서열 181의 아미노산 75-85
    Figure pct00014
    ;
    (d) 서열 181의 아미노산 52-56
    Figure pct00015
    ;
    (e) 서열 181의 아미노산 49-63
    Figure pct00016
    ; 또는
    (f) 서열 181의 아미노산 78-83 (WLDDFN) 및 서열 181의 아미노산 52-56 (EQDKR).
  24. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 교차 차단 또는 동일한 에피토프에의 결합이 비아코어 검정 또는 ELISA에서 검출되는 것인 항체 또는 기능적 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 이소형인 항-ActRIIB 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역의 돌연변이를 통해 변경된 이펙터 기능을 갖는 항-ActRIIB 항체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  28. 제27항에 있어서, 서열 113-140 또는 161-180 중 하나 이상을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열.
  29. 제27항 또는 제28항에 따른 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 하나 이상의 서열 113-140 또는 161-180, 또는 적어도 하나의 CDR 영역을 코딩하는 그의 단편을 포함하는 벡터.
  31. 제29항 또는 제30항에 따른 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  32. 제31항의 숙주세포를 배양하는 단계 및 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 항체 또는 기능적 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 상기 항체 또는 기능적 단백질의 생산 방법.
  33. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단백질 또는 제27항 또는 제28항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제약 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 하나 이상의 추가의 활성제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 추가의 활성제가 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린(Ghrelin) 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  37. 근골격 질환 또는 장애; 급성 및/또는 만성 신장 질환 또는 부전; 간 섬유증 또는 경변증; 암, 예컨대 유방암; 파킨슨병; 뉴런 사멸과 관련된 상태, 예컨대 ALS, 뇌 위축, 또는 치매 및 빈혈; 간, 신장 및 폐 섬유증; 연령-관련 상태; 및 횡문근육종, 골 손실 유도 암, 간세포 암종, 위장암으로 예시되지만 이들로 한정되는 것은 아닌 암 환자에게 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단백질의 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법.
  38. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단백질, 제27항 또는 제28항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물.
  39. 근골격 질환 또는 장애; 급성 및/또는 만성 신장 질환 또는 부전; 간 섬유증 또는 경변증; 암, 예컨대 유방암; 파킨슨병; 뉴런 사멸과 관련된 상태, 예컨대 ALS, 뇌 위축, 또는 치매 및 빈혈; 간, 신장 및 폐 섬유증; 연령-관련 상태; 및 횡문근육종, 골 손실 유도 암, 간세포 암종, 위장암으로 예시되지만 이들로 한정되는 것은 아닌 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단백질, 제27항 또는 제28항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 용도.
  40. 근골격 질환 또는 장애; 급성 및/또는 만성 신장 질환 또는 부전; 간 섬유증 또는 경변증; 암, 예컨대 유방암; 파킨슨병; 뉴런 사멸과 관련된 상태, 예컨대 ALS, 뇌 위축, 또는 치매 및 빈혈; 간, 신장 및 폐 섬유증; 및 횡문근육종, 골 손실 유도 암, 간세포 암종, 위장암으로 예시되지만 이들로 한정되는 것은 아닌 암을 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단백질, 제27항 또는 제28항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 근골격 질환 또는 장애가 근육 위축, 예를 들어 근병증, 예컨대 근긴장증, 선천성 근병증 (네말린 근병증, 멀티/미니코어 근병증 및 근세관성 (중심핵성) 근병증 포함), 미토콘드리아 근병증, 가족성 주기성 마비, 염증성 근병증, 대사성 근병증, 예컨대 글리코겐 또는 지질 축적 질환에 의해 유발되는 것, 피부근염, 다발성근염, 봉입체 근염, 골화성 근염, 횡문근융해증 및 미오글루빈뇨증; 이영양증, 예컨대 뒤시엔느(Duchenne), 베커(Becker), 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss), 안인두, 견갑상완, 지대, 후쿠야마(Fukuyama), 선천성 근이영양증, 또는 유전성 원위 근병증; 골다공증; 골절; 단신; 왜소증; 장기간 침상 안정; 수의 비활동; 또는 불수의 비활동에 의해 유발된 것인 용도.
  42. 제41항에 있어서, 치료하고자 하는 환자가 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴으로 사전 치료받은 환자인 용도.
  43. 제41항에 있어서, 치료하고자 하는 환자가 종전의 IGF-1, IGF-2 또는 IGF-1 또는 IGF-2의 변이체, 항-미오스타틴 항체, 미오스타틴 프로펩티드, ActRIIB에 결합하지만 그것을 활성화시키지는 않는 미오스타틴 디코이 단백질, 베타 2 효능제, 그렐린 효능제, SARM, GH 효능제/모방체 또는 폴리스타틴에 의한 치료에 대해 불응성인 용도.
  44. 제41항에 있어서, 치료하고자 하는 환자가 연로하거나, 무중력 환경에서 시간을 보내거나, 또는 비활동 기간을 겪은 자인 용도.
  45. 강요된 비활동 기간 또는 무중력 환경에서 보내는 시간 이전에 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 기능적 단백질의 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 강요된 비활동 또는 무중력 환경에서 보낸 시간의 근육 소모 효과를 개선하는 방법.
  46. 제41항에 있어서, 치료하고자 하는 환자가 사지 (즉, 다리 또는 팔) 또는 관절 (즉, 무릎 또는 엉덩이)에 골절을 가진 환자인 용도.
  47. 제41항에 있어서, 환자가 고관절 또는 슬관절 치환 수술을 받았거나 받을 예정인 용도.
  48. pBW522 (DSM22873) 또는 pBW524 (DSM22874)에 의해 코딩된 항체.
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