WO2024014989A1 - Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы - Google Patents

Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы Download PDF

Info

Publication number
WO2024014989A1
WO2024014989A1 PCT/RU2023/050042 RU2023050042W WO2024014989A1 WO 2024014989 A1 WO2024014989 A1 WO 2024014989A1 RU 2023050042 W RU2023050042 W RU 2023050042W WO 2024014989 A1 WO2024014989 A1 WO 2024014989A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
actriib
gbd
protein
recombinant protein
recombinant
Prior art date
Application number
PCT/RU2023/050042
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Михайлович ЛЯЩУК
Владимир Глебович ЛУНИН
Афанасий Владимирович ЛУНИН
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕД-РЕСУРС"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2022119326A external-priority patent/RU2792817C1/ru
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕД-РЕСУРС" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕД-РЕСУРС"
Publication of WO2024014989A1 publication Critical patent/WO2024014989A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • Recombinant protein GBD-ActRUB for increasing muscle mass in farm animals and poultry
  • the invention relates to genetic engineering, biochemistry, biotechnology and veterinary medicine, namely to the recombinant GBD-ActRIIB protein, including a fragment of the ActRIIB receptor (activin receptor type II B) and a glucan-binding domain (GBD), a method for producing the GBD-ActRIIB protein on alpha-glucan, an injectable drug based on the GBD-ActRIIB protein, as well as a method of using the said injectable drug to increase muscle mass and increase the meat productivity of farm animals and poultry.
  • the recombinant GBD-ActRIIB protein including a fragment of the ActRIIB receptor (activin receptor type II B) and a glucan-binding domain (GBD), a method for producing the GBD-ActRIIB protein on alpha-glucan, an injectable drug based on the GBD-ActRIIB protein, as well as a method of using the said injectable drug to increase muscle mass and increase the meat productivity of farm animals and poultry.
  • Activin receptors are glycoproteins with a molecular weight of ⁇ 55 kDa, which are transmembrane proteins consisting of a ligand-binding extracellular domain, a transmembrane domain, and a cytoplasmic serine/threonine kinase domain. Activin receptors are divided into types I and II, each of which is represented by two isoforms - A and B.
  • the ActRUA and ActRIIB receptors have been identified as type II receptors for activins [1, 2]. In addition to activins, ActRUA and ActRIIB can interact with several proteins of the TGF-P superfamily, including BMP7, Nodal, GDF8 and GDF11 [3-6].
  • GDF8 growth differentiation factor 8
  • myostatin is a secreted growth factor that inhibits the growth and differentiation of muscle tissue. Myostatin is expressed in muscles and then released into the blood, exerting its effect on muscles through binding to ActRII receptors (activin type II receptor) [7].
  • GDF8 is a negative regulator of skeletal muscle mass. Knockout of the GDF8 gene in transgenic mice is characterized by pronounced hypertrophy and hyperplasia of skeletal muscles [8]. A similar increase in skeletal muscle mass was found in the presence of naturally occurring GDF8 mutations in cattle [9–12]. Piedmontese and Belgian Blue breeds of cows carry a mutation in the GDF8 gene, which causes a marked increase in muscle mass [13]. By manipulating the activity of GDF8, it is possible to induce significant physiological changes in the body. Animal studies have shown that blocking myostatin leads to a significant increase in lean muscle mass with virtually no body fat [14]. Currently, a number of blockers of the action of myostatin are being developed.
  • Patent US6096506A claims an antibody that specifically binds to myostatin.
  • Patent US6468535B1 claims a method of increasing muscle mass in an animal by administering a monoclonal antibody against myostatin and blocking its activity.
  • patent RU2613420C1 claims the production of a fusion protein with the myostatin sequence, which, as part of an immunogenic composition, is capable of inducing the synthesis of specific autoantibodies to myostatin, blocking its action and, as a result, stimulating the growth of muscle tissue.
  • the drug ACVR2B has been developed based on the soluble form of the ActRIIB receptor.
  • the ACVR2B protein has a region that can bind to free myostatin, blocking its ability to activate ActRIIB receptors on the surface of myoblasts.
  • Variants of ActRIIB polypeptides that have significantly reduced affinity for activin (eg, activin A and/or activin B) compared to other ActRIIB ligands, such as GDF11 and/or myostatin, are called GDF decoys.
  • This drug was created by Se-Jin Lee (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore).
  • the ACVR2B decoy drug has proven highly effective in laboratory mice. Muscle growth was recorded after four weeks of using the drug.
  • Patents US8252900B2 and US8343933B2 are devoted to modulating tissue growth using soluble forms of ActRIIB.
  • Patent US8710016B2 proposes the use of the ActRUB ligand for the treatment of muscular dystrophy. As stated in patent US7842663B2, GDF traps can be used to increase muscle mass and reduce fat mass.
  • Patent application US2016/0031993A1 states that monoclonal antibodies to ActRIIB can be used to grow muscle tissue and treat muscle disorders such as muscle wasting.
  • the problem to be solved by the invention is the development of a new effective method for increasing muscle mass and increasing the meat productivity of farm animals and poultry, in particular in the development of an injection drug containing the immunologically active recombinant protein GBD-ActRIIB, and a method for its use.
  • the achieved technical result consists in increasing muscle mass and increasing meat productivity of farm animals and poultry, in easy protein purification, where the concentration of the purified GBD-ActRIIB fusion protein varies in the range of 1-8 mg/ml, which has sufficient immunogenicity against ActRIIB.
  • the technical result consists in obtaining a universal means for increasing the meat productivity of farm animals and poultry, that is, the developed product can be used for all farm animals and birds.
  • the protein according to the invention has increased resistance to proteases in comparison with the native conformation of the ActRIIB antigen and demonstrates high storage stability.
  • the ActRIIB fragment-based antigens of the present invention provide a storage function and a longer half-life in the immunized animal, given the increased resistance to degradation of these materials.
  • a significant advantage of the present invention is that immunized animals and birds may have several weeks to several months between booster immunizations, allowing the immune system to block by inducing the synthesis of specific autoantibodies, the endogenous ActRIIB receptor, preventing its binding to myostatin and/or reducing its activity in the body for a long time, inhibits the signal to muscle tissue cells, stopping their growth.
  • the mechanism of action is based on the induction of the synthesis of specific autoantibodies to the endogenous ActRIIB receptor, blocking the activity of endogenous myostatin in the blood serum and the induction of complex rearrangements of adaptive genesis, expressed in structural transformations in the body and stimulation of muscle tissue growth.
  • the solution to the first task is ensured by obtaining the recombinant protein GBD-ActRIIB with a molecular weight of 36 kDa, including a fragment of the ActRIIB protein with with the sequence SEQ ID NO 1, a glycine-serine spacer with the sequence SEQ ID NO 2 and an alpha-glucan binding domain (GBD) from Streptococcus mutans with the sequence SEQ ID NO 3.
  • GBD-ActRIIB with a molecular weight of 36 kDa, including a fragment of the ActRIIB protein with with the sequence SEQ ID NO 1, a glycine-serine spacer with the sequence SEQ ID NO 2 and an alpha-glucan binding domain (GBD) from Streptococcus mutans with the sequence SEQ ID NO 3.
  • the method for producing recombinant GBD-ActRIIB protein on alpha-glucan includes the following steps:
  • the recombinant GBD-ActRIIB protein includes the protein sequence of the glucan-binding domain (GBD), which determines the ability of this protein to bind to a glucan-containing sorbent, which allows concentration, purification and immobilization of the protein product on alpha-glucan in one step. Immobilization on alpha-glucan is ensured due to the presence in the recombinant protein of the alpha-glucan-binding domain from Streptococcus mutans, which has a high affinity for alpha-glucans (pullulan, glycogen, dextran, starch) and ensures irreversible binding to the carrier in a wide range of pH values 6, 0-9.0 and salt concentrations 0-3 M NaCl.
  • GBD glucan-binding domain
  • E. coli cells lack proteins that bind to alpha-glucan
  • the recombinant GBD-ActRIIB protein synthesized in E. coli cells is the only cell protein of the producer strain that strongly binds to alpha-glucan. This provides the possibility of a one-step production of a highly purified recombinant protein preparation immobilized on an alpha-glucan-containing sorbent.
  • the solution to the second task is ensured by the creation of an injectable drug to increase muscle mass and increase the meat productivity of farm animals and poultry.
  • the resulting preparation contains the recombinant protein GBD-ActRIIB, characterized above, suspended in an alpha-glucan-containing sorbent medium in a liquid suitable for injection use. carrier.
  • the method of increasing the muscle mass of farm animals and poultry includes twice, with an interval of 20 days, subcutaneous or intramuscular injections of a drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB, at a dose of 5-100 ⁇ g of the specified protein per kilogram of body weight of the animal or bird.
  • an active recombinant protein GBD-ActRIIB has been obtained, which has the ability to spontaneously bind to a glucan-containing sorbent, forming a highly immunogenic composition in the form of a polyantigen, induce the synthesis of specific autoantibodies to ActRIIB when administered as part of an injection drug to farm animals and poultry and, as a result, stimulate muscle growth tissue and increase meat productivity.
  • the first stage of the work was the design of the recombinant protein GBD-ActRIIB.
  • the nucleotide sequence of a chimeric gene (SEQ ID NO 4) encoding a fragment of the ActRIIB receptor (SEQ ID NO 1), spey cep (SEQ ID NO 2) and an alpha-glucan binding domain (GBD) from Streptococcus mutans (SEQ ID NO 3) was planned.
  • SEQ ID NO 3 The sequence of the chimeric gene was optimized for codon composition and secondary structure of mRNA.
  • the recombinant fusion protein contains a fragment of the ActRIIB receptor corresponding to the extracellular ligand-binding domain.
  • the amino acid sequence of an ActRIIB fragment may contain one or more changes relative to the native ActRIIB polypeptide, but not the ligand binding sequences.
  • the recombinant fusion protein may include one or more additional domains that impart a desired property, such as simple and efficient purification, for example, a polyhistidine sequence fused to glutathione-8-transferase or, preferably, a glucan binding domain (GBD) sequence.
  • GBD glucan binding domain
  • the target protein a high affinity for alpha-glucans (pullulan, glycogen, dextran, starch) and ensures irreversible binding to the carrier, allowing for effective immobilization of the recombinant protein on a glucan-containing sorbent and obtaining a highly purified preparation of the target protein GBD-ActRIIB, not containing impurities of other bacterial proteins, DNA of the producing strain, lipopolysaccharides and endotoxins.
  • the polysaccharide-binding domain can be attached to the ActRIIB antigen through an optimally configured spacer of variable length.
  • the spacer is necessary to ensure the presentation of the ActRIIB antigen on the surface of the protein molecule, as well as optimal presentation to the animal's immune system.
  • the spacer variant presented in this invention with the sequence SEQ ID NO 2 provides effective formation of the native conformation of the ActRIIB antigen, increased resistance to proteases, optimal effects on the immune system, and in experiments on immunization of farm animals and birds to increase muscle mass, demonstrated an unexpected improvement compared to constructs that do not have a spacer sequence and/or other sequences other than those presented in the present invention.
  • the target gene encoding the recombinant GBD-ActRIIB fusion protein with the nucleotide sequence SEQ ID NO 4 was synthesized by a chemical-enzymatic method followed by cloning. As a result, the pGBD-ActRIIB plasmid encoding the GBD-ActRIIB protein was obtained.
  • E. coli BL21 cells and their derivatives which provide a high level of synthesis of the target fusion protein, as well as plasmid expression vectors of the pET type.
  • a strain producing the recombinant protein GBD-ActRIIB was obtained.
  • E. coli BL21 cells were transformed with the resulting plasmid pGBD-ActRIIB.
  • 3 ⁇ l of 0.1 M isopropyl-P-O-thiogalactopyranoside (IPTG) solution was added to the culture and grown for 3 h at 37 °C.
  • IPTG isopropyl-P-O-thiogalactopyranoside
  • the level of synthesis of the target protein in E. coli was determined by comparing the intensity of the staining band of the recombinant protein with the band of the corresponding protein - the molecular weight standard. It has been shown that the recombinant protein GBD-ActRIIB is synthesized in E. coli cells in an insoluble form in the form of inclusion bodies.
  • GBD-ActRIIB a cell culture of E. coli strain BL21 [pGBD-ActRIIB] was grown in 1 L of LB medium with ampicillin (100 ⁇ g/ml) at 37 °C to an optical density corresponding to 1 unit. absorption at a wavelength of 550 nm. 15 ⁇ l of a 0.1 M IPTG solution was added to the medium and grown for 3 hours. Cells were pelleted by centrifugation at 5500 B for 15 minutes. The sediment was resuspended in phosphate buffer with lysozyme. Additionally, the suspension was treated with ultrasound. After centrifugation at 6000 g, the insoluble GBD-ActRIIB protein remained in the sediment.
  • the sediment was suspended in 8 M urea, centrifuged for 30 min at 12,000 g, and the supernatant was collected.
  • the supernatant was diluted 4 times with phosphate buffer, 1/10 of the volume of alpha-glucan suspension was added, incubated at 25 °C for 2 hours. Centrifuged at 8000 rpm, the sediment was resuspended in phosphate buffer; Alpha-glucan washing was repeated 3 times.
  • the recombinant GBD-ActRIIB fusion protein immobilized on alpha-glucan was a suspension of the sorbent with the protein adsorbed on it.
  • the purity of the protein preparation was at least 90%.
  • Preservation was carried out by adding benzyl alcohol to a concentration of 0.1%.
  • the fusion protein can be purified in accordance with known protein purification technologies, including, for example, lysis of bacterial cells with the enzyme lysozyme, French-press, ultrasound or DNase DNA degradation, subsequent differential centrifugation of inclusion bodies, dissolution of inclusion bodies in guanidine chloride or urea, refolding procedures, column chromatography on affinity and ion exchange columns, etc.
  • the resulting recombinant GBD-ActRIIB fusion protein exhibits high storage stability.
  • the ActRIIB fragment-based antigens of the present invention provide a storage function and a longer half-life in the immunized animal, given the increased resistance to degradation of these materials.
  • the polysaccharide-binding domain can be replaced by other polypeptides, for example, the ActRIIB antigen fragment can be combined with KLH (keyhole limpet hemocyanin), tetanus toxoid, CRM197 (a type of diphtheria toxin) or other protein carriers.
  • the recombinant GBD-ActRIIB fusion protein was obtained for subsequent creation on its basis of an injectable drug for administration to farm animals and poultry in order to increase muscle mass.
  • concentration of the purified GBD-ActRIIB fusion protein varies in the range of 1-8 mg/ml, typically it is 4-6 mg/ml.
  • the next stage of the research was the development of an injectable drug based on the GBD-ActRIIB protein for administration to farm animals and poultry.
  • the injectable preparation is a variant of an immunogenic composition based on a recombinant GBD-ActRIIB fusion protein (as an antigen), suspended in a medium of alpha-glucan-containing sorbent, in a liquid adjuvant suitable for injection use.
  • the drug is sterilized using ultrafiltration.
  • the immunogenic compositions of the present invention may be prepared using individually sterilized components prior to final formulation.
  • the injectable preparation which is an immunogenic composition according to the present invention, includes a recombinant fusion protein GBD-ActRIIB (1-10 mg/ml), dextran-500 (1-10 mg/ml), BEAE-dextran-500 (0, 2-2 .0 mg/ml).
  • Variants of the immunogenic composition contain optimized adjuvants (example No. 2), which ensure the induction of a humoral immune response, are stable, safe and effective when used for farm animals and poultry. They do not contain animal products or carcinogenic compounds.
  • the immunogenic compositions in this invention can be prepared as a sterile oil emulsion with MontanideTM (Examples No. 3 and 4) or a suspension with aluminum hydroxide (Example No. 5).
  • Options for the immunogenic compositions of this invention may further include dispersing or wetting agents, suspending agents, or other similar materials.
  • the immunogenic composition must be sterile and stable under production and storage conditions. Prevention of the growth of microorganisms can be achieved by adding various antibacterial and antifungal agents, for example, benzyl alcohol, parabens, chlorobutanol, sorbic acid, thiomersal, etc.
  • Typical embodiments of the invention are directed to farm animals and birds that are administered an injectable formulation of the recombinant GBD-ActRIIB protein of the invention to limit or prevent the effects of endogenous myostatin on muscle tissue, resulting in additional muscle growth.
  • the injectable preparation contains the recombinant GBD-ActRIIB protein suspended in an alpha-glucan solution (50% by weight), a water-oil suspension of Montanide (50% by weight) or aluminum hydroxide (equal volume).
  • an alpha-glucan solution 50% by weight
  • a water-oil suspension of Montanide 50% by weight
  • aluminum hydroxide equal volume
  • the ActRIIB antigen of the present invention is present in the tissues of farm animals and poultry for a longer time, causing a longer-lasting effect on the immune system.
  • the present invention also provides a maximized immune response through optimized adjuvants.
  • a significant advantage of the present invention is that in immunized animals and birds, several weeks to several months can pass between booster immunizations, which allows the immune system to block, by inducing the synthesis of specific autoantibodies, the endogenous ActRIIB receptor, preventing its binding to myostatin and/or reducing its activity in the body for a long time, inhibit the signal to muscle tissue cells, stopping their growth.
  • the invention provides a method for increasing muscle mass, increasing muscle strength and increasing bone density in farm animals and poultry.
  • Diseases or disorders for which the immunogenic compositions of the invention may be used in the treatment or prevention include, but are not limited to, frailty, cachexia, age-related sarcopenia, muscle wasting, myopathy, muscular dystrophy, osteoporosis, obesity, heart failure or heart disease.
  • the claimed invention namely a new injection drug based on the recombinant protein GBD-ActRIIB and a method for its use, has scientific novelty, has no complete analogues and has a competitive advantage in achieving the technical result of increasing muscle mass and increasing meat productivity of agricultural animals and poultry, in easy protein purification, where the concentration of the purified GBD-ActRIIB fusion protein varies in the range of 1-8 mg/ml, which has sufficient immunogenicity against ActRIIB, in obtaining a universal means for increasing the meat productivity of farm animals and poultry, increased resistance to proteases in comparison with the native conformation of the ActRIIB antigen, the recombinant GBD-ActRIIB protein demonstrates high storage stability, antigens based on the ActRIIB fragment in the present invention provide a deposition function and a longer half-life in the body of the immunized animal, given the increased resistance to degradation of these materials.
  • SEQ ID NO 4 The nucleotide sequence of a chimeric gene (SEQ ID NO 4) encoding a fragment of the ActRIIB receptor (SEQ ID NO 1), spey cep (SEQ ID NO 2) and an alpha-glucan binding domain (GBD) from Streptococcus mutans (SEQ ID NO 3) was planned. Next, the gene (SEQ ID NO 4) was synthesized by a chemical-enzymatic method, followed by cloning.
  • the plasmid pGBD-ActRIIB encoding the GBD-ActRIIB protein, was obtained by cloning the gene (SEQ ID NO 4) into the specified mother plasmid.
  • E. colt BL21 cells were used to express the recombinant protein, which ensured a high level of synthesis of the target fusion protein.
  • E. colt BL21 cells were transformed with the resulting plasmid pGBD-ActRIIB.
  • 3 ⁇ l of 0.1 M isopropyl-P-O-thiogalactopyranoside (PIGG) solution was added to the culture and grown for 3 h at 37 °C.
  • PIGG isopropyl-P-O-thiogalactopyranoside
  • coli was determined by comparing the intensity of the staining band of the recombinant protein with the band of the corresponding protein - the molecular weight standard. It has been shown that the recombinant protein GBD-ActRIIB is synthesized in E. coli cells in an insoluble form in the form of inclusion bodies.
  • GBD-ActRIIB a cell culture of E. coli strain BL21 [pGBD-ActRIIB] was grown in 1 L of LB medium with ampicillin (100 ⁇ g/ml) at 37 °C to an optical density corresponding to 1 unit. absorption at a wavelength of 550 nm. 15 ⁇ l of a 0.1 M IPTG solution was added to the medium and grown for 3 hours. Cells were pelleted by centrifugation at 5500 B for 15 minutes.
  • the sediment was resuspended in phosphate buffer with lysozyme. Additionally, the suspension was treated with ultrasound. After centrifugation at 6000 g, the insoluble GBD-ActRIIB protein remained in the sediment. The sediment was suspended in 8 M urea, centrifuged for 30 min at 12,000 g, and the supernatant was collected. To immobilize the recombinant GBD-ActRIIB protein on the sorbent, the supernatant was diluted 4 times with phosphate buffer, 1/10 of the volume of alpha-glucan suspension was added, incubated at 25 °C for 2 hours. Centrifuged at 8000 rpm, the sediment was resuspended in phosphate buffer; Alpha-glucan washing was repeated 3 times.
  • the recombinant GBD-ActRIIB fusion protein immobilized on alpha-glucan was a suspension of the sorbent with the protein adsorbed on it.
  • the purity of the protein preparation was at least 90%.
  • Preservation was carried out by adding benzyl alcohol to a concentration of 0.1%.
  • the fusion protein can be purified in accordance with known protein purification technologies, including, for example, lysis of bacterial cells with the enzyme lysozyme, French-press, ultrasound or DNase DNA degradation, subsequent differential centrifugation of inclusion bodies, dissolution of inclusion bodies in guanidine chloride or urea, refolding procedures, column chromatography on affinity and ion exchange columns, etc.
  • the resulting recombinant GBD-ActRIIB fusion protein exhibits high storage stability.
  • concentration of the purified GBD-ActRIIB fusion protein varies in the range of 1-8 mg/ml, typically it is 4-6 mg/ml.
  • the resulting purified GBD-ActRIIB fusion protein was coupled with a water-oil suspension of Montanide or aluminum hydroxide using standard methods under standard conditions.
  • the formulation contains recombinant GBD-ActRIIB protein suspended in an alpha-glucan solution (50% by weight), a water-oil suspension of Montanide (50% by weight), or aluminum hydroxide (equal volume), and is administered by subcutaneous or intramuscular injections of the drug twice with an interval of 20 days at a dose of 5-100 mcg of recombinant protein per kilogram of body weight of an animal or bird.
  • Example 3 The effect of an injection drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB on the increase in body weight of piglets
  • Landrace piglets aged 100-120 days with a body weight of 50-55 kg were subcutaneously injected with a drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB, suspended in a medium of alpha-glucan (50% by weight), water-oil suspension Montanide (50% by weight), twice with an interval of 20 days at the rate of 5-100 ⁇ g of recombinant protein per 1 kg of animal body weight. There were 10 animals in each experimental and control group.
  • Table 1 Change in body weight of piglets immunized with a drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB
  • Table 2 presents the results of determining by enzyme immunoassay the level of autoantibodies to myostatin in the blood serum of piglets after immunization with a drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB.
  • ActRIIB fragment-based antigens of the present invention provide a storage function and a longer half-life in the immunized animal, given the increased resistance to degradation of these materials.
  • Table 2 Level of autoantibodies to ActRIIB in blood serum samples of piglets immunized with a drug containing recombinant protein GBD-ActRIIB
  • Kholmogory bulls at the age of 10 months were subcutaneously injected with a drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB, suspended in a medium of alpha-glucan (50% by weight), a water-oil suspension of Montanide (50% by weight), twice with at intervals of 20 days at the rate of 50 ⁇ g of recombinant protein per 1 kg of live body weight of animals. There were 10 animals in each experimental and control group. The results of the study are presented in Table 3.
  • Example 5 Effect of an injectable preparation containing recombinant protein GBD-ActRIIB on body weight gain in turkeys
  • the drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB was intramuscularly administered to male turkeys of the white broad-breasted (heavy cross) breed at the age of 30 days.
  • the drug was used in doses of 5 and 50 ⁇ g/kg of recombinant protein GBD-ActRIIB, suspended in a medium of alpha-glucan (50% by weight), aluminum hydroxide suspension (50% by weight), twice with an interval of 20 days at a rate of 5-50 mcg of recombinant protein per 1 kg of live body weight of the bird. There were 10 animals in each experimental and control group. The results of the study are presented in Table 4.
  • Table 4 Change in body weight of white broad-breasted turkeys immunized with a drug containing the recombinant protein GBD-ActRIIB
  • SEQ ID NO 4 Nucleotide sequence of the gene encoding the recombinant GBD-ActRIIB protein and amino acid sequence of the recombinant GBD-ActRIIB protein

Abstract

Изобретения относятся к рекомбинантному белку GBD-ActRIIB, содержащему фрагмент рецептора ActRIIB и глюкансвязывающий домен GBD, к способу получения указанного рекомбинантного белка, к препарату для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB и к способу использования препарата на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB повышения массы сельскохозяйственных животных и птицы.

Description

Рекомбинантный белок GBD-ActRUB для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы
Область техники
Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и ветеринарии, а именно к рекомбинантному белку GBD-ActRIIB, включающему фрагмент рецептора ActRIIB (активиновый рецептор II типа В) и глюкансвязывающий домен (GBD), способу получения белка GBD-ActRIIB на альфа-глюкане, инъекционному препарату на основе белка GBD-ActRIIB, а также способу использования указанного инъекционного препарата для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.
Уровень техники
Активиновые рецепторы (ActR) - гликопротеины с молекулярной массой ~55 кДа, представляющие собой трансмембранные белки, состоящие из лиганд-связывающего внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического серин/треонинкиназного домена. Рецепторы активина подразделяются на типы I и II, каждый из которых представлен двумя изоформами - А и В.
Рецепторы ActRUA и ActRIIB были идентифицированы как рецепторы П типа для активинов [1, 2]. Кроме активинов, ActRUA и ActRIIB могут взаимодействовать с несколькими белками суперсемейства TGF-P, включая ВМР7, Nodal, GDF8 и GDF11 [3-6].
GDF8 (growth differentiation factor 8), также известный как миостатин, - это секретируемый фактор роста, который подавляет рост и дифференцировку мышечной ткани. Миостатин экспрессируется в мышцах и затем выделяется в кровь, оказывая свое действие на мышцы за счет связывания с рецепторами ActRII (activin type II receptor) [7].
GDF8 представляет собой негативный регулятор массы скелетных мышц. Нокаут гена GDF8 у трансгенных мышей характеризуется выраженной гипертрофией и гиперплазией скелетных мышц [8]. Аналогичное увеличение массы скелетных мышц обнаружено при наличии природных мутаций GDF8 у крупного рогатого скота [9-12]. Пьемонская и бельгийская голубая породы коров несут мутацию гена GDF8, которая вызывает выраженное увеличение мышечной массы [13]. Путем манипулирования с активностью GDF8 можно вызвать значительные физиологические изменения в организме. Исследования на животных показали, что блокирование миостатина приводит к значительному увеличению сухой мышечной массы с практически полным отсутствием жировой прослойки [14]. В настоящее время ведется разработка целого ряда блокаторов действия миостатина.
Патент US6096506A заявляет антитело, которое специфически связывается с миостатином.
Патент US6468535B1 заявляет способ увеличения мышечной массы животного путем введения моноклонального антитела против миостатина и блокирования его активности.
Кроме этого, известен патент RU2613420C1, заявляющий о получении слитого белка с последовательностью миостатина, способного в составе иммуногенной композиции индуцировать синтез специфических аутоантител к миостатину, блокировать его действие и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани.
Разработан препарат ACVR2B на основе растворимой формы рецептора ActRIIB. Белок ACVR2B имеет участок, способный связываться со свободным миостатином, блокируя его способность активировать рецепторы ActRIIB на поверхности миобластов. Варианты полипептидов ActRIIB, обладающие значительно сниженным сродством к активину (например, активину А и/или активину В) по сравнению с другими лигандами ActRIIB, такими как GDF11 и/или миостатин, называются ловушками GDF. Данный препарат был создан Se-Jin Lee (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore). Препарат-ловушка c ACVR2B доказал высокую эффективность на лабораторных мышах. Был зафиксирован мышечный прирост после четырех недель применения препарата. Максимальные показатели мышечного прироста были достигнуты при двух инъекциях в неделю, в дозировке 50 мкг на килограмм массы тела. Мышечная масса этих мышей увеличилась на 61 % по сравнению с исходной [15]. Модулированию роста тканей с помощью растворимых форм ActRIIB посвящены патенты US8252900B2 и US8343933B2. В патенте US8710016B2 предлагается использовать лиганд ActRUB для терапии мышечной дистрофии. Как заявлено в патенте US7842663B2, ловушки GDF могут применяться для повышения мышечной массы и снижения жировой массы. В заявке на патент US2016/0031993A1 указано, что моноклональные антитела к ActRIIB могут использоваться для роста мышечной ткани и лечения мышечных расстройств, таких как мышечные потери. Однако все предложенные технологии блокирования биологической активности миостатина имеют целый ряд ограничений при использовании, поскольку требуют систематического применения дорогостоящих моноклональных антител к миостатину, растворимых форм лигандов-ловушек на основе рецептора ActRIIB или моноклональных антител к рецепторам ActRUA и ActRIIB на протяжении многих месяцев. Таким образом, крайне актуальна разработка новых технических решений для снижения концентрации миостатина в крови животных и уменьшения связывания с рецепторами ActRIIB на поверхности миобластов. Одной из альтернативных технологий, реализованных в настоящем изобретении, является блокирование рецептора ActRIIB и миостатина с помощью аутоантител.
Раскрытие изобретения
Задачей, на решение которой направлено изобретение является разработка нового эффективного способа увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в частности в разработке инъекционного препарата, содержащего иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, и способа его использования.
Достигаемый технический результат заключается в увеличении мышечной массы и повышении мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в легкой очистке белка, где концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB. Кроме того, технический результат заключается в получении универсального средства для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, то есть разработанное средство может быть использовано для всех сельскохозяйственных животных и птиц. Также белок по изобретению имеет повышенную устойчивость к протеазам в сравнении с нативной конформации антигена ActRIIB и демонстрирует высокую стабильность при хранении. Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов. Значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что у иммунизированных животных и птиц может проходить от нескольких недель до нескольких месяцев между бустерными иммунизациями, что позволяет иммунной системе блокировать путем индукции синтеза специфических аутоантител эндогенный рецептор ActRIIB, препятствуя его связыванию с миостатином и/или снижая его активность в организме в течение длительного времени, ингибировать сигнал клеткам мышечной ткани, останавливающим их рост.
Механизм действия основан на индукции синтеза специфических аутоантител к эндогенному рецептору ActRIIB, блокировании активности эндогенного миостатина в сыворотке крови и индукции комплексных перестроек адаптивного генеза, выражающихся в структурных преобразованиях в организме и стимуляции роста мышечной ткани.
При реализации изобретения были решены следующие задачи:
1) создание рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с молекулярной массой 36 кДа, включающего фрагмент рецептора ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, спейсер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 3, разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 4 в клетках Escherichia coli BL21, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB;
2) создание инъекционного препарата, содержащего иммунологически активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа- глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте, разработка эффективного способа использования этого препарата в виде подкожных или внутримышечных инъекций, решающего задачу повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики и др.) и птицы за счет индукции синтеза специфических аутоантител к ActRIIB, блокировании его действия, снижения активности эндогенного миостатина в сыворотке крови и, как следствие, стимуляции роста мышечной ткани при условии несистематического применения препарата.
Следует отметить, что аминокислотная последовательность ActRIIB высокогомологична (>90%) у всех сельскохозяйственных животных и птиц. Вследствие этого разработанный препарат представляет собой универсальное средство для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.
Решение первой поставленной задачи обеспечивается получением рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с молекулярной массой 36 кДа, включающего фрагмент белка ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, глицин-сериновый спей сер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans c последовательностью SEQ ID NO 3.
Способ получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на альфа-глюкане включает следующие стадии:
1) выращивание клеток штамма Е. colt BL21, экспрессирующих ген, кодирующий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 4;
2) связывание рекомбинантного белка GBD-ActRIIB в составе клеточных экстрактов штамма A. coli BL21 с глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;
3) последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.
Рекомбинантный белок GBD-ActRIIB включает в себя белковую последовательность глюкансвязывающего домена (GBD), определяющего способность данного белка связываться с глюкансодержащим сорбентом, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на альфа-глюкане. Иммобилизация на альфа- глюкане обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке альфа- глюкансвязывающего домена из Streptococcus mutans, который обладает высоким сродством к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений pH 6, 0-9,0 и концентраций соли 0- 3 М NaCl.
Поскольку в клетках Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с альфа-глюканом, то синтезируемый в клетках Е. coli рекомбинантный белок GBD-ActRIIB является единственным белком клеток штамма-продуцента, прочно связывающимся с альфа- глюканом. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата рекомбинантного белка, иммобилизованного на альфа-глюкансодержащем сорбенте.
Решение второй поставленной задачи обеспечивается созданием инъекционного препарата для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы. Полученный препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, охарактеризованный выше, суспендированный в среде из альфа- глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе. Метод повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы включает двукратное с интервалом в 20 суток проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, в дозе 5-100 мкг указанного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.
Таким образом, получен активный рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, обладающий способностью самопроизвольно связываться с глюкансодержащим сорбентом, формируя высокоиммуногенную композицию в форме полиантигена, индуцировать синтез специфических аутоантител к ActRIIB при введении в составе инъекционного препарата сельскохозяйственным животным и птице и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани и повышать мясную продуктивность.
Осуществление изобретения
Первым этапом работы стал дизайн рекомбинантного белка GBD-ActRIIB. Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 4), кодирующая фрагмент рецептора ActRIIB (SEQ ID NO 1), спей cep (SEQ ID NO 2) и альфа- глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans (SEQ ID NO 3). Для эффективной экспрессии в Е. coli последовательность химерного гена оптимизировали по кодонному составу и вторичной структуре мРНК.
В составе слитого рекомбинантного белка представлен фрагмент рецептора ActRIIB, соответствующий внеклеточному лигандсвязывающему домену. В аминокислотной последовательности фрагмента ActRIIB может содержаться одно или более изменений относительно природного полипептида ActRIIB, но не в лигандсвязывающих последовательностях. Помимо целевого антигена, в состав слитого рекомбинантного белка может входить один или более дополнительных доменов, придающих желаемое свойство, такое как простая и эффективная очистка, например, последовательность полигистидина, слитого с глутатион-8-трансферазой или, предпочтительно, последовательность глюкансвязывающего домена (GBD) по изобретению, который придает целевому белку высокое сродство к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем, позволяя осуществлять эффективную иммобилизацию рекомбинантного белка на глюкансодержащем сорбенте и получение высокоочищенного препарата целевого белка GBD-ActRIIB, не содержащего примесей других бактериальных белков, ДНК штамма-продуцента, липополисахаридов и эндотоксинов. Полисахарид-связывающий домен может быть присоединен к антигену ActRIIB через оптимально сконфигурированный спейсер переменной длины. Спейсер необходим для обеспечения представления антигена ActRIIB на поверхности белковой молекулы, а также оптимальной презентации иммунной системе животного. Представленный в данном изобретении вариант спейсера с последовательностью SEQ ID NO 2 обеспечивает эффективное формирование нативной конформации антигена ActRIIB, повышенную устойчивость к протеазам, оптимальное воздействие на иммунную систему и в экспериментах по иммунизации сельскохозяйственных животных и птиц с целью увеличения мышечной массы продемонстрировал неожиданное улучшение по сравнению с конструкциями, не имеющими спейсерной последовательности и/или других последовательностей, отличных от представленной в настоящем изобретении.
Целевой ген, кодирующий слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 4 синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием. В результате получили плазмиду pGBD-ActRIIB, кодирующую белок GBD-ActRIIB. Для экспрессии рекомбинантного белка предпочтительно использование клеток Е. coli BL21 и их производных, обеспечивающих высокий уровень синтеза целевого слитого белка, а также плазмидных векторов экспрессии типа рЕТ.
Далее получали штамм-продуцент рекомбинантного белка GBD-ActRIIB. Для этого клетки Е. coli BL21 трансформировали полученной плазмидой pGBD-ActRIIB. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-Р-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 ч при 37 °C. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pGBD- ActRIIB], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GBD- ActRIIB - 36 кДа. Уровень синтеза целевого белка в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Показано, что рекомбинантный белок GBD-ActRIIB синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения.
Для получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB клеточную культуру штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB] выращивали в 1 л среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37 °C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 B течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000 g нерастворимый белок GBD-ActRIIB оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8 М мочевине, центрифугировали 30 мин при 12000 g и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в 4 раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25 °C в течение 2 ч. Центрифугировали при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза.
Иммобилизованный на альфа-глюкане слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты белкового препарата составляла не менее 90 %. Консервацию проводили добавлением бензилового спирта до концентрации 0,1 %.
Слитый белок может быть очищен в соответствии с известными технологиями очистки белка, включая, например, лизис бактериальных клеток ферментом лизоцимом, разрушение ДНК на установках типа French-press, ультразвуком или ДНКазой, последующее дифференциальное центрифугирование телец включения, растворение телец включения в гуанидинхлориде или мочевине, процедуры рефолдинга, колоночную хроматографию на аффинных и ионобменных колонках и т.п.
Полученный слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении. Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов. Следует отметить, что полисахарид-связывающий домен можно заменить другими полипептидами, например, фрагмент антигена ActRIIB можно комбинировать с KLH (keyhole limpet hemocyanin, гемоцианин лимфы улитки), столбнячным токсоидом, CRM197 (разновидность дифтерийного токсина) или другими белковыми носителями.
Таким образом, по разработанной простой и эффективной технологии был получен слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB для последующего создания на его основе инъекционного препарата для введения сельскохозяйственным животным и птице с целью увеличения мышечной массы. Концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, как правило, она составляет 4-6 мг/мл. Следующим этапом исследования стала разработка инъекционного препарата на основе белка GBD-ActRIIB для введения сельскохозяйственным животным и птице. Инъекционный препарат представляет собой варианты иммуногенной композиции на основе слитого рекомбинантного белка GBD-ActRIIB (в качестве антигена), суспендированного в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте. Препарат стерилизуется с помощью ультрафильтрации. Альтернативно, иммуногенные композиции в данном изобретении могут быть приготовлены с использованием индивидуально простерилизованных компонентов перед окончательным составлением композиции.
Инъекционный препарат, представляющий собой иммуногенную композицию по настоящему изобретению, включает слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB (1-10 мг/мл), декстран-500 (1-10 мг/мл), ВЕАЕ-декстран-500 (0, 2-2,0 мг/мл).
Варианты иммуногенной композиции содержат в своем составе оптимизированные адъюванты (пример № 2), которые обеспечивают индукцию гуморального иммунного ответа, стабильны, безопасны и эффективны при использовании для сельскохозяйственных животных и птицы. В их составе отсутствуют продукты животного происхождения и канцерогенные соединения. Иммуногенные композиции в данном изобретении могут быть приготовлены в виде стерильной масляной эмульсии с Montanide™ (примеры № 3 и 4) или взвеси с гидроокисью алюминия (пример № 5). Варианты иммуногенных композиций в данном изобретении могут дополнительно включать диспергирующие или смачивающие агенты, суспендирующие агенты или другие подобные материалы.
Во всех вариантах исполнения иммуногенная композиция должна быть стерильной, стабильной в условиях производства и хранения. Предотвращение роста числа микроорганизмов может быть достигнуто путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, бензилового спирта, парабенов, хлорбутанола, сорбиновой кислоты, тиомерсала и т.п.
Типичные варианты реализации изобретения направлены на сельскохозяйственных животных и птиц, которым вводят инъекционный препарат на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB по данному изобретению с целью ограничения или предотвращения воздействия эндогенного миостатина на мышечную ткань, что приводит к дополнительному росту мускулатуры. Иммуногенный инъекционный препарат с рекомбинантным белком GBD-ActRIIB и адъювантами оптимизирован для использования у позвоночных, в частности, для лечения заболеваний, вызывающих деградацию мускулатуры. Поскольку рецептор ActRIIB высококонсервативен у позвоночных, варианты реализации настоящего изобретения пригодны для индукции иммунного ответа у всех целевых позвоночных, иммунизированных с использованием способов и композиций, описанных в данном изобретении.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения инъекционный препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в растворе альфа- глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе) или гидроокиси алюминия (равный объем). Разработан способ использования инъекционного препарата по изобретению путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата двукратно с интервалом 20 суток в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.
За счет связывания рекомбинантного белка GBD-ActRIIB с высокополимерными растворимыми полисахаридами формируются молекулярные комплексы большого размера (20-40 нм), обеспечивающие иммуногенность препарата и устойчивость к деградации протеазами. Таким образом, антиген ActRIIB по настоящему изобретению присутствует в тканях у сельскохозяйственных животных и птицы более продолжительное время, оказывая более длительное воздействие на иммунную систему. Настоящее изобретение также обеспечивает максимизированный иммунный ответ за счет оптимизированных адъювантов.
Значительным преимуществом настоящего изобретения является то, что у иммунизированных животных и птиц может проходить от нескольких недель до нескольких месяцев между бустерными иммунизациями, что позволяет иммунной системе блокировать путем индукции синтеза специфических аутоантител эндогенный рецептор ActRIIB, препятствуя его связыванию с миостатином и/или снижая его активность в организме в течение длительного времени, ингибировать сигнал клеткам мышечной ткани, останавливающим их рост. Как следствие, изобретение обеспечивает способ увеличения мышечной массы, повышения мышечной силы и повышение плотности костей у сельскохозяйственных животных и птицы. Заболевания или расстройства, в терапии или профилактике которых могут использоваться иммуногенные композиции по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, дряхлость, кахексию, возрастную саркопению, мышечное истощение, миопатию, мышечную дистрофию, остеопороз, ожирение, сердечную недостаточность или заболевания сердца. Таким образом, заявленное изобретение, а именно новый инъекционный препарат на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB и способ его использования, обладает научной новизной, не имеет полных аналогов и обладает конкурентным преимуществом для достижения технического результата, заключающегося в увеличении мышечной массы и повышении мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, в легкой очистке белка, где концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, обладающего достаточной иммуногенностью в отношении ActRIIB, в получении универсального средства для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы, повышенную устойчивость к протеазам в сравнении с нативной конформации антигена ActRIIB, рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов.
Реализацию изобретения рассмотрим на характерных примерах, которые приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения каким-либо способом рамок данного изобретения.
Пример 1. Получение рекомбинантного белка GBD-ActRIIB
Была спланирована нуклеотидная последовательность химерного гена (SEQ ID NO 4), кодирующая фрагмент рецептора ActRIIB (SEQ ID NO 1), спей cep (SEQ ID NO 2) и альфа- глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans (SEQ ID NO 3). Далее ген (SEQ ID NO 4) синтезировали химико-ферментативным методом с последующим клонированием.
На основе плазмидного вектора экспрессии типа рЕТ получили плазмиду pGBD- ActRIIB, кодирующую белок GBD-ActRIIB, путем клонирования гена (SEQ ID NO 4) в указанную материнскую плазмиду.
Для экспрессии рекомбинантного белка использовали клетки Е. colt BL21, что обеспечило высокий уровень синтеза целевого слитого белка.
Для этого клетки Е. colt BL21 трансформировали полученной плазмидой pGBD- ActRIIB. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-Р-О-тиогалактопиранозида (ПИГГ) и выращивали в течение 3 ч при 37 °C. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. colt BL21 [pGBD- ActRIIB], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы, молекулярная масса которой соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GBD-ActRIIB - 36 кДа. Уровень синтеза целевого белка в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Показано, что рекомбинантный белок GBD-ActRIIB синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения.
Для получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB клеточную культуру штамма Е. coli BL21 [pGBD-ActRIIB] выращивали в 1 л среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37 °C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 B течение 15 мин.
Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000 g нерастворимый белок GBD-ActRIIB оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8 М мочевине, центрифугировали 30 мин при 12000 g и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в 4 раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25 °C в течение 2 ч. Центрифугировали при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза.
Иммобилизованный на альфа-глюкане слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты белкового препарата составляла не менее 90 %. Консервацию проводили добавлением бензилового спирта до концентрации 0, 1 %.
Слитый белок может быть очищен в соответствии с известными технологиями очистки белка, включая, например, лизис бактериальных клеток ферментом лизоцимом, разрушение ДНК на установках типа French-press, ультразвуком или ДНКазой, последующее дифференциальное центрифугирование телец включения, растворение телец включения в гуанидинхлориде или мочевине, процедуры рефолдинга, колоночную хроматографию на аффинных и ионобменных колонках и т.п.
Полученный слитый рекомбинантный белок GBD-ActRIIB демонстрирует высокую стабильность при хранении. Концентрация очищенного слитого белка GBD-ActRIIB варьирует в диапазоне 1-8 мг/мл, как правило, она составляет 4-6 мг/мл.
Пример 2. Получение иммуногенной композиции с рекомбинантным белком GBD- ActRIIB
Стандартными методами при стандартных условиях проводили соединение полученного очищенного слитого белка GBD-ActRIIB с водно-масляной суспензии Montanide или гидроокиси алюминия.
В конкретных вариантах осуществления изобретения препарат содержит рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в растворе альфа-глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе) или гидроокиси алюминия (равный объем), и используется путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата двукратно с интервалом 20 суток в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.
Эффективность применения инъекционного препарата на основе рекомбинантного белка GBD-ActRIIB для увеличения мышечной массы и повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы иллюстрируется следующими примерами.
Пример 3. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела поросят
В условиях промышленного свиноводческого комплекса поросятам породы ландрас в возрасте 100-120 суток с массой тела 50-55 кг подкожно вводили препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа-глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 5-100 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животного. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных.
Результаты исследования представлены в таблице 1. Как видно из полученных данных, двукратное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, привело к увеличению массы тела поросят через 60 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка на 4,8 % по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг - на 13,7 %; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг - на 11,8 %. Таблица 1 - Изменение массы тела поросят, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB
Figure imgf000015_0001
В таблице 2 представлены результаты определения методом иммуноферментного анализа уровня аутоантител к миостатину в сыворотках крови поросят после иммунизации препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB.
Кроме того, антигены на основе фрагмента ActRIIB в настоящем изобретении обеспечивают функцию депонирования и больший период их полувыведения в организме иммунизируемого животного, учитывая повышенную устойчивость к деградации этих материалов.
Таблица 2 - Уровень аутоантител к ActRIIB в образцах сывороток крови поросят, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB
Figure imgf000016_0001
Из данных таблиц 1 и 2 следует, что оптимальной дозой препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, для индукции аутоантител у животных является доза, равная 50 мг/кг массы тела животного. Пример 4. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела быков холмогорской породы
В условиях откормочного комплекса бычкам холмогорской породы в возрасте 10 месяцев подкожно вводили препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, суспендированный в среде из альфа-глюкана (50 % по массе), водно-масляной суспензии Montanide (50 % по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Изменение массы тела бычков калмыцкой породы, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB
Figure imgf000017_0001
Как видно из представленных в таблице 3 данных, двукратное (с интервалом 20 суток) введение бычкам калмыцкой породы препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD- ActRIIB, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 10,8 % по сравнению с контрольной группой животных.
Пример 5. Влияние инъекционного препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, на увеличение массы тела индеек
Препарат, содержащий рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, внутримышечно вводили индейкам (самцам) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) в возрасте 30 суток. Препарат применяли в дозах 5 и 50 мкг/кг рекомбинантного белка GBD-ActRIIB, суспендированного в среде из альфа-глюкана (50 % по массе), суспензии гидроокиси алюминия (50 % по массе), двукратно с интервалом 20 суток из расчета 5-50 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела птицы. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Результаты исследования представлены в таблице 4. Таблица 4 - Изменение массы тела индеек породы белая широкогрудая, иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GBD-ActRIIB
Figure imgf000018_0001
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 20 суток) введение индейке (самцы) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) препарата, содержащего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, привело к увеличению массы тела животных через 70 суток после второй инъекции препарата при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка на 12,1 %, а в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 13,6 % относительно контрольной группы птиц.
Приведенные примеры осуществления изобретения не являются исчерпывающими.
Возможные иные примеры осуществления, соответствующие объему патентных притязаний.
Список использованных источников
1 Mathews L.S., Vale W.W. // Cell. - 1991. - V. 65. - P. 973-982.
2 Attisano L., Wrana J.L., Cheifetz S., Massague J. // Cell. - 1992. - V. 68. - P. 97-108.
3 Yamashita H., ten Dijke P., Huylebroeck D. et al. // J. Cell Biol. - 1995. - V. 130. - P. 217- 226.
4 Lee S.J., McPherron A.C. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2001. - V. 98. - P. 9306-9311.
5 Yeo C., Whitman M. // Mol. Cell. - 2001. - V. 7. - P. 949-957.
6 Oh S.P., Yeo C.-Y., Lee Y. et al. // Genes Dev. - 2002. - V. 16. - P. 2749-2754.
7 Carnac G, Ricaud S., Vernus B., Bonnieu A. // Mini Rev. Med. Chem. 2006. V. 6. P. 765- 770.
8 McPherron A.C., Lawler A.M., Lee S. J. // Nature. - 1997. - V. 387. - P. 83-90.
9 Ashmore C.R., Parker W., Stokes H., Doerr L. // Growth. - 1974. - V. 38. - P. 501-507. 10 Swatland H. J., Kieffer N.M // J. Amm. Sci. - 1994. - V. 38. - P. 752-757.
11 McPherron A C., Lee S.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - V. 94. - P. 12457-12461.
12 Kambadur R., Sharma M., Smith T.P., Bass J.J. // Genome Res. - 1997. - V. 7. - P. 910- 915. 13 Grobet L., Martin L.J., Poncelet D. et al. // Nat. Genet. - 1997. - V. 17. - P. 71-74.
14 Kota J., Handy C.R., Haidet A.M. et al. Follistatin Gene Delivery Enhances Muscle Growth and Strength in Nonhuman Primates // Sci. Transl. Med. - 2009. - V. 1. - P. 6ral5.
15 Lee S.J., Reed L.A., Davies M.V. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V. 102. - P. 18117-18122.
Перечень последовательностей:
SEQ ID NO 1 Последовательность аминокислот ActRIIB
SEQ ID NO 2 Последовательность аминокислот глицин-серинового спейсера
SEQ ID NO 3 Последовательность аминокислот альфа-глюкансвязывающего домена (GBD) из Streptococcus mutans
SEQ ID NO 4 Последовательность нуклеотидов гена, кодирующего рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, и последовательность аминокислот рекомбинантного белка GBD- ActRIIB

Claims

Формула изобретения
1. Рекомбинантный белок GBD-ActRIIB, включающий фрагмент рецептора ActRIIB с последовательностью SEQ ID NO 1, спейсер с последовательностью SEQ ID NO 2 и альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO 3, для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.
2. Способ получения рекомбинантного белка GBD-ActRIIB по п.1, включающий следующие этапы:
- получение белка GBD-ActRIIB с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4 в составе клеточных экстрактов штамма A. coll BL21;
- связывание белка GBD-ActRIIB с альфа-глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;
- последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого рекомбинантного белка GBD-ActRIIB.
3. Препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы, представляющий собой композицию, содержащую рекомбинантный белок GBD- ActRIIB по п. 1, суспендированный в среде из альфа-глюкансодержащего сорбента, в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте.
4. Препарат по п.З, где приемлемым для инъекционного использования жидким адъювантом является водно-масляной суспензии Montanide или гидроокиси алюминия.
5. Препарат по п.4, где водно-масляная суспензии Montanide составляет 50 % по массе или гидроокись алюминия составляет равный объем.
6. Способ использования препарата по пи. 3-5 для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птиц, включающий проведение подкожных или внутримышечных инъекций двукратно с интервалом 20 дней в дозе 5-100 мкг рекомбинантного белка GBD-ActRIIB на один килограмм массы тела животного или птицы.
PCT/RU2023/050042 2022-07-14 2023-03-02 Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы WO2024014989A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2022119326 2022-07-14
RU2022119326A RU2792817C1 (ru) 2022-07-14 Рекомбинантный белок GBO-ActRIIB для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024014989A1 true WO2024014989A1 (ru) 2024-01-18

Family

ID=89537173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2023/050042 WO2024014989A1 (ru) 2022-07-14 2023-03-02 Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024014989A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160031993A1 (en) * 2009-04-27 2016-02-04 Novartis Ag Compositions and methods for increasing muscle growth
RU2613420C1 (ru) * 2016-04-13 2017-03-16 Сергей Михайлович Юдин Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
RU2750267C1 (ru) * 2020-02-07 2021-06-25 Общество с ограниченной ответственностью «НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ ИН-ВЕТ» Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (GDF11), способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также способ использования препарата

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160031993A1 (en) * 2009-04-27 2016-02-04 Novartis Ag Compositions and methods for increasing muscle growth
RU2613420C1 (ru) * 2016-04-13 2017-03-16 Сергей Михайлович Юдин Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
RU2750267C1 (ru) * 2020-02-07 2021-06-25 Общество с ограниченной ответственностью «НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ ИН-ВЕТ» Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (GDF11), способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также способ использования препарата

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2280115T3 (es) Composiciones inmunologicas para modular la miostatina en sujetos vertebrados.
ES2239457T3 (es) Procedimiento para regular a niveles mas bajos la actividad de ligando de osteoprotegerina.
DK201100184Y4 (da) Antistoffer fra immuniserede fugle
CN105924516A (zh) 变体激活素受体多肽及其用途
HRP980203A2 (en) Modified tnf "alpha" molecules, dna encoding such modified tnf "alpha" molecules and vaccines comprising such modified tnf "alpha" molecules and dna
US20060088543A1 (en) Use of passive myostatin immunization
JP2010510767A (ja) 抗原およびアジュバントの多量体複合体
JP2013006862A (ja) 免疫原性ｌｈｒｈ組成物およびそれに関する方法
CN108066755B (zh) 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用
RU2613420C1 (ru) Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
KR20010089364A (ko) 강화 백신
RU2792817C1 (ru) Рекомбинантный белок GBO-ActRIIB для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы
WO2024014989A1 (ru) Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы
JPH09510702A (ja) インヒビン組成物およびそれらの使用方法
RU2750267C1 (ru) Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (GDF11), способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также способ использования препарата
WO2003012045A2 (en) Hybrid proteins with neuregulin heparin-binding domain for targeting to heparan sulfate proteoglycans
AU2002322762A1 (en) Hybrid proteins with neuregulin heparin-binding domain for targeting to heparan sulfate proteoglycans
RU2614115C1 (ru) Рекомбинантный соматостатинсодержащий белок, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мясной и молочной продуктивности сельскохозяйственных животных, а также способ использования препарата
JPH05507208A (ja) 線虫ワクチン
US20050180947A1 (en) Novel application of vaccination against TNF-alpha
CN111939248A (zh) 一种b型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法和应用
EP2431052B1 (en) Protein for the immunocastration for mammals
CN1321189A (zh) 细胞性免疫的诱导方法以及被诱导了细胞免疫的细胞
US20040220098A1 (en) Inhibin compositions and methods of enhancing fertility and growth
RU2722849C1 (ru) Рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, способ его получения и применения

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23840052

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1